PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI OPTIMASI DAN VALIDASI PENETAPAN KADAR ALOPURINOL DALAM MATRIKS TABLET OBAT SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV DAN MATRIKS SAMPEL JAMU ASAM URAT SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Meta Kartika Sari NIM : 108114049

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI OPTIMASI DAN VALIDASI PENETAPAN KADAR ALOPURINOL DALAM MATRIKS TABLET OBAT SECARA SPEKTROFOTOMETRI UV DAN MATRIKS SAMPEL JAMU ASAM URAT SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Meta Kartika Sari NIM : 108114049

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014

i

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI





HALAMAN PERSEMBAHAN

“Think like a queen. A queen is not afraid to fail. Failure is a stepping stone to greatness!” -Oprah Winfrey-

Karya ini aku persembahkan untuk orang tua, keluarga, sahabat, dan almamaterku tercinta

vi


PRAKATA Puji dan syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas cinta kasih, berkat dan karunia-Nya yang begitu besar, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Optimasi Dan Validasi Penetapan Kadar Alopurinol DalamMatriks Tablet Obat Secara Spektrofotometri UVdan Matriks Sampel Jamu Asam Urat Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” sebagai salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak

pihak

dengan

adanya

masukan,

kritikan,

diskusi,

saran,

dan

bimbingan.Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada pihak-pihak yang telah membantu penulis selama penyusunan skripsi ini. 1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, masukan, motivasi, kritikan dan saran selama penelitian serta penyusunan skripsi ini. 2. Jefrry Julianus, M.Si. selaku Dosen Penguji yang memberikan bimbingan, kritik dan saran yang membangun untuk skripsi ini. 3. Dewi Setya, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing di laboratorium dan teman selama penelitian skripsi yang telah memberikan masukan, diskusi, saran, dan dukungan moral kepada penulis selama penelitian skripsi ini. 4. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Penguji yang memberikan banyak kritik dan saran yang membangun untuk skripsi ini.

vii


5. Aris Widyawati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas teladan seorang pemimpin yang diberikan. 6. Phebe Hendra, M.Si. selaku Wakil Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan Dosen Pembimbing Anak yang memberikan bimbingan, masukan dan saran selama penulis berkuliah dan menyusun naskah. 7. Sri Hartati Yuliani selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 8. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku Dosen Pengajar yang bersedia meluangkan waktunya untuk memberikan masukan diawal penelitian. 9. Bimo Aditya, Suparlan, Kunto, Wagiran dan segenap staf laboran yang turut membantu penulis selama penelitian. 10. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas ilmu, pengalaman, masukan, keceriaan, dan persahabatan yang telah diberikan. 11. Ria Kusuma Dewi dan Sugiarto Adji Soenarso sebagai rekan kerja dalam penelitian skripsi ini. Terima kasih atas kesabaran, kepercayaan, kerjasama, persahabatan, keceriaan dan semangat selama ini. 12. Papa dan mama tercinta yang telah memberikan kehidupan yang indah, yang selalu memberikan doa, semangat dan dukungan kepadaku. 13. Semua teman-teman FST A 2010 yang bersama-sama berjuang, terima kasih telah menjadi teman yang baik bagi penulis

viii


14. Teman angkatan 2010 yang bersama-sama berjuang dan mengisi sebagian cerita hidupku, terima kasih atas kebersamaan dan bantuan selama perkuliahan. 15. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, atas segala bantuan, semagat, dan doa yang menyertai penulis dari awal penelitian hingga selesainya penulisan skripsi ini. Penulis menyadari atas kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, karena keterbatasan wawasan dan kemampuan.Penulis dengan sengan hati membuka diri menerima kritik dan saran yang membangun dari semua pihak, dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan skripsi ini memberikan manfaat yang berarti bagi para pembaca.Akhir kata, penulis mempersembahkan skripsi ini demi majunya ilmu pengetahuan farmasi.

Yogyakarta, 11 November 2014

Penulis

ix


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL .................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING..........................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................

iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. iv LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ...................................

v

HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................................... vi PRAKATA ................................................................................................

vii

DAFTAR ISI .............................................................................................

x

DAFTAR TABEL .....................................................................................

xiv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................

xvi

INTISARI ................................................................................................

xviii

ABSTRACT .................................................................................................

xix

BAB I PENDAHULUAN ..........................................................................

1

A. Latar Belakang ...............................................................................

1

1. Permasalahan............................................................................

4

2. Keaslian Penelitian ...................................................................

4

3. Manfaat Penelitian ....................................................................

5

B. Tujuan Penelitian ...........................................................................

5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .........................................................

6

A. Obat Tradisional .............................................................................

6

B. Alopurinol ......................................................................................

7

x


C. Spektrofotometri UV ......................................................................

8

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ..................................................

10

1. Definisi dan Instrumentasi .......................................................

10

2. Optimasi Metode ......................................................................

18

3. Pemisahan Puncak Dalam Kromatografi ...................................

18

E. Validasi Metode Analisis................................................................

26

F. Landasan Teori...............................................................................

27

G. Hipotesis ........................................................................................

29

BAB III METODE PENELITIAN .............................................................

30

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................

30

B. Variabel Penelitian .........................................................................

30

1. Variabel Bebas .........................................................................

30

2. Variabel Tergantung .................................................................

30

3. Variabel Pengacau Terkendali ..................................................

30

C. Definisi Operasional .......................................................................

31

D. Bahan Penelitian.............................................................................

31

E. Alat Penelitian ................................................................................

32

F. Tata Cara Penelitian .......................................................................

32

1. Metode Spektrofotometri UV untuk Sediaan Tablet Alopurinol

32

a. Pembuatan Larutan NaOH 0,1 N.........................................

32

b. Pembakuan NaOH .............................................................

33

c. Pembuatan Larutan Stok dan Intermediet Alopurinol ..........

33

d. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ........................

34

xi


e. Pembuatan Seri Larutan Baku Alopurinol ...........................

34

f. Validasi Metode..................................................................

34

2. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .................................

35

a. Penyiapan Fase Gerak .........................................................

35

b. Optimasi KCKT Fase Terbalik............................................

35

c. Uji Kesesuaian Sistem KCKT Fase Terbalik ...........................

36

d. Validasi Metode Analisis KCKT Fase Terbalik ......................

38

G. Analisis Hasil .................................................................................

40

1. Analisis Hasil Validasi Metode Spektrofotometri UV ...............

40

2. Analisis Hasil Optimasi KCKT Fase Terbalik ...........................

41

3. Analisis Hasil Validasi MetodeKCKT Fase Terbalik ................

42

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 43 A. Verifikasi Kinerja Metode Analisis Alopurinol Spektrofotometri Ultraviolet ......................................................................................

44

1. Pembuatan dan Pembakuan Natrium HIdroksida ......................

44

2. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Alopurinol ...........

46

3. Pembuatan Seri Larutan Baku Alopurinol .................................

47

4. Validasi Metode Analisis ..........................................................

50

a. Linearitas ............................................................................

50

b. Sensitivitas .........................................................................

51

B. Pengembangan Metode Analisis Alpurinol dalam Jamu secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ..................................................

53

1. Optimasi Sistem KCKT ............................................................

53

xii


a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Alopurinol.......

53

b. Penentuan Fase Gerak .........................................................

54

c. Optimasi Komposisi Fase Gerak dan Flow Rate ..................

58

2. Evaluasi Penetapan Kadar Metode Analisis KCKT ...................

65

a. Uji Kesesuaian Sistem dalam Periode Pertama ....................

66

b. Uji Kesesuaian Sistem dalam Periode Kedua ......................

69

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN......................................................

77

A. Kesimpulan ....................................................................................

77

B. Saran ..............................................................................................

77

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................

78

LAMPIRAN ..............................................................................................

81

BIOGRAFI PENULIS ...............................................................................

122

xiii


DAFTAR TABEL Tabel I.

Indeks

polaritas

dan

karakteristik

solvent

selectivitybeberapa pelarut KCKT .......................................

14

Tabel II.

Komposisi optimasi fase gerak............................................

35

Tabel III.

Perbandingan panjang gelombang maksimum alopurinol dalam sampel tablet obat hasil pengukuran terhadap panjang gelombang maksimum teoritis ...............................

47

Tabel IV.

Data kurva baku alopurinol dalam tablet obat......................

48

Tabel V.

Hubungan r dengan n ..........................................................

49

Tabel VI.

Panjang

gelombang

maksimum

alopurinol

hasil

pengukuran ......................................................................... Tabel VII.

54

Perbandingan masing-masing komposisi fase gerak dan indeks polaritas ...................................................................

56

Tabel VIII.

Nilai parameter tR, N, HETP, Tf dan Rs ..............................

61

Tabel IX.

Persen koefisien variasi nilai tRdan AUC baku alopurinol periode I .............................................................................

67

Tabel X.

Data kurva baku alopurinol periode I ..................................

68

Tabel XI.

Persen koefisien variasi nilai tRdan AUC baku alopurinol periode II ............................................................................

70

Tabel XII.

Data kurva baku alopurinol periode II .................................

71

Tabel XIII.

Perbedaan uji kesesuaian sistem dalam periode tertentu ......

72

xiv


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Struktur alopurinol ..............................................................

7

Gambar 2.

Skema instrumentasi KCKT................................................

12

Gambar 3.

Skema sampler KCKT ........................................................

16

Gambar 4.

Ilustrasi difusi Eddy ............................................................

21

Gambar 5.

Ilustrasi pelebaran puncak ..................................................

22

Gambar 6.

Peak kromatogram untuk mengukur resolusi .......................

24

Gambar 7.

Penentuan asymmetry factor dan tailing factor ....................

26

Gambar 8.

Reaksi kalium biftalat dengan NaOH ..................................

45

Gambar 9.

Reaksi fenoftalein dengan NaOH ........................................

46

Gambar 10.

Plot kurva baku alopurinol dalam tablet obat.......................

50

Gambar 11.

Interaksi alopurinol dengan fase diam C18 ...........................

55

Gambar 12.

Interaksi alopurinol dengan fase gerak yang teroptimasi......

55

Gambar 13.

Kromatogram baku alopurinol pada fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90) ..........

Gambar 14.


Gambar 15.

Gambar 16.

59

60


61

Kurva van Deemter .............................................................

63

xv


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1.

Certificate of Analysisbaku alopurinol E. Merck .................

82

Lampiran 2.

Certificate of Analysis SPE MCX .......................................

83

Lampiran 3.

Perhitungan pembakuan NaOH 0,1 N .................................

84

Lampiran 4.

Spektrogram penetapan panjang gelombang maksimum alopurinol untuk Spektrofotometri UV ................................

85

Lampiran 5.

Data penimbangan kurva baku sampel tablet obat ...............

86

Lampiran 6.

Perhitungan Limit of Detection sampel tablet obat ...............

89

Lampiran 7.

Spectrogram scanning panjang gelombang maksimum alopurinol ...........................................................................

90

Lampiran 8.

Perhitungan polaritas ..........................................................

92

Lampiran 9.

Kromatogram hasil optimasi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90) ...........................

93

Lampiran 10. Kromatogram hasil optimasi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (20:80) ...........................

96

Lampiran 11. Kromatogram hasil optimasi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (30 : 70) .........................

99

Lampiran 12. Kromatogram alopurinol untuk pembuatan kurva baku, uji kesesuaian sistem dan penentuan LOD periode I ................

102

Lampiran 13. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar baku periode I

111

Lampiran 14. Perhitungan Limit of Detection periode I .............................

113

Lampiran 17. Kromatogram alopurinol untuk pembuatan kurva baku, uji kesesuaian sistem dan penentuan LOD periode II................

xvi

114


Lampiran 18. Perhitungan Limit of Detection periode II............................

120

Lampiran 19. Perhitungan uji t untuk slope kurva baku alopurinol periode I dan periode II ...................................................................

xvii

121


INTISARI Alopurinol merupakan obat anti-inflamasi nonsteroid (NSAID) yang dapat menurunkan kadar asam urat dalam darah. Dalam penggunaannya, alopurinol sering digunakan sebagai bahan kimia obat yang dicampurkan ke dalam jamu agar efek yang ditimbulkan lebih cepat.Alopurinol dapat menyebabkan reaksi kulit dan gangguan pencernaan. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui metode analisis yang tepat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Metode spektrofotometer dalam penelitian ini menggunakan detektor UV pada  257 nm. Verifikasi kinerja metode analisis alopurinol yang dilakukan menunjukkan nilai LOQ metode spektrofotometer UV yaitu 15,58g/mglebih besar dibandingkan LOQ yang harus dicapai (0,52g/mg), sehingga metode spektrofotometer UV kurang tepat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Penelitian selanjutnya dilakukan pengembangan metode analisis alopurinol dalam jamu secara KCKT.Sistem KCKT fase terbalik dalam penelitian ini menggunakan fase diam C18, detektor UV pada  274 nm. Optimasi dilakukan pada komposisi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides serta flow rate. Kondisi optimum yang diperoleh, yaitu komposisi fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90) dengan flow rate 0,5 mL/menit yang memenuhi kriteria waktu retensi, N, HETP, tailing factor, dan resolusi.Metode ini pada kondisi yang optimum memenuhi parameter validasi yang baik dengan linearitas (r = 0,993); CVtR = 0,3% dan CV AUC = 0,9%; LOD = 0,03 g/mL. Kata kunci : alopurinol, optimasi metode, validasi metode, KCKT fase terbalik, spektrofotometri UV

xviii


ABSTRACT Allopurinol is an anti-inflammation nonsteroid drug (NSAID) which can decreased gout in blood. In use, allopurinol is usually found in gout traditional medicine as adulterants to make a fast effect. Allopurinol can caused a skin reaction and digestion problem. The purpose of this study is to determined an analysis method which can identification that adulterants in traditional medicine. Spectrophotometer method in this study uses an UV detector at  257 nm. Verification about analysis method of alopurinol indicates that analysis method can not to identification adulterants in traditional medicine because LOQ this method 15,58g/mg is more bigger than LOQ (0,52g/mg). This study is done on developed with HPLC method for identification adulterants in traditional medicine. Reversed-phase HPLC system in this study uses a C18, UV detector at  274 nm. Optimization is done on the mobile phase composition of methanol : water + ammonium hydroxide 0,1% and flow rate. The optimum conditions are obtained mobile phase composition of methanol : water + ammonium hydroxide 0,1% (10:90) and a flow rate of 0,5 mL/minute those meet the criteria for retention time, N, HETP, tailing factor and resolution. This method at optimum condition has a good validation parameters with linearity (r = 0,993); CVtR = 0,3% dan CV AUC = 0,9%; LOD = 0,03 g/mL. Keywords:allopurinol, method optimization,method validation,reversed-phaseHPLC, UV spectrophotometry

xix


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Penyakit asam urat merupakan salah satu masalah kesehatan yang sering dialami oleh masyarakat lanjut usia di Indonesia. Kebiasaan dan pola hidup yang kurang sehat serta mengkonsumsi makanan yang tinggi purin menjadi penyebab utama tingginya prevalensi penyakit ini (Iskandar, 2006). Indonesia merupakan Negara yang memiliki kekayaan hayati yang cukup besar terutama tanaman yang berkhasiat obat atau lebih dikenal dengan obat tradisional. Pengertian obat tradisional yaitu bahan atau ramuan bahan berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian atau galenik, atau campuran dari bahan tersebut, yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman(Permenkes RI N0. 007, 2012). Berdasarkan variasinya, Badan POM (2004) mengelompokan sediaan bahan alam menjadi tiga, yaitu sediaan jamu, sediaan obat herbal terstandar dan sediaan fitofarmaka.Ketiga sediaan tersebut memiliki persyaratan yang berbeda yaitu untuk jamu klaim khasiatnya berdasarkan data empiris, sediaan obat herbal terstandar bahan bakunya harus distandarisasi dan sudah diuji praklinik, sedangkan fitofarmaka mirip dengan obat modern yang bahan bakunya harus distandarisasi dan harus melalui uji klinik. Berdasarkan Keputusan Kepala Badan POM no.HK.00.05.41.1384 tahun 2005, dalam obat tradisional dilarang menggunakan bahan kimia hasil isolasi atau

1


2

sintetik berkhasiat obat, narkotika atau psikotropika dan hewan atau tumbuhan yang dilindungi sesuai dengan ketentuan peraturan perundang-undangan yang berlaku. Namun seiring dengan berkembangnya jaman, banyak industri obatobatan dan obat tradisional menggunakan salah satu bahan kimia obat dalam kandungan jamu. Alopurinol merupakan salah satu bahan kimia obat yang terkadang sengaja ditambahkan ke dalam jamu asam urat. Alopurinol termasuk golongan obat anti-inflamasi nonsteroid (NSAID) yang dapat menurunkan kadar asam urat dalam darah. Dalam penggunaannya, jamu dikonsumsi hampir setiap hari sehingga sangat berbahaya jika terkandung bahan kimia obat di dalamnya.Penggunaan alopurinol yang berlebihan dapat menimbulkan reaksi kulit seperti kulit kemerahan, reaksi alergi berupa demam, leukopenia, pruritus, eosinofillia, artralgia dan gangguan pencernaan (Dipiro et al., 2005).No Observe Adverse Effect Level (NOAEL) merupakan dosis tertinggi sampai menimbulkan efek buruk yang tidak teramati. Alopurinol memiliki nilai NOAEL sebesar 12 mg/kgBB/hari (Anonim, 2014). Oleh karena itu, perlu dilakukan penetapan kadar alopurinol untuk matriks sampel jamu asam urat. Berdasarkan Depkes RI (1974), penetapan kadar alopurinol dalam tablet dapat diukur dengan spektrofotometri UV.Untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu, perlu

dilakukan

verifikasi

kinerja

metode

analisis

alopurinol

secara

spektrofotometri UV. Matriks jamu sangat kompleks sehingga perlu dilakukan pengembangan metode analisis dan clean up alopurinol dalam matriks jamu.Analisis alopurinol


3

dalam jamu dilakukan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dipilih untuk analisis alopurinol dalam jamu asam urat karena mampu memisahkan dari suatu campuran sekaligus menetapkan kadarnya, mudah, cepat dan sensitif.Detektor UV dipilih karena alopurinol memiliki kromofor yang dapat memberikan serapan di daerah UV. Untuk menetapkan alopurinol dalam jamu dengan metode KCKT perlu dilakukan optimasi pada sistem KCKT dan validasi metode penetapan kadar terlebih dahulu untuk memperoleh data yang dapat dipercaya. Pada penelitian ini, optimasi pemisahan dengan KCKT fase terbalik dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk memperoleh kondisi yang optimum dengan parameter nilai waktu retensi, N, HETP, tailing factor, dan resolusi. Optimasi pada sistem KCKT fase terbalik untuk penetapan kadar alopurinol dalam matriks jamu asam urat dengan fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides dan fase diam C18 yang telah optimum digunakan dalam validasi metode analisis untuk menjamin bahwa metode yang diperoleh dapat dipercaya dan dipertanggungjawabkan sesuai dengan persyaratan yang telah ditentukan. Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis antara lain presisi, linearitas, dan sensitivitas. Penelitian ini merupakan tahap awal dari serangkaian penelitian yang meliputi “Optimasi Isolasi Alopurinol Dalam Sediaan Tablet dan Jamu” dan “Validasi

Metode

Analisis

Alopurinol

Dalam

Matriks

Tablet

Secara

Spektrofotometri dan Matriks Jamu Asam Urat Secara KCKT Fase Terbalik serta Aplikasinya”.


4

1. Permasalahan Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut : a. Apakah metode penetapan kadar alopurinol secara spektrofotometri UV dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu? b. Apakah dapat dilakukan optimasi komposisi fase gerak dan flow rate yang optimal dalam pemisahan alopurinol pada matriks sampel jamu asam urat dengan metode KCKT? c. Bagaimana hasil optimasi komposisi fase gerak dan flow rate yang optimal dalam periode tertentu dapat memberikan data dengan validitas yang baik menggunakan metode KCKT?

2. Keaslian Penelitian Sejauh pengetahuan penulis, optimasi dan validasi penetapan kadar alopurinol dalam matriks tablet secara spektrofotometri UV dan matriksjamu asam urat secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi belum pernah dilakukan sebelumnya.BerdasarkanDepkes RI (1974), kadar alopurinol dalam tablet dapat ditetapkan menggunakan metode spektrofotometri UV. Namun, penelitian mengenai optimasi dan validasi penetapan kadar alopurinol dalam matriks tablet secara spektrofotometri UV dan matriksjamu asam urat secara KCKTfase terbalik dengan fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1% dalamakuabides dan fase diam C18 belum pernah dilakukan.


5

3. Manfaat Penelitian a.

Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi mengenai optimasi sistem KCKT dan parameter validitas dalam membandingkan kurva baku alopurinol dalam periode tertentu secara KCKT dan penetapan kadar alopurinol secara spektrofotometri UV. b.

Manfaat praktis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan

sumbangan bagi ilmu pengetahuan mengenai optimasi sistem KCKT dan parameter validitas dalam membandingkan kurva baku alopurinol dalam periode tertentu secara KCKT dan penetapan kadar alopurinol secara spektrofotometri UV.

B. Tujuan Penelitian 1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode penetapan kadar alopurinol secara spektrofotometri UV dapat digunakan atau tidak untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu. 2. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum komposisi fase gerak dan flow rate dalam pemisahan alopurinol pada matriks sampel jamu asam urat dengan metode KCKT. 3. Mengetahui sistem KCKT masih memberikan data dengan validitas yang baik atau tidak dalam periode tertentu menggunakan metode KCKT yang optimal.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Obat Tradisional Permenkes RI N0. 007 Tahun 2012 menyatakan bahwa obat tradisional merupakan bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dari bahan tersebut yang secara turun-temurun telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman. Sediaan obat tradisional yang banyak beredar saat ini terbuat dari bahan simplisia nabati, yaitu bagian tanaman atau seluruh tanaman, baik segar atau sudah dikeringkan, atau hasil penyarian dengan berbagai bentuk sediaan seperti rajangan, serbuk, pil, tablet, kapsul, cairan (sediaan luar dan sediaan dalam), salep, krim, parem, tapel dan lainnya (Badan Pengawasan Obat dan Makanan, 2004). Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia nomor 179 / Men.Kes. / Per / VII / 76 tentang produksi dan distribusi obat tradisional menyatakan bahwa “untuk melindungi kesehatan dan keselamatan masyarakat perlu adanya pencegahan terhadap produksi dan distribusi obat tradisional yang dapat merugikan dan membahayakan masyarakat”. Sediaan obat tradisional perlu dilakukan berbagai jenis pengujian untuk mengetahui mutu dari sediaan obat tradisional yang akan diproduksi. Pengujian yang dilakukan meliputi pengujian mutu dan keamanan.

6


7

Sesuai dengan Keputusan Kepala Badan POM no.HK.00.05.41.1384 tahun 2005, dalam obat tradisional dilarang menggunakan : 1. Bahan kimia hasil isolasi atau sintetik berkhasiat obat 2. Narkotika atau psikotropika 3. Hewan atau tumbuhan yang dilindungi sesuai dengan ketentuan peraturan perundang-undangan yang berlaku.

B. Alopurinol Alopurinol juga dikenal dengan 4-hydroxypyrazolopyrimidine dan nama berdasarkan IUPAC 1H - Pirazolol - (3,4) - dipirimidin - 4 – ol (Chemaxon, 2013).

Alopurinol

memiliki

rumus

molekul

C5H4N4O;

berat

molekul

136,11g/mol. Berbentuk serbuk halus putih hingga hampir putih. Berbau lemah.Titik lebur > 300°C.Praktis tidak larut dalam kloroform dan eter.Larut dalam larutan kalium dan natrium hidroksida (Depkes RI, 1995).Sedikit larut dalam air dan etanol (Anonim, 2014). Alopurinol memiliki nilai log koefisien partisi oktanol : air (log Kow) 0,33 (Machata, 2005) dan pKa 9,4.

Gambar 1.Struktur Alopurinol (Depkes RI, 1995)

Alopurinol merupakan obat anti-gout disease yang dapat menurunkan kadar asam urat dalam darah dan digunakan untuk mengatasi hiperurisemia yang


8

berkaitan dengan gout kronik, pembentukan batu asam urat yang berulang-ulang, gangguan enzim, nephropati asam urat akut, kemoterapi kanker. Alopurinol juga digunakan untuk mengurangi oksidasi dengan memblok produksi radikal bebas.Penggunaan alopurinol untuk gout dan hiperurisemia dengan aksi menghambat enzim xantin oksidase sehingga enzim tersebut tidak dapat mengkatalisis perubahan hipoxantin menjadi xantin dan perubahan xantin menjadi asam urat (Katzung, 2004). Penggunaan alopurinol yang berlebihan dapat menimbulkan reaksi kulit seperti kulit kemerahan, reaksi alergi berupa demam, leukopeni, pruritus, eosinofillia, artralgia dan gangguan pencernaan (Dipiro et al., 2005).No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) merupakan dosis tertinggi sampai menimbulkan efek buruk yang tidak teramati. Alopurinol memiliki nilai NOAEL sebesar 12 mg/kgBB/hari (Anonim, 2014). Tablet alopurinol dapat ditetapkan kadarnya secara spektrofotometri ultraviolet dengan panjang gelombang serapan maksimum kurang lebih 250 nm dengan menggunakan larutan NaOH P 0,4% b/v dan HCl 1% v/v sebagai blanko (Depkes RI, 1974).

C. Spektrofotometri UV Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm. Molekul yang dikenakan suatu gelombang radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai dapat terabsorbsi atau terjadi penyerapan karena serapan tersebut akan menghasilkan perbedaan energi serapan. Selisih energi setara dengan energi foton


9

yang diserap.Energi yang berubah dari keadaan dasar (ground state) ke keadaan tereksitasi (excited state)disebut transisi. E − E = h. v = Keterangan,

h. c λ

(1)

E1 = energi pada keadaan dasar/lebih rendah (ground state) E2 = energi pada keadaan tereksitasi/lebih tinggi (excited state) h = konstanta Planck v = frekuensi foton yang diabsorbsi/diserap  = panjang gelombang c = kecepatan (Gandjar dan Rohman, 2010).

Serapan cahaya molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel tergantung pada struktur elektronik dari molekul.Spektrofotometri ultraviolet dan visibel senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan tenaga elektronik.Keuntungan dari serapan ultraviolet yaitu gugus-gugus karakteristik dapat dikenal dalam molekul yang sangat kompleks.Spektrum ultraviolet menggambarkan hubungan antara panjang gelombang atau frekuensi serapan dengan intensitas serapan atau absorbansi (Sastrohamidjojo, 2002). Dalam memilih panjang gelombang terkait hubungan sifat optik cuplikan dengan pelarut dimana adanya perbedaan kemampuan dari pelarut untuk mensolvasi antara keadaan dasar dengan keadaan tereksitasi (Gandjar dan Rohman, 2010).Penyerapan radiasi UV atau visibel terkait dari elektron terluar atau elektron valensi dari molekul dan tergantung pula pada jenis ikatan kimia


10

dalam molekul, adanya ikatan kimia penyebab terjadinya serapan sinar UV-VIS disebut kromofor (Johnson, 1978). Kromofor merupakan ikatan rangkap tidak jenuh selang-seling yang menyerap radiasi pada daerah UV dan visibel, sedangkan auksokrom merupakan gugus jenuh yang terikat pada kromofor dan dapat menyebabkan adanya perubahan panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum.Ciri dari auksokrom adalah gugus heteroatom yang langsung terikat pada kromofor, seperti –OCH3, –Cl, –OH, dan –NH2.Penambahan auksokrom dapat menyebabkan pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih panjang karena adanya substitusi gugus atau atom atau adanya pengaruh pelarut (Sastrohamidjojo, 2002).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 1. Definisi dan Instrumentasi Kromatografi merupakan suatu teknik dimana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi karena solut-solut ini melewati suatu kolom

kromatografi

(Gandjar

dan

Rohman,

2007).Definisi

tersebut

menggambarkan bahwa dalam sistem kromatografi terjadi pemisahan zat-zat terlarut yang terdistribusi diantara fase diam dan fase gerak berdasarkan kemampuan solut terangkut melewati fase diamnya.Perpindahan solut melewati fase diam tergantung pada afinitas relatif antar fase yang ditentukan berdasarkan parameter retensi (Kealey, 2005). Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan metode yang paling banyak dipilih untuk melakukan analisis.KCKT sudah banyak dikembangkan


11

untuk penelitian bahan-bahan obat, bahan kimia, makanan dan obat. Hal tersebut dikarenakan KCKT memiliki kemampuan untuk memisahkan zat analit serta kuantifikasinya atau menetapkan jumlah zat analit tersebut berdasarkan respon Area Under Curve (AUC). KCKT biasa digunakan untuk menganalisis ketidakmurnian suatu senyawa karena KCKT mampu untuk mengkuantifikasi senyawa (Rohman, 2009).Keunggulan lain dari KCKT adalah dapat digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa yang memiliki struktur yang mirip, analisis molekul non-volatil (sulit menguap) seperti terpenoid rantai panjang, golongan fenolik, alkaloid, lipid dan gula (Haborne, 1998) yang tidak dapat dideteksi dengan kromatografi gas, dan analisis senyawa dengan jumlah yang sangat kecil.Metode KCKT merupakan salah satu teknik analisis yang paling banyak digunakan untuk analisis kuantitatif obat-obatan, biomolekul, polimer, dan senyawa organik lainnya (Ahuja and Dong, 2005). Teknik kromatografi membutuhkan adanya zat yang terlarut dan terdistribusi diantara dua fase, yakni fase diam dan fase gerak.Fase diam (sorben yang dikemas dalam kolom) bertindak sebagai penjerap.Fase gerak (fase cair yang mengalir) membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau lebih akhir.Pada kromatografi partisi digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda.Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam bersifat nonpolar, maka disebut sebagai kromatografi fase terbalik (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995). Sistem KCKT merupakan gabungan dari berbagai macam alat yang dirangkaikan untuk dapat menghasilkan suatu pemisahan, pendeteksian dan


12

kuantifikasi zat analit.Rangkaian alat tersebut dikenal dengan instrumen kromatografi sebagai berikut.

Gambar 2. Skema Instrumentasi KCKT (Gandjar dan Rohman, 2010)

Menurut Gandjar dan Rohman (2010), instrumen KCKT pada dasarnya terdiri atas beberapa komponen yaitu : wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam peak. a. Fase gerak Sebelum digunakan, fase gerak harus dilakukan penyaringan terlebih dahulu untuk menghilangkan partikel kecil yang mungkin ada sebagai pengotor karena dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi.Partikel pengotor yang terkumpul pada kolom atau selang penhubung dapat menimbulkan penyumbatan.Selain itu, fase gerak juga harus di degassing terlebih dahulu untuk menghilangkan gelembung atau gas yang terdapat pada fase gerak, adanya gelembung atau gas tersebut yang berkumpul pada detektor dapat mengacaukan


13

analisis.Saat pembuatan fase gerak, dianjurkan untuk menggunakan fase gerak dengan kemurnian yang tinggi agar tingkat pengotor yang ada rendah dan tidak mengacaukan sistem kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2010). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur dan berperan dalam daya elusi dan resolusi.Daya elusi dan resolusi tersebut ditentukan berdasarkan polaritas keseluruhan pelarut fase gerak, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.Terdapat dua fase yang biasanya digunakan dalam sistem KCKT yaitu fase normal dan fase diam. Penentuan kedua fase ini tergantung pada tingkat kepolaran dari masing-masing fase gerak dan fase diam yang digunakan.Jika fase diam yang digunakan bersifat lebih polar dibandingkan fase geraknya maka disebut fase normal.Pada KCKT fase

normal,

kemampuan

elusi

senyawa

nonpolar

meningkat

dengan

meningkatnya polaritas pelarut.Sedangkan untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dibandingkan fase gerak).Kemampuan elusi senyawa nonpolar menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Rohman, 2009). Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara gradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). Metode isokratik merupakan metode pencampuran fase gerak secara manual dengan tangan dan saat memasuki sistem KCKT tidak dibutuhkan adanya pencampuran fase gerak kembali

dan dilakukan dengan satu

pompa.Metode gradien merupakan metode pencampuran fase gerak yang dilakukan di dalam sistem KCKT, menggunakan beberapa pompa untuk memompa pelarut ke dalam wadah pencampuran fase gerak dan hasil


14

pencampuran fase gerak tersebut dialirkan ke dalam kolom (Snyder, Kirkland and Dolan, 2010). Pemilihan fase gerak dalam suatu metode pemisahan berdasarkan pada indeks polaritas (P’) campuran fase gerak tersebut.Semakin besar nilai indeks polaritasnya menyatakan semakin polar fase gerak yang digunakan.Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau lebih campuran pelarut yang saling bercampur secara keseluruhan. Campuran fase gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks polaritas fase gerak (Harvey, 2000). ′ Keterangan,

=Φ . ′ + Φ . ′

(2)

ΦAdan Φ B = fraksi volume pelarut pada pelarut A dan B P’Adan P’B = indeks polaritas pelarut pada pelarut A dan B (Harvey, 2000).

Tabel I. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity beberapa pelarut KCKT (Snyder, Kirkland dan Dolan, 2010)


15

Deret eluotropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan panduan yang berguna dalam pemilihan fase gerak yang akan digunakan dalam KCKT. Deret eluotropik dapat dilihat pada tabel I. b. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sesuai dengan syarat wadah pelarut yaitu pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang sering digunakan untuk pompa yakni gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3mL/menit (Rohman, 2009). Penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah agar dapat menjamin proses penghantaran fase gerak yang berlangsung dengan tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas gangguan (Gandjar dan Rohman, 2010). Selain itu, pompa yang digunakan juga harus dapat menjamin akurasi dan konsistensi kecepatan alir dari fase gerak yang dibutuhkan untuk menjaga stabilitas dan ripitabilitas interaksi antara zat analit dengan fase diam. Kecepatan alir yang buruk dapat mempengaruhi waktu retensi dan resolusi pemisahan analit (Chan et al., 2004). c. Tempat penyuntikan sampel Penyuntikan sampel pada KCKT dilakukan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir menuju kolom. Penggunaan syringe atau autosampler merupakan wadah yang digunakan dalam penyuntikan sampel (Gandjar dan Rohman, 2010). Pada sistem KCKT, penyuntikan sampel melalui loop


16

injectoryang dapat menyimpan volume dari 0,5L – 2 mL. Pada posisi load, sampel diinjeksikan dan loop sampler terisolasi dari fase gerak. Kemudian ketika katup dipindahkan ke posisi loading (posisi inject), injectorakan berpindah ke posisi inject dan saat itu fase gerak mengaliri sampel dan terbawa memasuki kolom (Harvey, 2000).

Gambar 3.Skema sampler KCKT. (a) posisi load, sampel diinjeksikan dan terisolasi dari fase gerak. (b) posisi inject, sampel terbawa fase gerak dan memasuki kolom (Denney, 1993)

d. Kolom Kolom merupakan bagian terpenting dalam rangkaian KCKT karena fase diam dalam KCKT terdapat dalam kolom.Dengan demikian, pemisahan analit dari komponen lainnya terjadi pada kolom.Keberhasilan pemisahan analit tergantung pada keadaan kolom, sehingga pemilihan kolom sangatlah penting (Mulja dan Suharman, 1995). Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Modifikasi silika secara kimia akan menutupi gugus silanol dan menggantinya dengan guus fungsional


17

lain. Hasil reaksi kimiawi tersebut akan menghasilkan silika yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan siloksan (Si-O-Si). Hasil modifikasi tersebut memiliki karakter kromatografi dan selektivitas yang berbeda dengan gugus silanol bebas (Gandjar dan Rohman, 2010). Oktadesilsilan (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, dan tinggi. e. Detektor Terdapat dua golongan detektor pada KCKT yaitu detektor umum dan spesifik.Detektor umum merupakan detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat selektif dan spesifik. Contoh dari detektor umum adalah detektor indeks dan detektor massa. Detektor spesifik merupakan detektor yang hanya dapat mendeteksi suatu analit sesuai dengan spesifikasi tertentu, misalnya detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia.Penggunaan detektor spesifik, maka analit yang digunakan harus memiliki persyaratan yang sesuai untuk dapat dideteksi dengan detektor tersebut (Rohman, 2009). Detektor Spektrofotometri UV-Vis Detektor UV-Vis merupakan detektor yang paling banyak digunakan karena hampir semua senyawa obat memiliki struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Sel detektor umumnya berupa tabung berdiameter 1 mm dan panjang celah optik 10 mm (Gandjar dan Rohman, 2007). Senyawa yang dapat dideteksi dengan detektor UV-Vis ini adalah senyawa yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom serta memiliki serapan pada panjang gelombang UV dan Vis.


18

Menurut Gandjar dan Rohman (2010), detektor pada KCKT memiliki beberapa karakteristik sebagai berikut : a. Respon terhadap analit cepat dan reprodusibel b. Mampu mendeteksi analit hingga kadar yang sangat kecil c. Stabil saat dioperasikan d. Memiliki sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita e. Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran luas (AUC) f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak 2. Optimasi Metode Tahap optimasi merupakan serangkaian kondisi awal yang muncul pada tahap pengembangan metode dan harus dimaksimalkan dengan baik.Hal yang harus dimaksimalkan tersebut yaitu resolusi, bentuk puncak, jumlah lempeng, kapasitas, dan retention time (Gandjar dan Rohman, 2010). Kecepatan alir yang optimal biasanya 0,8 mL/menit; 1,2 mL/menit; dan 2,5 mL/menit untuk kolom dengan diameter internal 4,6 mm dan ukuran partikel berkisar 3-10 m. Semakin kecil ukuran partikel akan menghasilkan pemisahan yang lebih cepat dan optimal (Ahuja and Rasmussen, 2007). 3. Pemisahan Puncak Dalam Kromatografi Karakteristik umum yang biasanya digunakan untuk mendeskripsikan kolom, sistem dan pemisahan kromatografi adalah faktor retensi (k’), efisiensi (N), selektivitas (), dan resolusi (R) (Ahuja and Rasmussen, 2007).


19

a. Efisiensi kolom Tujuan umum kromatografi adalah memisahkan suatu campuran yang akan dianalisis. Kualitas pemisahan dengan kromatografi dapat dilihat berdasarkan 2 parameter, yakni resolusi dan efisiensi.Parameter resolusi yaitu tingkat pemisahan puncak-puncak analit yang saling berdekatan.Sementara parameter efisiensi yaitu ukuran banyaknya pelebaran puncak dari masing-masing puncak zat analit.Efisiensi pemisahan suatu kolom terdiri dari dua teori yaitu teori lempeng dan teori laju. i.

Teori Lempeng Efisiensi merupakan karakteristik yang penting dalam kolom.Efisiensi

diekspresikan sebagai jumlah lempeng teoritis (N) yang dihitung dengan persamaan sebagai berikut : = 16 Dimana,

(3)

tR = retention time analit W = lebar peak pada posisi baseline

Efisiensi kolom dalam kromatografi berkaitan juga dengan waktu retensi atau retention time, yakni lamanya waktu komponen atau molekul yang akan dianalisis berada di dalam kolom (Gandjar dan Rohman, 2007). Pengukuran terhadap efisiensi kolom membutuhkan faktor lebar peak (W) karena waktu retensi berpengaruh terhadapnya, peningkatan nilai W akan meningkatkan retention time. Semakin tinggi jumlah lempeng teoritis pada suatu pemisahan menyatakan semakin baik pula efisiensi kolom, dan sebaliknya jika


20

nilai lempeng teoritis yang didapatkan kecil, maka efisiensi kolom juga menurun (Miller dan Crowther, 2010). Terdapat parameter lain terkait efisiensi kolom, yakni tinggi plat atau plate height (H) yang dirumuskan dengan persamaan berikut : =

(4)

Dimana, L merupakan panjang kolom. Tinggi plat (H) atau sering disebut tinggi plat teori (HETP = Height Equivalent Theoretical Plate) dalam kromatografi merupakan panjang kolom kromatografi (dalam mm) yang diperlukan sampai terjadinya satu kali keseimbangan molekul solute dalam fase gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2010). HETP dapat digunakan untuk membandingkan efisiensi kolom dengan panjang kolom yang berbeda karena pada pengukuran HETP ini, panjang kolom yang bervariasi dibandingkan dengan jumlah lempeng teoritis masing-masing kolom sehingga perbandingannya tidak berdasarkan masing-masing panjang kolom.Nilai HETP berbanding terbalik dengan jumlah lempeng teoritis (N).Semakin tinggi nilai N maka semakin kecil nilai HETP dan semakin efisien kolom yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007). ii.

Teori Laju Teori lempeng hanya menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif,

tetapi tidak dapat menggambarkan pengaruh variabel-variabel lain yang menyebabkan terjadinya pelebaran peak sehingga perlu diketahui teori laju.Pada waktu migrasi, zat analit mengalami transfer dalam fase diam dan fase gerak berulang-ulang.Zat analit hanya dapat bergerak jika berada dalam fase gerak


21

sehingga migrasi di dalam kolom juga tidak teratur dan mengakibatkan laju ratarata analit relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi, sehingga terjadi pelebaran peak analit. Alasan timbulnya bentuk puncak dan pelebaran puncak didasarkan pada difusi Eddy, difusi longitudinal, dan transfer massa (Snyder dkk., 2010). 1) Difusi Eddy Difusi Eddy mempresentatifkan faktor lain yang menyebabkan pelebaran pita. Molekul analit masuk ke dalam kolom melewati partikel fase diam dengan arah yang berbeda-beda menuju keluar kolom. Molekul yang bergerak lebih lambat akan keluar lebih lambat dan molekul yang bergerak lebih cepat akan keluar lebih dahulu. Pelebaran pita tidak tergantung pada kecepatan alir tetapi hanya bergantung dari penyusunan dan ukuran partikel dalam kolom. Pelebaran pita yang diakibatkan karena difusi Eddy akan semakin besar seiring dengan meningkatnya ukuran partikel dalam kolom (Snyder dkk., 2010). Difusi Eddy dapat diminimalkan dengan memperkecil diameter rata-rata partikel dalam kolom hingga sekecil mungkin dan seseragam mungkin (Willard et al., 1988).

Gambar 4. Ilustrasi difusi Eddy saat memasuki kolom dan menyebabkan pelebaran pita (Miller dan Crowther, 2010)


22

2) Difusi longitudinal Difusi longitudinal menggambarkan pergerakan acak molekul dalam fase gerak.Difusi longitudinal berpengaruh secara signifikan terhadap ketinggian lempeng pada kecepatan fase gerak yang rendah atau lambat.Sedangkan pada kecepatan difusi solut yang tinggi dalam fase gerak menyebabkan molekul solut terdispers secara aksial dan lambat bermigrasi melalui kolom (Willard et al., 1988).

Gambar 5. Ilustrasi yang menyebabkan pelebaran puncak selama pemisahan menggunakan KCKT (Snyder dkk., 2010)

3) Transfer massa Transfer massa dapat menyebabkan pelebaran pita, terjadinya transfer massa disebabkan oleh transfer massa fase gerak yang merupakan kecepatan alir analit yang mempengaruhi pelebaran pita, diantara partikel fase diam terdapat


23

rongga yang jika analit melewatinya akan lebih cepat keluar terbaca detektor dan jika analit cenderung lebih menyamping maka akan terjadi interaksi dahulu terhadap partikel fase diam. Transfer massa fase diam mempresentatifkan analit yang terpenetrasi ke dalam partikel fase diam dan tinggal lebih lama sebelum meninggalkan partikel fase diam. Perbedaan lama waktu tinggal dan adanya analit yang terlebih dahulu terelusi keluar akan menyebabkan pelebaran pita (Snyder dkk., 2010). b. Faktor retensi Jika nilai faktor retensi (k’) kecil maka resolusi menjadi lebih buruk. Ketika nilai k’ dibuat lebih besar, resolusi akan meningkat. Peningkatan nilai ∝ juga akan meningkatkan nilai resolusi (Snyder dkk, 2010). Faktor retensi (k’) dirumuskan dengan persamaan sebagai berikut : =

−

(5)

c. Resolusi Resolusi dapat didefinisikan sebagai perbedaan waktu antara retention time dua puncak peak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak, sehingga yang sangat berpengaruh terhadap pemisahan komponen analit merupakan retention time (tR) masing-masing analit dan lebar puncaknya (W). Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 untuk memberikan pemisahan yang baik (Gandjar dan Rohman, 2010). =

( − ) 0,5( + )

(6)


24

Gambar 6. Peak kromatogram untuk mengukur resolusi (Snyder dkk., 1997)

d. Selektivitas Selektivitas

merupakan

kemampuan

sistem

kromatografi

untuk

memisahkan dua analit dan dapat digambarkan sebagai rasio faktor retensi dengan persamaan sebagai berikut : =

′ = ′

− −

(7)

Selektivitas tergantung pada sifat dari fase diam dan komposisi fase gerak.Selektivitas harus > 1,0 untuk pemisahan puncak (Ahuja and Dong, 2005). Selektivitas dapat menghasilkan pergeseran satu puncak relatif terhadap puncak lainnya dengan menaikan nilainya. Efisiensi pemisahan yang ditunjukkan oleh faktor N akan berubah dengan mengubah panjang kolom (L) atau mengubah kecepatan alir fase gerak. Menaikan lempeng teoritis (N) suatu kolom akan mengakibatkan penyempitan dua puncak sehingga lebar puncak (W) menjadi kecil dan resolusi menjadi lebih besar. Menurunkan nilai k’ akan menghasilkan pemisahan yang jelas dan retention time yang pendek, sebaliknya menaikan nilai k’ akan memberikan resolusi yang lebih baik dan waktu pemisahan menjadi naik (Gandjar dan Rohman, 2010).


25

e. Tailing factor Kondisi yang diperlukan dalam analisis KCKT yaitu kondisi puncak yang simetris karena puncak yang asimetris dapat menghasilkan bilangan lempeng teoritik dan faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan tidak teliti, penurunan derajat resolusi dan puncak-puncak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta waktu retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan adalah peak asymmetry factor (As), yang diukur pada 10% tinggi puncak (Snyder dkk., 1997). Faktor asimetri atau sering disebut tailing factor (Tf) yang dinyatakan dengan rasio antara lebar setengah tinggi puncak kromatogram yang menghasilkan nilai Tf = 1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat simetris.

Nilai

Tf>

1

menunjukkan

bahwa

kromatogram

mengalam

tailing.Semakin besar nilai Tf menunjukkan bahwa kolom yang digunakan semakin kurang efisien.Berdasarkan hal tersebut maka nilai Tf dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007). Jika nilai Tf dan As = 1 menyatakan bahwa telah terjadi pemisahan yang baik pada kromatogram. Semakin meningkatnya nilai Tf dan As maka pemisahan yang terjadi pada kolom semakin tidak baik. Nilai Tf yang lebih dari 2 dapat mengganggu analisis analit, sehingga syarat tailing factor untuk analisis yaitu kurang dari 2 (Snyderdkk., 2010).


26

Gambar 7. Penentuan asymmetry factor (As) dan tailing factor (TF) (Snyder dkk., 2010)

E. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis merupakan suatu proses tindakan penilaian terhadap suatu parameter, berdasarkan perlakuan di laboratorium untuk membuktikan

bahwa

parameter

tersebut

memenuhi

persyaratan

dalam

penggunaannya. Parameter-parameter tersebut antara lain sebagai berikut : a. Presisi dan repeatability. Presisi merupakan derajat keterulangan hasil uji terhadap metode yang dilakukan secara berulang pada sampel. Repeatability adalah ukuran keterulangan dari prosedur analisis dalam jangka waktu yang singkat, oleh analis dan peralatan yang sama (The United States Pharmacopeia, 2007). b. Linearitas.

Linearitas

merupakan

kemampuan

suatu

metode

untuk

mendapatkan hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel (The United States Pharmacopeia, 2007). c. Limit of Detection (LOD). LOD adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih memberikan respon yang signifikan dibandingkan blanko (The United States Pharmacopeia, 2007).


27

F. Landasan Teori Asam urat merupakan salah satu masalah kesehatan yang sering dialami oleh masyarakat di Indonesia karena kebiasaan dan pola hidup yang kurang sehat.Alopurinol merupakan obat anti gout yang dapat menurunkan kadar asam urat dalam darah (Katzung, 2004). Dalam perkembangannya, seringkali alopurinol dijadikan sebagai bahan kimia obat yang dicampurkan ke dalam jamu.Keputusan Kepala Badan POM no.HK.00.05.41.1384 tahun 2005, menyatakan bahwa dalam obat tradisional dilarang menggunakan salah satunya yaitu bahan kimia hasil isolasi atau sintetik berkhasiat obat.Oleh karena itu harus diketahui kadarnya dalam jamu asam urat.Informasi terkait dosis tertinggi alopurinol hingga menimbulkan efek buruk yang tidak teramati (NOAEL) adalah sebesar 12mg/kgBB/hari (Anonim, 2014).Berdasarkan nilai NOAEL, dapat ditetapkan batas kuantifikasi (LOQ) yang harus dicapai dari alopurinol. Depkes RI (1974) menyatakan bahwakadar alopurinol dalam tablet dapat diukur

dengan

spektrofotometri

UV.Untuk

mengetahui

apakah

metode

spektrofotometri dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu, perlu

dilakukan

verifikasi

kinerja

metode

analisis

alopurinol

secara

spektrofotometri UV. Matriks jamu sangat kompleks sehingga perlu dilakukan pengembangan metode analisisdan clean upalopurinol dalam matriks jamu. Analisis alopurinol dalam jamu dilakukan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dengan fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1%


28

dalam akuabides dan fase diam C18. KCKT dipilih untuk analisis alopurinol dalam jamu asam urat karena mampu memisahkan dari suatu campuran sekaligus menetapkan kadarnya, mudah, cepat dan sensitif.Detektor UV dipilih karena alopurinol memiliki kromofor yang dapat memberikan serapan di daerah UV. Fase diam C18 digunakan karena fase diam ini cocok untuk senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi dan memiliki pH di antara 2,5-7,5. Interaksi pada C18 didasarkan pada interaksi van der Waals. Bagian cincin benzen dari alopurinol merupakan bagian hidrofobik yang akan berinteraksi dengan fase diam. Untuk dapat mengelusi alopurinol, digunakan campuran pelarut metanol :amonium hidroksida 0,1%dalam akuabides. Alopurinol bersifat polaryang dapat berinteraksi dengan fase gerak yang polar sehingga alopurinol dapat terelusi. Untuk menetapkan alopurinol dalam jamu dengan metode KCKT perlu dilakukan optimasi pada sistem KCKT dan validasi metode penetapan kadar terlebih dahulu untuk memperoleh data yang dapat dipercaya. Pada penelitian ini, optimasi pemisahan dengan KCKT fase terbalik dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk memperoleh kondisi yang optimum dengan parameter nilai waktu retensi, N, HETP, tailing factor, dan resolusi. Optimasi pada sistem KCKT fase terbalik untuk penetapan kadar alopurinol dalam matriks sampel jamu asam urat dengan fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides dan fase diam C18 yang telah optimum digunakan dalam validasi metode analisis untuk menjamin bahwa metode yang diperoleh dapat dipercaya dan dipertanggungjawabkan sesuai


29

dengan persyaratan yang telah ditentukan. Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis antara lain presisi, linearitas, dan sensitivitas.

G. Hipotesis 1. Metode penetapan kadar alopurinol secara spektrofotometri ultraviolet tidak dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu. 2. KCKT fase terbalik dengan fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides dan fase diam C18 dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam matriks sampel jamu asam urat dilihat dari waktu retensi, N, HETP, tailing factor, dan resolusi. 3. Selama periode penelitian, sistem KCKT yang digunakan masih reprodusibel dengan validitas yang baik pada parameter linearitas dan presisi.


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental deskriptif karena adanya perlakuan terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah perbandingan komposisi fase gerak metanol : akuabides + ammonium hidroksida 0,1% dan flow rate yang digunakan. 2. Variabel Tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah bentuk peak, retention time, resolusi dan nilai absorbansi yang dihasilkan. 3. Variabel Pengacau Terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah: a. Kemurnian pelarut, digunakan pelarut pro analysis dengan kemurnian yang tinggi. b. Alat yang digunakan dikendalikan dengan cara mengukur validitas metode yang digunakan berupa nilai linearitas dan sensitivitas (spektrofotometri UV) dan presisi, linearitas dan sensitivitas (KCKT).

30


31

C. Definisi Operasional 1. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan seperangkat alat KCKT fase terbalik yang menggunakan fase diam oktadesilsilan (C18) dan fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides dengan perbandingan yang optimal. 2. Optimasi dilakukan dengan cara melakukan perubahan terhadap komposisi dan flow rate fase gerak. 3. Pemisahan yang optimal dengan metode KCKT fase terbalik dilihat dari resolusi (Rs), tailing factor (Tf), jumlah lempeng, dan nilai HETPyang dihasilkan. 4. Validasi metode yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pengukuran terhadap

parameter-parameter

validitas

yaitu

presisi,

linearitas,

dan

sensitivitas.

D. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan memiliki kualitas pro analysis kecuali dinyatakan lain yaitu baku alopurinol (PT. IFARS) dengan Certificate of Analysis, metanol (E. Merck), ammonia solution 25% (E. Merck), asam klorida (E. Merck), kloroform (E. Merck), natrium hidroksida (E. Merck), etanol teknis, akuades, dan akuabides yang didapatkan dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah beberapa sampel jamu merek “x” yang dibeli di Pasar Bringharjo.


32

E. Alat Penelitian Alat yang digunakan berupa seperangkat alat spektrofotometri UV-VIS merek Optima SP 300 Plus, seperangkat KCKT fase terbalik merek Shimadzu dengan sistem isokratik (pompa merek Shimadzu, detektor UV-VIS merek Shimadzu), kolom oktadesilsilan (C18) merek Shimadzu (Dimensi 250 x 4,5 mm, 5μm), seperangkat komputer merek Dell B6RDZ1S Connexant System RD01D850 A0-0382 JP France S.A.S, printerHP Deskjet D2566 HP-024-000625 730, ultrasonikator merek Retsch tipe T460 No V935922013 EY, destilator aquabidest merek Thermo Scientific, syringe, neraca analitik Ohaus Carat Series PAJ 1003 (maks 60/120g, min 0,001g, d=0,01/0,1mg), penyaring milipore, mikropipet Socorex, indikator pH (E. Merck), organic and anorganic solvent membrane filter(Whatman) ukuran pori 0,45 m dengan diameter 47 mm, vakum, dan seperangkat alat gelas (Pyrex).

F. Tatacara Penelitian 1. Metode Spektrofotometri UV untuk Sediaan Tablet Alopurinol a. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N Sejumlah 1 g pelet NaOH dilarutkan dengan akuades hingga semua larut sempurna lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan diencerkan dengan akuades hingga batas tanda. N=


33

b. Pembakuan NaOH Sejumlah lebih kurang 400 mg kalium biftalat ditimbang secara seksama yang sebelumnya telah dihaluskan dan dikeringkan pada suhu 120°C selama 2 jam dan larutkan dalam 75 mL air bebas CO2 lalu ditambahkan 2 tetes indikator fenolftalein. Selanjutnya larutan dititrasi dengan larutan natrium hidroksida hingga terjadi warna merah muda mantap.Kemudian normalitas dapat dihitung dengan rumus berikut. N NaOH = (Mursyidi, 2008). c. Pembuatan larutan stok dan intermediet alopurinol i. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Sejumlah lebih kurang 50 mg baku alopurinol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL dilarutkan dengan NaOH 0,1 N hingga tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 μg/mL. ii. Pembuatan larutan intermediet 1. Larutan induk dengan konsentrasi 1000 μg/mL diambil 1,0 mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, diencerkan dengan NaOH 0,1 N hingga batas tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 μg/mL. iii. Pembuatan larutan intermediet 2.Larutan induk intermediet 1 dengan konsentrasi 100 μg/mLdiambil 10 mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, diencerkan dengan NaOH 0,1 N hingga batas tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 20 μg/mL.


34

d. Penentuan panjang gelombang maksimum Pembuatan seri larutan kurva baku dengan konsentrasi 4, 8, 12 μg/mL dibuat dengan cara mengambil 2,0; 4,0; 6,0 mL dari larutan intermediet 2 lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan menggunakan NaOH 0,1 N hingga tanda. Kemudian diukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm. e. Pembuatan seri larutan baku alopurinol Pembuatan seri larutan kurva baku dengan konsentrasi 4, 6, 8, 10, 12 dan 14 μg/mL dibuat dengan cara mengambil 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 mL dari larutan intermediet 2 lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan menggunakan NaOH 0,1 N hingga batas tanda. f. Validasi metode i. Linearitas Linearitas ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh dengan memplotkan seri larutan konsentrasi terhadap absorbansi hasil pembacaan spektrofotometri UV. ii. Sensitivitas Sensitivitas ditentukan dari nilai slope dan LOD yang diperoleh dari kurva baku linear hubungan antara konsentrasi dan absorbansi.


35

2. Metode KCKT Fase Terbalik untuk Matriks Jamu Asam Urat a. Penyiapan fase gerak Metanol dan amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides yang akan digunakan sebagai fase gerak terlebih dahulu disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman yang berbeda. Pada fase gerak akuabides digunakan kertas saring untuk pelarut anorganik sedangkan fase gerak metanol digunakan kertas saring untuk pelarut organik. Optimasi komposisi pelarut yang akan digunakan dalam penelitian dapat dilihat pada tabel II : Tabel II. Komposisi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides

No. 1 2 3

Komposisi fase gerak Amonium hidroksida Metanol 0,1% dalam akuabides 10 90 20 80 30 70

b. Optimasi KCKT fase terbalik i.

Penentuan panjang gelombang maksimum alopurinol. Panjang

gelombang maksimum alopurinol ditentukan dengan cara mengukur spektra larutan baku alopurinol dalam pelarut amonium hidroksida 5 % dalam metanol dengan konsentrasi 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 dan 15,0 µg/mL pada rentang 200-400 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Berdasarkan spektra yang terukur dapat diketahui panjang gelombang dengan serapan yang maksimum pada masingmasing konsentrasi, kemudian dapat ditentukan panjang gelombang yang akan digunakan dalam optimasi.


ii.

36

Optimasi komposisi fase gerak dan flow rate. Detektor pada alat

KCKT di atur pada panjang gelombang maksimum. Sejumlah 20 L larutan baku alopurinol 30 g/mL yang sudah disaring dengan millipore dan di-degassing selama 15 menit, lalu diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase gerak yang telah dibuat seperti pada langkah di atas. Sistem operasi KCKT dilakukan dengan mengubah volume komposisi fase gerak dan flow rate. Pengubahan volume komposisi fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides tersebut meliputi 10:90; 20:80; 30:70, serta flow rate yang meliputi 0,5; 0,8; dan 1 mL/menit untuk masing-masing fase gerak. Dari kromatogram akan diperoleh nilai tR, Tf, Rs, N dan HETP yang digunakan untuk penentuan parameter optimasi komposisi fase gerak dan flow rate. c. Uji kesesuaian sistem KCKT fase terbalik i.

Uji kesesuaian sistem periode pertama 1.

Pembuatan larutan stok bakualopurinol. Sejumlah lebih kurang

25 mg baku alopurinol ditimbang secara seksama, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol. Diperoleh konsentrasi 1 mg/mL 1000g/mL. 2.

Pembuatan larutan intermedietalopurinol.Larutan intermediet

dengan konsentrasi 500 g/mL dibuat dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu takar 10 mL dan diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. 3.

Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Larutan seri baku

dengan massa alopurinol 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 ngdibuat dengan cara


37

mengambil sejumlah 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 μL larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Masing-masing labu takar diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. Masing-masing seri baku alopurinol disaring menggunakan milipore kemudian di-degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Cara kerja ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali, masing-masing seri larutan baku sejumlah 20 μL diinjeksikan ke sistem KCKT dengan kolom C18 (Dimensi 250 x 4,5 mm, 5μm) menggunakan fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1 %dalam akuabides (10 : 90) dengan flow rate 0,5 mL/menit. ii.

Uji kesesuaian sistem periode kedua 1.

Pembuatan larutan stok bakualopurinol. Sejumlah lebih kurang

25 mg baku alopurinol ditimbang secara seksama, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol. Diperoleh konsentrasi 1 mg/mL 1000g/mL. 2.

Pembuatan larutan intermedietalopurinol. Larutan intermediet

dengan konsentrasi 500 g/mL dibuat dengan cara mengambil sebanyak 100L dari larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu takar 10 mL dan diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. 3.

Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Larutan seri baku

dengan massa alopurinol 1, 2, 3, dan 4 ngdibuat dengan cara mengambil sejumlah 100, 200, 300, dan 400μL larutan intermediet alopurinol kemudian masingmasing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Masing-masing labu takar diencerkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. Masing-


38

masing seri baku alopurinol disaring menggunakan milipore kemudian didegassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Cara kerja ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali, masing-masing seri larutan baku sejumlah 10 μL diinjeksikan ke sistem KCKT dengan kolom C18 (Dimensi 250 x 4,5 mm, 5μm) menggunakan fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1 % dalam akuabides (10:90) dengan flow rate 0,5 mL/menit. d. Validasi metode analisis KCKT fase terbalik i.

Linearitas 1.

Linearitas pada periode pertama. Detektor pada alat KCKT diatur

pada panjang gelombang maksimum. Larutan kerja dengan massa alopurinol 100, 200, 300, 400, 500 dan 600 ng yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik sebanyak 20 μL menggunakan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Cara kerja ini dilakukan 3 kali replikasi. Dari kromatogram akan diperoleh luas area alopurinol untuk masing-masing konsentrasi. Luas area ini kemudian diplotkan terhadap konsentrasi alopurinol untuk memperoleh regresi linear dengan persamaan y = bx + a dan nilai koefisien korelasi (r) yang akan digunakan untuk penentuan parameter validasi linearitas. 2.

Linearitas pada periode kedua. Detektor pada alat KCKT diatur

pada panjang gelombang maksimum. Larutan kerja dengan massa alopurinol 1, 2, 3, dan 4 ng yang telah disaring dengan millipore dan di-degassing selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik sebanyak 10 μL menggunakan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Cara kerja ini dilakukan 3


39

kali replikasi. Dari kromatogram akan diperoleh luas area alopurinol untuk masing-masing konsentrasi. Luas area ini kemudian diplotkan terhadap konsentrasi alopurinol untuk memperoleh regresi linear dengan persamaan y = bx + a dan nilai koefisien korelasi (r) yang akan digunakan untuk penentuan parameter validasi linearitas. ii.

Presisi 1.

Presisi pada periode pertama. Detektor pada alat KCKT diatur

pada panjang gelombang maksimum. Larutan kerja dengan massa alopurinol 100, 200, 300, 400, 500 dan 600 ng yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik sebanyak 20 μL menggunakan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Cara kerja ini dilakukan 3 kali replikasi. 2.

Presisi pada periode kedua. Detektor pada alat KCKT diatur pada

panjang gelombang maksimum. Larutan kerja dengan massa alopurinol 1, 2, 3, dan 4 ng yang telah disaring dengan millipore dan di-degassing selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik sebanyak 10 μL menggunakan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Cara kerja ini dilakukan 3 kali replikasi. iii.

Sensitivitas 1.

Sensitivitas pada periode pertama. Detektor pada alat KCKT di

atur pada panjang gelombang maksimum. Larutan alopurinol dengan massa 100, 200, 300, 400. 500 dan 600 ng yang telah disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik


40

sebanyak 20 L menggunakan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Kemudian dihitung nilai LOD dan slope dari persamaan kurva regresi linear yang diperoleh. 2.

Sensitivitas pada periode kedua. Detektor pada alat KCKT di atur

pada panjang gelombang maksimum. Larutan alopurinol dengan massa 1, 2, 3, dan 4 ng yang telah disaring dengan millipore dan di-degassing selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik sebanyak 10 L menggunakan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Kemudian dihitung nilai LOD dan slope dari persamaan kurva regresi linear yang diperoleh.

G. Analisis Hasil 1. Analisis Hasil Validasi Metode Spektrofotometri UV a. Linearitas Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Berdasarkan Snyder et al. (2010), metode untuk analisis dikatakan memiliki linearitas yang baik jika memiliki nilai koefisien korelasi (r)  0,999. b. Sensitivitas Sensitivitas dapat dilihat dari nilai LOD dan slope.LOD merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. LOD dapat dihitung dengan persamaan berikut : = 3,3 Keterangan : Sa = Standar deviasi

b = slope


41

Slope menunjukkan respon dari alat. Nilai slope diperoleh dari persamaan regresi linear y = bx + a dan ditunjukkan pada nilai b. 2. Analisis Hasil Optimasi KCKT fase terbalik Data kromatogram yang diperoleh dari hasil optimasi komposisi fase gerak dan flow rate yang telah ditentukan untuk menetapkan kadar alopurinol dalam matriks jamu asam urat dapat dilihat dari bentuk peak, nilai resolusi,tailing factor, HETP dan jumlah lempeng teoritis (N) yang dihasilkan. Parameter ini dilakukan dengan perhitungan secara otomatis menggunakan sistem yang telah terprogram pada sistem KCKT. a. Daya pisah (Resolusi) Nilai daya pisah merupakan nilai yang diperoleh dengan melakukan perhitungan puncak analit terhadap puncak terdekat.Nilai Resolusi yang baik adalah  1,5 (Snyder, Kirkland, and Glajch, 2012). b. Jumlah lempeng (N) dan HETP Nilai N (lempeng) berbanding terbalik terhadap efisiensi kolom (HETP).Semakin besar nilai N maka semakin kecil nilai HETP yang berarti bahwa kolom memberikan efisiensi yang baik (Gandjar dan Rohman, 2007). c. Bentuk peak Parameter yang digunakan untuk melihat peak yang simetris adalah nilai tailing factor(Tf).Nilai Tf 2 dikatakan baik, karena tidak mengganggu atau berpengaruh terhadap pemisahan, sedangkan nilai Tf> 2 dapat berpotensi mengganggu dan memberikan efek terhadap pemisahan secara rutin (Snyder, Kirkland, and Glajch, 2012).


42

3. Analisis Hasil Validasi Metode KCKT fase terbalik a. Linearitas Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel.Berdasarkan Snyder dkk.(2010), metode untuk analisis dikatakan memiliki linearitas yang baik jika memiliki nilai koefisien korelasi (r)  0,999. b. Presisi Presisi merupakan derajat keterulangan hasil uji ketika metode dilakukan secara berulang pada sampel dengan beberapa kali sampling (The United States Pharmacopeia, 2007).Presisi biasanya dinyatakan dengan koefisien variasi (CV) c. Sensitivitas Sensitivitas dapat dilihat dari nilai LOD dan slope.LOD merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. LOD dapat dihitung dengan persamaan berikut : = 3,3 Keterangan : Sa = Standar deviasi

b = slope

Slope menunjukkan respon dari alat. Nilai slope diperoleh dari persamaan regresi linear y = bx + a dan ditunjukkan pada nilai b.


BAB IV PEMBAHASAN Penetapan kadar alopurinol dalam jamu asam urat diperlukan untuk mengetahui kemungkinan adanya alopurinol dalam kandungan jamu, karena sesuai dengan Keputusan Kepala Badan POM no.HK.00.05.41.1384 tahun 2005, dalam obat tradisional dilarang menggunakan bahan kimia obat, narkotika atau psikotropika dan hewan atau tumbuhan yang dilindungi sesuai dengan ketentuan peraturan perundang-undangan yang berlaku.Namun apabila di dalam obat tradisional terdapat alopurinol maka perlu diketahui batas toksisitas dari nilai NOAEL yang merupakan dosis tertinggi sampai menimbulkan efek buruk yang tidak teramati.Nilai NOAEL dari alopurinol pada hewan tikus secara per oral adalah sebesar 12 mg/kgBB (Anonim, 2014).Berdasarkan nilai NOAEL tersebut dapat diketahui batas maksimal kandungan alopurinol yang tidak menimbulkan efek toksik pada manusia apabila terkandung dalam produk jamu asam urat adalah 7,2 mg yang ditunjukkan pada perhitungan berikut. Batas NOAEL alopurinol 12 mg/kgBB pada hewan uji tikus BB manusia normal = 60 kg

(Noegrohati, 2013) =

MOS = =

= 7.2 mg

43


44

Apabila dalam 1 sachet jamu memiliki massa sebanyak 7 g, maka dalam setiap gram sampel,batas kuantifikasi (LOQ) alopurinol yang harus dicapai adalah sebesar 0,52 mg/g  0,52g/mg. Berdasarkan Depkes RI (1974), penetapan kadar alopurinol dapat diukur dengan metode spektrofotometri UV. Hal tersebut karena alopurinol memiliki gugus kromofor dan auksokrom yang dapat memberikan serapan di daerah UV. Untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu, perlu dilakukan verifikasi kinerja metode analisis alopurinol secara spektrofotometri UV.

A. Verifikasi Kinerja Metode Analisis Alopurinol secara Spektrofotometri Ultraviolet Prinsip metode analisis alopurinol dalam tablet (Depkes RI, 1974) dilakukan pengembangan metode dengan melarutkan sampel tablet ke dalam larutan NaOH 0,1 N. Larutan sampel kemudian disaring dan dibuat larutan intermediet dengan pengenceran 2500 kali. Larutan intermediet selanjutnya diukur serapan pada maksdengan spektrofotometri UV. Verifikasi yang dilakukan meliputi tata cara berikut. 1. Pembuatan dan Pembakuan Natrium Hidroksida Pembakuan larutan natrium hidroksida dilakukan untuk menentukan konsentrasi larutan secara teliti yang disebabkan oleh sifat larutan NaOH yang hidroskopis sehingga dapat menyerap air dari lingkungannya.Hal tersebut dapat


45

mengubah konsentrasi NaOH, selain itu NaOH juga dapat bereaksi dengan gas CO2 dari udara. NaOH + CO2 → Na2CO3 + H2O Pembakuan NaOH dilakukan dengan kalium biftalat sebagai baku primer. Reaksi antara kalium biftalat dengan NaOH sebagai berikut.

Gambar 8. Reaksi Kalium Biftalat dengan NaOH (Mursyidi, 2008)

Pembakuan dapat dilakukan dengan titrasi. Titrasi merupakan suatu proses penentuan konsentrasi suatu larutan dengan mereaksikan larutan yang telah ditentukan konsentrasinya (larutan standar). Pada penelitian ini dilakukan titrasi volumetri yaitu mengukur volume dari suatu asam atau basa yang bereaksi (Ibnu, 2004). Pada penelitian ini, proses pembakuan dilakukan dengan menggunakan larutan kalium biftalat yang dilarutkan dalam air bebas CO2 dan ditambahkan dua tetes fenoftalein kemudian dititrasi dengan larutan natrium hidroksida 0,1 N. Titrasi dapat dihentikan jika terjadi perubahan warna yang artinya telah mencapai titik ekuivalen atau titik akhir titrasi. Titik ekuivalen merupakan titik pada proses akhir titrasi ketika asam atau basa tepat habis bereaksi. Indikator perubahan warna terlihat ketika larutan kalium biftalat yang awalnya jernih berubah warna menjadi merah muda pada volume akhir 21,35 mL.Berdasarkan perhitungan normalitas natrium hidroksida (terlampir) yaitu sebesar 0,092 N.


46

Gambar 9. Reaksi fenoftalein dengan NaOH (Mursyidi, 2008)

2. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Alopurinol Penentuan panjang gelombang dilakukan pada baku alopurinol bertujuan untuk mendapatkan panjang gelombang maksimum (maks). Panjang gelombang maksimum menunjukkan panjang gelombang absorbansi terbesar bagi analit yang dianalisis. Dilakukan analisis pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang ini akan memberikan sensitivitas dan presisi yang baik dan dapat meminimalisasikan kesalahan pembacaan oleh detektor karena daerah disekitar puncak kurva panjang gelombang maksimum merupakan daerah dengan fluktuasi absorban yang minimal. Pengukuran ini diharapkan dapat menghasilkan


47

panjang gelombang yang berada pada panjang gelombang teoritis.Pengukuran panjang gelombang dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri UV. Pada penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan mengamati panjang gelombang pada rentang 200-400 nm dan menggunakan tiga level konsentrasi, yaitu 4, 8 dan 12 g/mL. Penggunaan tiga level konsentrasi tersebut bertujuan untuk melihat apakah perbedaan konsentrasi menghasilkan perubahan pada panjang gelombang maksimum. Tabel III. Perbandingan panjang gelombang maksimum alopurinol dalam sampel tablet obat hasil pengukuran terhadap panjang gelombang maksimum teoritis

Konsentrasi (g/mL) 4 8 12

 maks terukur 257,0 257,0 257,0

 maks teoritis 257 nm

Berdasarkan tabel III dapat dilihat bahwa panjang gelombang terukur dari ketiga level konsentrasi alopurinol memiliki serapan maksimum pada 257 nm (Lampiran 4) yang sesuai dengan serapan maksimum secara teoritis. 3. Pembuatan Seri Larutan Baku Alopurinol Baku alopurinol dengan kemurnian 100,51%masuk dalam rentang kadar yang telah ditetapkan oleh PT. IFARS (98 – 101%) berdasarkan sertifikat Certificate of Analysis (CoA) (Lampiran 1) untuk menjamin kemurnian alopurinol. Larutan baku kemudian dipersiapkan dan dilarutkan dengan pelarut. Pada metode spektrofotometri UV dilakukan dengan menggunakan pelarut natrium hidroksida 0,1 N yang dapat melarutkan baku alopurinol secara sempurna. Pembuatan larutan baku alopurinol dilakukan dengan konsentrasi 20 g/mL. Tujuan pembuatan larutan baku ini adalahuntuk mengetahui apakah


48

hubungan antara respon instrumen dengan kosentrasi analit linear pada seri larutan kurva baku sehingga diperoleh persamaan regresi linear yang selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar alopurinol dalam sampel tablet obat. Penentuan kurva baku alopurinol dilakukan dengan mengukur nilai absorbansi pada 6 konsentrasi alopurinol (4, 6, 8, 10, 12, dan 14 g/mL) dengan replikasi sebanyak tiga kali. Persamaan regresi linear yang diperoleh merupakan hubungan antara konsentrasi alopurinol vs absorbansi yang dihasilkan dari pengukuran sampel pada spektrofotometri UV. Kadar alopurinol dalam sampel dihitung dengan memasukkan absorbansi sampel ke dalam persamaan kurva baku yang diperoleh.Hasil penelitian ditunjukkan pada tabel IV. Tabel IV. Data kurva baku alopurinol dalam tablet obat

Replikasi

1

2

3

C (g/mL)

Absorbansi

4 6 8 10 12 14 4 6 8 10 12 14 4 6 8 10 12 14

0,256 0,356 0,453 0,563 0,659 0,755 0,253 0,355 0,460 0,570 0,686 0,776 0,253 0,367 0,475 0,587 0,683 0,798

Perhitungan regresi linear

a = 0,045 b = 0,052 y = bx + a y = 0,052x + 0,045


49

Dari ketiga replikasi kemudian data dimasukkan ke dalam program powerfit sehingga diperoleh kurva kalibrasi gabungan yang linear. Linearitas menunjukkan hubungan korelasi antara kadar alopurinol dengan absorbansi yang dihasilkan. Persamaan kurva baku yang diperoleh adalah y = 0,052x +0,045 dan diperoleh nilai r sebesar 0,998. Batasan yang digunakan untuk nilai koefisien korelasi ini menggunakan Pearson’s correlation coefficient test, dimana dapat dijelaskan bahwa koefisien korelasi memiliki hubungan terhadap banyaknya jumlah determinasi (n) yang dilakukan (Cook et al., 2000). Hubungan tersebut dapat dilihat pada tabel berikut. Tabel V. Hubungan r dengan n (Cook et al., 2000)

Apabila nilai r dari suatu regresi linear lebih besar daripada nilai r pada tabel tersebut menunjukkan hubungan linearitas pada kurva baku secara statistik terpenuhi. Pada tabel IV diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,998 dengan n = 6, maka dapat dikatakan linear secara statistik karena nilai r > 0,811.


50

Linearitas dapat ditunjukkan dengan hubungan korelasi antara kenaikan kadar alopurinol yang sebanding dengan kenaikan nilai absorbansinya, seperti yang terlihat pada gambar berikut :

Gambar 10. Plot kurva bakualopurinol dalam tablet obat

4. Validasi Metode Analisis Validasi metode merupakan suatu prosedur penjaminan bahwa metode analisis yang digunakan dapat diterima dan terpercaya sehingga dapat digunakan untuk tujuan analisis tertentu. Terdapat beberapa parameter yang digunakan untuk mengetahui validitas dari metode spektrofotometri UV yang digunakan dalam analisis alopurinol dalam tablet obat asam urat, meliputi linearitas dan sensitivitas. a. Linearitas Linearitas suatu metode analisis merupakan kemampuan metode untuk mendapatkan hasil uji yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi yang ditentukan oleh beberapa seri larutan baku dengan tiga kali replikasi. Batasan yang digunakan untuk nilai koefisien korelasi ini menggunakan Pearson’s correlation


51

coefficient test, dimana dapat dijelaskan bahwa koefisien korelasi memiliki hubungan terhadap banyaknya jumlah determinasi (n) yang dilakukan. Nilai r yang diperoleh pada kurva baku replikasi I, II, dan III kemudian dimasukkan dalam program Powerfit dan diperoleh nilai r sebesar 0,998. Berdasarkan data yang diperoleh, koefisien korelasi (r) > 0,811 dari r tabel V. Sehingga dapat disimpulkan bahwa metode ini memiliki linearitas yang baik. b. Sensitivitas Batas deteksi (LOD) merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. LOD dapat ditentukan dari persamaan regresi linear kurva baku. Pada metode spektrofotometri UV, perhitungan LOD dilakukan terhadap seri larutan kurva baku tablet obat. Semakin kecil nilai LOD maka dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memiliki sensitivitas yang baik. Polynomial Degree is: 1 , based on 18 data points (#1 to #18) POLYNOMIAL is: F(x) = 0.04479 + 0.05246 x higher degree is no significant improvement: F(1,15,95.0%) = 4.542 > F_obs = 0.197 Coefficients, Standard Deviations and 95.0% Confidence Limits are: Coefficient Std.Dev. Min.Limit Max.Limit a0 4.47873E-002 7.62142E-003 2.86298E-002 6.09448E-002 a1 5.24619E-002 7.91724E-004 5.07834E-002 5.41404E-002 Variance Y, S^2 =

1.316337302E-004

Covariance matrix of Coefficients: 5.80860E-005 -5.64145E-006 -5.64145E-006 6.26827E-007 Correlation Coefficient: 0.99818 x value at y = 0: -0.854 Std.Dev.:

0.157 Range: -1.2E+000 < x0 < -5.2E-001

Berdasarkan data diatas didapatkan persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 0,052x – 0,045, dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,998 dan nilai Sa = 7,62.10-3. Sensitivitas juga ditentukan dari nilai slope yang menunjukkan respon


52

dari alat. Nilai slope dapat ditunjukkan dari nilai b pada persamaan kurva baku yang diperoleh yaitu sebesar 0,052. Dari perhitungan menggunakan rumus LOD maka didapatkan nilai LOD sebesar 0,48g/mL. Untuk mengetahui apakah metode analisis spektrofotometri UV sudah tepat digunakan dalam penetapan kadar alopurinol pada jamu asam urat, maka dilakukan perhitungan berdasarkan perlakuan sampel berikut. Sejumlah 77 mg (setara dengan 25 mg zat aktif) tablet alopurinol dilarutkan dalam 25 mL NaOH 0,1 N dan disaring. Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL (Labu A). Selanjutnya diambil 1,0 mL dari Labu A dan diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga batas tanda. (Nilai LOQ alopurinol yang harus dicapai = 0,52g/mg; LOD = 0,48 g/mL) LOQ = LOD x faktor pengenceran = 0,48



= 15,58g/mg Nilai LOQ yang diperoleh (15.58 g/mg) menunjukkan bahwa metode analisis spektrofotometri UV tidak dapat digunakan dalam penetapan kadar alopurinol dalam jamu karena batas kuantifikasi (LOQ) alopurinol yang harus dicapai (0,52g/mg).Apabila dalam 1 tablet obat memiliki kadar sebanyak 100mg, maka dalam setiap 300 mg sampel,batas kuantifikasi (LOQ) alopurinol dalam tablet yang harus dicapai adalah sebesar 0,33 mg/mg (= 330 g/mg), sehingga metode spektrofotometri UV lebih tepat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam sampel tablet obat nilai LOQ yang diperoleh jauh lebih kecil dari batas yang ditentukan.


53

Oleh karena itu, untuk selanjutnya dilakukan analisis penetapan kadar alopurinol dalam jamu asam urat dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik. B. Pengembangan Metode Analisis Alopurinol dalam Jamu secara KCKT Prinsip yang akan digunakan hampir sama dengan metode analisis alopurinol dalam tablet, yaitu dengan melarutkan sampel jamu dengan larutan NaOH 0,1 N. Namun pada metode ini dilakukan ekstraksi dengan kloroform dan diperoleh koekstraktan matriks. Adanya matriks dapat mengganggu analit sehingga perlu dilakukan clean up yang dilakukan oleh Soenarso (2014). Untuk menetapkan alopurinol dalam jamu yang telah di clean up digunakan metode analisis KCKT. Oleh karena itu, perlu dilakukan optimasi pada sistem KCKT. 1. Optimasi Sistem KCKT a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Alopurinol Penentuan panjang gelombang maksimum ( maks) larutan baku alopurinol bertujuan untuk mendapatkan hasil analisis dengan sensitivitas tertinggi. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan mengamati panjang gelombang pada rentang 200-400 nm dan menggunakan lima level konsentrasi, yaitu 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; dan 15,0g/mL. Panjang gelombang maksimum merupakan karakteristik fisiko kimiawi suatu senyawa, oleh karena itu panjang gelombang maksimum tidak berubah meskipun konsentrasi berbeda. Panjang gelombang maksimum yang didapatkan akan digunakan sebagai panjang


54

gelombang pengamatan pada penelitian ini.Berikut adalah tabel panjang gelombang maksimum alopurinol hasil pengukuran. Tabel VI. Panjang gelombang maksimum alopurinol hasil pengukuran

Konsentrasi (g/mL) 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0

 maks terukur

Rata-rata  maks terukur

272,9 273,9 273,7 274,0 273,8

273,7 ≈ 274 nm

Menurut Clarks (2005) maksteoritis alopurinol sebesar 257 nm dalam NaOH 0,1 N namun dalam penelitian ini diperoleh rata-rata maks terukur sebesar 274 nmdalam pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol (Tabel VI). Perbedaan  maks tersebut dapat disebabkan adanya perbedaan pelarut yang dipengaruhi oleh kepolaran pelarut sehingga mempengaruhi maks karena kepolaran molekul berubah jika suatu elektron bergerak dari satu orbital ke orbital lainnya.Pengaruh pelarut biasanya mencapai hingga 20 nm (Pecsok, 1968). Menurut perhitungan polaritas, NaOH 0,1 N memiliki indeks polaritas sebesar 10,2 sedangkan amonium hidroksida sebesar 5,4 (Lampiran 8). Dalam pelarut polar (NaOH 0,1 N) transisi * suatu molekul memerlukan energi yang lebih besar dibandingkan pelarut yang kurang polar (amonium hidroksida 5% dalam metanol).Untuk selanjutnya digunakan panjang gelombang maksimum 274 nm. b. Penentuan Fase Gerak Pemisahan senyawa analit alopurinol menggunakan sistem KCKT fase terbalik, dimana fase gerak yang digunakan lebih polar dibandingkan dengan fase diamnya. Fase diam yang digunakan yaitu oktadesilsilan (C18) dan fase gerak


55

yang digunakan adalah campuran metanol : amonium hidroksida 0,1%dalam akuabides. Pada sistem KCKT fase terbalik ini, senyawa yang lebih polar akan terelusi terlebih dahulu dibandingkan senyawa yang lebih nonpolar. Hal ini terjadi karena senyawa yang lebih polar akan lebih kuat untuk berinteraksi dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam dan menyebabkan akan lebih mudah terelusi melewati fase diamnya, sedangkan senyawa yang bersifat lebih nonpolar akan cenderung berinteraksi lebih kuat dengan fase diamnya sehingga akan tertinggal pada kolom lebih lama.

Gambar 11. Interaksi alopurinol dengan fase diam C18 melalui interaksi van Der Waals

Gambar 12. Interaksi alopurinol dengan fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides melalui interaksi hidrogen


56

Pada penelitian ini, fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol p.a. dan akuabides yang ditambahkan dengan amonium hidroksida 0,1%. Metanol digunakan sebagai salah satu penyusun komposisi fase gerak karena metanol memiliki viskositas yang rendah yaitu 0,55 cp sehingga dapat menurunkan tekanan pada kolom (Gandjar dan Rohman, 2010). Penggunaan amonium hidroksida 0,1% sebagai campuran fase gerak ini bertujuan untuk mengurangi interaksi alopurinol dengan gugus silanol pada C18 yang dapat mengakibatkan waktu retensi lebih lama dan peak tailing (Snyder dkk., 2010). Untuk mendapatkan kepolaran fase gerak yang sesuai, optimasi komposisi fase gerak dilakukan terhadap perbandingan metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides yaitu 30:70; 20:80 dan 10:90. Pada penelitian ini dilakukan penurunan jumlah metanol secara bertahap. Menurut Snyder dkk. (1997), dengan meningkatnya jumlah metanol dalam sistem KCKT fase terbalik maka analit akan terelusi lebih mudah. Namun hal tersebut tidak dilakukan, karena didalam sampel terdapat banyak analit atau senyawa – senyawa yang terkandung, sehingga apabila dilakukan peningkatan metanol maka alopurinol sebagai analit yang akan dianalisis dapat terelusi lebih cepat dan terpisah dengan analit lain. Akibatnya puncak alopurinol akan menumpuk dengan puncak lain dan menjadikan penelitian ini menjadi tidak spesifik dan selektif. Tabel VII. Perbandingan masing-masing komposisi fase gerak dan indeks polaritas

No. 1. 2. 3.

Komposisi Fase Gerak Metanol + Akuabides amonium hidroksida 0,1% 10 : 90 20 : 80 30 : 70

′=Φ . ′ + Φ . ′

Indeks Polaritas

(0,1 x 5,1) + (0,9 x 10,2) (0,2 x 5,1) + (0,8 x 10,2) (0,3 x 5,1) + (0,7 x 10,2)

9.69 9,18 8,67


57

Nilai indeks polaritas yang semakin besar akan menyebabkan fase gerak bersifat lebih polar. Alopurinol yang memiliki nilai polaritas sebesar 11,92 (MarvinSketch) merupakan senyawa yang bersifat polar. Berdasarkan prinsip like dissolve like, maka komposisi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides(10:90) dengan nilai indeks polaritas sebesar 9,69 dapat mengelusi alopurinol pada sistem KCKT ini. Sistem elusi yang digunakan adalah sistem isokratik dimana tidak ada perubahan komposisi fase gerak selama proses elusi. Tujuan digunakannya sistem isokratik karena peneliti ingin melihat respon pemisahan yang dapat dihasilkan oleh optimasi campuran fase gerak.Pencampuran kedua komposisi fase gerak dilakukan di dalam instrumen KCKT. Komponen fase gerak harus disaring terlebih dahulu dengan menggunakan kertas saring Whatmanukuran pori 0,45m dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan adanya partikel-partikel kecil yang dapat menyumbat kolom sehingga dapat mempengaruhi analisis pada sistem KCKT. Kertas saring Whatman yang digunakan untuk menyaring fase gerak terdapat dua macam yaitu kertas Whatman organik yang digunakan untuk menyaring larutan organik (metanol) dan kertas Whatman anorganik untuk menyaring larutan anorganik (akuabides).Selanjutnya

fase

gerak

di

degassing

dengan

menggunakan

ultrasonikator selama 15 menit yang bertujuan untuk menghilangan gelembung udara yang terdapat dalam fase gerak. Adanya gelembung udara yang terdapat dalam fase gerak dapat mengakibatkan tekanan pada pompa menjadi tidak stabil sehingga mempengaruhi proses pembacaan sinyal dalam instrumen KCKT.


58

c. Optimasi Komposisi Fase Gerak dan Flow Rate Optimasi yang dilakukan dengan menggunakan metode KCKT ini adalah mengubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk mendapatkan pemisahan yang optimal. Komposisi fase gerak yang dilakukan adalah 10:90; 20:80 dan 30:70 (campuran metanol dan amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides) dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit. Berikut ini merupakan kromatogram optimasi komposisi fase gerak dan flow rate kurva baku alopurinol. a) Fase gerak I metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90)


59

Gambar 13. Kromatogram baku alopurinol dengan komposisi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90). Keterangan : (1) baku flow rate 0,5 mL/menit; (2) baku flow rate 0,8 mL/menit; (3) baku flow rate 1 mL/menit

b) Fase gerak II metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (20:80)


60


c) Fase gerak III metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (30:70)


61


Dari kromatogram diatas dilakukan pengukuran terhadap parameter jumlah waktu retensi,jumlah lempeng (N),HETP,tailing factor, dan Rs yang disajikan pada tabel berikut. Tabel VIII. Nilai parameter tR, N, HETP, Tf, dan Rs

Fase Gerak Flow Metanol : rate Amonium (mL/ hidroksida 0,1% menit) dalam akuabides 0,5 10 : 90 0,8 1,0

20 : 80

30 : 70

HETP

Tf ( 2,0)

Rs ( 1,5)

7381 6007 4969

20,3 25,0 30,2

0,9 1,0 1,1

2,2 1,8 1,7

0,5

5491

27,3

1,1

1,2

0,8

4632

32,4

1,1

1,2

1,0

4015

37,4

1,1

1,4

0,5

7550

19,8

1,1

1,1

0,8

5092

29,4

1,2

0,2

1,0

4332

34,6

1,2

-

N

Keterangan

Memenuhi Memenuhi Memenuhi Rs tidak memenuhi Rs tidak memenuhi Rs tidak memenuhi Rs tidak memenuhi Rs tidak memenuhi Rs tidak memenuhi


i.

62

Waktu retensi Alopurinol Waktu retensi (tR) merupakan karakteristik fisiko kimiawi suatu senyawa,

oleh karena itu masing-masing analit memiliki waktu retensi yang berbeda. Sebelum dilakukan optimasi komposisi dan flow rate pada fase gerak, terlebih dahulu dilakukan orientasi untuk mengetahui letak peak tunggal dari senyawa analit. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa peak yang muncul pada larutan baku adalah alopurinol dan juga melihat parameter optimasi yang memenuhi syarat yaitu  10 menit (Depkes RI, 1995). Pada tabel VIII dapat diamati bahwa waktu retensi yang diperoleh memenuhi persyaratan  10 menit, baik dengan perbandingan komposisi fase gerak dan flow rate. Pada sistem KCKT terbalik, kekuatan fase gerak dalam mengelusi akan semakin meningkat seiring dengan menurunnya polaritas. ii.

HETP danJumlah LempengTeoretis (N) HETP menggambarkan kinetika interaksi molekul - molekul senyawa

didalam sistem KCKT yang digunakan (Noegrohati, 1994), oleh karena itu penggunaan fase gerak yang lebih polar dan laju alir yang lebih lambat, memberikan HETP terendah, dengan konsekuensi jumlah lempeng teoretis tertinggi.Pada fase gerak III dengan flow rate 0,5 mL/menit menghasilkan nilai HETP yang lebih kecil dibandingkan fase gerak I dan II dengan flow rate yang sama. Hal tersebut dapat dilihat pada gambar kurva van Deemter berikut.


63

Gambar 16.Kurva van Deemter (Willard, 1988)

Berdasarkan Gambar 16 dapat dilihat bahwanilai HETP dipengaruhi oleh difusi eddy (A), difusi longitudinal (B) dan transfer massa (C). Berdasarkan data yang diperoleh, nilai HETP dipengaruhi oleh transfer massa dan difusi longitudinal. Pada flow rate yang tinggi, kesetimbangan dalam proses transfer massa menjadi dominan dimana semakin besar flow rate maka semakin besar nilai HETP yang diperoleh. Namun dalam penelitian terjadi ketidaksesuaian nilai HETP pada fase gerak I dan III dengan flow rate 0,5 mL/menit. Hal ini disebabkan oleh difusi longitudinal yang berpengaruh terhadap flow rate yang rendah. Difusi longitudinal berkaitan dengan viskositas fase gerak dimana pada fase gerak yang memiliki viskositas yang tinggi dapat terjadi difusi longitudinal sehingga menyebabkan pembesaran nilai HETP yang diperoleh. Pada fase gerak I memiliki viskositas 0,86 cp, sedangkan fase gerak III memiliki viskositas 0,79 cp sehingga pada fase gerak I mengalami difusi longitudinal yang lebih besar dan menyebabkan nilai HETP yang diperoleh lebih besar.


64

Jumlah lempeng teoritis (N) sangat penting dalam pemilihan fase gerak.Nilai N menggambarkan efisiensi pada sistem KCKT untuk mengetahui kemampuan sistem KCKT dalam memisahkan analit.Nilai N berbanding terbalik dengan nilai HETP. Berdasarkan Snyder dkk (2010), jumlah lempeng yang baik untuk kolom C18 150 x 4,6 mm dengan ukuran partikel 5 m adalah  3000 lempeng. Pada tabel VIII dapat diamati bahwa jumlah lempeng yang diperoleh pada fase gerak I, II, dan III telah memenuhi persyaratan yaitu  3000 lempeng. iii.

Tailing factor Nilai tailing factor yang diperoleh dapat digunakan sebagai pertimbangan

untuk menentukan komposisi dan flow rate fase gerak yang paling optimal.Nilai tailing factor bertujuan untuk melihat kesimetrisan dari puncak yang terbentuk dimana puncak simetris yang sempurna yaitu menyerupai puncak Gaussian. Pada penelitian, tailing factor dapat terjadi disebabkan oleh adanya adsorpsi atau interaksi lain yang lebih kuat antara analit dengan fase diam, sedangkan puncak mengalami fronting karena kolom yang digunakan overload, reaksi kimia atau isomerisasi selama kromatografi (Ahuja and Dong, 2005). Syarat untuk nilai tailing factor adalah  2, dimana jika Tf yang dihasilkan  2 maka kemungkinan terjadi permasalahan sehingga dapat mengakibatkan peak mengalami tailing (Synder et al., 2010). Dari data yang diperoleh berdasarkan tabel VIII dapat diamati bahwa untuk semua komposisi fase gerak dan flow rate yang digunakan memenuhi syarat nilai Tf yang baik, yaitu nilai Tf 2(Synder dkk., 2010). Semakin kecil nilai Tf maka puncak yang terbentuk akan semakin simetris. Pada


65

data tabel tersebut menunjukkan nilai Tf paling kecil terdapat pada fase gerak I dengan flow rate 0,5 mL/menit. iv.

Resolusi Nilai resolusi menggambarkan daya pemisahan kolom dua senyawa analit

yaitu antara alopurinol dengan puncak terdekat yang berada pada sebelah kiri puncak alopurinol (terelusi lebih dulu). Tujuan pengamatan nilai resolusi ini adalah untuk mengetahui komposisi dan flow rate yang dapat menghasilkan kromatogram dengan nilai resolusi  1,5 (Synder, Kirkland, and Glajch, 2012). Nilai resolusi yang besar dapat meminimalisasikan adanya gangguan analit lain terhadap puncak sehingga pengukuran akan lebih spesifik. Pada tabel VIIIdapat diamati bahwa nilai Rs yang memenuhi persyaratan 1,5 adalah fase gerak I. Dari ketiga flow rate pada fase gerak I, flow rate 0,5 mL/menit memiliki nilai resolusi yang paling besar yaitu 2,2. Berdasarkan parameter diatas menunjukkan fase gerak I dengan flow rate 0,5 mL/menit sebagai fase gerak yang optimal dengan waktu retensi sebesar ± 4,9 menit, oleh karena itu komposisi fase gerak dan flow rate yang digunakan adalah fase gerak I dengan perbandingan 10:90 dan flow rate 0,5 mL/menit. 2. Evaluasi Penetapan Kadar Metode Analisis KCKT Evaluasi dilakukan untuk mengetahui kesesuaian sistem penetapan kadar alopurinol dalam jamu yang meliputi serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode analisis yang digunakan dapat menghasilkan presisi, linearitas dan sensitivitas yang dapat diterima.


66

Uji kesesuaian sistem ini dilakukan dengan menggunakan larutan baku alopurinol (PT. IFARS) dengan kemurnian 100,51% dan memiliki sertifikat Certificate of Analysis (CoA) (Lampiran 1) untuk menjamin kemurnian alopurinol. Larutan baku kemudian dipersiapkan dan dilarutkan dengan pelarut. Pada metode KCKT, pelarut yang digunakan yaitu amonium hidroksida 5% dalam metanol.Alasan digunakan pelarut amonium hidroksida karena merupakan salah satu komponen penyusun fase gerak sehingga bertujuan untuk menghindari perbedaan kekuatan pelarut yang dapat muncul jika dilarutkan dalam pelarut selain komponen fase geraknya. Penggunaan amonium hidroksida 5% karena menyesuaikan pelarut yang digunakan untuk mengelusi analit pada proses clean up menggunakan SPE (Waters, 2008). a. Uji Kesesuaian Sistem dalam Periode Pertama (2013) i. Presisi terhadap parameter tR dan AUC Presisi merupakan suatu ukuran keterulangan terhadap metode analisis dan digambarkan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel. Pada penelitian dilakukan penentuan ripitabilitas dengan pengukuran pada kondisi percobaan yang sama secara berulang baik operator, peralatan, dan tempat pada waktu yang singkat. Presisi dinyatakan dengan persen koefisien variasi (CV).Semakin kecil nilai persen CV maka dikatakan memiliki presisi yang baik.pada penelitian ini dilakukan uji presisi terhadap parameter tR, N, HETP, Tf, Rs dan AUC yang ditunjukkan pada tabel berikut.


67

Tabel IX. Persen koefisien variasi nilai tR dan AUC baku alopurinol periode I

Massa Alopurinol (ng) Rep. 1 302 Rep. 2 Rep. 3 Rata-rata SD CV (%)

tR 4,7 4,7 4,7 4,7 6,6 x 10-3 0,1

AUC 1654925 1651463 1650687 1652358,3 2256,4 0,1

Berdasarkan data diatas, menunjukkan bahwa metode KCKT yang digunakan reprodusibel karena CV tRdanAUC yang diperoleh dibawah 8% untukkonsentrasi  100 g/mL (Horwitz, 2007) sehingga metode KCKT ini cukup optimal untuk digunakan. ii. Linearitas kurva baku alopurinol periode pertama Kegiatan ini dilakukan pada bulan Desember 2013 dengan menggunakan hasil optimasi komposisi fase gerak dan flow rate yang optimal yaitu fase gerak I dengan perbandingan 10:90 dan flow rate 0,5 mL/menit. Pada periode pertama dilakukan pembuatan larutan kurva baku sebanyak 3 kali replikasi dengan 6 konsentrasi alopurinol yaitu 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 g/mL, kemudian larutan ini segera diaplikasikan pada KCKT yang telah dioptimasi, sehingga diperoleh massa alopurinol yaitu 100, 200, 300, 400, 500 dan 600 ng. Pada penelitian ini pembuatan kurva baku dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan semua data diplotkan pada program Powerfit sehingga dapat ditentukan regresi linear yang mampu mencakup ketiga kurva baku tersebut. Berikut adalah data kurva baku alopurinol periode pertama.


68

Tabel X. Data kurva baku alopurinol periode I

Replikasi

1

2

3

Massa alopurinol (ng) 101 201 302 402 503 603 101 201 302 402 503 603 101 201 302 402 503 603

AUC 247249 818744 1654925 2309629 2986392 3639311 245974 813919 1651463 2307736 2986772 3653295 245746 815105 1650687 2306361 2981560 3655325

Persamaan

Persamaan kumulatif

F(x) = -471920.3 + 6859.7 x r= 0.999

F(x) = -480792.2 + 6886.3 x r = 0.999

F(x) = -477792.8 + 6876.6 x r = 0.999

F(x) = -480665.7 + 6883.9 x r = 0.999

Pada tabel X diperoleh persamaan kumulatif dengan koefisien korelasi (r) sebesar 0,999 dengan n = 6, maka dapat dikatakan linear secara statistik karena r > 0,811 (Tabel V). iii. Sensitivitas Batas deteksi (LOD) merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. LOD dapat ditentukan dari persamaan regresi linear kurva baku. Pada metode KCKT, perhitungan LOD dilakukan terhadap seri larutan kurva bakujamu asam urat. Semakin kecil nilai LOD maka dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memiliki sensitivitas yang baik.


69

Polynomial Degree is: 1 , based on 18 data points (#1 to #18) POLYNOMIAL is: F(x) = -477792.75059 + 6876.65128 x higher degree is no significant improvement: F(1,15,95.0%) = 4.542 > F_obs = 0.403 Coefficients, Standard Deviations and 95.0% Confidence Limits are: Coefficient Std.Dev. Min.Limit Max.Limit a0 -4.77793E+005 2.60150E+004 -5.32945E+005 -4.22641E+005 a1 6.87665E+003 6.64352E+001 6.73581E+003 7.01750E+003 Variance Y, S^2 =

2.338397951E+009

Covariance matrix of Coefficients: 6.76778E+008 -1.55360E+006 -1.55360E+006 4.41364E+003 Correlation Coefficient: 0.99925 x value at y = 0: 69.480 Std.Dev.:

3.193 Range: 6.3E+001 < x0 < 7.6E+001

Berdasarkan data diatas didapatkan persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 6876,6 x – 477792,8 dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,999 dan nilai Sa = 2,60.104. Sensitivitas juga ditentukan dari nilai slope yang menunjukkan respon dari alat. Nilai slope dapat ditunjukkan dari nilai b pada persamaan kurva baku yang diperoleh yaitu sebesar 477792,8. Dari perhitungan menggunakan rumus LOD maka didapatkan nilai LOD sebesar 12,5ng/20 L. b. Uji Kesesuaian Sistem dalam Periode Kedua (2014) Selama penelitian terdapat jeda waktu sehingga analis melakukan uji kesesuaian sistem kembali pada bulan Februari 2014 untuk mengetahui apakah kondisi metode KCKT yang digunakan masih reprodusibel untuk menetapkan kadar alopurinol dalam matriks jamu asam urat. i. Presisi terhadap parameter tR dan AUC Pada bulan Februari 2014 dilakukan uji presisi kembali untuk mengetahui keterulangan terhadap metode analisis selama periode waktu tertentu.Presisi dinyatakan dengan persen koefisien variasi (CV).Semakin kecil nilai persen CV


70

maka dikatakan memiliki presisi yang baik.Pada penelitian ini dilakukan uji presisi terhadap parameter tRdanAUC yang ditunjukkan pada tabel berikut. Tabel XI. Persen koefisien variasi nilai tR dan AUC baku alopurinol periode II

Massa Alopurinol (ng) Rep. 1 3 Rep. 2 Rep. 3 Rata-rata SD CV (%)

tR

AUC

4,9 4,8 4,8 4,8 0,01 0,3

27433 26991 27438 27287,3 256,6 0,9

Berdasarkan data diatas, menunjukkan bahwa metode KCKT yang digunakan masih cukup optimal karena CV tRdanAUC yang diperoleh dibawah 16% untuk konsentrasi  1 g/mL (Horwitz, 2007). ii. Linearitas kurva baku alopurinol periode kedua Kegiatan ini dilakukan pada bulan Februari 2014dengan menggunakan hasil optimasi komposisi fase gerak dan flow rate yang optimal yaitu fase gerak I dengan perbandingan 10:90 dan flow rate 0,5 mL/menit. Pada periode kedua dilakukan pembuatan kurva baku alopurinol untuk perhitungan LOD sebanyak 3 kali replikasi dengan 4 konsentrasi yaitu 0,1; 0,2; 0,3; dan 0,4 g/mL yang selanjutnya diaplikasikan pada KCKT yang telah dioptimasi dengan volume inject sejumlah 10 L, sehingga diperoleh massa alopurinol sebesar 1, 2, 3, dan 4 ng. Pada penelitian ini pembuatan kurva baku dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan semua data diplotkan pada program Powerfit sehingga dapat ditentukan regresi linear yang mampu mencakup ketiga kurva baku tersebut. Berikut adalah data kurva baku alopurinol periode pertama.


71

Tabel XII. Data kurva bakualopurinol periode II

Replikasi

1

2

3

Massa Alopurinol (ng) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

AUC 18307 22397 27433 34450 16573 21598 26991 34521 16871 21857 27438 34305

Persamaan

Persamaan kumulatif

F(x) = 12280.5 + 5346.5 x r = 0.992 F(x) = 10111.5 + 5923.7 x r = 0.995

F(x) = 11013 + 5686.2 x r = 0,993

F(x) = 10647 + 5788.3 x r = 0.997

Berdasarkan tabel XIIdiperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,993 dengan n = 4, maka dapat dikatakan linear secara statistik karena nilai r > 0,950 (Tabel V). iii. Sensitivitas Pada bulan Februari 2014 dilakukan uji sensitivitas kembali untuk mengetahui sensitivitas terhadap metode analisis selama periode waktu tertentu. Sensitivitas dapat ditentukan oleh nilai LOD.Semakin kecil nilai LOD maka dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memiliki sensitivitas yang baik. Polynomial Degree is: 1 , based on 12 data points (#1 to #12) POLYNOMIAL is: F(x) = 11013.00000

+ 5686.16667 x

Coefficients, Standard Deviations and 95.0% Confidence Limits are: Coefficient Std.Dev. Min.Limit Max.Limit a0 1.10130E+004 5.85995E+002 9.70697E+003 1.23190E+004 a1 5.68617E+003 2.13975E+002 5.20927E+003 6.16306E+003 Variance Y, S^2 =

6.867800500E+005

Covariance matrix of Coefficients: 3.43390E+005 -1.14463E+005 -1.14463E+005 4.57853E+004 Correlation Coefficient: 0.99299 x value at y = 0: -1.937 Std.Dev.:

0.172 Range: -2.3E+000 < x0 < -1.6E+000


72

Berdasarkan data diatas didapatkan persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 5686.2 x + 11013dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,993 dan nilai Sa = 5,86.102. Sensitivitas juga ditentukan dari nilai slope yang menunjukkan respon dari alat. Nilai slope dapat ditunjukkan dari nilai b pada persamaan kurva baku yang diperoleh yaitu sebesar 11013. Dari perhitungan menggunakan rumus LOD maka didapatkan nilai LOD sebesar 0,3ng/10 L. Apabila data uji kesesuaian sistem dan validasi metode dalam dua periode, yaitu parameter tR, N, HETP, Tf, Rs, sensitivitas (slope, LOD), linearitas (r) dan presisi (Sy/x) dibandingkan, maka hasilnya terlihat pada tabel XIII. Tabel XIII. Perbedaan uji kesesuaian sistem dalam periode tertentu

Parameter tR N HETP Tf Rs Sensitivitas Linearitas Presisi

Slope LOD (ng) r Sy/x

Periode I 4,7 6048 24,9 1,0 2,0 6876,6 12,5 0,999 47958,3

Periode II 4,8 1600 94,8 1,3 1,2 5686,2 0,3 0,993 824,6

Berdasarkan tabel XIII dapat dilihat bahwa terjadi perubahan nilai pada parameter selama periode tertentu. a. Waktu retensi Waktu retensi pada kedua periode masih memenuhi syarat yaitu  10 menit (Depkes RI, 1995).Namun pada periode kedua terjadi pergeseran waktu menjadi lebih lama yang ditunjukkan pada tabel XIII.


73

b. Jumlah lempeng (N) dan HETP Semakin besar nilai N maka semakin efisien metode analisis dalam memisahkan analit.Nilai N berbanding terbalik dengan nilai HETP.Berdasarkan pada tabel XIII terjadi penurunan nilai N dan peningkatan HETP pada periode kedua.Hal ini menunjukkan bahwa metode analisis yang digunakan sudah mengalami penurunan kualitas kolom HPLC. c. Tailing factor Nilai Tf yang memenuhi syarat yang baik, yaitu nilai Tf 2(Synderdkk., 2010). Semakin kecil nilai Tf maka puncak yang terbentuk akan semakin simetris. Pada tabel XIII menunjukkan bahwa kedua periode masih memenuhi persyaratan karena nilai Tf 2.Namun pada periode kedua terjadi peningkatan nilai Tf, hal ini menunjukkan bahwa terjadi penurunan kualitas metode analisis. d. Resolusi Resolusi menunjukkan kualitas pemisahan suatu analit. Nilai Rs yang memenuhi syarat yang baik, yaitu nilai Rs 1,5(Synder dkk., 2010) sehingga dapat memisahkan analit dengan baik. Apabila nilai jumlah lempeng (N) yang diperoleh semakin kecil, maka nilai HETP yang diperoleh akan semakin besar sehingga dapat menyebabkan pada periode kedua diperoleh nilai Rs  1,5 yaitu 1,2. Hal tersebut menunjukkan bahwa terjadi overlapping sehingga dapat dikatakan bahwa metode analisis sudah mengalami penurunan kualitas resolusi dan tidak memenuhi persyaratan nilai minimal Rs.


74

e. Sensitivitas Sensitivitas dari suatu metode analisis dapat dilihat dari nilai slope dan Limit of Detection (LOD).Semakin kecil nilai LOD maka dapat dikatakan bahwa metode analisis memiliki batas deteksi yang lebih rendah.Berdasarkan tabel XIII diperoleh nilai LOD yang kecil pada periode kedua. Hal tersebut dikarenakan adanya perbedaan konsentrasi yang diinjeksikan pada sistem KCKT, dimana konsentrasi yang digunakan pada periode kedua yaitu 0,1g/mL hingga 0,4 g/mL. Meskipun demikian, sensitivitas juga ditentukan dari nilai slope yang menunjukkan respon dari alat. Apabila dilihat dari tabel XIII terlihat adanya perbedaan dari kedua periode. Untuk mengetahui hal tersebut maka perlu dilakukan uji signifikansi terhadap slope kurva baku periode I dan II. Uji signifikansi yang dilakukan adalah uji t untuk melihat apakah ada signifikansi antara kurva baku periode I dan II. Dari hasil perhitungan (Lampiran 17) diperoleh nilai t hitung sebesar 22,38 lebih besar dari t tabel yaitu 2,048 dengan tingkat kepercayaan 95%, sehingga dapat disimpulkan bahwa slope kurva baku pada periode I berbeda signifikan dengan slope kurva baku pada periode II. Perbedaan slope kurva baku yang signifikan pada kedua periode menunjukkan bahwa respon alat untuk mendeteksi perubahan kadar analit telah menurun sehingga dapat dikatakan bahwa metode analisis mengalami penurunan sensitivitas.


75

f. Linearitas Berdasarkan nilai koefisien korelasi (r) pada kedua periode menunjukkan nilai r lebih besar dari nilai r pada tabel V sehingga dapat dikatakan bahwa kedua periode memiliki linearitas yang baik secara statistik. g. Presisi Presisi dapat dilihat dari nilai Sy/x yang menunjukkan variansi dari kurva baku. Semakin kecil nilai Sy/x maka presisi semakin baik.Pada tabel XIII diperoleh nilai Sy/xyang kecil pada periode kedua yang menunjukkan bahwa metode analisis masih memiliki presisi yang cukup baik. Berdasarkan parameter – parameter diatas, maka dapat disimpulkan bahwa terjadi penurunan kualitas instrumen KCKT yang digunakan.Untuk mengetahui apakah metode analisis KCKT sudah tepat digunakan dalam penetapan kadar alopurinol pada jamu asam urat, maka dilakukan perhitungan berdasarkan perlakuan sampel berikut. PERIODE I (Desember 2013) 0,5 gram sampel dilarutkan dalam 10 mL NaOH 0,1 N lalu diekstraksi dengan kloroform. Kemudian diasamkan dengan HCl hingga pH 2 dan diperoleh volume akhir sebanyak 4 mL. Diambil 1 mL lalu clean up dan elusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol. (LOQ alopurinol dalam jamu yang harus dicapai = 0,52g/mg; LOD = 12,5 ng/20L ≈ 0,625 g/mL) LOQ = LOD x faktor pengenceran =0,625 g/mL = 0,05g/mg


76

PERIODE II (Februari 2014) Dengan perlakuan sampel yang sama. (LOQ alopurinol dalam jamu yang harus dicapai = 0,52g/mg; LOD = 0,3 ng/10L ≈ 0,03 g/mL) LOQ = LOD x faktor pengenceran =0,03 g/mL = 2,4 x 10-3g/mg Dari kedua periode dapat dilihat bahwa nilai LOQ yang diperoleh sangat berbeda.Hal ini menunjukkan adanya perubahan kondisi selama periode tertentu. Namun, berdasarkan perhitungan diatas dapat dilihat bahwa nilai LOQ yang diperoleh pada kedua periode lebih kecil dibandingkan batas kuantifikasi alopurinol yang harus dicapaisehingga metode KCKT dapat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Untuk tahap selanjutnya digunakan kurva baku pada periode kedua untuk mempresentasikan keadaan yang sebenarnya dalam menetapkan kadar alopurinol dalam jamu.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Metode spektrofotometri UV kurang tepat digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam matriks jamu. 2. Kondisi optimum yang diperoleh untuk analisis alopurinol dalam matriks sampel jamu asam urat dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dengan fase diam C18 dapat memenuhi kriteria parameter pemisahan, yang meliputi waktu retensi, N, HETP, tailing factor, dan resolusi dapat tercapai dengan menggunakan komposisi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10 : 90) dan flow rate 0,5 mL/menit. 3. Kurva baku alopurinol menggunakan sistem KCKT yang optimal mengalami perubahan kondisi selama periode penelitian dilihat dari perbedaan yang signifikan terhadap slope kedua kurva baku dengan nilai t hitung sebesar 22,38 yang lebih besar dari t tabel yaitu 2,048.

B. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian dalam satu periode agar dapat menjamin performa alat sehingga pemisahan alopurinol dan turunannya dapat terpisah dengan baik.

77


78

DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S. and Dong, M. W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, Elsevier Inc., London, pp. 21, 22-35, 203. Ahuja, S. and Rasmussen, H., 2007, HPLC Method Developments for Pharmaceutical, Elsevier Academic Press, Italy, pp. 14,15,472. Anonim, 2014, Toxicology of Allopurinol, http://www.gsk.com, diakses tanggal 10 Maret 2014 Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004, Klasifikasi Obat Herbal, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta. Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2005, Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor HK.00.05.41.1384 tentang Kriteria dan Tata Laksana Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta. Chan, C.C., Lam, H., 2004, Analytical Method Validation and Instrument Perfomance Verification, John Willey & Sons, Inc., New York, pp. 1314, 125. Chemaxon, 2013, Chemicalize.org Beta, Properties Viewer, http://www.chemicalize.org/structure/allopurinol, diakses tanggal 20 Desember 2013 Clarks, E.G.,2005, Isolation and Identification of Drug, The Phamaceutical Press, London, pp. 179-181. Cook, et al., 2000, Pearson’s Product Moment Correlation Coefficient, http://media3.bmth.ac.uk/spss/focus_pages/focus_10a.htm, diakses tanggal 16 Agustus 2014 Denney, R. C., 1993, A Dictionary of Chromatography, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York, pp. 93-95, 165. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979, Farmakope Indonesia, edisi 3, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.


79

Dipiro, J.T., et al., 2005, Pharmacotherapy Handbook, Sixth edition, The Mc. Grow Hill Company, USA. Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2010, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 220-246, 335-340, 378-390. Haborne, A.J., 1998, Phytochemical Methods A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis, Thomson Science, Weinheim, Germany, pp. 15. Harvey,D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw-Hill Companies, UnitedStates of America, pp. 370,371, 579-586,584. Horwitz, W., Latimer, G.W., (Eds), 2007, Official Method of Analysis, AOAC International, USA, pp. 254-250. Ibnu, Drs., M. Sodiq, dkk, 2004, Kimia Analitik 1, JICA, Malang, pp. 99-100. Iskandar, J., 2006, Rematik dan Asam Urat, Bhuana Ilmu Komputer, Jakarta, pp. 34-38. Johnson, E.L., 1978, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp. 22-24, 99. Katzung, B.G., 2004,Farmakologi Dasar dan Klinik, EGC, Jakarta. Kealey, D., 2005, Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publisher Limited, United Kingdom, pp. 191. Machata, S.G., 2005, Comparison of Octanol/Water Partition Coefficients Calculated by ClogP®, ACDlogP and KowWin® to Experimentally Determined Values, International Journal of Pharmaceutics, 294, pp. 185-192. Miller,

J.M. dan Crowther, J.B., 2010, Analytical Chemistry In a GMPEnvironment – A Practical Guide, John Wiley & Sons, Inc., New York,United States Of America, pp. 196-197,205,389.

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga, Surabaya, pp. 26. Mursyidi, A., 2008, Volumetri dan Gravimetri, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, pp. 88-89, 109-110.


80

Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakarta. Noegrohati, S., 2013, An Introduction on the Effectivity and Safety, UGM, Yogyakarta Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia, 2012, Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 007 Tahun 2012 tentang Registrasi Obat Tradisional, Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia, 2013, Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia nomor 179 / Men.Kes. / Per / VII / 76 tentang produksi dan distribusi obat tradisional. Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, edisi pertama, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, pp. 217-230. Sastrohamidjojo, 2002, Dasar-Dasar Liberty,Yogyakarta, pp. 22-23. Snyder,

Spektroskopi,

edisi

2,

Penerbit

L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, 2nd edition, John Willey & Sons, Inc., New York, pp 25-26.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Dolan, J.W., 2010, Introduction of Modern LiquidChromatography, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp.Xl. 25, 28, 33, 40-42, 51-52, 71, 109,151-152,316,327,331. Soenarso, A.S., 2014, Optimasi Isolasi Alopurinol Dalam Sediaan Tablet dan Jamu, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. The United States Pharmacopeia, 2007, The United States Pharmacopeia 30th : The National Formulary 25th, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Washington, D.C. Waters, 2008, OASIS Sample Preparation, Waters Corporation, USA, pp. 7. Willard, H. H., Merrit, jr., Dean, J.A., dan Settle, F.A., 1988, Instrumental Methods of Analysis, 7th edition, Wadsworth Publishing Company, California, pp. 519, 522-530, 580, 614-615.


81


LAMPIRAN 1.Certificate of Analysisbaku alopurinol E. Merck

82


LAMPIRAN 2.Certificate of Analysis SPE MCX

83


LAMPIRAN 3.Perhitungan pembakuan NaOH 0,1 N

1. Penimbangan kalium biftalat Penimbangan

Kalium biftalat (g)

Berat kertas

0,4574

Berat kertas + zat

0,8375

Berat kertas + sisa

0,4377

Berat zat

0,3998

2. Perhitungan pembakuan Natrium Hidroksida 0,1 N Diketahui : Bobot kalium biftalat = 0,3998 g = 399,8 mg BM kalium biftalat = 204,2 Volume NaOH = 21,35 mL Reaksi : KHC5H4O4 + NaOH

KNaC5H4O4 + H2O

Perhitungan : N NaOH = =

, ,

,

= 0,0917 N

Warna larutan setelah terjadi titik akhir titrasi

84


LAMPIRAN 4.Spektrogram penetapan alopurinol untuk Spektrofotometri UV a. Kosentrasi 4 μg/mL

b. Konsentrasi 8 μg/mL

c. Konsentrasi 12 μg/mL

panjang

gelombang

85

maksimum


86

LAMPIRAN 5.Data penimbangan kurva baku sampel tablet obat

1. Tabel keseragaman bobot tablet obat No.

Bobot tablet (mg)

No.

Bobot tablet (mg)

1.

307,9

11.

307,1

2.

310,1

12.

303,9

3.

311,4

13.

305,9

4.

306,4

14.

310,0

5.

307,5

15.

302,0

6.

305,6

16.

302,0

7.

306,0

17.

302,7

8.

309,2

18.

304,1

9.

305,6

19.

303.2

10.

304,4

20.

304,8

Σ = 6119,8

SD = 2,7388

̅ = 305,99

CV = 0,8951%

2. Penimbangan baku alopurinol untuk pembuatan kurva baku Penimbangan

Replikasi I (g)

Replikasi II (g)

Replikasi III(g)

Berat kertas

0,2560

0,2455

0,2545

Berat kertas + zat

0,3064

0.2961

0,3050

Berat kertas + sisa

0,2564

0,2461

0,2550

Berat zat

0,0500

0,0500

0,0500


87

3. Data persamaan kurva baku dalam sampel tablet obat Replikasi 1

Replikasi 2 Konsentrasi

Konsentrasi

Konsentrasi(µg/mL)

Abs

4

0,256

4

0,253

4

0,253

6

0,356

6

0,355

6

0,367

8

0,453

8

0,460

8

0,475

10

0,563

10

0,570

10

0,587

12

0,659

12

0,686

12

0,683

14

0,755

14

0,776

14

0,798

(µg/mL)

Abs

Replikasi 3

(µg/mL)

Abs

y = 0,050 x + 0,055

y = 0,053 x + 0,039

y = 0,054 x +0,040

r = 0,999

r = 0,999

r = 0,999

NB : Ketiga kurva baku diatas dimasukkan ke dalam program powerfit dan diperoleh persamaan y = 0.045 + 0.052 x dengan linearitas 0,998.

Plot kurva baku dalam matriks tablet obat


88

4. Contoh perhitungan kadar Replikasi 1 Tingkat kemurnian alopurinol = 100,51 (berdasarkan CoA pada lampiran 1) Jumlah allopurinol = 50 mg x 100,51% = 5025,5 mg C stok

= 5025,5 mg/50 mL = 1,0051 mg/ml = 1005,1 μg/mL

C1V1 = C2V2 C baku intermediet 1 →1005,1 x 1 mL = C2 x 10 mL C2 = 100,51 μg/mL C baku intermediet 2 →100,51 x 10 mL = C2 x 50 mL C2 = 20,102 μg/mL Seri 1→ 20,102 μg/mL x 2 mL = C2 x 10 mL C2 = 4,0204μg/mL≈ 4 μg/mL

NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan menyesuaikan volume larutan baku intermediet 2 yang diambil.


LAMPIRAN 6.Perhitungan Limit of Detection sampel tablet obat

Persamaan regresi linier yang diperoleh, y = 0,052x - 0,045 Polynomial Degree is: 1 , based on 18 data points (#1 to #18) POLYNOMIAL is: F(x) = 0.04479 + 0.05246 x higher degree is no significant improvement: F(1,15,95.0%) = 4.542 > F_obs = 0.197 Coefficients, Standard Deviations and 95.0% Confidence Limits are: Coefficient Std.Dev. Min.Limit Max.Limit a0 4.47873E-002 7.62142E-003 2.86298E-002 6.09448E-002 a1 5.24619E-002 7.91724E-004 5.07834E-002 5.41404E-002 Variance Y, S^2 =

1.316337302E-004

Covariance matrix of Coefficients: 5.80860E-005 -5.64145E-006 -5.64145E-006 6.26827E-007 Correlation Coefficient: 0.99818 x value at y = 0: -0.854 Std.Dev.:

Perhitungan : LOD = =

,

,

,

.

,

= 0,48 μg/mL

0.157 Range: -1.2E+000 < x0 < -5.2E-001

89


LAMPIRAN 7.Spektogram scaning panjang gelombang maksimum alopurinol a. Alopurinol 5 μg/mL

b.

Alopurinol 7,5 μg/mL

c. Alopurinol 10 μg/mL

90


d. Alopurinol 12,5 μg/mL

e. Alopurinol 15 μg/mL

91


92

LAMPIRAN 8.Perhitungan polaritas

Diketahui data berikut : Pelarut / Solvent

Polarity Index

Metanol

5,1

Air

10,2

Perhitungan polarity index pelarut dalam penentuan panjang gelombang : 1. Pelarut NaOH 0,1 N dalam 100% air Indeks polaritas =

10,2 = 10,2

2. Pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol = 5:95 Indeks polaritas =

10,2 +

5,1 = 0,51 + 4,84 = 5,35 ≈ 5,4

Perhitungan polarity indexfase gerak: 3. Fase gerak metanol : akuabides + ammonium hidroksida 5% = 10:90 Indeks polaritas =

5,1 +

10,2 = 0,51 + 9,18 = 9,69

4. Fase gerak metanol : akuabides + ammonium hidroksida 5% = 20:80 Indeks polaritas =

5,1 +

10,2 = 1,02 + 8,16 = 9,18

5. Fase gerak metanol : akuabides + ammonium hidroksida 5% = 30:70 Indeks polaritas =

5,1 +

10,2 = 1,53 + 7,14 = 8,67


93

LAMPIRAN 9. Kromatogram hasil optimasi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90)

1. Flow rate 0,5 mL/menit Kromatogram alopurinol konsentrasi 20 g/mL

Contoh perhitungan nilai Resolusi (flow rate 0,5 mL/menit) Diketahui : tR0 = 4,402 menit w ½ h0 = 0 menit

tR1 = 4,884 menit w ½ h1 = 0,221 menit

keterangan : 0,65 cm = 0,5 menit ; 1 cm = 1,3 menit

Rs =

(

)

=

, (

, ,

)

= 2,181



94


3. Flow rate 1 mL/menit Kromatogram alopurinol konsentrasi 20 g/mL

95


96





97



98


99





100



101


102

LAMPIRAN 12.Kromatogram alopurinol untuk pembuatan kurva baku, uji kesesuaian sistem dan penentuan LOD periode I Replikasi 1 a.

Seri 1 (101 ng)

Alopurinol

b.

Seri 2 (201 ng)


c.

Seri 3 (302 ng)

d.

Seri 4 (402)

103


e. Seri 5 (503 ng)

f.

Seri 6 (603 ng)

104


Replikasi II a. Seri 1 (101 ng)

b. Seri 2 (201 ng)

105


c. Seri 3 (302 ng)

d. Seri 4 (402 ng)

106


e. Seri 5 (503 ng)

f. Seri 6 (603 ng)

107


Replikasi III a. Seri 1 (101 ng)

b. Seri 2 (201 ng)

108


c. Seri 3 (302 ng)

d. Seri 4 (402 ng)

109


e. Seri 5 (503)

f. Seri 6 (603 ng)

110


111

LAMPIRAN 13.Penimbangan dan contoh perhitungan kadar baku periode I a.

Penimbangan Penimbangan

b.

Replikasi I (g)

Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Berat kertas

0,2133

0,2141

0,2125

Berat kertas + zat

0,2383

0,2391

0,2375

Berat kertas + sisa

0,2133

0,2141

0,2125

Berat zat

0,0250

0,0250

0,0250

AUC

Persamaan

Data AUC

Replikasi

1

2

3

c.

Massa alopurinol (ng) 101 201 302 402 503 603 101 201 302 402 503 603 101 201 302 402 503 603

247249 818744 1654925 2309629 2986392 3639311 245974 813919 1651463 2307736 2986772 3653295 245746 815105 1650687 2306361 2981560 3655325

Persamaan kumulatif

F(x) = -471920.3 + 6859.7 x r= 0.999

F(x) = -480792.2 + 6886.3 x r = 0.999

F(x) = -477792.8 + 6876.6 x r = 0.999

F(x) = -480665.7 + 6883.9 x r = 0.999

Contoh perhitungan kadar Replikasi I Tingkat kemurnian alopurinol = 100,51 (berdasarkan CoA pada lampiran 1) Jumlah alopurinol = 25 mg x 100,51% = 25,1275 mg C stok = 25,1275 mg/25 mL = 1005,1 mg/1000 mL = 1005,1g/mL


112

C1V1 = C2V2 C baku intermediet →1005,1 x 5 mL = C2 x 10 mL C2 = 502,55g/mL Seri 1→ 502,55g/mL x 0,1 mL = C2 x 10 mL x volume inject C2 = 5,0255g/mL x 20 L = 5,0255 ng/L x 20 L = 100,51 ng = 101 ng

NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan menyesuaikan volume larutan baku intermediet yang diambil.


113

LAMPIRAN 14.Perhitungan Limit of Detection periode I Konsentrasi (g/mL) 5

10

15

20

25

30

Regresi

A Bx R

Replikasi 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 -477792,8 6876,6 0.999

Massa (ng) 101

201

302

402

503

603

AUC 247249 245974 245746 818744 813919 815105 1654925 1651463 1650687 2309629 2307736 2306361 2986392 2986772 2981560 3639311 3653295 3655325

Y = -477792,8 + 6876,6 x

Nilai Sa diperoleh dari program Powerfit (Utrecht University Faculteit Scheikunde) Sa = 2,66.104

Perhitungan LOD : = 3,3 = 3,3

2,60.10 6876,6

= 12,5 ng


114

LAMPIRAN 15.Kromatogram alopurinol untuk pembuatan kurva baku, uji kesesuaian sistem dan penentuan LOD periode II Replikasi I a.

Seri 1 (1 ng)

b.

Seri 2 (2 ng)


c.

Seri 3 (3 ng)

d.

Seri 4 (4 ng)

115


Replikasi II a.

Seri 1 (1 ng)

b.

Seri 2 (2 ng)

116


c.

Seri 3 (3 ng)

d.

Seri 4 (4 ng)

117


Replikasi III a.

Seri 1 (1 ng)

b.

Seri 2 (2 ng)

118


c.

Seri 3 (3 ng)

d.

Seri 4 (4 ng)

119


120

LAMPIRAN 16. PerhitunganLimit of Detection periode II Konsentrasi (g/mL) 0.1

0.2

0.3

0.4 A Bx R

Regresi

Replikasi 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 11013 5686.2 0.993

Massa (ng) 1

2

3

4

AUC 18307 16573 16871 22397 21598 21857 27433 26991 27438 34450 34521 34305

Y = 11013 + 5686.2 x

Nilai Sa diperoleh dari program Powerfit (Utrecht University Faculteit Scheikunde) Sa = 5,86.102

Perhitungan LOD : = 3,3 = 3,3

5,86.10 5686,2

= 0,3 ng


121

LAMPIRAN 17. Perhitungan Uji T untuk slope kurva baku alopurinol periode I dan periode II

t hitung = (

)

untuk mencari nilai s digunakan rumus : s2= =

(

(

( )

.

) )

(

(

) )

= 20668.15 s = 143.76 .

t hitung =

.

.

= 22,38 t tabel= 2,048

karena nilai t hitung (22,38) lebih besar daripada t tabel (2,048) pada tingkat kepercayaan 95% dengan harga degree of freedom 28, maka nilai slope antara kurva baku Idan II berbeda signifikan.


122

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama lengkap Meta Kartika Sari dan akrab dipanggil Meta merupakan anak tunggal dari pasangan Ong Tian Tjoan dan Yellis Gunawan.Penulis dilahirkan di Tangerang pada tanggal 28 Mei 1992. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis yaitu di TK Kristen Kanaan Tangerang (1998), SD Kristen Kanaan Tangerang (2004), SMP Strada Santa Maria 1 Tangerang (2007), SMA Santo Thomas Aquino Tangerang (2010) dan pada tahun 2010 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta sampai tahun 2014. Selama menjadi mahasiswa penulis aktif dalam berbagai kegiatan antara lain Kampanye Informasi Obat (KIO) sebagai volunteer (2010), KMBK Dharma Virya sebagai sie pendidikan (2011), Komisi Pemilihan Umum KMBK Dharma Virya dan HUT KMBK sebagai koordinator acara (2012), Organisasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi sebagai anggota divisi publikasi dan informasi (2012), Seminar Motivasi Andrie Wongso “Who Are You, Give or Be Given” sebagai bendahara (2012), Komisi Pemilihan Umum Gubernur Badan Eksekutif Mahasiswa dan Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi sebagai sie acara (2013), asisten dosen praktikum Analisis Farmasi (2014), dan Validasi Metode (2014).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents