PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)

SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh: Aditya Christian Firmanto NIM : 118114161

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015


PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)

SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh: Aditya Christian Firmanto NIM : 118114161

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015 i


Persetujuan Pembimbing PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)

Skripsi yang diajukan oleh: Aditya Christian Firmanto NIM : 118114161

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

(Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.)

Tanggal 3 Desember 2015 ii


Pengesahan Skripsi Berjudul PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus) Oleh : Aditya Christian Firmanto NIM : 118114161 Dipertahankan dihadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Dekan

(Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt.)

Panitia Penguji: Tanda tangan 1.

Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.

2.

Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.

3.

Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. iii


Halaman Persembahan

“Dunia tak akan selebar ini jika tidak ada ilmu yang mendampingi. Dunia tak akan semegah ini bila tidak ada orangorang dengan usaha di dalamnya. Dunia tak akan seberlimpah ini bila Tuhan tidak mengijinkan semua ini terjadi.”

Karya kecil ini, penulis persembahkan untuk pelebaran dunia dan kemuliaan nama Tuhan.

iv


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama

: Aditya Christian F

Nomor Mahasiswa

: 118114161

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus) Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Dengan pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal, Januari 2016 Yang menyatakan

(Aditya Christian F)

v


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis dan susun ini tidak memuat karya atau bagian dari pekerjaan orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala resiko sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku

Yogyakarta, Desember 2015 Penulis,

Aditya Christian Firmanto

vi


PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas limpah karuniaNya penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax quadricarinatus)” dengan baik. Tugas akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat mendapatkan gelar Sarjana Farmasi program studi Farmasi. Selama penyusunan dan penyelesaian tugas akhir ini, penulis telah mendapatkan banyak dukungan berupa doa, semangat, bantuan, kritik dan saran dari berbagai pihak. Dalam kesempatan ini penulis hendak berterima kasih kepada: 1. Bapak dan ibu serta adik atas doa, kasih saying, kesabaran, materi, motivasi, nasehat dan pendapat yang diberikan pada penulis selama penyusunan tugas akhir ini. 2. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma 3. Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku dosen pembimbing yang telah membimbing, memberikan diskusi, kritik dan saran kepada penulis mulai dari penyusunan proposal, proses penelitian hingga penyusunan naskah tugas akhir ini.

vii


4. Bapak dan Ibu Karjono selaku seperti pembimbing kedua dalam menyusun skripsi, menimba ilmu tentang lobster dan belajar mengenai nilai-nilai kehidupan. 5. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. sebagai dosen penguji dan atas kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan, kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini. 6. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. sebagai dosen penguji dan atas kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan, kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini. 7. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu, nasihat dan bimbingan yang telah diberikan. 8. Ibu Agustina Setiawati M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium yang bersedia direpotkan dengan banyak permintaan tanda tangan surat lembur. 9. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi: Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, Mas Kayat dan Mas Agung atas bantuannya selaman penelitian berlangsung. 10. Tante Yolanda Novia selaku partner skripsi yang mampu dan mau sabar menjalani tiap proses sedih dan senang selama penyusunan skripsi. 11. Adik Vincentius Henzu selaku teman dan manager yang mau mengorbankan banyak waktu, kesibukan, materi dan diri untuk mendukung bahkan menghibur selama proses penyusunan skripsi ini walau tidak dibayar sepeser pun.

viii


12. Mbak Gita Mentari selaku teman seperjuangan yang sudah bersedia menyediakan tempat untuk menyusun naskah mentah selama 2 minggu. 13. Bibi Villianova dan Bibi Ratna sebagai teman yang setia mendukung dan menunggu sidang pendadaran. 14. Adik Gaiety Suthami sebagai teman sekaligus tempat sampah selama proses penyusunan skripsi. 15. Mas Wahyu Bramastyo sebagai mentor dan motivator dalam mengambil setiap langkah selama proses penyusunan skripsi. 16. Teman-teman Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas kerja sama dan kebersamaan selama proses perkuliahan. 17. Seluruh pihak yang telah membantu selama proses penelitian ini yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadariada banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. Akhir kata, penulis meminta maaf apabila ada kesalahan dalam penyusunan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat berkontribusi baik untuk kemajuan ilmu pengetahuan farmasi.

Yogyakarta, Desember 2015

Penulis

ix


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ..................................................................................

i

PERSETUJUAN PEMBIMBING ...............................................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN .....................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................

iv

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ..................

v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .....................................................

vi

PRAKATA ..................................................................................................

vii

DAFTAR ISI ...............................................................................................

x

DAFTAR TABEL .......................................................................................

xiv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xv

DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................

xvii

INTISARI. ...................................................................................................

xix

ABSTRACT ..................................................................................................

xx

BAB I. PENDAHULUAN ..........................................................................

1

A. Latar Belakang .......................................................................................

1

1. Rumusan masalah ...............................................................................

3

2. Keaslian penelitian .............................................................................

3

3. Manfaat penelitian ..............................................................................

4

B. Tujuan Penelitian ....................................................................................

4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.........................................................

5

A. Persiapan Habitat Lobster Air Tawar .....................................................

5

x


1. Permodelan semi intensif ........................................................................

5

2. Derajad keasaman (pH) dan kesadahan ..................................................

6

3. Dissolve of oxygen dan suhu ...................................................................

7

4. Sedimen ...................................................................................................

7

B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus) .........................

8

C. Persiapan Pakan Lobster.........................................................................

9

1. Pakan lobster ...........................................................................................

9

2. Tetrasiklin HCl ........................................................................................

10

D. Mikroorganisme .....................................................................................

11

E. Protein .....................................................................................................

12

F. Coomasie Brilliant Blue (CBB) ..............................................................

14

G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif..............................................

15

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ............................

16

I. Validasi metode .......................................................................................

17

1. Akurasi ...............................................................................................

18

2. Presisi .................................................................................................

18

3. Linearitas ............................................................................................

18

4. Selektivitas .........................................................................................

19

5. Kriteria................................................................................................

19

J. Landasan Teori ........................................................................................

19

K. Hipotesis .................................................................................................

21

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ..................................................

22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................

22

xi


B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ........................................

22

C. Bahan Penelitian .....................................................................................

24

D. Alat Penelitian ........................................................................................

24

E.Tata Cara Penelitian .................................................................................

25

F. Analisis Hasil ..........................................................................................

41

G. Rancangan Penelitian .............................................................................

45

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................

46

A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar ..........................................

46

B. Tahap Persiapan Pakan Lobster .............................................................

47

1. Validasi dan analisis kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam sediaan kapsul................................................................................................

47

2. Optimasi dosis TCH .........................................................................

48

3. Pembuatan dan pemberian perlakuan pakan antibiotik ....................

49

C. Tahap Ekstraksi Protein..........................................................................

50

D. Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif ..................

51

E. Analisis Sampel ......................................................................................

53

1. Analisis populasi mikroba dalam air habitat lobster ..........................

53

2. Analisis kadar protein dalam sedimen................................................

57

3. Pertumbuhan lobster air tawar terkait panjang dan berat lobster .......

59

F. Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster .....................................

60

1.Preparasi dan ekstraksi TC dalam daging lobster ...............................

61

2.Orientasi panjang gelombang TC ........................................................

63

3. Penetapan puncak TC .........................................................................

63

xii


4.Optimasi fase gerak HPLC ..................................................................

65

G. Validasi Metode HPLC ..........................................................................

66

H. Penetapan Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster ....................

69

I. Keterbatasan Penelitian............................................................................

70

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN.....................................................

71

A. Kesimpulan ............................................................................................

71

B. Saran .......................................................................................................

71

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

72

LAMPIRAN ................................................................................................

76

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................

104

xiii


DAFTAR TABEL

Tabel I. Taksonomi lobster air tawar ..........................................................

9

Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak ..................................

10

Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan.................................................

12

Tabel IV. Hasil validasi penetapan kadar TCH dalam kapsul ....................

48

Tabel V. Jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis TCH ....................

49

Tabel VI. %D kurva adisi protein ...............................................................

53

Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC ...............

66

Tabel VIII. %D kurva adisi TC ...................................................................

68

Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi TC ....................................................

68

Tabel X. Kadar tetrasiklin total dalam daging lobster ................................

70

xiv


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl ...........................................................

11

Gambar 2. Struktur CBB R-250 ................................................................

14

Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB ...........................................

15

Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi ..........................

51

Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein .......

52

Gambar 6. Bakterosidal dan bakteriostatik antibiotik ...............................

54

Gambar 7. Log populasi mikroba kelompok kontrol dan antibiotik .........

55

Gambar 8. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok kontrol) ....................................................................................

55

Gambar 9. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok perlakuan)................................................................................

56

Gambar 10. Kurva kadar protein dalam sedimen selama hari perlakuan ...

59

Gambar 11. Kurva perbandingan panjang lobster kontrol dan perlakuan ..

60

Gambar 12. Kurva perbandingan berat lobster kontrol dan perlakuan .......

60

Gambar 13. Reaksi oksidasi trigliserida oleh asam ....................................

62

Gambar 14. Kromatogram standar TCH dalam pelarut fase gerak .............

63

Gambar 15. Kromatogram blangko.............................................................

64

Gambar 16. Kromatogram standar TC basa ................................................

64

Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak methanol:buffer McIlvaine ................................................................................

66

Gambar 18. Kromatogram TC dengan fase gerak asetonitril : buffer McIlvaine ............................................................................... xv

66


Gambar 19. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC .............

67

Gambar 20. Kompleks TC dengan ion logam .............................................

69

xvi


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat permohonan working standar tetrasiklin HCl......................

77

Lampiran 2. COA working standar tetrasiklin HCl .........................................

78

Lampiran 3. COA reagen coomasie R............................................................

79

Lampiran 4. COA albumin (BSA) .................................................................

80

Lampiran 5. Hasil determinasi lobster air tawar ..............................................

81

Lampiran 6. Kurva baku penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ...........

84

Lampiran 7. Tabel hasil penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ............

84

Lampiran 8. Hasil jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis tetrasiklin .....

85

Lampiran 9. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 0 ................................

86

Lampiran 10. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 3 ..............................

87


89


91

Lampiran 13. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 14 ............................

93

Lampiran 14. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 28 ............................

95

Lampiran 15. Tabel data jumlah populasi mikroba .........................................

97

Lampiran 16. Tabel data tinggi derivat kurva baku solven protein ...................

97

Lampiran 17. Tabel data tinggi derivat kurva adisi protein ..............................

97

Lampiran 18. Contoh perhitungan %D ..........................................................

97

Lampiran 19. Contoh perhitungan %RSD ......................................................

98

Lampiran 20. Contoh perhitungan LOQ ........................................................

98

Lampiran 21. Contoh spektrum derivatif protein ............................................

98

xvii


Lampiran 22. Data kadar protein dalam sedimen ............................................

99

Lampiran 23. Tabel data panjang lobster air tawar..........................................

99

Lampiran 24. Tabel data berat lobster air tawar ..............................................

99

Lampiran 25. Spektrum orientasi panjang gelombang tetrasiklin .....................

99

Lampiran 26. Tabel data AUC kurva baku solven tetrasiklin ...........................

100

Lampiran 27. Tabel data AUC kurva adisi tetrasiklin .....................................

100

Lampiran 28. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva baku solven ...................

100

Lampiran 29. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva adisi tetrasiklin ..............

100

Lampiran 30. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 14 ..............................................................................

101

Lampiran 31. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 28 ..............................................................................

101

Lampiran 32. Kandungan pakan dan merek dagang pakan ........................

101

Lampiran 33. Proses perlakuan ...................................................................

101

Lampiran 34. Sedimen lobster air tawar .....................................................

102

Lampiran 35. Perbandingan jumlah sedimen pada hari ke 28 ....................

102

Lampiran 36. Contoh perhitungan uji t tidak berpasangan (p<0,05) ..........

102

Lampiran 37. Tabel uji t tidak berpasangan terhadap panjang dan berat .....................................................................................

xviii

103


INTISARI Budidaya lobster air tawar (Cherax quadricarinatus) merupakan pemanfaatan sumber daya alam yang cukup diminati masyarakat karena mudah dilakukan bahkan memiliki prospek yang baik di Indonesia dan manca negara. Yang menjadi masalah adalah adanya akumulasi antibiotik dalam daging lobster akibat penggunaan antibiotik untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster dari penyakit. Tentunya penggunaan antibiotik dalam akuakultur akan mempengaruhi kualitas air, maka perlu dilakukan analisis pengaruh pakan berantibiotik pada populasi mikroba dalam air dan kadar protein sedimen sebagai parameter kualitas air dan kadar akumulasi antibiotik dalam daging serta pengaruhnya terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar. Dalam penelitian ini dilakukan pemberian pakan berantibiotik (Tetrasiklin HCl) dan pakan kontrol (tanpa antibiotik) sebagai pembanding, pada lobster air tawar selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Populasi mikroba dalam air diuji dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu), kadar protein sedimen dianalisis dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif, dan kadar akumulasi tetrasiklin daging menggunakan metode HPLC fase terbalik. Analisis hasil dilakukan dengan membandingkan hasil populasi mikroba, kadar protein dan laju pertumbuhan lobster kelompok kontrol dan kelompok perlakuan antibiotik. Hasil penelitian menunjukkan fluktuatif populasi mikroba dalam air tetapi menunjukkan tren polinomial log populasi mikroba yang tidak meningkat maupun menurun. Kadar protein sedimen, panjang dan berat lobster meningkat tetapi tidak berbeda antara kedua kelompok. Pada kelompok perlakuan antibiotik terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster sebesar 53,0970 µg/g. Kata kunci : Lobster air tawar, sedimen, tetrasiklin, spektrofotometri sinar tampak, derivatif, HPLC

xix


xx

ABSTRACT The freshwater lobster cultivation is one of the natural resources utilization which has been interested by many people in community because it is simple to do, even it has good prospect for future business in Indonesia and foreign countries. The problem is that there is antibiotic accumulation in meat because antibiotics usage in feeding lobster to maintain their health and productivity of cultivated lobster. Surely, antibiotics usage in aquaculture will influence the water quality, therefore the analysis of microbial population in water and amount of protein in sediment as the parameter of the water quality, antibiotics accumulation in meat and its effect to growth rate of freshwater lobster are needed. In this study, treatment had been given by feeding lobster using food containing antibiotics (tetracycline HCl) and food without antibiotics as control for a period of 3, 5, 7, 14 and 28 days. Microbial population in water was analysed by using colony forming unit method, the amount of protein in sediment by using CBB R method and spectrophotometry visible derivative, and antibiotics accumulation in meat by using reverse-phase HPLC. The result was analysed by comparing the amount of microbial population and protein, also length and weight of freshwater lobter both control group and treatment group. The result in this study showed fluctuation of microbial population in water but there was no increasing or decreasing of log microbial population in polynomial trend. The amount of protein in sediment, length and waeight of freshwater lobster had been increasing but it showed no difference both control group and treatment group. In treatment group, the accumulation of antibiotics in meat was 53,0970 µg/g. Keywords : Freshwater lobster, sediment, tetracycline, spectrophotometry visible, derivative, HPLC

xx


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Kebutuhan pangan yang meningkat menyebabkan masyarakat mencari alternatif pemanfaatan sumber daya alam, mulai dari pertanian hingga perikanan. Salah satu pemanfaatan sumber daya perikanan yang cukup diminati adalah budidaya lobster air tawar, karena budidaya lobster air tawar relatif mudah dan memiliki profit yang cukup tinggi. Kemudahan dalam pengembangbiakan lobster air tawar ini membuat minat masyarakat semakin meningkat (Lim, 2006). Masalah yang ada dalam budidaya perikanan saat ini adalah kondisi cuaca ekstrim dan kelembaban udara yang tinggi. Kondisi ini menyebabkan laju pertumbuhan mikroba semakin tinggi dan berakibat pada penurunan produktivitas lobster air tawar karena penyakit oleh mikroba. Mikroba yang banyak dilaporkan menyebabkan penyakit hingga kematian pada golongan Crustaceae adalah Vibrio spp (Ansari dan Raissy, 2010). Hal ini membuat peternak menggunakan antibiotik sebagai alternatif untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster air tawar dengan menghambat atau membunuh mikroba merugikan yang ada di habitat (Kurniawan, 2010). Penggunaan antibiotik sebagai pencegah penyakit pada ternak memiliki kerugian, yaitu terjadi akumulasi antibiotik dalam tubuh ternak. Hal ini dibuktikan dengan adanya penolakan hasil budidaya perikanan maupun peternakan oleh beberapa negara, disebabkan oleh adanya akumulasi senyawa antibotik Chloramphenicol dalam daging ternak. Akumulasi senyawa antibiotik dalam 1


2

daging ini dikhawatirkan memberikan pengaruh yang buruk jika dikonsumsi manusia dalam jangka panjang, sehingga penggunaan antibiotik dalam beberapa hal seperti tambahan dalam pakan ternak sudah dibatasi bahkan dilarang (Weifen, Hong, Changhu, dan Jamil, 2004). Air dan sedimen merupakan komponen habitat yang mendukung pertumbuhan dan perkembangan lobster. Tentunya parameter air yang layak untuk lobster hidup juga diperlukan, seperti ketersediaan oksigen dan komponen organik dalam air. Sedimen merupakan sisa pakan dan hasil ekskresi dari lobster air tawar yang sebagian besar adalah protein, mengendap di dasar habitat. Sedimen ini akan berada dalam habitat lobster dan memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan lobster. Dalam hal ini, peran mikroba terhadapsiklus kimia air sangat diperlukan untuk menjaga kualitas air. Dalam penelitian digunakan tetrasiklin HCl sebagai perlakuan antibiotik, karena tetrasiklin HCl memiliki spektrum yang lebar dalam menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun gram negatif (Krasner dan Shors, 2014). Keberadaan pakan yang mengandung tetrasiklin dalam habitat, akan berdampak pada kualitas sedimen yang terbentuk di dalam air. Adanya masalah pada kualitas sedimen maupun kondisi air akan berpengaruh pada tumbuh kembang lobster, maka perlu dilakukan penelitian terkait pengaruh pakan mengandung antibiotik terhadap habitat dan laju pertumbuhan lobster dalam jangka waktu tertentu. Pengamatan pengaruh pakan mengandung antibiotik terhadap habitat dilakukan dengan melihat jumlah populasi mikroba pada air, dan kandungan protein pada sedimen dengan metode coomassie brilliant blue R dan


3

spektrofotometri sinar tampak derivatif (400-800 nm). Pengamatan laju petumbuhan lobster dilakukan dengan mengukur panjang dan berat lobster dan pengamatan akumulasi antibiotik dengan metode High Performance Liquid Chromatograhpy (HPLC) fase terbalik dengan pengembangan. Validasi yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi akurasi (%D), presisi (%RSD), sensitivitas (LOQ), dan linearitas (r). Analisis hasil dilakukan dengan membandingkan antara perlakuan dan kontrol dengan hari perlakuan pakan mengandung antibiotik. 1. Rumusan masalah a. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi mikroba dalam habitat lobster air tawar? b. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam sedimen lobster air tawar? c. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar? d. Apakah terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster air tawar? 2. Keaslian penelitian Penelitian yang dipublikasikan terkait sedimen adalah bioremediasi sedimen tambak lobster (Kurniawan, 2010), Measurement of Protein in Nearshore marine Sedimens (Mayer et al, 1986). Determination of Tetracycline Antibiotic Residues in Edible Swine Tissues by Liquid Chromatography with Spectrofluorometric Detection and Confirmation by Mass Spectrometry (Pena et al, 2007). Method Development and Validation of Tetracycline Antibiotics and


4

their Epimers in Marine Products as per the EU Guidelines (Vora, 2013). Sejauh peneliti mengamati penelitian sebelumnya, belum ada yang mengamati pengaruh pakan antibiotik tetrasiklin HCl terhadap populasi mikroba dalam akuakultur, kada protein dalam sedimen dan akumulasi pada lobster air tawar dengan pengembangan metode analisis tetrasiklin sebagai indikator laju pertumbuhan lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dan pengetahuan terkait pengaruh pakan berantibiotik terhadap budidaya lobster air tawar. Selain itu hasil penelitian juga dapat sumbangsih untuk penelitian lain terkait penggunaan tetrasiklin dalam akuakultur agar ilmu dapat berkembang lebih baik. b. Manfaat praktis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan kualitas lingkungan hidup lobster air tawar yang berdampak pada kualitas lobster. B. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi mikroba dalam habitat lobster air tawar. 2. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam sedimen lobster air tawar. 3. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar. 4. Mengetahui kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster air tawar


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Persiapan Habitat Lobster Air Tawar 1. Permodelan semi intensif Budidaya dengan sistem semi intensif ini merupakan budidaya dengan padat penebaran cukup tinggi, menggunakan kincir dan pakan buatan atau pelet. Dalam kondisi demikian, beban bahan organik tambak menjadi tinggi. Bahan organik berasal dari ekskresi udang, sisa pakan dan bangkai organisme mengendap di dasar tambak. Untuk menanggulangi hal tersebut, pada tambak semi intensif dilakukan pengaerasian dan pergantian air yang cukup, baik kuantitas maupun frekuensinya. Upaya tersebut dilakukan guna mempertahankan kualitas air bagi kelangsungan hidup dan pertumbuhan optimum organisme (Effendy, 1998). Salah satu hal yang berperan penting pada tahap awal budidaya lobster adalah kualitas air. Secara umum kualitas air berhubungan dengan kandungan bahan terlarut di dalamnya. Tingkat kandungan dari bahan tersebut akan menentukan kelayakannya. Beberapa sifat fisika dan kimia air yang dapat mempengaruhi hidup lobster air tawar adalah suhu, oksigen terlarut, CO2 bebas, derajat keasaman (pH), alkalinitas, amoniak, nitrat, dan nitrit (Lukito dan Prayugo, 2007).

5


2.

6

Derajat keasaman (pH) dan kesadahan Derajat keasaman (pH) air ini penting sebagai parameter kualitas air

karena dapat mengontrol tipe dan laju kecepatan reaksi zat di dalam air. Derajat keasaman (pH) air yang baik untuk pertumbuhan lobster air tawar berkisar 6-9,5. Jika angka pH kurang dari 5, akan berpengaruh buruk bagi pertumbuhan lobster air tawar karena dapat menyebabkan kematian. Sementara pH>9 akan menurunkan nafsu makan pada lobster air tawar sehingga pertumbuhannya menjadi lambat (Lukito dan Prayugo, 2007). pH air dan kehadiran karbon dioksida juga berkaitan erat dengan alkalinitas. Pada pH kurang dari 5, alkalinitas dapat mencapai angka 0. Semakin tinggi angka pH air, semakin tinggi pula nilai alkalinitas sedangkan kadar CO2 bebas semakin rendah. Nilai alkalinitas akan menurun jika terjadi pengendapan padatan suspensi dari bahan organik sehingga mengakibatkan peningkatan kandungan CO2 bebas (Lukito dan Prayugo, 2007). Kesadahan merupakan salah satu parameter kualitas air yang diperlukan bagi lobster air tawar. Kesadahan ini ditunjukkan dengan kandungan ion Ca2+ dan Mg2+ serta ion logam polivalen lainnya. Kesadahan juga menggambarkan kandungan garam-garam alkalinitas tanah. Perairan dengan nilai kesadahan kurang dari 50 mg/l CaCO3 masuk dalam perairan tidak sadah (lunak). Air dengan kesadahan tinggi (100-200 mg/l) lebih optimum untuk habitat lobster (Lukito dan Prayugo, 2007).


7

3. Dissolve of oxygen (DO) dan suhu Keberadaan oksigen di dalam air sangat dibutuhkan oleh organisme air. Ketersediaan oksigen di dalam air dipengaruhi oleh suhu, tekanan udara dan adanya tumbuhan air. Semakin tinggi suhu air akan menyebabkan kandungan oksigen yang terlarut menjadi semakin sedikit. Semakin rendah tekanan udara suatu lingkungan, kandungan oksigen di dalam air pun semakin rendah. Lobster air tawar dapat hidup pada selang parameter air yang lebar, diketahui bahwa lobster toleran terhadap kandungan oksigen terlarut sangat rendah. Lobster air tawar memerlukan kadar oksigen terlarut lebih dari 4 ppm untuk dapat bertumbuh dan berkembang (Lukito dan Prayugo, 2007). Lobster air tawar memiliki sifat toleran terhadap suhu dingin bahkan mendekati beku hingga suhu di atas 35°C. Pada kisaran suhu 20-30°C, lobster air tawar mampu bertahan hidup tetapi laju pertumbuhannya lambat. Sementara pada suhu 23-25°C, pertumbuhannya menjadi lambat. Meskipun demikian, lobster air tawar yang hidup di daerah tropis hendaknya dipelihara pada selang suhu 24-30°C(Lukito dan Prayugo, 2007). 4. Sedimen Pada dasarnya sedimen dibagi menjadi dua bagian yaitu dasar dan pematang tambak serta akumulasi sedimen (sludge yang terkumpul selama pemeliharaan). Sedimen terakumulasi merupakan sisa pakan, feses, plankton yang mati, dan erosi. Komponen dari sedimen ini harus dapat dikelola dengan baik sehingga tidak menimbulkan residu bahan organik berlebih yang dapat menimbulkan kerusakan lingkungan budidaya. Keberadaan bahan organik yang


8

berlebih dapat memicu terjadinya kondisi lingkungan yang anaerob (oksigen rendah) sehingga terjadi penurunan mutu lingkungan yang pada akhirnya berdampak pada respon pertumbuhan ternak yang rendah. Faktor-faktor yang mempengaruhi kondisi prima suatu lingkungan budidaya salah satunya adalah keberadaan pakan buatan dan implikasinya bagi media budidaya selama pemeliharaan. Pakan merupakan masukan terbesar yang dapat mempengaruhi akumulasi bahan organik di sedimen dan kualitas air tambak. Akumulasi sisa pakan yang merupakan bahan organik akan menurunkan kualitas lingkungan hidup ternak dengan menyumbang kandungan nitrogen dan fosfor sebagai sumber polutan bagi ternak (Nur, 2011).

B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus) Lobster air tawar crayfish atau sering disebut capit merah merupakan spesies endemik kelompok udang yang hidup di perairan tawar kawasan Queensland, Australia. Ciri-ciri morfologi lobster air tawar capit merah ini tubuh berwarna hijau kemerahan dengan warna dasar bagian atas capit berupa garis merah tajam, terutama pada induk jantan yang telah berumur lebih dari 7 bulan. Lobster air tawar capit merah dapat hidup dan tumbuh pada suhu 21-37°C. Suhu air optimum untuk hidup dan tumbuh lobster ini adalah 23-31°C. Sementara itu, toleransi terhadap kandungan oksigen di dalam air adalah 1 ppm, pH keasaman (6-9,5), dan amonia 1 ppm (Sukmajaya dan Suharjo, 2003). Sistem pencernaan lobster air tawar capit merah terdiri dari mulut, kerongkongan, lambung, usus, dan anus. Pakan yang masuk lobster akan dihancurkan secara mekanik oleh gigi halus yang terletak di permukaan mulut.


9

Di dalam lambung, enzim pencernaan diekskresikan untuk memecah pakan menjadi bentuk yang lebih sederhana. Sisa pencernaan akan diekskresikan melalui anus (Lukito dan Prayugo, 2007). Kebanyakan jenis lobster mengkonsumsi pakan dengan bantuan rangsang kimia (kemoreseptor). Pada saat pakan diberikan, atraktan (asam amino) dari pakan akan dilepas ke air dan dideteksi oleh kemoreseptor yang menyebar di seluruh tubuh lobster sehingga lobster dapat mencapai pakan yang dituju (Nur, 2011). Tabel I. Taksonomi lobster air tawar (Lukito dan Prayugo, 2007) Animalia Kingdom Arthropoda Filum Malacostraca Kelas Decapoda Ordo Parastacidae Famili Cherax Genus Cherax quadricarinatus Spesies

C. Persiapan Pakan Lobster 1. Pakan lobster Pakan merupakan salah satu faktor yang penting dalam masa pembesaran karena pertumbuhan lobster sangat dipengaruhi oleh pakan, dengan pemberian pakan yang benar diharapkan lobster dapat bertumbuh dan berkembang dengan kualitas baik (Bachtiar, 2006). Pakan

merupakan

nutrien

esensial

untuk

proses

pertumbuhan,

pemeliharaan dan penggantian jaringan yang telah rusak, pengaturan beberapa fungsi tubuh, serta mempertahankan kondisi kesehatan. Salah satu prinsip penerapan pakan dalam budidaya adalah program pemberian pakan secara efektif.


10

Hal ini memerlukan pengetahuan tentang kebutuhan nutrien dari ternak yang akan dipelihara, kebiasaan dan tingkah laku makan, serta kemampuan kultivan dalam mencerna dan menggunakan nutrien esensial. Pakan yang diberikan harus mengandung nutrien yang dibutuhkan ternak seperti protein dan asam amino esensial, lemak dan asam lemak, energi, vitamin, serta mineral (Nur, 2011). Pengaturan jumlah pakan dilakukan sesuai dengan nafsu makan, pertumbuhan, dan mortalitas ternak. Jika pakan diberikan terlalu sedikit dapat mengakibatkan pertumbuhan menjadi lambat, bahkan memicu kanibalisme terutama pada pemeliharaan ternak dengan kepadatan tinggi. Jika pemberian pakan diberikan secara berlebih maka akan terjadi penumpukan sisa pakan yang dapat menyebabkan penurunan mutu air. Seberapa besar jumlah pakan yang dikonsumsi oleh ternak dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu : jenis pakan, ukuran ternak, suhu air, cuaca, kualitas air, dan status kesehatan ternak itu sendiri. Perhitungan jumlah pakan harian yang diberikan pada ternak adalah dengan mengalikan total biomas ternak dengan prosentase pakan sesuai dengan berat ternak seperti tercantum pada tabel II (Nur, 2011). Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak (Nur, 2011) Berat udang (g) Pakan tambahan Pakan lengkap 0-3 10%-4% 15%-8% 3-15 4%-2,5% 8%-4% 15-40 2,5%-2% 4%-2%

2. Tetrasiklin HCl Tetrasiklin HCl (TCH) merupakan antibiotik yang dihasilkan oleh jamur Streptomyces aureofasiens dan S. rimosus. Tetrasiklin HCl bersifat bakteriostatik dengan daya jangkauan (spektrum) luas. Tetrasiklin HCl ini menghambat sintesis


11

protein dengancara mengikat sub unit 30 S pada ribosom sel bakteri sehingga bakteri tidak dapat membentuk protein untuk berkembangbiak menjadi banyak (Subronto dan Tjahjati, 2001). Tetrasiklin HCl memiliki rumus molekul C22H24N2O8.HCl dengan berat molekul 480,6 g/mol. Rumus struktur kimianya sebagai berikut:

Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl (Anonim, 1995)

Organoleptis tetrasiklin HCl adalah serbuk hablur, kuning, tidak berbau, agak higroskopis, stabil di udara tetapi pada pemaparan terhadap cahaya matahari yang kuat dalam udara lembab menjadi berwarna gelap. Kelarutan tetrasiklin HCl dalam air, alkali hidroksida dan dalam larutan karbonat sangat tinggi, sukar larut dalam etanol, praktis tidak larut dalam kloroform dan eter. Tetrasiklin HCl membentuk garam dengan ion Na+ dan Cl- sehingga kelarutannya dalam air meningkat (Anonim, 1995).

D. Mikroorganisme Proses penanganan air limbah secara biologi terdiri dari campuran mikroorganisme yang mampu memetabolisme limbah organik. Mikroorganisme yang ditemukan dalam air dan air limbah digolongkan dalam 4 golongan yaitu, virus, organisme prokarotik, organisme eukariotik, dan invertebrata sederhana bersel jamak. Mikroorganisme golongan prokariotik ini menjadi perhatian khusus


12

dalam melihat kondisi air maupun penanganan air limbah. Bakteri merupakan salah satu organisme prokariotik yang cukup penting dalam sistem penanganan air limbah. Dua hal yang menjadi poin dalam air limbah yaitu bakteri patogen dan bakteri yang dapat memetabolisme limbah. Pada umumnya bakteri menggunakan bahan organik seperti protein sebagai sumber energi dan karbon dengan merombak protein menjadi senyawa yang lebih sederhana. Beberapa spesies bakteri mengoksidasi senyawa-senyawa anorganik seperti NH3 untuk energi dan menggunakan CO2 sebagai sumber karbon (Jenie dan Rahayu, 1993). Keragaman mikroba dalam lingkungan habitat air dan air limbah adalah sebagai berikut : Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan (Vaz-Moreira et al.,2014) Lingkungan Genus Acidovorax Mycobacterium Nitrospirae Curvibacter Flavobacterium Spirochaetes Sphingomonas Bacillus Chlamydiae Aeromonas Clostridium Aquificae Acinetobacter Epsilonproteobacteria Thermotogae Habitat air dan Pseudomonas Acidobacteria Fusobacteria Air limbah Legionella Verrucomicrobia Synergistetes Rhodococcus Planctomycete Tenericutes Cyanobacteria Chloroflexi Escherichia Gordonia Gemmatimonadetes Enterococcus Chlorobi

E. Protein Protein merupakan makromolekul kompleks yang tersusun atas asam amino berurutan, saling terikat secara kovalen melalui ikatan peptida. Sebanyak 20 asam amino yang menyusun bentuk protein memiliki sifat yang beragam seperti hidrofobik, hidrofilik, asam, basa ataupun netral. Komposisi kimia asam amino bertanggung jawab penting dalam menyumbang karakteristik dari protein


13

Seperti kereaktifan kimia, muatan ion dan hidrofobisitas. Pada pH rendah, protein yang mengandung lisin maupun arginin akan bermuatan positif sedangkan pada pH rendah kelompok protein yang mengandung aspartat, asam glutamat akan bermuatan negatif. Berdasarkan polaritas dan muatannya, ada 8 asam amino bersifat nonpolar dan hidrofobik, 5 diantaranya memiliki gugus hidrokarbon alifatik (alanin, leusin, isoleusin, valin dan prolin), 2 asam amino memiliki cincin aromatis (fenilalanin dan triptofan) dan 1 asam amino mengandung sulfur (metionin). Asam amino non polar ini memiliki profil kelarutan dalam air yang rendah, berbeda dengan asam amino bersifat polar seperti serin, treonin, tirosin, asparagin dan glutamin, sistein serta glisin. Kelarutan asam amino polar di dalam air sangat tinggi karena terjadinya interaksi asam amino dengan hidrogen dalam air. Asam amino bermuatan negatif pada pH 6,0-7,0 mengandung kelompok karboksil yang bersifat asam yaitu asam amino asam, asam aspartat dan asam glutamat. Pada asam amino basa yang mengandung gugus bermuatan positif pada pH 7,0 yaitu lisin, arginin, dan histidindengan tingkat kebasaan yang lemah. Pada pH 6,0 lebih dari 50% histidin terprotonasi sedangkan pada pH 7,0 kurang dari 10% bermuatan positif (Rosenberg, 2005). Protein memiliki sifat tergantung pada pH, maka untuk melakukan analisis terhadap protein disarankan untuk memperhatikan pH larutan pada saat proses analisis. Dalam melakukan kontrol pH, salah satunya dengan menggunakan buffer atau larutan penyangga, yaitu suatu sistem larutan yang terbuat dari asam maupun basa lemah dengan bentuk garamnya dalam medium air. Langkah isolasi protein dapat dilakukan mulai dari pembuatan sifat protein yang larut dalam suatu


14

pelarut sehingga dapat dilakukan homogenisasi dalam suatu buffer dan pada akhirnya dipisahkan dengan sentrifugasi (Dennison, 2003).

F. Coomasie Brilliant Blue (CBB)

Gambar 2. Struktur CBB R-250 (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011)

Pengukuran protein total merupakan jenis pengukuran dalam supernatan melalui ekstraksi dan klarifikasi dengan sentrifugasi. Kekurangan dari pengukuran protein total ini adalah variasi protein yang beragam. Metode pengukuran paling akurat yaitu analisis protein dengan hidrolisis, mengubah susunan protein menjadi asam amino yang lebih kecil sehingga dapat dihitung total asam amino. Analisis terhadap protein harus bersifat cepat dan sensitif dan tergantung pada interaksi reagen dengan protein (Ahmed, 2004). CBB merupakan suatu metode pewarnaan senyawa protein berdasarkan interaksi struktur CBBterhadap protein sehingga protein dapat terwarnai CBB R merupakan golongan coomassie brilliant dye yang memiliki dasar warna merah kecoklatan-biru. Pada analisis protein dengan jumlah kecil dapat dilakukan dengan menggunakan sistem koloidal pada CBB R-250 dengan sensitivitas yang tinggi (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011). CBB sebagai metode deteksi protein ditemukan oleh Bradford dan menjadi metode analisis kuantitatif yang cepat, mudah dan sensitif daripada


15

metode Lowry. Prinsip dari CBB ini mengadakan interaksi dengan struktur protein. Bentuk muatan positif dari CBB ini akan terjadi lebih banyak dalam kondisi asam dan dapat dideteksi pada panjang gelombang maksimal 470 nm. Sebaliknya, dalam kondisi netral, CBB akan dominan dalam bentuk anion (bermuatan negatif) dan akan mengadakan interaksi dengan struktur protein sehingga dapat dideteksi (Kruger, 1994).

Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB (Georgiou et al., 2008)

CBB mengandung gugus sulfonat yang akan bereaksi dengan rantai samping struktur protein yaitu arginine, lysine, dan histidine. Interaksi yang terjadi mengakibatkan warna dari CBB tereduksi (memudar). Ikatan yang terjadi antara protein dengan dye adalah ikatan ionik, elektrostatik, dan van der Waals. Ikatan van der Waals merupakan ikatan yang paling dominan terjadi dalam pewarnaan (Otlets, 2005). G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif Spektrofotometri sinar tampak merupakan metode pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar tampak (visible) yang diabsorbsi oleh suatu zat. Sinar tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi pada rentang panjang gelombang 400-800 nm dan dideteksi dalam bentuk absorbansi (Dachriyanus, 2004).


16

Metode spektrofotometri derivatif atau metode kurva turunan adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk analisis multikomponen secara langsung tanpa harus melakukan pemisahan terlebih dahulu walaupun dengan panjang gelombang yang berdekatan. Keuntungan dari metode spektrofotometri derivatif

adalah

spektrum

derivatif

yang

memungkinkan

menganalisis

multikomponen dalam campuran yang spektranya saling tumpang tindih. Spektrum derivatif memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum serapan dan gambaran ini makin jelas dari spektra derivatif pertama ke derivatif keempat sehingga dapat dilakukan analisis kuantitatif suatu komponen dalam campuran dengan bahan yang panjang gelombangnya saling berdekatan (Nurhidayati, 2007).

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu metode analisis kuantitatif dengan cara memisahkan dan menganalisis analit dari komponen lain dalam matriks sampel dengan bantuan kolom sebagai fase diam dan liquid sebagai fase gerak (Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010). Sistem HPLC dimulai dari sampel dimasukan ke dalam tempat injeksi yang menuju ke kolom kromatografi. Fase gerak menuju kolom dengan bantuan pompa, zat-zat terlarut akan terpisah karena adanya interaksi yang bebeda antara komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam di dalam kolom. Zatzat terlarut yang sudah terpisah akan meninggalkan kolom dan terdeteksi oleh detektor. Hasil yang diperoleh dari proses tersebut adalah kromatogram yang


17

terdiri dari signal detektor dan waktu. Fase gerak biasanya terdiri dari beberapa campuran pelarut sehingga memiliki daya elusi dan resolusi yang diinginkan. Daya elusi dan resolusi tersebut ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-komponen sampel (Snyder et al., 2010). Fase gerak yang digunakan pada HPLC fase terbalik (HPLC-RP) adalah fase gerak yang bersifat polar, contohnya campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril atau campuran metanol dengan asetonitril (Gandjar dan Rohman, 2007). Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan fase gerak, yaitu polaritas, kelarutan analit, stabilitas, pH dan kompatibilitas antar pelarut. Selain itu, fase gerak dapat tercampur dengan baik dan tidak terdapat endapan apabila terdiri dari campuran beberapa pelarut (Kazakevich dan Lobrutto, 2007). Kolom merupakan bagian yang sangat penting dalam pemisahan komponen-komponen sampel yang terdapat di dalamnya. Oktadesilsilan (C18) dan oktil silica (C8) merupakan fase diam yag paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007). I. Validasi Metode Analisis Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2006). Validasi metode analisis merupakan prosedur yang digunakan untuk menunjukan bahwa


18

metode analisis yang digunakan untuk kuantifikasi analit dalam matriks bersifat reliable dan reprodusibel untuk mencapai tujuannya (Chan, Lam, Lee, dan Zhang, 2004).

1. Akurasi Akurasi adalah suatu prosedur analisis untuk melihat kedekatan antara nilai terukur atau nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya (Ermer dan Miller, 2005). Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali yang ditentukan dengan melakukan spiking ataupun dengan cara metode penambahan baku (standard addition method) (Gandjar dan Rohman, 2007). Dalam bioanalisis, nilai akurasi dapat dinyatakan dalam % Difference (%D) yaitu perbandingan antara selisih nilai konsentrasi awal dan terukur dengan nilai konsentrasi awal. Kriteria terpenuhi jika %D dibawah 20% (Anonim, 2013).

2. Presisi Presisi adalah prosedur analisis untuk melihat derajat kesesuaian hasil uji individual dari beberapa penginjeksian suatu seri baku. Presisi diukur sebagai persen Relative Standard Deviation (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007). Nilai RSD yang diperbolehkan adalah kurang dari 20% (Anonim, 2013). 3. Linieritas Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasilhasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan (Gandjar dan Rohman, 2007). Suatu metode dikatakan memiliki


19

linieritas yang baik jika nilai koefisien korelasri (r) > 0,99 atau r2 >0,997 (Chan et al., 2004). Pada sumber lain mengatakan bahwa nilai koefisien korelasi (r2) yang baik adalah lebih tinggi dari 0,995 (Anonim, 2013).

4. Selektivitas Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur dan membedakan dengan akurat respon analit dengan seluruh komponen sampel yag mungkin ada dalam matriks sampel (Chan et a.l, 2004).

5. Kriteria validasi Kriteria validasi untuk bioanalisis meliputi akurasi, presisi, LOQ, dan linearitas serta pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi (Anonim, 2013).

J.

Landasan Teori

Lobster air tawar merupakan golongan Crustaceae yang hidup di air tawar dan kemampuannya untuk bertahan hidup lebih besar daripada udang air payau maupun air laut. Ketersediaan protein dan kondisi habitat lobster sangat mempengaruhi pertumbuhan lobster. Salah satu masalah dalam budidaya lobster adalah penurunan produktivitas lobster karena penyakit oleh mikroba patogen seperti Vibrio spp. Penggunaan antibiotik dalam pakan lobster dilakukan untuk mencegah perkembangan mikroba patogen yang menyebabkan penyakit sehingga kelangsungan hidup lobster lebih panjang tetapi terjadi kasus akumulasi antibiotik dalam tubuh lobster seperti kloramfenikol.


20

Selain mikroba patogen, yang tumbuh dalam media air adalah mikroba normal air. Keberadaan mikroba normal air berkontribusi baik dalam penanganan limbah atau penumpukkan bahan organik dalam air sehingga kualitas air terjaga. Tetrasiklin merupakan senyawa antimikroba dengan spektrum luas, yaitu dapat menghambat pertumbuhan beragam jenis mikroba yang ada di alam, baik mikroba patogen maupun mikroba normal air.Jumlah mikroba normal maupun patogen ditentukan dengan melihat populasi mikroba dalam air. Mikroba dapat merombak bahan organik seperti protein menjadi senyawa lebih sederhana. Penambahan populasi mikroba akan menanggulangi bahan organik yang ada di habitat lobster sehingga kualitas air terjaga. Analisis kandungan protein dilakukan dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif. Metode CBB ini menggunakan reagen coomassie brilliant blue dengan mekanisme pembentukkan warna terhadap protein primer. Protein akan berinteraksi dengan reagen sehingga larutan protein menjadi berwarna, hal ini menunjukkan banyaknya ikatan peptida yang terjadi. Metode spektrofotometri sinar tampak ini digunakan untuk melihat absorbansi kompleks protein berwarna dengan interval panjang gelombang cahaya visible (400-800 nm). Adanya kandungan antibiotik seperti tetrasiklin dalam akuakultur dapat menyebabkan akumulasi dalam tubuh lobster. Untuk melihat pengaruh tersebut dilakukan analisis jumlah tetrasiklin dalam daging lobster dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Validasi yang dilakukan meliputi pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi, linearitas, akurasi dan


21

presisi serta sensitivitas. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik padajumlah populasi mikroba air,kadar protein sedimen, laju pertumbuhan lobster, dan adanya kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging dilakukan perbandingan antara perlakuan dan kontrol yang diplotkan dalam grafik versus hari perlakuan.

K. Hipotesis 1. Pakan berantibiotik menyebabkan penurunan jumlah populasi mikroba dalam habitat air lobster air tawar. 2. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan kadar protein dalam sedimen lobster air tawar. 3. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan laju pertumbuhan lobster air tawar. 4. Terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)” merupakan penelitian eksperimental murni dengan membandingkan kurva hubungan lama perlakuan dengan respon antara kelompok kontrol dan perlakuan untuk melihat pengaruh yang disebabkan oleh tetrasiklin dalam pakan terhadap kualitas habitat dan laju pertumbuhan lobster air tawar.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian a.

Variabel utama 1) Variabel bebas : lama pemberian pakan berantibiotik 2) Variabel tergantung : jumlah populasi mikroba dalam air, jumlah protein dalam sedimen, panjang lobster, berat lobster dan jumlah TCH dalam daging lobster

b.

Variabel pengacau 1) Variabel terkendali : volume air, cahaya matahari, kandungan klor, kesadahan air, pH air dan oksigen terlarut dalam air. 2) Variabel tidak terkendali : lobster mati. 22


23

2. Definisi Operasional a. Pakan berantibiotik merupakan pakan lobster yang telah dimodifikasi dengan menambahkan tetrasiklin HCl ke dalam sediaan pakan. b. Lobster air tawarcrayfish (Cherax quadricarinatus) merupakan hewan golongan Crustaceae yang hidup di perairan tawar dan dalam penelitian digunakan sebagai hewan uji dengan kriteria yang ditentukan. c. Rumah lobster merupakan pipa yang disusun dan diikat berjajar dan digunakan sebagai tempat perlindungan untuk lobster, dibuat dari pipa dengan panjang 6 cm dan diameter 2,5 cm sebanyak 8 pipa.. d. Aerasi merupakan sistem sirkulasi udara dari luar ke dalam air dengan bantuan alat pompa elektrik dan selang. e. Budidaya permodelan merupakan metode budidaya lobster dengan merekayasa pembiakan yaitu memberikan sedimen dan rumah lobster serta aerasi yang cukup sebagai tempat hidup lobster. f. Sedimen merupakan suatu masa padat yang berasal dari sisa pakan maupun hasil ekskresi dari lobster air tawar crayfish yang mengendap di dasar akuarium. g. Kelompok kontrol merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan pakan tanpa antibiotik. h. Kelompok perlakuan merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan pakan berantibiotik.


24

i. Panjang dan berat lobster merupakan parameter yang diukur pertumbuhan lobster, diukur dari kepala hingga ekor (panjang). j. Populasi mikroba merupakan jumlah koloni mikroba yang ditentukan dalam satuan cfu/cm2. C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sedimen lobster air tawar, pakan lobster merek Bintang®, standar tetrasiklinHCl (kualitas p.a, China), antibiotik tetrasiklin HCl merek Tetrasanbe®, lobster air tawar jenis crayfish (Cherax quadricarinatus), air sumur dengan kriteria (kesadahan 53 ppm, oksigen terlarut 7-8 ppm, suhu 25,5°C, pH 6), reagen coomasie brilliant blue R-250 (kualitas p.a, Germany), phosphate buffer saline (PBS) pH 7 (NaCl, KCl, Na2HPO4, dan K2HPO4), metanol (grade HPLC), etanol (kualitas p.a), akuabides, NaOH (kualitas p.a), HCl (kualitas p.a), standar bouvine serum albumine (kualitas p.a, Germany), daging lobster air tawar jenis crayfish, buffer McIlvainepH 4 (7,71 ml larutan Na2HPO4 0,2 N dalam 12,29 ml asam sitrat0,1 N), asetonitril (grade HPLC). D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium (panjang 60 cm, lebar 30 cm dan tinggi 50 cm), kincir air atau aerator merek Amara®, fan, DO meter (pengukur dissolve oxygen), rumah lobster (pipa bertingkat), spuit, alat-alat gelas (Pyrex, Germany), mistar merek Ziegel®, timbangan analitik merek OHAUS® (e=1 mg), batang pengaduk, pipet tetes, pipet volume, micropipette,


25

macropipette, flakon, pompa vacuum, corong Buchner, labu hisap, pH stick universal, cawan porselen, stamper, mortir, kertas saring, oven, vortex, centrifuge, milipore, degasser, spectrophotometer Visible SHIMADZU (UV-1800), rotary evaporator, High Performance Liquid Chromatography merek SHIMADZU (kolom C18). E. Tata Cara Penelitian 1. Tahap preparasi lobster dan habitat a. Persiapan alat dan bahan Sebanyak 12 buah akuarium (60 x 30 x 50 cm) disiapkan dalam tempat terhindar dari cahaya. Lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus didapatkan dari peternak lobster Godean Yogyakarta dengan kriteria usia 3 bulan, panjang 5-5,5 cm dan berat 3-3,5 gram. Sedimen didapatkan dari peternak lobster air tawar Godean Yogyakarta. b. Determinasi lobster Lobster air tawar yang digunakan sebagai hewan uji dideterminasi oleh Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan menggunakan sumber determinasi berjudul Cherax quadricarinatus oleh Jones dan Wingfield, The Freshwater and Land Crayfishes of Australia oleh Clark dan The Australian Freshwater Crayfish (Crustaceae:Decapoda:Parasticidae) with Descriptions of New Species oleh Riek.


26

c. Preparasi habitat lobster Sedimen yang terkumpul dihomogenkan dan ditimbang sebanyak 100 gram, lalu dimasukkan dalam akuarium dan diisi air sumur setinggi 10 cm dari dasar akuarium(setara 14 liter). Rumah lobster dan aerator dimasukkan dalam akuarium (1 rumah dan aerator/akuarium). Lobster air tawar dimasukkan dalam akuarium (15 ekor/akuarium). Media ini selanjutnya digunakan untuk pemeliharaan lobster.

2. Tahap preparasi pakan lobster a. Penetapan kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam kapsul Tetrasanbe® 1) Pembuatan stok standar TCH 1 mg/ml Sebanyak 100 mg standar TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml ditambahkan akuabides hingga batas tanda. 2) Validasi metode Pembuatan seri baku TCH 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; dan 0,5 mg/ml.. Larutan stok standar TCH 1 mg/ml dibuat seri, diambil 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; dan 5,0 ml dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda. Lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel dan dibuat persamaan regresi linear dan nilai r (linearitas). Selain itu dilakukan penetapan akurasi dengan melihat %D, sensitivitas LOD dan LOQ, serta presisi didapat dari sampel yang direplikasi 3 kali lalu dicari %RSD.


27

3) Preparasi sampel kapsul Sebanyak 10 kapsul TCH 500 mg dibuka dan dikeluarkan serbuknya, ditimbang kemudian digerus dan dihomogenkan dalam mortir. Sebanyak 25 mg sampel TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda. 4) Penetapan kadar TCH dengan spektrofotometri uv Blanko dibuat dari seluruh pelarut yang digunakan tanpa zat analit. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap spektrofotometri

uv.

Sampel

dideteksi

absorbansi

dengan

spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel. b. Optimasi dosis TCH Sebanyak 4 akuarium kosong (A, B, C, D) disiapkan. Sedimen sebagai habitat awal lobster ditimbang masing-masing sebanyak 100 gram. Sedimen dimasukkan dalam akuarium dan diberi air yang telah disesuaikan dengan luas akuarium setinggi 10 cm dari dasar akuarium (setara dengan 14 liter), kemudian diaduk hingga homogen. Kincir air (aerator) dimasukkan ke dalam akuarium dan diaktifkan. TCH sebanyak 2,25 gram; 4,5 gram; dan 9 gram dimasukkan ke dalam akuarium B, C, dan D secara berurutan, ditunggu selama 1 hari. Setelah 1 hari dilakukan sampling pada pukul 06.00 WIB dan dilakukan pengecekan jumlah


28

populasi mikroba oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu). c. Pembuatan dan pola pemberian pakan berantibiotik 1) Pembuatan pakan berantibiotik Berdasarkan prosentase pakan lengkap dengan berat udang 3-15 gram maka diberikan adalah 8-4%. Sesuai dengan berat lobster, digunakan prosentase sebesar 4% sehingga jumlah pakan lobster diberikan sebanyak 1,8 gram/hari. Selanjutnya jumlah pakan ini digunakan untuk membuat dosis pakan selama 5 hari. Sebanyak 0,2025 gram TCH ditimbang dan dilarutkan dalam akuabides sebanyak 25 ml dalam labu takar. Sebanyak 45 gram pakan lobster dilakukan penyemprotan dengan larutan TCH secara merata. Setelah penyemprotan, pelet pakan lobster dikering udarakan hingga kering (± 3jam) dengan menggunakan fan, dihindarkan dari cahaya. 2) Frekuensi pemberian pakan Pakan mengandung tetrasiklin diberikan pada lobster 3 kali sehari yaitu pada pagi hari 0,45 gram (25%), sore hari 0,45 gram (25%) dan malam hari 0,9 gram (50%).

3. Tahap persiapankelompok kontrol dan kelompok perlakuan a.

Pembuatan kelompok kontrol Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari) dan 5 akuarium perlakuan pemberian pakan biasa (tanpa tetrasiklin)


29

dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari. b.

Pembuatan kelompok perlakuan Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari) dan 5 perlakuan pemberian pakan berantibiotik dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan berantibiotik dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari.

4. Tahap preparasi analit a. Ekstraksi protein dalam sedimen Proses ekstraksi pada penelitian ini mengacu pada penelitian oleh Mayer, Schick, dan Setchell (1986). Sedimen kering ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml. Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu ditunggu selama 2 jam (OT) pada suhu 60oC di dalam oven. Setelah OT, campuran disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml dan pH dinetralkan dengan HCl 2,5 N hingga pH 7-8, lalu dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dideteksi absorbansinya dengan menggunakan metode CBB dan spektrofotometer sinar tampak derivatif.


30

b. Ekstraksi tetrasiklin dalam daging lobster 1)

Preparasi sampel ekstrak daging Lobster pada perlakuan hari ke 14 (13,12 gram) dan 28 (9,02 gram) diambil daging pada abdomen dan dibersihkan dari cangkang kulit lobster. Daging dihaluskan menggunakan mortir dan ditimbang. Daging halus dimasukkan dalam campuran HCl dan akuabides dengan perbandingan 1 : 1 sebanyak 40 ml. Sampel ditutup dan disimpan dalam suhu rendah dan terhindar dari cahaya matahari.

2)

Ekstraksi tetrasiklin Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan 3 ml asetonitril; 1,5 ml buffer McIlvaine; 1 ml NaOH (pH 4) kemudian divortex dan dievaporasi hingga asetonitril menguap seluruhnya (2 jam). Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer McIlvaine hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dipreparasi untuk deteksi dengan metode HPLC.

5.

Tahap persiapan metode penetapan kadar a. Metode penetapan kadar protein dalam sedimen Kadar protein dalam sedimen ditetapkan dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang dikembangkan oleh Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini.


31

b. Metode penetapan kadar tetrasiklin 1) Orientasi panjang gelombang tetrasiklin Standar tetrasiklin HCl (TCH) ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan dalam HCl : akuabides (1:1) ditambahkan hingga tanda batas dalam labu takar 10 ml. Larutan TCH sebanyak 0,5 ml diekstraksi. Kemudian hasil ekstraksi disaring dengan milipore dan dilakukan degassing lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv dengan interval panjang gelombang 200-400 nm. 2) Penentuan puncak tetrasiklin a) Pembuatan larutan blangko Larutan HCl : akuabides (1:1) disiapkan sebanyak 5 ml, diambil 0,5 ml lalu diberi perlakuan ekstraksi sama seperti perlakuan sampel. b) Pembuatan larutan standar TCH Larutan TCH 0,2 ppm dalam asetonitril : buffer McIlvaine disiapkan dan dideteksi dengan menggunakan HPLC. c) Pembuatan larutan standarTC Larutan standar TCH dalam HCl : akuabides disiapkan dan diekstraksi hingga didapat konsentrasi 0,2 ppm dan dideteksi dengan menggunakan HPLC. 3) Optimasi fase gerak HPLC a) Kondisi HPLC


32

(1) Fase diam : kolom C18 (oktadesil silika) (2) Detektor : uv-sinar tampak (3) Fase gerak : (a) Asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4) 50:50% (b) Metahol : buffer McIlvaine (pH 4; asam sitrat dan natrium bifosfat) 50:50% (4) Panjang gelombang : 270 nm (hasil orientasi) (5) Flow rate : 0,5 ml/menit b) Pembuatan fase gerak (1) Pembuatan metanol : buffer McIlvaine (pH 4) Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran metanol dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50% v/v. Metanol dan buffer McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. (2) Pembuatan asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4) Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran asetonitril dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50% v/v. Asetonitril dan buffer


33

McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. c) Persiapan instrumen HPLC Kolom HPLC dicuci dengan menggunakan metanol (HPLC grade) selama 1 jam kemudian dilakukan conditioning dengan fase gerak selama 1 jam dan dicek baseline hingga kolom siap digunakan. Vial berisi standar TCH 20 ppm dimasukkan dalam tray dan dicek AUC menggunakan HPLC detektor UV dengan waktu elusi 13 menit.

6.

Tahap validasi metode penetapan kadar a. Validasi spektrofotometri sinar tampak derivatif 1) Linearitas a) Pembuatan stok albumin (BSA) 40 mg/ml Sebanyak 2 gram albumin (BSA) dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas. b) Pembuatan seri baku albumin (BSA) Sebanyak 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 µl dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS


34

hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00; 2,40; 2,80; 3,40; 3,60; dan 4,00 mg/ml. c) Analisis dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada 400800 nm. d) Pembuatan kurva baku solven Hasil spektrum yang keluar setiap seri baku dilakukan derivatisasi kedua. Setiap konsentrasi pada hasil spektrum derivatisasi diplotkan dan dicari nilai r dari persamaan regresi liniernya. 2)

Pembuatan kurva adisi Sedimen ditimbang masing-masing 0,2 gram dimasukkan dalam flakon (A, B, C, D, E, F) ditambahkan albumin 10, 30, 50, 70, dan 90 mg dalam flakon (B, C, D, E, F) secara berurutan. Kemudian dilakukan preparasi dan ekstraksi sesuai dengan sampel sedimen lalu dilakukan pengecekan tinggi derivat dengan menggunakan CBB dan spektrofotometri sinar tampak derivatif.


3)

35

Akurasi Akurasi dinyatakan dalam bentuk %D dari kurva adisi. Nilai %D yang baik adalah kurang dari 20%

4) Presisi Presisi didapatkan dari kurva adisi yang direplikasi sebanyak 3 kali dan dihitung %RSD. Nilai %RSD yang baik adalah kurang dari 20% 5) Limit Of Quantification (LOQ) LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SD/slope b. Validasi metode HPLC 1) Linearitas a) Pembuatan stok tetrasiklinHCl (TCH) 500 ppm Sebanyak 5 mg TCH dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan HCl : akuabides (1:1) hingga tanda batas. b) Pembuatan seri TC Seri konsentrasi TC dibuat 2, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, dan 120 ppm. Sebanyak 20, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 960 dan 1200 µl dari stok TCH (500 ppm) dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan HCl : akuabides hingga tanda batas. Tiap seri baku diambil 0,5 ml dan diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer hingga tanda batas.


36

c) Analisis dengan HPLC Setiap seri baku dimasukkan dalam vial HPLC. Sampel dicek dengan menggunakan HPLCdengan kondisi optimasi. d) Pembuatan kurva baku solven Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri baku diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a. 2) Pembuatan kurva adisi a) Pembuatan seri TC Daging

lobster

bebas

tetrasiklin

dihaluskan

dengan

menggunakan mortar dan stamper. Daging ditimbang masingmasing 1 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E. Sebanyak 20, 100, 300, 700, 1000 µl dari stok TCH 500 ppm dimasukkan dalam flakon B, C, D , E. HCl : akuabides (1:1) ditambahkan sebanyak 4980 (A), 4900 (B), 4700(C), 4300(D), 4000(E) µl dengan micropipette ke dalam flakon. b) Analisis tetrasiklindengan HPLC Masing-masing seri baku (A,B,C,D,E) dalam flakon divortex selama 3 menit lalu ditambahkan NaCL 0,1 g dan dilakukan sentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatant sampel A,B,C,D,E diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon lalu diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar


37

5 ml ditambahkan buffer hingga batas tanda. Larutan disaring dengan milipore dan dilakukan degassing untuk diinjeksikan ke HPLC. c) Pembuatan kurva adisi Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri adisi diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a. Kurva adisi dibandingkan dengan kurva baku solven. 3) Akurasi Akurasi didapatkan dari perhitungan %D kurva adisi. 4) Presisi Presisi didapat dari perhitungan %RSD 3 replikasi kurva adisi. 5) Selektivitas Selektivitas dilihat dari nilai resolusi pada pengecekan AUC kurva adisi. 6) Limit Of Quantification (LOQ) LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SD/slope 7.

Analisis sampel a.

Analisis kuantitatif jumlah populasi mikroba pada sampel air 1) Preparasi sampel air kelompok kontrol dan kelompok perlakuan a) Sampling air dilakuakan pada pukul 06.00 WIB. Air dalam akuarium diaduk hingga homogen dan ditunggu selama 5 menit


38

hingga partikel sedimen mengendap kemudian dilakukan pengambilan air, 2 cm diatas sedimen secara random dengan spuit yang telah dimodifikasi (100 ml), dimasukkan dalam botol steril yang disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. b) Penetapan jumlah populasi mikroba dilakukan oleh Bagian Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan colony counter. b.

Analisis kuantitatif protein pada sampel sedimen 1) Preparasi NaOH 0,1 N dan HCl 2,5 N NaOH (kualitas p.a) ditimbang sebanyak 0,4 gram, ditambahkan akuabides dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. HCl (kualitas p.a) diambil 2,083 ml diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 10 ml hingga batas tanda. 2) Preparasi phosphate buffer saline(PBS) Sebanyak 4 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,72 gram Na2HPO4, dan 0,12 gram KH2PO4 ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 500 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas. 3) Preparasi reagen coomasie brilliant blue Sebanyak 10 mg CBB ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml PBS dan 10 ml etanol, disebut campuran A. Sebanyak 3 ml campuran A


39

dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 8 ml PBS dan 3,75 ml etanol kemudian ditambahkan akuabides hingga tanda batas. 4) Preparasi protein dalam sedimen Air

akuarium

didekantir

dan

sedimen

diambil

seluruhnya,

dimasukkan dalam botol sampel. Sedimen disaring menggunakan corong Buchner dan pompa vacuum hingga kering. Sedimen kering dimasukkan dalam mortir dan digerus dengan stamper hingga homogen. Sedimen ditimbang sebanyak 0,2 gram dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml dengan menggunakan makropipet. Campuran diaduk dan divortex hingga homogen lalu dimasukkan dalam oven dengan suhu 600C, ditunggu selama 2 jam. Setelah 2 jam, dikeluarkan dari oven dan disentrifuge dengan kecepatan putar 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml ditambahkan HCl 2,5 N hingga pH 7-8 kemudian dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan PBS hingga tanda batas. 5) Analisis kuantitatif protein Blanko dibuat dari seluruh pelarut dan reagen yang digunakan tanpa ada sampel. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap spektrofotometer sinar tampak. Sampel dalam labu takar diambil sebanyak 1 ml dimasukkan dalam labu takar 5 ml. Reagen CBB ditambahkan dalam labu takar hingga tanda batas dan


40

dilakukan operating time hingga 15 menit. Setelah 15 menit, campuran dimasukkan dalam kuvet dan dicek absorbansi dengan spektrofotometer sinar tampakpada spektrum 400-800 nm. Spektra yang keluar diderivatisasi level kedua kemudian dilakukan pengukuran tinggi puncak derivat. c.

Pengukuran panjang dan berat lobster Lobster yang ada dalam akuarium dikeluarkan seluruhnya dan ditimbang berat serta diukur panjangnya. Pengukuran berat dengan menggunakan timbangan analitik dan pengukuran panjang dengan mengukur dari ujung kepala sampai ekor. Kelompok kontrol dan perlakuan dibandingkan nilai slope dari kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang dan berat lobster hari ke 0.

d.

Analisis kuantitatif tetrasiklin dalam daging lobster Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil 0,5 ml dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan asetonitril sebanyak 1,5 ml kemudian ditambahkan 1,5 ml buffer McIlvaine (pH 4). pH campuran dinaikkan dengan menggunakan NaOH 2,5 N sebanyak 1 ml lalu ditambahkan asetonitril 1,5 ml. Campuran dievaporasi dengan rotary evaporator dengan suhu 40oC selama 2 jam. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas, lalu disaring dengan


41

milipore dan dilakukan degassing selama 5 menit lalu dimasukkan dalam vial. Sampel dideteksi dengan HPLC.

F. Analisis Hasil 1. Validasi metode spektrofotometri uv a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari absorbansi tetrasiklin HCl dari data penentuan kurva baku dalam regresi linear. b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus : %D = (C terhitung – C diketahui) / C terhitung x 100% c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : %RSD = SD / rata-rata x 100% d. Sensitivitas. Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung LOD dicari dengan rumus 3,3 x SD/slope dan LOQ dengan 10 x SD/slope.

2. Validasi metodespektrofotometri sinar tampak derivatif a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari tinggi derivat spektrum protein (BSA) dari data penentuan kurva baku dalam regresi linear. b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus : % D = [C diketahui – C terhitung] / C diketahui x 100% c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : %RSD = SD / rata-rata x 100%


d. Sensitivitas.

Sensitivitas

dapat

dicari

dengan

menghitung

42

LOQ

(konsentrasi terkecil kurva adisi yang masih bisa terkuantifikasi baik).

3. Validasi metode HPLC a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari data AUC penentuan kurva baku ke dalam regresi linear. b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus : %D = [C diketahui-C terhitung] / C diketahui x 100%. c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : %RSD = SD / rata-rata x 100%. d. Sensitivitas. Sensitivitas dicari dengan menghitung LOQ (konsentrasi terkecil pada kurva adisi yang masih dapat terkuantifikasi baik).

4. Analisis jumlah populasi mikroba air a. Evaluasi hasil. Hasil uji jumlah populasi mikroba (cfu/cm2) dikelurkan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Evaluasi hasil didapat dari perbandingan kurva hari perlakuan versus log jumlah populasi mikroba kelompok kontrol dan log jumlah populasi mikroba kelompok

perlakuan.

dibandingkan.

Kurva

kelompok

kontrol

dan

perlakuan


No

1 2 3 4 5 6

Hari

Jumlah populasi mikroba Kontrol (K)

Jumlah populasi mikroba Perlakuan (P)

cfu/cm2

cfu/cm2

43

0 3 5 7 14 28

5. Analisis protein dengan metode CBB dan spektrofotometri sinar tampak derivatif a. Hitung kadar protein. Kadar protein dihitung dengan memasukkan respon tinggi derivat dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi dalam gram sedimen. b. Evaluasi hasil. Evaluasi hasil didapat dari perbandingan kurva hari perlakuan versus selisih kadar protein kelompok (kontrol dan perlakuan) dan kadar protein hari ke 0. Slope dari kurva kelompok kontrol dan perlakuan dicari dan dibandingkan.

6. Penentuan panjang dan berat lobster (pertumbuhan lobster) a. Panjang lobster. Data panjang lobster diolah dengan membandingkan slope kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok (kontrol dan perlakuan) dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari dan dilakukan perbandingan.


No

Hari

1 2 3 4 5 6

0 3 5 7 14 28

Panjang Lobster Kontrol (K) Cm

Panjang Lobster Perlakuan (P) Cm

44

Selisih Dengan Hari ke 0 K P

b. Berat lobster. Data berat lobster diolah dengan membandingkan slope kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok (kontrol dan perlakuan) dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari dan dilakukan perbandingan.

No

Hari

1 2 3 4 5 6

0 3 5 7 14 28

Berat Lobster Kontrol (K) Gram

Berat Lobster Perlakuan (P) Gram

Selisih Dengan Hari ke 0 K P

7. Penetapan kadar tetrasiklin dalam daging Kadar tetrasiklin dihitung dengan memasukkan respon AUC dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi awal dalam daging.

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 45

G. Rancangan Penelitian


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh tetrasiklin (antibiotik) dalam pakan terhadap perkembangan lobster air tawar dalam habitat hidup lobster dibandingkan dengan kontrol dalam jangka waktu tertentu. Ada empat parameter yang diteliti dalam penelitian ini, meliputi jumlah populasi mikroba dalam air, kandungan protein dalam sedimen, panjang dan berat lobster serta penetapan kadar tetrasiklin dalam daging lobster sebagai indikator adanya akumulasi. Penelitian ini diawali dengan persiapan habitat dan pakan serta pembagian kelompok lobster.

A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar Dalam penelitian ini digunakanbudidaya permodelan yaitu dengan melakukan modifikasi terhadap model pembiakan semi intensif, meliputi pemberian sedimen dalam habitat, pemberian perlindungan (rumah lobster) dan tidak ada penggantian air selama perlakuan. Alat dan bahan yang dibutuhkan untuk persiapan habitat adalah sedimen, air, rumah lobster, dan aerator. Sedimen berasal dari sisa pakan maupun hasil ekskresi lobster air tawar crayfish yang mengendap sehingga habitat yang dibuat menyerupai habitat di alam. Dalam pemeliharan lobster air tawar crayfish ini diperlukan media yang layak untuk tumbuh kembangnya, seperti kesadahan, ketersediaan oksigen, derajat keasaman, suhu dan kandungan kimia dalam air. Menurut Lukito dan Prayugo (2007), lobster air tawar crayfish dapat hidup dalam air dengan kondisi kesadahan 50 mg/L 46


47

CaCO3, kadar oksigen terlarut air sumur >4 ppm, suhuberkisar antara 25-29°C dan derajat keasamaan berkisar antara 6-9,5. Air yang digunakan dalam budidaya lobster air tawar crayfish ini merupakan air sumur yang sudah memenuhi kriteria kualitas air sehingga selanjutnya digunakan sebagai media pemeliharan selama perlakuan. Tindakan kontrol terhadap kondisi air tetap dilakukan seperti aerasi dan pencegahan paparan sinar matahari dengan tujuan menjaga ketersediaan oksigen dalam media pemeliharaan selama proses perlakuan dan mencegah rusaknya struktur tetrasiklin akibat sinar matahari. Lobster yang digunakan dideterminasi oleh Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada dan dinyatakan sebagai lobster air tawar jenis crayfish (Cherax quadricarinatus).

B. Tahap Persiapan Pakan Lobster Pakan yang digunakan merupakan pakan jadi dengan penambahan senyawa tetrasiklin HCl sebagai pencegah penyakit pada lobster. Tetrasiklin HCl yang digunakan adalah tetrasiklin dengan kualitas teknis sehingga perlu dilakukan penetapan kadar tetrasiklin HCl terlebih dahulu agar diketahui kadarnya. Selain itu, untuk mendapatkan daya penghambatan pertumbuhan mikroba yang optimal, maka dilakukan optimasi terhadap dosis tetrasiklin HCl yang digunakan.

1. Validasi dan analisis kadartetrasiklinHCl (TCH) dalam sediaan kapsul Penetapan kadar TCH dalam kapsul dilakukandengan menggunakan metode spektrofotometri uv. Sebelum dilakukan penetapan kadar TCH maka perlu dilakukan validasi terhadap metode yang digunakan meliputi linearitas, akurasi,


48

presisi, LOD dan LOQ. Berdasarkan ketentuan FDA (2013), metode penetapan kadar senyawa tunggal yang baik memiliki kriteria linearitas (r2>0,995), akurasi (%D <20%), dan presisi (%RSD <20%). Sesuai tabel hasil validasi metode penetapan kadar senyawa tunggal TCH dalam sampel kapsul, metode ini memenuhi kriteria. Tabel IV. Hasil validasi penetapan kadar TCH dalam kapsul Parameter Hasil 0,15-0,5 mg/ml, r2 =0,9953, Linearitas y = 1,5176x + 0,0668 Akurasi (%D) 0,6326% Presisi (%RSD) 6,2821% LOD 0,0321 mg/ml LOQ 0,0972 mg/ml

Analisis kadar TCH dalam kapsul dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri uv pada panjang gelombang maksimum 276 nm. Kadar TCH yang didapat adalah sebesar 94,1357% b/b. Farmakope Indonesia (1995) menyatakan bahwa kadar TCH dalam kapsul yang dapat diterima adalah kadar dalam interval 90-125%, maka kapsul TCH dapat digunakan untuk perlakuan dalam penelitian ini.

2. Optimasi dosis TCH Dosis TCH yang digunakan untuk perlakuan sebesar 4,5 g/kg pakan kering (Johnson, 2010) dan dilakukan optimasi dosis TCH sebesar 2,25 g/kg; 4,5 g/kg; dan 9,0 g/kg pakan. Dosis yang paling efektif yaitu dosis yang memberikan jumlah populasi mikroba paling kecil, ditetapkan dengan melihat jumlah koloni mikroba yang tumbuh (cfu/cm2) dalam air habitat lobster yang diberi perlakuan antibiotik. Antibiotik merupakan senyawa kimia yang memiliki aktivitas


49

menghambat pertumbuhan mikroba sehingga dengan melihat jumlah populasi mikroba dalam air, dapat ditentukan dosis antibiotik yang menghambat pertumbuhan mikroba paling efektif. Tabel V. Jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis TCH Perlakuan Jumlah populasi mikroba (cfu/cm2) Tanpa tetrasiklin 2,4 x 103 2,25 g/kg 4,8 x 105 4,5 g/kg 25 9,0 g/kg 2,3 x 103

Sesuai dengan hasil jumlah populasi mikroba pada sampel air, dipilih dosis TCH paling efektif adalah 4,5 g/kg pakan dengan jumlah populasi mikroba paling kecil yaitu 25 cfu/cm2.

3. Pembuatan dan pemberian perlakuan pakan antibiotik Pembuatan pakan dan sistem pemberiannya ditentukan sesuai dengan jumlah lobster dan cara lobster mencerna makanan yang diberikan. Lobster crayfish ini merupakan hewan nocturnal yaitu bersifat aktif pada malam hari sehingga pemilihan waktu pemberian porsi pakan lebih besar pada malam hari (Lukito dan Prayugo, 2007). Pembuatan pakan berantibiotik ini dilakukan dalam interval 5 hari sekali untuk 5 akuarium dengan tujuan menstabilkan efektivitas antibiotik dalam pakan lobster, karena pembuatan pakan lebih dari 5 hari terjadi pertumbuhan jamur pada pakan. Pemberian pakan berantibiotik pada lobster dilakukan selama 1 bulan (28 hari) pada 6 akuarium yang berbeda yaitu 1 akuarium sebelum perlakuan (hari ke 0) dan 5 akuarium perlakuan selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Sebagai pembanding, 6 akuarium untuk kelompok kontrol (pakan tanpa antibiotik) yaitu 1 akuarium (hari ke 0) dan 5 akuarium diberi pakan tanpa


50

antibiotik selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Sampling dilakukan dengan mengambil sampel air, sedimen dan lobster yaitu pada hari setelah jangka waktu perlakuan pada pukul 06.00 WIB agar kondisi saat sampling sama.

C. Tahap Ekstraksi Protein Kadar protein dalam sedimen ini ditetapkan dengan menggunakan metode pewarnaan yaitu metode coomassie brilliant blue R (CBB R) dan dideteksi dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak derivatif. Protein dalam penelitian ini berada dalam matriks sedimen sehingga perlu dilakukan preparasi sampel supaya protein dapat keluar dari matriks sedimen dan terbentuk struktur protein yang lebih sederhana sehingga dapat dideteksi dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak deriatif. Protein dalam sedimen ini diekstraksi dengan menggunakan basa yaitu NaOH dengan cara merusak matriks sedimen dan melepas protein ke dalam air. Selain itu, basa juga mengakibatkan denaturasi protein menjadi senyawa lebih sederhana. Sebagian besar protein di alam memiliki struktur tersier bahkan quarterner. Struktur tersier ini terbentuk akibat adanya interaksi antar asam amino di rantai polipeptida. Adanya proses denaturasi (gambar 4) mengakibatkan interaksi-interaksi gugus yang membentuk struktur tersier menjadi lemah sehingga kemungkinan untuk terputus sangat besar dan pembentukan protein struktur primer dapat terjadi (Campbell, Reece, Mitchell, 2002).


51

Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi (Campbellet al., 2002)

D. Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif Menurut Harmita (2006), validasi merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu dalam prosedur penetapan, yang digunakan untuk membuktikan bahwa parameter yang dipilih sudah memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Suatu validasi terhadap metode dapat dilakukan dengan melihat aspek akurasi, presisi, linearitas dan sensitivitas yang menunjukkan suatu metode menghasilkan parameter atau data yang valid dan dapat dipertanggung jawabkan. Pada penetapan kadar protein dalam sedimen dengan menggunakan metode CBB dan spektrofotometri sinar tampakini divalidasi terkait linearitas yaitu dengan pembuatan kurva baku dan persamaan regresi linear. Linearitas menunjukkan respon atau parameter yang didapat sudah sesuai jika nilai koefisien korelasi (r) mendekati angka satu. Pada metode penetapan kadar protein ini didapatkan persamaan regresi y = 0,0589x + 0,1018 dan R² = 0,9709. Pada penelitian ini dilakukan juga pembuatan kurva adisi untuk melihat pengaruh matriks dalam sedimen terhadap penetapan kadar protein dalam sedimen. Kurva adisi yang dibuat terdiri dari 6 titik yaitu mulai dari adisi 0, 10, 30, 50, 70, dan 90 mg BSA. Kurva adisi yang didapat memiliki persamaan regresi linear y = 0,5813x + 0,054 dan R² = 0,9907.


52

Ada tidaknya efek matriks dalam sedimen dapat diketahui dengan membandingkan kurva baku solven dengan kurva adisi pada gambar 5. Kurva adisi memberikan respon yang meningkat lebih tinggi daripada respon pada kurva baku solven. Hal ini menunjukkan adanya intervensi dari matriks sedimen pada penetapan kadar protein sehingga untuk menentukan kadar protein dalam sedimen ini digunakan persamaan regresi linear kurva adisi supaya merepresentasikan kondisi yang sebenarnya. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi

Tinggi derivat (cm)

0.35 y = 0.5813x + 0.054 R² = 0.9907

0.3

Kurva baku solven

0.25 0.2

Kurva adisi

0.15 y = 0.055x + 0.1122 R² = 0.9826

0.1 0.05 0 0

1

2

3

4

Linear (Kurva baku solven) Linear (Kurva adisi)

Konsentrasi (mg/ml)

Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein

Akurasi penetapan kadar protein dinyatakan dalam %D yaitu persen difference. %D pada penetapan kadar protein ini didapatkan dari perbandingan selisih konsentrasi diketahui dan konsentasi terhitung, dengan konsentrasi diketahui dari kurva adisi. Berdasarkan FDA (2013), kriteria %D adalah <20%. Pada tabel VI, menunjukkan hasil %D kurang dari 20% mulai dari adisi 30 mg sedangkan adisi 10 mg tidak memenuhi kriteria akurasi sehingga dieksklusi dan persamaan regresi linear yang digunakan mulai dari titik adisi 30 mg dengan konsentrasi 0,16 mg/ml hingga adisi 90 mg dengan konsentrasi 0,48 mg/ml.


53

Tabel VI. %D kurva adisi protein Adisi (mg) Konsentrasi (mg/ml) %D 10 0,05 67,9161 30 0,16 18,8720 50 0,27 13,5893 70 0,37 4,8465 90 0,48 2,5106

Presisi penetapan kadar protein ini dinyatakan dalam %RSD dari kurva adisi. Berdasarkan FDA (2013), suatu metode dikatakan memiliki keterulangan atau presisi yang baik jika nilai %RSD <20%. Pada penetapan kadar protein dalam sedimen dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif ini menunjukkan %RSD sebesar 12,554% sehingga kriteria terpenuhi. Sensitivitas metode merupakan tingkat kepekaan suatu metode dalam mendeteksi senyawa tertentu pada konsentrasi terkecil. Sensitivitas dinyatakan dengan nilai LOQ. LOQ persamaan kurva adisi ini sebesar 0,0922 mg/ml.

E. Analisis Sampel 1. Analisis populasi mikroba dalam air habitat lobster Antibiotik merupakan senyawa alami maupun buatan yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba (bakteri) di alam. Terdapat dua macam mekanisme dalam mempengaruhi pertumbuhan mikroba yaitu bakteriosidal dan bakteriostatik. Pada gambar 6, dinyatakan bahwa bakteriostatik tidak menurunkan log jumlah bakteri yang hidup tetapi menekan pertumbuhan bakteri sehingga grafik log jumlah bakteri hidup menjadi datar. Berbeda dengan grafik log jumlah bakteri hidup pada penambahan senyawa bakteriosidal yang mengalami penurunan akibat bakteri mati (Scholar dan Pratt, 2000).


54

Gambar 6. Bakterosidal dan bakteriostatik antibiotik (Scholar dan Pratt, 2000)

Menurut Krasner dan Shors (2014), antibiotik memiliki spektrum aktivitas bakteriostatik atau bakteriosidal pada jenis bakteri tertentu. Beberapa antibiotik efektif menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan yang lain efektif menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif. Tetrasiklin merupakan senyawa antibiotik dengan mekanisme bakteriostatik dan memiliki spektrum yang luas dalam mempengaruhi pertumbuhan mikroba (gram positif dan gram negatif). Penetapan jumlah populasi mikroba dalam air habitat lobster air tawar dilakukan dengan menghitung jumlah koloni mikroba yang tumbuh dan dilakukan oleh

Laboratorium

Mikrobiologi

Balai

Kesehatan

Yogyakarta

dengan

menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan colony counter. Perhitungan jumlah koloni mikroba ini tidak spesifik terhadap mikroba tertentu melainkan menghitung semua mikroba yang hidup yang dapat bertumbuh membentuk koloni. Pada tabel III, menunjukkan ada beragam jenis bakteri yang dapat hidup di lingkungan air limbah bahkan dalam air bersih sekalipun dan meliputi mikroba normal alam dan mikroba yang bersifat patogen.


55

8.0000 6.0000 4.0000 2.0000 0.0000 0

3

5

Kontrol

7

14

28

Antibiotik

Gambar 7. Log jumlah populasi mikroba kelompok kontrol dan antibiotik

Gambar 7, menyatakan log jumlah populasi mikroba. Pada hari ke 0 hingga hari ke 7, kelompok kontrol maupun kelompok antibiotik memiliki nilai log jumlah populasi mikroba tidak jauh berbeda. Pada hari ke 14 hingga 28 terjadi perbedaan log jumlah populasi mikroba antara kontrol dan perlakuan yaitu log jumlah populasi mikroba pada kelompok antibiotik lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol. Hasil ini menunjukkan ketidaksesuaian efek tetrasiklin sebagai antimikroba. Pada kasus ini, peneliti belum bisa mengambil kesimpulan terhadap terjadinya peningkatan log jumlah populasi mikroba pada kelompok

Log jumlah populasi mikroba

antibiotik. 7.0000 6.0000 5.0000 4.0000 3.0000 2.0000 1.0000 0.0000

Kontrol

Poly. (Kontrol)

0

20 Hari

40

Gambar 8. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok kontrol)

Log jumlah populasi mikroba


7.000 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000

56

Antibiotik Poly. (Antibiotik) 0

20 Hari

40

Gambar 9. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok antibiotik)

Pada gambar 8, tren polinimial yang terjadi adalah penurunan log jumlah populasi mikroba selama perlakuan hingga 28 hari. Jika dibandingkan dengan gambar 9, tren polinomial yang terjadi dikatakan tidak mengalami penurunan maupun peningkatan yang nyata. Mengacu pada penelitian terdahulu oleh Hossain, Sharker, Haque, Reza, dan Mondal (2014), jumlah populasi bakteri mengalami peningkatan pada ikan yang diberi antibiotik selama penyimpanan di ruang pendingin. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi penurunan efek antibiotik terhadap populasi bakteri. Jika gambar 8 dan gambar 9 dibandingkan maka dapat dikatakan terjadi perbedaan tren polynomial terhadap log jumlah populasi mikroba selama hari perlakuan. Menurut Scholar dan Pratt (2000), pada gambar 6, tren log jumlah koloni bakteri terhadap waktu pada perlakuan bakteriostatik tidak menunjukkan peningkatan maupun penurunan. Pada gambar 9 menunjukkan tren yang mirip yaitu tidak terjadi peningkatan maupun penurunan. Hasil ini dapat menyatakan adanya kemungkinan efek tetrasiklin terjadi tetapi perlu penelitian lebih lanjut terhadap bakteri secara spesifik yang ada dalam air habitat lobster. Keberadaan mikroba di lingkungan sangat bervariasi. Tetrasiklin merupakan antibiotik dengan


57

spektrum luas menghambat pertumbuhan mikroba tertentu tetapi tidak pasti dapat menghambat pertumbuhan semua jenis mikroba.

2. Analisis kadar protein dalam sedimen Penetapan kadar protein dalam sedimen dilakukan dengan tujuan mengamati kadar protein yang masih ada di dalam sedimen yang belum dirombak oleh mikroba maupun pakan lobster air tawar yang belum dimakan. Penetapan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode CBB R dan dideteksi dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang telah dikembangkan oleh Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini. Sebelum dilakukan penetapan kadar, validasi dilakukan pada metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif. Validasi yang dilakukan meliputi akurasi, presisi, dan sensitivitas. Kadar protein dalam sedimen akan menunjukkan eksistensi pengaruh pakan berantibiotik terhadap kualitas habitat lobster air tawar. Adanya kuman atau mikroba dalam suatu habitat akan mempengaruhi ketersediaan nutrisi yaitu protein dalam air yang berguna untuk pertumbuhan lobster. Mikroba normal alam akan membantu penguraian protein dan bahan organik lain menjadi komponen yang lebih sederhana sehingga siklus kimia normal (kandungan bahan organik) dalam air dapat terdaur ulang. Kehadiran antibiotik dalam habitat akan mempengaruhi perkembangan mikroba khususnya bakteri. Berkurangnya jumlah populasi mikrobanormal dalam air akan mempengaruhi kualitas hidup lobster. Kadar protein dalam sedimen ini ditetapkan dengan menggunakan metode pewarnaan yaitu metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak


58

derivatif. Pewarnaan CBB ini bertujuan untuk memberikan profil warna terhadap protein sehingga protein dapat dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang sinar tampak. Pada gambar 3, reaksi yang terjadi antara protein dan reagen CBB ini adalah ikatan ionik, elektrostatik dan van der Waals antara asam sulfonat dan rantai samping protein (arginin, lisin, dan histidin) yang akan menyebabkan reduksi warna menjadi biru (Otlets, 2005). Selain ketiga mekanisme reaksi itu, CBB juga berinteraksi dengan bagian hidrofobik protein seperti pada gambar 3. Protein yang berinteraksi secara bebas dengan struktur CBB adalah struktur protein primer seperti pada gambar 4. Pada penelitian ini perubahan warna yang terjadi adalah warna ungu menjadi biru. Semakin tinggi jumlah protein yang berinteraksi dengan CBB semakin memudar warna ungu dari CBB. Pada penetapan kadar protein dalam sampel sedimen didapatkan hasil berupa kadar protein (mg) dalam tiap gram sedimen. Kadar protein yang didapatkan dievaluasi dengan menyelisihkan kadar protein pada kontrol dan perlakuan dengan hari ke 0 lalu diplotkan dalam kurva dan dibandingkan. Jika dilihat pada gambar 10, tren menunjukkan peningkatan kadar protein dalam sedimen pada kedua kelompok. Tren kedua kelompok perlu diuji t supaya dapat menyatakan ada perbedaan atau tidak. Setelah diuji t tidak berpasangan dengan taraf kepercayaan 95% didapatkan hasil bahwa kadar protein kelompok kontrol tidak berbeda nyata dengan kadar protein kelompok antibiotik, tertera pada lampiran 36.

selisih kadar protein dengan H-0


140.0000 120.0000 100.0000 80.0000 60.0000 40.0000 20.0000 0.0000 -20.0000 0 -40.0000

59

Kelompok kontrol

y = 5.7389x - 38.564 kelompok antibiotik

y = 5.2599x - 23.353 Linear (Kelompok kontrol)

10

20

30

Linear (kelompok antibiotik)

Hari

Gambar 10. Kurva kadar protein dalam sedimen selama hari perlakuan

3. Pertumbuhan lobster air tawar terkait panjang dan berat lobster Menurut Lukito dan Prayugo (2007), lobster dengan umur 2-3 bulan (juvenile) merupakan fase pertumbuhan optimum sehingga membutuhkan banyak nutrisi dengan kata lain lobster mengkonsumsi pakan dalam jumlah besar. Pada aspek pertumbuhan lobster dilakukan pengukuran pada panjang dan berat lobster. Lobster air tawar mengkonsumsi pakan untuk memenuhi kebutuhan nutrisi untuk bertumbuh menjadi lebih besar. Pengukuran panjang dan berat lobster ini dilakukan untuk melihat pengaruh tetrasiklin dalam pakan terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar. Evaluasi data dilakukan dengan membandingkan panjang dan berat antara kelompok kontrol dan perlakuan (telah diselisihkan dengan hari 0) dalam kurva. Pengukuran panjang dan berat dilakukan pada lobster air tawar padahari ke 0 sampai 14. Data panjang dan berat lobster pada hari ke 28 dieksklusi karena terjadi kematian masal lobster pada kelompok perlakuan antibiotik. Pada gambar 11, menunjukkan laju pertambahan panjang lobster air tawar kelompok antibiotik meningkat sama dengan kelompok kontrol. Pada gambar 12, menunjukkan laju pertumbuhan berat lobster air tawar kedua


60

kelompok meningkat pula. Setelah dilakukan uji t tidak berpasangan dengan taraf kepercayaan 95% terhadap kedua kelompok didapatkan hasil bahwa laju pertumbuhan lobster kelompok kontrol tidak berbeda nyata dengan lobster kelompok antibiotik. Hal ini menunjukkan bahawa lobster air tawar pada kedua

Panjang (cm)

kelompok memiliki aktivitas makan yang sama.

0.7000 0.6000 0.5000 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 -0.1000 0 -0.2000

Kontrol y = 0.039x - 0.1682 Antibiotik y = 0.0488x - 0.1455 Linear (Kontrol) 5

10

15

Linear (Antibiotik)

Hari

Berat (gram)

Gambar 11. Kurva perbandingan panjang lobster kelompok kontrol dan antibiotik

0.7000 0.6000 0.5000 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000

Kontrol y = 0.0083x + 0.2441 Antibiotik y = 0.0145x + 0.3645 Linear (Kontrol)

0

5

10

15

Linear (Antibiotik)

Hari

Gambar 12. Kurva perbandingan berat lobster kelompok kontrol dan antibiotik

F. Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster Tujuan penetapan kadar TC dalam daging lobster ini adalah untuk melihat adanya TC yang terakumulasi dalam daging lobster setelah diberi


61

perlakuan selama 28 hari. Penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan dengan menggunakan metode HPLC yaitu penetapan kadar suatu senyawa dengan cara memisahkan dan menganalisis analit dari komponen lain dalam matriks sampel dengan bantuan kolom sebagai fase diam dan liquid sebagai fase gerak (Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010). Pada penelitian ini, peneliti ingin menghitung kadar TC dalam bentuk TC basa sehingga perlu dilakukan preparasi sampel sebelum proses ekstraksi sehingga analit dapat terambil dalam bentuk TC basa. Sebelum dilakukan penetapan kadar TC dengan metode HPLC ini perlu dilakukan orientasi dan optimasi agar hasil yang digunakan merupakan hasil yang paling optimum maka dilakukan orientasi penentuan puncak TC, panjang gelombang TC dan optimasi fase gerak.

1. Preparasi dan ekstraksi TC dalam daging lobster Ekstraksi TC dalam sampel daging yang sudah digerus dilakukan dengan menggunakan HCl : akuabides (1:1). HCl merupakan asam kuat dengan nilai derajat keasaman 1. Sifat eksotermis dari HCl mengakibatkan energi panas dapat terjadi dalam suatu sistem larutan (Frankel, 2012). Penggunaan HCl : akuabides ini ditujukan untuk mengambil TC dalam bentuk garam tetrasiklin HCl (TCH) dari matriks daging dengan mekanisme pemecahan struktur lemak daging lobster dan denaturasi protein sehingga TC dapat terlarut dalam HCl : akuabides. Reaksi denaturasi protein dapat dilihat pada gambar 4. Reaksi oksidasi lemak yaitu pada trigliserida oleh asam dapat dilihat pada gambar 13.


62

Gambar 13. Reaksi oksidasi trigliserida oleh asam (Frankel, 2012)

Analit yang dituju dalam sampel daging adalah tetrasiklin basa (TC) karena digunakan HPLC fase terbalik yang mana analit harus bersifat non polar dibandingkan dengan fase geraknya agar bisa terpisah dengan baik, maka perlu dilakukan pembentukan TC bersifat basa dengan polaritas lebih rendah dari bentuk garamnya yaitu tetrasiklin HCl (TCH). Preparasi selanjutnya, TC yang sudah terambil (dalam bentuk TCH) dari matriks daging direaksikan dengan NaOH sehingga terjadi reaksi kesetimbangan dengan reaksi sebagai beikut : Tetrasiklin HCl + NaOH  Tetrasiklin + NaCl + H2O (garam)

(basa)

(basa)

(garam)

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ekstraksi cair-cair yaitu asetonitril dan buffer McIlvaine (pH 4) dengan bantuan NaCl dengan tujuan TC basa akan terlarut dalam asetonitril dan zat lain terlarut dalam buffer McIlvaine. Ekstraksi menggunakan asetonitril dan buffer McIlvaine dengan penambahan garam NaCl dilakukan dengan tujuan mengadakan efek salting out yaitu menarik air sehingga terjadi pemisahan antara air dan asetonitril. Pada awalnya tujuan peneliti mengambil fase asetonitril untuk kemudian dilakukan penguapan, tetapi tidak terjadi pemisahan secara sempurna sehingga pada sampel secara langsung


63

dilakukan proses penguapan dengan menggunakan rotary evaporator dengan anggapan bahwa zat lain ikut menguap bersama asetonitril.

2. Orientasi panjang gelombang TC Orientasi panjang gelombang TC dilakukan pada 20 ppm standar TCH dalam HCl (dengan proses ektraksi) dengan melihat spektrum absorbansi TC (setelah dilakukan perlakuan ekstraksi) dengan menggunakan spektrofotometri uv. Pada orientasi panjang gelombang TC ini didapatkan panjang gelombang maksimal pada 270 nm dapat dilihat pada lampiran 25.

3. Penetapan puncak TC Penetapan puncak TC dilakukan dengan menggunakan standar TCH yang dilarutkan dalam asetonitril : buffer McIlvaine dan dilakukan deteksi dengan menggunakan HPLC. Kromatogram standar TCH ditunjukkan pada gambar 14, terdapat puncak pada waktu retensi 5,1 sehingga waktu retensi 5,1 dipilih sebagai waktu retensi TCH dalam fase gerak.

TCH

Gambar 14. Kromatogram standar TCH dalam pelarut fase gerak

Penetapan puncak TCH dalam daging yang diekstraksi yaitu TC basa juga dilakukan untuk menentukan puncak TC basa. Kromatogram hasil deteksi


64

TC basa dengan menggunakan HPLC yaitu pada gambar 16. Pada gambar 16, menunjukkan adanya 3 puncak tertinggi pada waktu retensi 3,9; 5,7; dan 10,0. Selanjutnya dilakukan perbandingan dengan kromatogram blangko yaitu pelarut dengan perlakuan ekstraksi tanpa TCH. Pada gambar 15, ternyata pada waktu retensi 3,9 juga terdapat puncak seperti pada kromatogram standar TC (gambar 16). Kromatogram standar TC (gambar 16) menunjukkan ada dua puncak tertinggi yang tidak ditemukan pada kromatogram blangko sehingga 2 puncak pada waktu retensi 5,7 dan 10,0. Jika gambar 16 dibandingkan dengan gambar 14 maka dapat ditentukan bahwa pada waktu retensi 5,7 adalah puncak dari TCH dan pada waktu retensi 10,0 adalah puncak dari TC basa. Sesuai dengan sifat polaritas tetrasiklin basa (TC) dan garam tetrasiklin HCl (TCH) akan menentukan waktu retensinya juga. TCH bersifat lebih polar dibanding TC basa sehingga akan terelusi lebih dulu.

Gambar 15. Kromatogram blanko (tanpa TCH)

TCH

TC

Gambar 16. Kromatogram standar TC basa


65

Pembentukan dua puncak ini dapat disebabkan karena ketidak sempurnaan dalam ekstraksi sehingga untuk menetapkan kadar tetrasiklin dalam daging dengan kondisi adanya dua puncak tetrasiklin, maka dilakukan penjumlahan antara puncak pada waktu retensi 5,7 dan 10,0 untuk merepresentasikan tetrasiklin total yang ada dalam sampel daging lobster. Dalam antisipasi kegagalan ekstraksi perlu dilakukan optimasi kembali terhadap ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini.

4. Optimasi fase gerak HPLC Optimasi fase gerak dilakukan untuk mendapatkan formula fase gerak yang tepat untuk memisahkan TC basa dan senyawa lain sehingga TC basa dapat terdeteksi tanpa adanya penumpukan peak. Optimasi fase gerak ini dilakukan pada 20 ppm standar TCH (telah dilakukan preparasi dan ekstraksi) dengan menggunakan fase gerak metanol : buffer McIlvaine (pH 4) dan acetonitiril : buffer McIlvaine (pH 4). Asetonitril dan metanol merupakan pelarut yang sering digunakan untuk melarutkan senyawa tetrasiklin. Pada kromatogran gambar 18, terdapat 2 puncak paling tinggi pada penggunaan fase gerak asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4). TC basa dengan konsentrasi yang sama dideteksi dengan menggunakan HPLC dan fase gerak metanol : buffer McIlvaine (pH 4) menghasilkan kromatogram pada gambar 17. Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan dengan menggunakan kedua pelarut, asetonitril : buffer McIlvaine dipilih sebagai fase gerak yang paling optimum untuk memisahkan analit pada penelitian ini.


66

Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak metanol : buffer McIlvaine

TCH

TC

Gambar 18. Kromatogram TC dengan fase gerak asetonitril : buffer McIlvaine

G. Validasi Metode HPLC Validasi metode penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan untuk menjamin metode HPLC dalam menetapkan kadar TC. Validasi yang dilakukan meliputi linearitas, akurasi, presisi, sensitivitas (LOQ) dan selektivitas (resolusi). Pada penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan juga perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi. Persamaan regresi linear yang didapat yaitu pada tabel VII. Nilai slope pada kedua kurva (tabel VII) memiliki selisih yang besar sehingga matriks sampel dapat mempengaruhi penetapan kadar TC. Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi Kurva R2 Slope Persamaan regresi linear Baku solven Adisi

0,9919 0,9976

209507 90169

y = 209507x – 46814 y = 90169x + 8799


67

3000000 Kurva adisi

2500000

AUC

2000000 Kurva baku solven

1500000 1000000

Linear (Kurva adisi)

500000 0 -500000 0

5 10 15 Konsentrasi (ppm)

Linear (Kurva baku solven)

Gambar 19. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC

Pada gambar 19, terlihat bahwa kurva baku solven memiliki respon yang lebih tinggi daripada kurva adisi terhadap deteksi HPLC. Dalam penelitian ini, efek matriks yang terjadi adalah menurunkan kadar TC sehingga digunakan kurva adisi untuk melakukan penetapan kadar TC dalam daginng, agar dapat merepresentasikan kondisi yang sebenarnya. Linearitas pada kurva baku solven dinyatakan dengan nilai R2 sebesar 0,9919 dengan persamaan regresi linear y = 209507x-46814 sedangkan pada kurva adisi didapatkan nilai R2 sebesar 0,9976 dengan persamaan regresi linear y = 90169x+8799. Sensitivitas pada metode dilakukan dengan menyatakan nilai LOQ pada kurva adisi yaitu sebesar 1 ppm. LOQ metode HPLC menggunakan kurva adisi yang didapat sebesar 0,53 ppm sehingga konsentrasi 0,2 ppm pada kurva adisi tidak masuk dalam LOQ. Akurasi dinyatakan dengan persen difference (%D) yang didapatkan dari kurva adisi dapat dilihat pada tabel. Ketentuan dari FDA, menyatakan metode yang akurat memiliki nilai %D dan %RSD kurang dari 20%. Akurasi pada kurva adisi yang digunakan pada tabel VIII, menyatakan %D lebih dari 20% pada konsentrasi 0,2 dan 1 ppm. Hasil menunjukkan akurasi yang tidak sesuai kriteria.


68

Tabel VIII. %D kurva adisi Konsentrasi (ppm) %D 0,2 134,7459 1 30,2421 3 0,7057 7 0,3219 10 0,3422

Penetapan presisi dilakukan pada kurva adisi terhadap 4 titik mulai dari 1-10 ppm dan didapatkan %RSD <20% yaitu 17,2625% sehingga presisi masih masuk kriteria pada konsentrasi 1-10 ppm. Karena keterbatasan waktu pada penetapan kadar TC dalam daging lobster ini, maka tetap digunakan persamaan regresi linear dari konsentrasi 0,2-10 ppm karena AUC sampel yang tidak masuk interval kurva adisi bila digunakan kurva adisi dari 1-10 ppm maka hasil penelitian ini hanya dapat dinyatakan secara kualitatif. Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode dalam memisahkan analit secara tepat dan spesifik, parameter yang diamati adalah resolusi. Menurut Snyder et al. (2010), suatu metode analisis dikatakan selektif apabila memiliki resolusi ≥ 1,5. Nilai ini menunjukan pemisahan antara puncak kromatogram sudah terjadi secara sempurna. Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi sampel TC Sampel Waktu retensi Resolusi Rata-rata nilai resolusi 5,8 0,191 1 2,213 10,1 2,223 5,8 2,223 2 10,1 3,656 5,8 2,203 3,208 3 10,1 3,744

Tabel X menunjukan rata-rata resolusi dari puncak TC dengan puncak lain yang terdekat adalah ≥ 1,5, yaitu 2,213 pada waktu retensi 5,8 dan 3,208


69

pada 10,1. Hal ini menunjukan bahwa metode analisis yang digunakan memiliki kriteria selektivitas terpenuhi karena dapat memisahkan senyawa analit dari senyawa-senyawa lain yang ada pada matriks.

H. Penetapan Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster Penetapan kadar tetrasiklin (TC) dalam daging dilakukan pada lobster air tawar perlakuan hari ke 14 dan ke 28 untuk melihat ada tidaknya peningkatan kadar akumulasi TCH yang cukup terlihat dalam daging lobster. TCH memiliki sifat larut yang cukup baik di dalam air sehingga kemungkinan untuk mengendap dan terakumulasi dalam tubuh lobster sangat kecil. TCH memiliki harga logP sebesar -1,37 yang menunjukkan kelarutan di dalam air yang tinggi (Hansh, Leo, dan Hoekman, 1995). Tetapi TCH memiliki sifat tidak stabil dengan ion logam seperti Mg dan Ca. TC dapat berikatan kovalen dengan ion logam menjadi suatu kompleks kelat sehingga fungsinya sebagai anti mikroba tidak muncul. Kompleks kelat TCH-Ca ini sulit didegradasi sehingga tetap berada dalam habitat dan kemungkinan untuk termakan oleh lobster sangat besar sehingga terjadi akumulasi dalam daging lobster.

Gambar 20. Kompleks TC dengan ion logam


70

Kadar TCH dalam daging yang ditetapkan adalah pada hari perlakuan 14 dan 28 daging lobster. Pada hari perlakuan ke 14, data kadar TC dalam daging dieksklusi karena memiliki %RSD yang besar(presisi kadar tidak terpenuhi). Pada perlakuan hari ke 28 didapatkan presisi sebesar 1,41901 dan rata-rata kadar akumulasi TC sebesar 53,0970 ug/g. Tabel X. Kadar tetrasiklin total dalam daging lobster Replikasi Kadar TC (ug/g) Rata-rata (ug/g) 1 53,9382 2 52,8686 53,0970 3 52,4842

I. Keterbatasan Penelitian Penelitian ini memiliki banyak kekurangan yaitu pada penetapan kadar tetrasiklin dalam daging lobster tidak digunakan standar internal sebagai faktor koreksi terhadap proses ekstraksi. Proses ekstraksi yang tidak dioptimasi sehingga terjadi dua puncak pada kromatogram. Kurva baku adisi yang digunakan untuk menetapkan kadar protein dalam sedimen dan tetrasiklin dalam daging lobster tidak memenuhi kriteria. Pada pembagian lobster dalam akuarium sebelumnya tidak diukur panjang dan berat per akuarium melainkan diambil rata-rata keseluruhan lobster. Selain itu tidak dilakukan pengecekan kualitas air per sampling.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan berpengaruh terhadap jumlah populasi mikroba. 2. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan tidak berpengaruh terhadap kadar protein dalam sedimen. 3. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan tidak berpengaruh terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar. 4. Terjadi akumulasi antibiotik tetrasiklin sebesar 53,0970 µg/g.

B. Saran 1. Perlu dilakukan pengamatan dan evaluasi jumlah populasi mikroba secara spesifik pada jenis bakteri untuk dapat menyatakan efek tetrasiklin. 2. Perlu dilakukan optimasi kembali terkait ekstraksi tetrasiklin dalam daging. 3. Perlu dilakukan pengecekan kualitas air per hari perlakuan.

71


DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, H., 2004, Principles and Reactions Of Protein Extraction, Purification, and Characterization, CRC Press, USA. Pp. 35-37. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Reublik Indonesia, Jakarta, pp. 781-782, 1061. Anonim, 2013, Bioanalytical Method Validation, CDER, Food and Drug Administration. Ansari, M., dan Raissy, M., 2010, In vitro Susceptibility of Commonly Used Antibiotics against Vibrio spp. Isolated from Lobster (Panulirus homarus), African Journal of Microbiology Research,4(23), 2629-2631. Bachtiar, Y., 2006, Usaha Budi Daya Lobster Air Tawar di Rumah, P.T. AgroMedia Pustaka, Jakarta, pp. 42. Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitchell, L. G., 2002, Biologi, Erlangga, Jakarta, pp. 77-80. Chan, C. C., Lam, H.,dan Zhang, X. M., 2004, Analytical Method validation and Instrument Performance Verification, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 16-17, 105, 156. Dachriyanus, (2004), Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektrofotometri, Cetakan pertama, CV. Trianda Anugrah Pratama, Padang, pp. 1-2. Dennison, Clive., 2003, A Guide to Protein Isolation, 2nd edition, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp.13-19, 23-28

Effendy, 1998, Memelihara Ikan Mas Koki Dalam Akuarium, Kanisius, Yogyakarta. Ermer, J. dan Miller, J.H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, New York, pp. 2124. 72


73

Frankel, E. N., 2012, Lipid Oxidation, 2nd edition, Woodhead Publishing, USA, pp. 10-12. Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 378-417, 456-480. Glencross, H., Ahmed N., dan Wang Q., 2011, Biomedical Science Practice Experimental and Professional Skills, Oxford University Press, New York, pp.359,360. Georgiou, C. D., Grintzalis, K., Zervoudakis, G., dan Papapostolou, I., 2008, Mechanism of Coomassie brilliant blue G-250 Binding to Proteins: A Hydrophobic Assay for Nanogram Quantities of Proteins, Anal Bioanal Chem, 391, 391–403. Harmita., dan Radji, M., 2006, Buku Ajar Analisis Hayati, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 125-126. Hansch, C., Leo, A., D. Hoekman,1995, Exploring QSAR - Hydrophobic, Electronic, and Steric Constants, Washington, DC, American Chemical Society, pp. 177. Hossain, Sharker, Haque, Reza, dan Mondal (2014), Effects of antibiotic on the bacterial microflora in two commercially important catfish species, Clarias batrachus and Heteropneustes fossilis in Bangladesh, Journal of Coastal Life Medicine, 2(11): 845-848. Jenie, Betty S.L dan Rahayu, W. P., 1993, Penanganan Limbah Industri Pangan, Kanisius, Yogyakarta, pp.27-28. Johnson, B., 2010, Oxytetracycline (Terramycin® 200 for Fish) Medicated Feed Clinical Field TrialsINAD 8069, http://www.fws.gov/fisheries/aadap/inadsavailable/medicatedfeeds/Oxyte tracycline-shrimp/index.html, diakses tanggal 2 Desember 2015. Kazakevich, Y. dan Lobrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 145-157. Krasner, R. I., 2014, The Microbial Challenge : A Public Health Perspective, 3rd edition, Jones & Bartlett Learning, USA, pp. 399-400.


74

Kruger N. J., 1994, The Bradford method for protein quantitation, in Methods in Molecular Biology, Vol. 32 : Basic Protein and Peptide Protocols (J.M. Walker, ed.), Humana Press, New Jersey, pp. 9-15. Kurniawan, D.,2010, Bioremediasi Sedimen Tambak Udang, Laporan Penelitian, Fakultas Perikanan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman, Samarinda. Lim, K., 2006, Pembenihan Lobster Air Tawar : Meraup Untung Dari Lahan Sempit, AgroMedia Pustaka, Jakarta. Lukito, A., dan Prayugo, S., 2007, Panduan Lengkap Lobster Air Tawar, Penebar Swadaya, Jakarta, pp. 6-9, 56-74. Mayer, L, M., Schick, L, L., dan Setchell, F, W., 1986, Measurement of Protein in Nearshore Marine Sediment, Inter-Research, 30,159-165. Nur, A., 2011, Manajemen Pemeliharaan Udang Vaname, Direktorat Jendral Perikananan Budidaya Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau Jepara, Jakarta, pp. 2-10, 13-19, 23. Nurhidayati, L., 2007, Spektrofotometri Derivatif dan Aplikasinya dalam Bidang Farmasi, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 5(2), 93-99. Otlets, S., 2005, Methods of Analysis of Food Components and Additives, Taylor & Francis Group, United States, pp. 79. Rosenberg, I. M., 2005, Protein Analysis and Purification Benchtop Techniques, Second Ed, Springer Scince and Business Media, USA, pp. 20-27. Scholar, E. M., dan Pratt, W. B., 2000, The Antimicrobial Drugs, 2nd edition, Oxford University Press, New York, pp. 260-261. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., dan Dolan, J. W., 2010, Introduction Modern Liquid Chromatography, 3rded., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 1-5, 54-55, 88-144. Subronto dan Tjahjati, 2001, Pedoman Pengobatan pada Hewan Ternak, Bentang Pustaka, Yogyakarta, pp. 137, 145-147.


75

Sukmajaya, Ir. Y. dan Suharjo, I., 2003, Mengenal lebih Dekat Lobster Air Tawar, Komoditas Perikanan Prospektif, PT Agromedia Pustaka Utama, Tangerang, pp. 56, 57. Vaz-Moreira, I., Nunes, O. C., dan Manaia, C. M., 2014, Bacterial Diversity And Antibiotic Resistance In Water Habitats: Searching The Links With The Human Microbiome, Federation of European Microbiology Societies, 38, 761–778. Weifen,W., Hong, L., Changhu, X., dan Jamil, K., 2004, Elimination of Chloramphenicol, Sulphamethoxazole And Oxytetracycline In Shrimp, Penaeus Chinensis Following Medicated-Feed Treatment, Environment International, 30, 367-373.


LAMPIRAN

76


Lampiran 1. Surat permohonan working standar tetrasiklin HCl

77


Lampiran 2. COA working standar tetrasiklin HCl

78


Lampiran 3. COA reagen coomasie R

79


Lampiran 4. COA albumin (BSA)

80


Lampiran 5. Hasil determinasi lobster air tawar

81


82


83


Lampiran 6. Kurva baku penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul

Kurva Baku

1 Absorbansi

0.8 0.6 0.4 y = 1.5176x + 0.0668 R² = 0.9953

0.2 0 0

0.2

0.4

0.6

Konsentrasi (mg/ml)

Konsentrasi (mg/ml) 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

Absorbansi 0.293 0.374 0.432 0.527 0.621 0.667 0.733 0.833

Lampiran 7. Tabel hasil penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul Penimbangan Sampel g 0.2514 0.251 0.2512

0.4290 0.4230

Konsentrasi (mg/ml) 0.2387 0.2347

Konsentrasi (% b/b) 94.9349 93.5110

0.4250

0.2360

93.9612

Keterangan

Absrobansi

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

84


Lampiran 8. Hasil jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis tetrasiklin

85


Lampiran 9. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 0

86



87


88



89


90



91


92



93


94



95


96


Lampiran 15. Tabel data jumlah populasi mikroba Perlakuan selama (hari) 0 3 5 7 14 28

Kelompok Kontrol Populasi Mikroba 370000 3200000 30000 290000 2200 32000

Log Populasi Mikroba 5,5682 6,5051 4,4771 5,4624 3,3424 4,5051

Kelompok Antibiotik Populasi Mikroba 370000 2900000 31000 98000 1000000 340000

Lampiran 16. Tabel data tinggi derivat kurva baku solven protein Konsentrasi (mg/ml) Tinggi derivate (cm) 0,4 0,13 0,8 0,15 1,2 0,18 1,6 0,20 2,0 0,23 2,4 0,25 2,8 0,28 3,2 0,28 3,6 0,30 Lampiran 17. Tabel data tinggi derivat kurva adisi protein Adisi (mg) 10 30 50 70 90

Konsentrasi (mg/ml) 0,05 0,16 0,27 0,37 0,48

Lampiran 18. Contoh perhitungan %D

Tinggi derivat 0,13 0,15 0,20 0,28 0,33

Log Populasi Mikroba 5,5682 6,4624 4,4914 4,9912 6,0000 5,5315

97


Lampiran 19. Contoh perhitungan %RSD x (mg/ml) 0,16 0,27 0,37 0,48

y (cm) 0,15 0,2 0,28 0,33

RF (y/x) 0,9375 0,75 0,75 0,6875

SD

Rata-rata

0,10825

0,78125

Lampiran 20. Contoh perhitungan LOQ Persamaan regresi linear Standar deviasi Slope (b)

y = bx+ a y = 90169x + 8799 14394,40 90169

Lampiran 21. Contoh spektrum derivatif protein

98


Lampiran 22. Data kadar protein dalam sedimen Hari perlakuan 0 3 5 7 14 28

Kadar protein (mg/g) kontrol 117,7318 108,2719 117,9104 101,8463 149,0747 246,7443

antibiotik 117,7318 117,9104 132,3681 92,2078 123,3722 246,7443

Kadar protein (selisih dengan hari ke 0) kontrol antibiotik 0 0 -9,4599 0,1786 0,1786 14,6363 -15,8855 -25,5240 31,3429 5,6404 129,0125 129,0125

Lampiran 23. Tabel data panjang lobster air tawar Hari 0 3 5 7 14 28

Kontrol Panjang (cm) 5,2500 5,3067 5,3133 5,1385 5,7000 5,5071

Antibiotik Panjang (cm) 5,2500 5,3867 5,3067 5,2867 5,8533 mati

Selisih dengan hari ke 0 Kontrol Antibiotik 0 0 0,0567 0,1367 0,0633 0,0567 -0,1115 0,0367 0,4500 0,6033 0,2571 -

Lampiran 24. Tabel data berat lobster air tawar Hari 0 3 5 7 14 28

Kontrol Berat (gram) 3,2500 3,5293 3,6660 3,3685 3,6536 3,9829

Antibiotik Berat (gram) 3,2500 3,8273 3,5887 3,5760 3,8860 mati

Selisih dengan hari ke 0 Kontrol Antibiotik 0 0 0,2793 0,5773 0,4160 0,3387 0,1185 0,3260 0,4036 0,6360 0,7329 -

Lampiran 25. Spektrum orientasi panjang gelombang tetrasiklin

99


Lampiran 26. Tabel data AUC kurva baku solven tetrasiklin Konsentrasi (ppm) 0,2 1,2 2,4 3,6 4,8 6,0 7,2 9,6 12,0

AUC 59168,7 234696,3 470502,0 604299,0 954569,0 1242458,0 1319205,3 2033852,3 2506746,3

Lampiran 27. Tabel data AUC kurva adisi tetrasiklin Adisi (ppm) Konsentrasi (ppm) 2 0.2 10 1 30 3 70 7 100 10

AUC 2533 126237 277397 642014 907403

Lampiran 28. Contoh kromatogram kurva baku solven

Lampiran 29. Contoh kromatogram kurva adisi tetrasiklin

100


Lampiran 30. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 14

Lampiran 31. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 28

Lampiran 32. Kandungan pakan dan merek dagang pakan

Lampiran 33. Proses perlakuan

101


102

Lampiran 34. Sedimen lobster air tawar

Lampiran 35. Perbandingan jumlah sedimen pada hari ke 28

Lampiran 36. Contoh perhitungan uji t tidak berpasangan (p<0,05) H0  X1=X2

X1(kadar protein kelompok kontrol)

H1  X1≠X2

X2(kadar protein kelompok antibiotik)

H0 = kadar protein kelompok kontrol tidak berbeda nyata dengan kadar protein kelompok antibiotik. H1 = kadar protein kelompok kontrol berbeda nyata dengan kadar protein kelompok antibiotik. Rumus :


103

Perhitungan :

Kesimpulan : H1 diterima jika t hitung ≥ t tabel 1,1577< 2,306 Maka H1 ditolak sehingga kadar protein kelompok kontroltidak berbeda nyata dengan kadar protein kelompok antibiotik. Lampiran 37. Tabel uji t tidak berpasangan terhadap panjang dan berat losbter Parameter Panjang Berat

df (n=4) 6 6

S 0,023825 0,020480

t hitung -2,7814 -5,7025

Keterangan < <

t tabel 2,447


BIOGRAFI PENULIS Penulis dengan nama lengkap Aditya Christian Firmanto dilahirkan di Pati pada tanggal 19 April 1993 sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Penulis skripsi berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)” menempuh pendidikan formal yang ditempuh penulis adalah TK Petiwi Wedarijaksa (1997-1999), SD Kanisius Pati (1999-2005), SMP Kanisius Pati (20052008), SMA Negeri 1 Pati (2008-2011). Pada tahun 2011, penulis melanjutkan pendidikan di program studi S1 Fakultas Famasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten dosen pada praktikum Kimia Dasar dan Kimia Organik. Selain itu, penulis juga aktif dalam kegiatan kemahasiswaan kampus antara lain sebagai anggota Paduan Suara Mahasiswa Sanata Dharma, pernah mengikuti beberapa perlombaan antara lain Bali International Choir Competition mendapat medali emas (2012), pernah mengisi acara kebudayaan di Hongaria(2014) dan pernah mengikuti beberapa kepanitiaan antara lain Inisiasi Sanata Dharma sebagai divisi expo (2013), Pharmacy Performance sebagai divisi keamanan (2011) serta pernah mengikuti beberapa seminar.

104

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents