PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

PEMBUATAN DAN UJI AKTIVITAS SEDIAAN GEL SCARLESS WOUND DENGAN EKSTRAK BINAHONG DAN ZAT AKTIF PIROXICAM

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Diajukan oleh: Ayaga Divadi NIM: 128114075

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015


PEMBUATAN DAN UJI AKTIVITAS SEDIAAN GEL SCARLESS WOUND DENGAN EKSTRAK BINAHONG DAN ZAT AKTIF PIROXICAM

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Diajukan oleh: Ayaga Divadi NIM: 128114075

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015 ii

PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI PLAGIAT

,-

! ,.4

'1


Pengesehan Skripsi Beriudul

PEMBUATAN DAITT UJI AKTTVTTAS SEDIAAN GNL SCARLESS WOUA{D DENGAN EKSTRAK BINAIIONG DAI\I ZAT AKTIF PIRO}ilCAM

Oleh:

AyagalXvadi

NM: L28ll4A75

r*s M.Si., Ph.D., Apt.

PanitiaPenguji:

1. Dr. Sri Ilartati Yuliani, Apt

2. Enade Perdana Istya$ono, Ph-!- Aft. 3.

Wahyuning Setymi, M.Sc.,

Apt

iv




INTISARI Luka adalah keadaan di mana kontinuitas jaringan rusak, sehingga tubuh akan berusaha memperbaikinya dengan mekanisme penyembuhan luka. Mekanisme ini seringkali menimbulkan parut luka yang disebabkan oleh fase inflamasinya. Binahong mengandung asam askorbat dan flavonoid yang berperan penting dalam pembentukan kolagen, sehingga dapat mempercepat proses penyembuhan luka. Piroxicam dapat memperpendek atau menghambat fase inflamasi dengan cara menghambat enzim siklooksigenase (COX) pada sintesis prostaglandin, yang berperan dalam pembentukan parut luka. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah kombinasi piroxicam dan ekstrak binahong dalam sediaan gel penyembuh luka dapat memberikan efek pengurangan parut luka. Dalam penelitian ini gel dengan ekstrak binahong akan di kombinasikan dengan piroxicam untuk menghasilkan gel scarless wound (BinPirox). Metode yang digunakan adalah metode eksperimental murni. Metode uji yang digunakan adalah uji histopatologi yang dilanjutkan dengan penghitungan luas kolagen. Data penghitungan luas kolagen dianalisis menggunakan uji t sampel independen dengan taraf kepercayaan 95%. Dalam penelitian ini diduga penambahan piroxicam akan mengurangi pembentukan parut luka insisi pada hewan uji mencit putih (Mus musculus) galur Swiss Webster. Hasil penelitian menunjukkan bahwa BinPirox menghasilkan parut luka lebih sedikit secara statistik (1,3020 ± 0,0232 mm2) dibandingkan Bin (formula basis gel yang mengandung ekstrak binahong) (7,7070 ± 0,0821 mm2). Kata kunci: luka, piroxicam, binahong (Anredera cordifolia (Ten. Steenis), parut luka.

vii


ABSTRACT Wound is a condition where the tissue integrity is damaged so that body will attempt to repair the damaged tissue by wound healing mechanism. This mechanism usually results in the scar formed by its inflammatory phase. Binahong contains ascorbic acid and flavonoids which are important for collagen formation, to improve the rate of the wound healing process. Piroxicam can shorten or detain the inflammatory phase by inhibiting the cyclooxygenase (COX) enzymes in the prostaglandine synthesis process, which play an important role in scar formation. The aim of this research is to discover if the combination of piroxicam and binahong extract in the scarless wound gel could offer scar reduction effect. In this research, a gel preparation with binahong extract was combined with piroxicam to develop the scarless wound gel (BinPirox). The research was purely experimental. It was done by conducing a histopathological test followed by collagen area calculation. The data were analyzed by independent sample ttest with 95% significancy level. In this research, the addition of piroxicam was expected to reduce the scar formation on incisional wound of white Swiss Webster mice (Mus musculus). The result showed that BinPirox formed statistically less scar (1,3020 ± 0,0232 mm2) when compared to Bin (a gel preparation with binahong extract) (7,7070 ± 0,0821 mm2). Keywords: wound, piroxicam, binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis), scar.

viii


HALAMAN PERSEMBAHAN

Inilah hasil usaha anak-Mu, yang kupersembahkan hanya kepada-Mu.

“And, when you want something, all the universe conspires in helping you to achieve it” -Paulo Coelho-

ix


PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala perlindungan dan berkat yang telah diberikan sehingga skripsi dengan berjudul “Pembuatan dan Uji Aktivitas Sediaan Gel Scarless Wound dengan Ekstrak Binahong dan Zat Aktif Piroxicam” dapat dikerjakan dengan baik dan lancar. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak terlepas dari campur tangan berbagai pihak. Kesempatan ini penulis gunakan untuk mengungkapkan rasa terima kasih kepada: 1.

Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma;

2.

Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi dan pembimbing yang selalu menuntun, memberikan saran, dan memotivasi selama penelitian dan penyusunan skripsi;

3.

Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam penggunaan fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian ini;

4.

Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., yang telah memberikan bantuan dalam determinasi tanaman Anredera cordifolia (Ten.) Steenis;

5.

Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., yang juga terus mendukung dan memberi banyak panduan dan masukan dalam penelitian ini;

x


6. Pak Musrifin, Pak Agung, Pak Wagiran, Pak Mukminin, Pak Sigit dan Pak Parjiman, selaku laboran laboratorium Fakultas Farmasi yang telah membantu penulis dalam proses pelaksanaan penelitian di laboratorium; 7.

Bapak Yohanes Ratijo, yang telah banyak meluangkan waktu, tempat, dan tenaga, serta selalu memotivasi demi lancarnya penelitian ini;

8.

Keluarga tercinta, Vincentius, Marcelina, Benedetto, dan keluarga besar penulis yang selalu memberi motivasi, perhatian, dan doa demi kelancaran studi dan penyusunan naskah skripsi;

9.

Prita Patricia sebagai partner skripsi sekaligus sahabat terbaik, atas pengertian, perhatian, bantuan, motivasi, dan waktu yang diberikan;

10. Teman-teman seperjuangan: Bertha dan Ossak atas segala kerjasama, bantuan, dan semangat dalam penyusunan skripsi ini dari awal hingga akhir; 11. Partner in Crime dan Masboy 2012, untuk keceriaan dan motivasi yang diberikan; 12. Teman-teman FSM-B 2012, FST-A 2012, dan seluruh angkatan 2012; 13. Serta semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan sehingga penulis berharap kritik dan saran dari semua pihak. Akhir kata, penulis berharap semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu farmasi. Yogyakarta, 7 Desember 2015

Penulis xi


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ........................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................... iii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................... v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................. vi INTISARI ........................................................................................... vii ABSTRACT ....................................................................................... viii HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................... ix PRAKATA ......................................................................................... x DAFTAR ISI ...................................................................................... xii DAFTAR TABEL ............................................................................... xvi DAFTAR GAMBAR .......................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................... xviii BAB I PENDAHULUAN ................................................................... 1 A. Latar Belakang ............................................................................. 1 B. Rumusan Masalah ........................................................................ 3 C. Tujuan .......................................................................................... 3 D. Keaslian Penelitian ....................................................................... 4 E. Manfaat Penelitian ....................................................................... 4 1.

Manfaat teoretis ..................................................................... 4 xii


2.

Manfaat praktis ..................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................... 5 A. Luka ............................................................................................. 5 1.

Definisi ................................................................................. 5

2.

Penyembuhan luka ................................................................ 5

3.

Parut luka .............................................................................. 6

B. Piroxicam ..................................................................................... 8 C. Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) ............................. 9 1.

Klasifikasi dan deskripsi ........................................................ 9

2.

Zat aktif binahong ................................................................. 10

3.

Aktivitas penyembuhan luka ................................................. 10

D. Hidrogel ....................................................................................... 10 1.

Deskripsi ............................................................................... 10

2.

Kelembapan .......................................................................... 10

3.

Formula ................................................................................. 11

E. Landasan Teori ............................................................................ 11 F. Hipotesis ...................................................................................... 12 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ............................................. 13 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................... 13 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ............................... 13 1.

Variabel tergantung ............................................................... 13

2.

Variabel bebas ....................................................................... 13

3.

Variabel pengacau ................................................................. 13

xiii


C. Definisi operasional ..................................................................... 14 D. Bahan Penelitian .......................................................................... 14 1.

Subjek penelitian ................................................................... 14

2.

Bahan penelitian .................................................................... 14

E. Alat Penelitian ............................................................................. 15 F. Tata Cara Penelitian ..................................................................... 15 1.

Pengumpulan bahan dan pengeringan .................................... 15

2.

Ekstraksi binahong ................................................................ 15

3.

Pembuatan gel scarless wound .............................................. 16

4.

Uji sterilitas ........................................................................... 17

5.

Uji daya sebar ....................................................................... 18

6.

Uji homogenitas .................................................................... 19

7.

Perlakuan pemberian luka pada mencit .................................. 19

8.

Uji histopatologi – pengecatan Hematoxylin-Eosin (HE) ....... 20

G. Tata Cara Analisis Hasil ............................................................... 21 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 23 A. Determinasi Tanaman .................................................................. 23 B. Ekstraksi ...................................................................................... 24 C. Pembuatan gel scarless wound ..................................................... 25 D. Uji Sterilitas ................................................................................. 26 E. Uji Sifat Fisis ............................................................................... 26 F. Kriteria dan Perlakuan terhadap Mencit ........................................ 29 G. Analisis Hasil Uji Histopatologi .................................................... 32

xiv


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................... 35 A. Kesimpulan .................................................................................. 35 B. Saran ............................................................................................ 35 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................... 36 LAMPIRAN ....................................................................................... 39 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................ 52

xv


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I.

Formula sediaan uji scarless wound .................................. 17

Tabel II.

Rata-rata hasil uji viskositas dan daya sebar ...................... 28

Tabel III. Rata-rata hasil penghitungan luas kolagen ......................... 32

xvi


DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Skema dasar penghitungan luas kolagen ............................ 21 Gambar 2. Daun binahong .................................................................. 23 Gambar 3. Proses dan hasil elektrolisis ............................................... 24 Gambar 4. Hasil uji sterilitas ............................................................... 27 Gambar 5. Grafik hasil uji rheologi ..................................................... 28 Gambar 6. Preparat hasil uji histopatologi ........................................... 31

xvii


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan hasil determinasi tanaman ................... 39 Lampiran 2. Certificate of Analysis piroxicam ..................................... 40 Lampiran 3. Ethical Clearance dari LPPT UGM ................................. 41 Lampiran 4. Surat keterangan analisa data dengan instrumen “IBM SPSS Statistics 22 lisensi UGM” ........................... 42 Lampiran 5. Data hasil uji sifat fisis dan luas kolagen ......................... 43 Lampiran 6. Data statistik penghitungan luas kolagen ......................... 44 Lampiran 7. Foto-foto dokumentasi kegiatan penelitian ...................... 47

xviii


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang “Kesan pertama adalah segalanya”. Bagi sebagian orang, slogan tersebut memang benar adanya. Kesan pertama, yang biasanya datang dari sisi visual, seringkali menentukan penilaian seseorang terhadap orang lain untuk seterusnya. Kulit yang mulus tanpa cela adalah salah satu contoh penampilan tubuh yang sempurna. Salah satu hal yang merusak kesempurnaan kulit adalah keberadaan parut luka. Pembentukan parut luka ini dapat disebabkan oleh proses penyembuhan luka, baik itu akibat luka bakar, luka terbuka, luka gores, dan sebagainya (Gauglitz, Korting, Pavicic, Ruzicka, dan Jeschke, 2011). Manusia dan sebagian besar hewan menutup lukanya dengan menimbulkan bekas luka, bukan dengan cara mengganti jaringan yang rusak dengan jaringan baru yang identik (Mistry, 2005). Menurut Eming, Krieg, dan Davidson (2007), proses penyembuhan luka sendiri bertujuan memperbaiki dan mengembalikan keutuhan jaringan dan homeostasisnya,

dengan

melalui

tiga

tahapan

umum,

yaitu

inflamasi,

pembentukan jaringan, dan penyusunan ulang jaringan. Fase inflamasi memang penting dalam penyembuhan luka, namun inflamasi berlebihan dapat menyebabkan terbentuknya parut luka. Mempersingkat fase inflamasi menjadi langkah logis untuk menghindari terbentuknya parut luka ini tanpa harus menghilangkan keseluruhan fase inflamasinya. Tanpa fase 1


2

inflamasi, subyek uji justru menjadi rentan terhadap infeksi (Wilgus, Vodovotz, Vittadini, Clubbs, dan Oberyszyn, 2003). Wilgus dkk. (2003) dalam penelitiannya telah membuktikan bahwa pemberian topikal celecoxib (zat antiinflamasi) terhadap luka insisi pada mencit telah berhasil menghambat kinerja enzim targetnya, yaitu siklooksigenase-2 atau COX-2. Hal ini berakibat pada penurunan kadar prostaglandin yang diketahui berperan dalam peningkatan proliferasi fibroblas dan produksi kolagen. Fibroblas dan kolagen bertanggung jawab membentuk parut luka (Eming dkk., 2007). Piroxicam adalah obat AINS yang memiliki aktivitas antiinflamasi, antipiretik, dan analgesik dengan cara menghambat sintesis prostaglandin, melalui penghambatan enzim COX (Abd-Allah, Dawaba, Mansour dan Samy, 2011) secara nonselektif (Greene dkk., 2010), meskipun hasil uji in vitro menunjukkan kecenderungan terhadap COX-1 (Dequeker dkk., 1998). Sebelumnya, piroxicam telah terbukti efektif memperlambat proses regenerasi jaringan dalam rangkaian proses penyembuhan luka. Penelitian yang dilaksanakan oleh Klang, Siganos, Benita, dan Frucht-Pery (1999) membuktikan bahwa emulsi piroxicam mampu menghambat

proses

penyembuhan epitel,

sementara

kontrol negatifnya

menunjukkan aktivitas reepitelisasi yang normal. Salah satu bentuk sediaan yang sering digunakan untuk perawatan luka adalah sediaan gel. Sejak tahun 1960, telah dibuktikan bahwa proses penyembuhan luka optimal dalam lingkungan yang lembap (Chaby dkk., 2007). Keuntungan lingkungan yang lembap adalah mencegah dehidrasi jaringan dan terutama mengurangi rasa sakit yang timbul selama proses penyembuhan luka


3

(Field dan Kerstein, 1994). Sediaan gel sendiri merupakan jaringan tiga dimensi rantai polimer silang yang memiliki kemampuan mengembang dengan cara menyerap air atau cairan biologis, sehingga gel dapat menjadi salah satu alternatif dalam perawatan luka (Gadri, Mulyanti, dan Aprilianti, 2014). Binahong diketahui memiliki manfaat untuk perawatan berbagai macam penyakit seperti hipertensi dan penyakit kulit. Di Indonesia, binahong telah terbukti secara empiris mampu mempercepat proses penyembuhan luka (Sumartiningsih, 2011). Selain itu, Yuliani (2012) melalui penelitiannya telah menemukan konsentrasi optimum ekstrak etanol daun binahong dalam sediaan hidrogel penyembuh luka. Kandungan flavonoid dan asam askorbatnya memiliki aktivitas pembentukan kolagen dan percepatan epitelisasi. Hal inilah yang diduga kuat membuat binahong dapat beraksi sebagai penyembuh luka (Ariani, Loho, dan Durry, 2013). Menggabungkan sediaan gel binahong dengan piroxicam sebagai paket komplit perawatan luka diharapkan akan menghasilkan sediaan penyembuh luka tanpa parut luka, atau selanjutnya disebut sebagai sediaan scarless wound.

B. Rumusan Masalah Apakah kombinasi piroxicam dan ekstrak binahong dalam sediaan gel penyembuh luka dapat memberikan efek pengurangan parut luka?

C. Tujuan Mengetahui apakah kombinasi piroxicam dan ekstrak binahong dalam sediaan gel penyembuh luka dapat memberikan efek pengurangan parut luka.


4

D. Keaslian Penelitian Yuliani (2012) melakukan penelitian mengenai formulasi sediaan hidrogel penyembuh luka dengan ekstrak binahong. Wilgus dkk. (2003) melakukan penelitian mengenai formulasi sediaan topikal celecoxib untuk mengurangi pembentukan parut luka. Sejauh penelusuran peneliti, belum pernah dilakukan penelitian mengenai formulasi sediaan gel penyembuh luka dengan penambahan antiinflamasi untuk mengurangi pembentukan parut luka.

E. Manfaat Penelitian 1.

Manfaat teoretis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan kontribusi pada perkembangan ilmu kefarmasian khususnya yang berkaitan dengan aktivitas antiinflamasi piroxicam untuk mengurangi pembentukan parut luka, sehingga dapat pula dijadikan acuan untuk penelitian berikutnya.

2.

Manfaat praktis Penelitian

ini

diharapkan dapat

membuktikan

secara

ilmiah

daya

penghilangan parut luka oleh penambahan piroxicam dalam sediaan gel scarless wound dengan ekstrak binahong.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Luka 1.

Definisi Luka adalah gangguan terhadap keutuhan normal pada suatu struktur tubuh. Istilah “luka”, seperti yang dapat ditemukan dalam kamus-kamus dan sebagai suatu terminologi yang diterima secara umum. Luka biasanya mengacu pada suatu cedera akut atau trauma mekanis akut, seperti luka tembak, luka tusuk, dan lain-lain (Shai dan Maibach, 2005).

2.

Penyembuhan luka Rangkaian proses penyembuhan luka adalah fase inflamasi, fase pembentukan jaringan, dan fase penyusunan ulang jaringan atau remodelling phase (Shai dan Maibach, 2005; Eming dkk., 2007). Inflamasi sebagai fase pertama melibatkan pendarahan untuk membilas bakteri atau antigen yang ada pada luka. Pendarahan mengaktifkan hemostasis yang diinisiasi oleh komponen eksudat seperti faktor pembekuan. Fibrinogen yang terdapat dalam eksudatlah yang menjalankan mekanisme pembekuannya, sehingga terjadi koagulasi eksudat. Dari sini, terjadi pembentukan jaringan fibrin, menutup luka sehingga pendarahan dapat berhenti (Whelan, Stewart, dan Schwartz, 2005; Eming dkk., 2007; Boateng, Matthews, Stevens, dan Eccleston, 2008).

5


6

Prostaglandin yang dilepaskan oleh jaringan yang terluka dan histamin yang disekresikan oleh sel mast menginduksi vasodilatasi seiring dengan meningkatnya permeabilitas kapiler. Neutrofil dan makrofag muncul tak lama kemudian untuk melawan organisme patogen dan menyingkirkan jaringan mati (Shai dan Maibach, 2005; Whelan dkk., 2005). Fase kedua, fase pembentukan jaringan atau fase proliferasi merupakan fase utama dalam mekanisme pembentukan jaringan. Pelepasan berbagai faktor pertumbuhan menginduksi perpindahan dan proliferasi sel-sel endotelial. Hal ini menyebabkan angiogenesis atau proses pembentukan pembuluh darah baru. Fibroblas bermigrasi dan muncul di area luka, mereka berproliferasi dan kemudian mengaktifkan sintesis kolagen. Pengendapan kolagen inilah yang menjadi awal terbentuknya suatu struktur yang lama kelamaan mengembalikan integritas kulit (Shai dan Maibach, 2005; Shaw dan Martin, 2009). Fase ketiga, atau fase penyusunan ulang jaringan (remodelling phase), melibatkan pembentukan jaringan konektif sel sekaligus memperkuat epitelium baru yang akan menentukan sifat parut luka nantinya (Boateng dkk., 2008). Serat-serat kolagen diatur sedemikian rupa hingga pada akhirnya akan terbentuk jaringan parut luka (Shai dan Maibach, 2005). 3.

Parut luka Pembentukan parut luka adalah titik akhir fisiologis yang tak terelakkan dari suatu proses penyembuhan luka dan telah banyak penelitian yang menunjukkan bahwa inflamasi adalah prasyarat esensial dalam proses


7

pembentukan parut luka (Eming dkk., 2007). Ada beberapa penelitian yang menunjukkan bahwa fase inflamasi dalam penyembuhan luka sangat erat kaitannya

dengan

pembentukan

parut

luka,

salah

satunya

adalah

perbandingan antara penyembuhan pasca kelahiran dengan penyembuhan luka fetal. Pada kulit janin, tidak ada parut luka yang terbentuk setelah penyembuhan luka (Wilgus dkk., 2003). Meskipun ada banyak faktor intrinsik dan ekstrinsik yang dapat mempengaruhi penyembuhan luka ini, hanya ketiadaan aktivitas inflamasilah yang menjadi sebab utamanya. Luka pada fetus trimester pertama dan kedua sembuh tanpa adanya parut luka, menumbuhkan kulit normal tanpa produksi kolagen berlebih dan tak beraturan, dan yang paling penting, proses ini berlangsung hanya pada kondisi ketiadaan proses inflamasi (Wilgus dkk., 2003). Pernyataaan ini diperkuat oleh Cianfarani dkk. (2006), bahwa respon inflamasi memang diperlukan dalam proses penyembuhan luka, namun respon inflamasi yang berlebihan atau terlalu lama dapat memicu pembentukan parut luka Salah satu respon pertama terhadap stimulus inflamasi seperti luka adalah induksi enzim COX-2, yang mengkatalisis konversi asam arakidonat menjadi prostaglandin. Enzim-enzim COX, termasuk enzim homeostatis COX-1, adalah target dari obat-obat AINS seperti aspirin dan ibuprofen. Prostaglandin sendiri diketahui dapat menginduksi proliferasi fibroblas secara in vitro dan produksi kolagen pada luka in vivo. Menariknya, pembentukan parut luka dapat dikurangi tanpa harus mengeliminasi proses inflamasinya


8

sama sekali, yang dapat menempatkan mencit uji dalam resiko terkena infeksi. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa enzim COX dan prostaglandin yang diproduksinya adalah penentu paling penting dalam jumlah parut luka yang terbentuk (Wilgus dkk., 2003).

B. Piroxicam Piroxicam, salah satu derivat oxicam, adalah obat AINS yang memiliki aktivitas antiinflamasi, antipiretik, dan analgesik (Klang dkk., 1999) dengan cara menghambat sintesis prostaglandin, melalui penghambatan enzim COX. Piroxicam merupakan inhibitor COX nonselektif (Greene dkk., 2010), atau dapat menghambat enzim COX-1 dan COX-2 sama baiknya, meskipun hasil uji in vitro menunjukkan kecenderungan terhadap COX-1 (Dequeker dkk., 1998). Namun, sama seperti obat AINS lainnya, bagaimana persisnya mekanisme aksi piroxicam terkait penghambatan prostaglandin sintetase tidak dapat dipahami secara utuh (Abd-Allah dkk., 2011). Meskipun demikian, piroxicam telah terbukti efektif memperlambat proses regenerasi jaringan dalam rangkaian proses penyembuhan luka. Penelitian yang dilaksanakan oleh Klang dkk. (1999) membuktikan bahwa emulsi piroxicam mampu menghambat proses penyembuhan epitel. Kontrol negatifnya, sementara itu, menunjukkan aktivitas reepitelisasi yang normal.


9

C. Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) 1.

Klasifikasi dan deskripsi Klasifikasi binahong menurut taksonomi adalah sebagai berikut: Regnum

: Plantae

Divisio

: Magnoliophyta

Classis

: Magnoliopsida

Ordo

: Caryophyllales

Familia

: Basellaceae

Genus

: Anredera

Species

: Anredera cordifolia (Ten.) Steenis

Sinonim

: Boussingaultia cordifolia Ten.; Boussingaultia gracilis Miers; Boussingaultia pseudobasseloides Haum (Starr, Starr, dan Loope, 2003; Sumartiningsih, 2011). Binahong termasuk tanaman menjalar yang memiliki ukuran panjang

batang 3-6 meter. Batangnya lunak dan berbentuk silindris, berwarna merah, saling membelit, serta membentuk semacam umbi yang melekat di ketiak daun dengan bentuk tidak beraturan dan bertekstur kasar. Daun binahong merupakan daun tunggal, tangkai daun berukuran pendek, daun dan tangkai daun berwarna hijau. Bentuk helaian daun menyerupai jantung dengan ukuran panjang daun 1-11 cm dan lebar 0,8-8 cm. Helaian daun memiliki ujung runcing, pangkal berlekuk, tepi rata, permukaan licin, serta daging daun tipis lunak (Starr dkk., 2003).


2.

10

Zat aktif binahong dan aktivitas penyembuhan luka Tanaman binahong diketahui memiliki kandungan fenol, flavonoid, saponin, terpenoid, steroid, alkaloid (Astuti, Sakinah, Andayani, dan Risch, 2011), asam askorbat (Ariani dkk., 2013), dan asam ursolat (Lin, Kuo, Chao, dan Lin, 1988; Lim dkk., 2007). Sebuah artikel yang ditulis oleh Manoi (2009) mengungkapkan kemampuan binahong untuk menyembuhkan dalam waktu yang lebih singkat dibandingkan dengan luka yang tidak diberi binahong. Selain itu, Yuliani (2012) melalui penelitiannya telah menemukan konsentrasi optimum ekstrak etanol daun binahong dalam sediaan hidrogel penyembuh luka. Kandungan flavonoid dan asam askorbatnya memiliki potensi aktivitas pembentukan kolagen dan percepatan epitelisasi, sementara saponin berperan mencegah infeksi pada luka (Ariani dkk., 2013).

D. Hidrogel 1.

Deskripsi Gel merupakan salah satu bentuk sediaan untuk beberapa rute pemberian obat. Gel dapat diberikan secara topikal, vaginal, dan rektal. Gel biasanya terdiri dari komponen-komponen berikut: basis, pelembut, surfaktan, pengawet, zat aktif, pewarna, dan parfum (Mitsui, 1997).

2.

Kelembapan Sejak tahun 1960, telah dibuktikan bahwa proses penyembuhan luka optimal dalam lingkungan yang lembap (Chaby dkk., 2007). Keuntungan lingkungan yang lembap adalah mencegah dehidrasi jaringan dan terutama


11

mengurangi rasa sakit yang timbul selama proses penyembuhan luka (Field dan Kerstein, 1994). Sediaan gel sendiri merupakan jaringan tiga dimensi rantai polimer silang yang memiliki kemampuan mengembang dengan cara menyerap air atau cairan biologis, sehingga gel dapat menjadi salah satu alternatif dalam perawatan luka (Gadri dkk., 2014).

3.

Formula Formula yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: kalium sorbat, asam borat, CMC-Na, carbopol, Ca-alginat, gliserol, akuades, piroxicam, ekstrak etanol binahong.

E. Landasan Teori Proses penyembuhan luka berlangsung dalam 3 fase, yaitu fase inflamasi, proliferasi, dan remodelling. Diketahui bahwa pada fase inflamasi terjadi induksi enzim COX-2 yang memicu sintesis prostaglandin dan pembentukan kolagen. Namun, hasil penelitian menunjukkan bahwa derajat inflamasi yang tinggi tidak diperlukan dalam penyembuhan luka. Piroxicam adalah obat AINS yang memiliki aktivitas antiinflamasi, antipiretik, dan analgesik dengan cara menghambat sintesis prostaglandin, melalui penghambatan enzim COX, sementara kandungan flavonoid dan asam askorbat binahong memiliki peranan dalam pembentukan kolagen dan percepatan epitelisasi. Dengan demikian, ekstrak binahong akan mempercepat proses penyembuhan luka, sedangkan piroxicam dengan aktivitas


12

antiinflamasinya akan meminimalisir fase inflamasi sehingga pembentukan parut luka dapat berkurang.

F. Hipotesis Penambahan piroxicam diduga dapat mengurangi pembentukan parut luka pada hewan uji mencit putih (Mus musculus) galur Swiss Webster dengan menggunakan metode uji histopatologi.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian yang berjudul “Pembuatan dan Uji Aktivitas Sediaan Gel Scarless Wound dengan Ekstrak Binahong dan Zat Aktif Piroxicam” ini termasuk penelitian eksperimental murni.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1.

Variabel tergantung Variabel tergantung pada penelitian

ini adalah daya pengurangan

pembentukan parut luka (parameter: luas kolagen baru). 2.

Variabel bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah penambahan piroxicam 5% ke dalam sediaan gel penyembuh luka dengan ekstrak binahong.

3.

Variabel pengacau a.

Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah tempat memperoleh tanaman binahong, berat badan mencit, galur mencit, dan jenis kelamin mencit.

b.

Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah kondisi patologis hewan uji.

13


4.

14

Definisi operasional a.

Ekstrak binahong (Anredera cordifolia). Merupakan larutan hasil ekstraksi total daun binahong yang diperoleh dengan cara ekstraksi.

b.

Parut luka. Parut luka atau jaringan parut adalah jaringan yang terbentuk akibat proses penyembuhan luka, disebabkan oleh fase inflamasi.

c.

Uji

histopatologi.

Pengamatan kondisi

kulit

mencit

secara

mikroskopik dengan mikroskop cahaya dengan bantuan zat pewarna.

C. Bahan Penelitian 1.

Subjek penelitian a.

Populasi. Populasi pada penelitian ini adalah mencit putih (Mus musculus) galur Swiss Webster dari Laboratorium Imono Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

b.

Sampel. Sampel pada penelitian ini adalah 6 ekor mencit putih (Mus musculus) galur Swiss Webster dari Laboratorium Imono Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, yang memiliki deviasi berat badan kurang dari 3 gram (25-28 gram).

2.

Bahan penelitian Daun binahong, etanol 96%, piroxicam (dari PT. Sanbe Farma), Bioplacenton®, kalium sorbat, asam borat, carbopol, CMC-Na, Ca-alginat, gliserol, TEA, akuades, etanol 70%, Nutrien Agar (Oxoid), kloroform teknis, ketamin, krim depilatori, formalin 10%, larutan Harris Hematoxylin, larutan


15

acid alkohol, larutan ammonium, larutan stok Eosin alkohol 1%, larutan working Eosin.

D. Alat Penelitian Gelas beker, hotplate magnetic stirrer, stirrer, termometer, corong Buchner, pompa vakum, kertas saring, gelas ukur, plat stainless steel, sel elektrolisis, corong, sentrifugator, aluminium foil, batang pengaduk, kabinet LAF, ose, labu ukur, tabung sentrifugasi, mortir, stamper, spuit injeksi, pinset, gunting, skalpel, blade, jarum bedah, benang operasi, pisau mikrotom dan pengasahnya, object glass, pipet tetes, plastic wrap, kaca bundar, dan mikroskop cahaya.

E. Tata Cara Penelitian 1.

Pengumpulan bahan dan pengeringan Bahan uji yang digunakan adalah daun binahong (Anredera cordifolia). Bahan uji tersebut diperoleh dari Laboratorium Kebun Obat Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, yang dipanen pada bulan Desember 2014. Tanaman segar yang didapat, dipisahkan dari batang dan akarnya, kemudian daunnya dikeringkan untuk mendapatkan simplisia kering yang akan digunakan dalam penelitian.

2.

Ekstraksi binahong Simplisia yang telah disortasi kering, dibuat menjadi serbuk dengan menggunakan blender. Kemudian 200 gram simplisia kering binahong


16

diambil dan dimasukkan ke dalam gelas beker yang telah berisi 1000 mL etanol 96% dan stirrer dan dipanaskan dalam mantle heater di atas magnetic stirrer. Suhu mantle heater dikontrol pada 60oC selama 90 menit. Gelas beker kemudian diangkat dan stirrer dikeluarkan. Ekstrak binahong tersebut lalu disaring dengan corong buchner dan ditambahkan 50 mL akuades ke dalam gelas beker yang berisi filtrat. Kemudian dua buah plat besi dimasukkan ke dalam gelas beker tersebut dan dihubungkan dengan sel elektrolisis. Proses elektrolisis dilakukan hingga ekstrak tersisa 250 mL saja. Hasil elektrolisis lalu disaring dengan corong buchner dan dilanjutkan dengan sentrifugasi. Bagian supernatan diambil dan disimpan dalam gelas beker dan ditutup dengan aluminium foil. 3.

Pembuatan gel scarless wound Formula basis gel acuan yang digunakan adalah sebagai berikut: R/

m.f. gel

Carbopol

1

CMC-Na

0,5

Ca-alginat

0,5

Trietanolamin

sampai pH 7

Gliserol

12,5

Asam borat

0,5

Kalium sorbat

0,2

Etanol

10

Akuades

ad 90


17

Sediaan yang akan dibuat adalah sediaan gel dengan ekstrak binahong (Bin), gel dengan piroxicam (Pirox), gel dengan ekstrak binahong dan piroxicam (BinPirox), dan basis gel itu sendiri (Gel). Formula masingmasing sediaan tersebut adalah sebagai berikut: Tabel I. Formula sediaan uji scarless wound Formula Gel Bin Pirox BinPirox Carbopol 1 1 1 1 CMC-Na 0,5 0,5 0,5 0,5 Ca-alginat 0,5 0,5 0,5 0,5 sampai sampai sampai sampai Trietanolamin pH 7 pH 7 pH 7 pH 7 Gliserol 12,5 12,5 12,5 12,5 Asam borat 0,5 0,5 0,5 0,5 Kalium sorbat 0,2 0,2 0,2 0,2 Etanol 10 5 5 Akuades ad 90 ad 90 ad 90 ad 90 Ekstrak 5% 5% binahong Piroxicam 5% 5%

Kalium sorbat dan asam borat masing-masing sebanyak 200 mg dan 500 mg dimasukkan ke dalam 10 mL air. Kemudian 25 gram larutan carbopol 4% ditambahkan ke dalamnya, diaduk hingga homogen. Selanjutnya 20 gram larutan CMC-Na 3% yang telah dicampur dengan Ca-alginat, ditambahkan ke dalam campuran sebelumnya, diaduk hingga homogen. Gliserol sejumlah 12,5 gram dimasukkan, diaduk hingga homogen. Dilanjutkan dengan penambahan 32 mL akuades, diaduk hingga homogen. TEA ad pH 7. Piroxicam dan ekstrak binahong masing-masing sebanyak 5% dari bobot sediaan yang diperlukan ditambahkan ke dalam sediaan.


4.

18

Uji sterilitas Kabinet LAF disterilkan dengan lampu UV selama 24 jam setelah sebelumnya dibersihkan dengan alkohol 70%. Peralatan yang digunakan juga diterilkan sebelumnya menggunakan autoklaf pada 121 oC selama 15 menit. Nutrien Agar (Oxoid) sebanyak 21 gram ditambah 750 mL akuades diaduk homogen dengan batang pengaduk. Media dipanaskan dengan hotplate magnetic stirrer sampai tercampur homogen. Media dituangkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 15 mL, kemudian tabung reaksi ditutup dengan penutup yang sesuai. Seluruh media dalam tabung reaksi tersebut disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 1 atm dan suhu 121oC. Media yang telah steril kemudian dituang ke cawan petri dalam LAF; penuangan dilakukan dekat bunsen. Media NA dalam cawan petri dibiarkan memadat. Gel yang akan diuji sterilitasnya disiapkan, kemasannya dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%. Jarum ose dipanaskan di atas bunsen hingga memijar, kemudian didinginkan. Kemasan gel dibuka secara aseptis dekat nyala bunsen, kemudian sedikit gel dibuang, setelah itu diambil 1 ose gel dan digoreskan pada permukaan media agar secara zigzag. Ose dipijarkan setiap akan digunakan untuk penggoresan. Tiap petri kemudian diberi label dan dibungkus dengan plastic wrap, lalu diinkubasi terbalik dalam LAF (tanpa nyala bunsen) selama 24 jam.

5.

Uji daya sebar Sediaan sebanyak 0,5 gram ditimbang dan diletakkan di tengah kaca bundar. Letakkan kaca bundar lainnya (yang telah ditimbang bersama dengan


19

pemberat, sehingga total bobotnya 125 gram) di atas kaca bundar pertama dan diamkan selama 1 menit. Diameter sediaan yang telah menyebar diukur (dengan mengambil nilai rata-rata setelah diukur dari 4 arah berbeda, vertikal, horisontal, dan kedua diagonalnya) dan diulangi sebanyak 3 kali. 6.

Uji homogenitas Sediaan secukupnya diletakkan pada object glass lalu letakkan object glass yang lain di atas object glass pertama, tekan hingga keduanya merapat. Homogenitas sebarannya diamati. Ulangi sebanyak 3 kali.

7.

Perlakuan pemberian luka pada mencit Enam ekor mencit ditimbang dengan deviasi berat badan kurang dari 3 gram. Mencit-mencit tersebut kemudian diberi olesan krim depilatori pada bagian punggungnya dan didiamkan selama 5 menit. Krim tersebut lalu dibilas dengan kapas yang dibasahi air bersih, sehingga tampak kulit punggung mencit tersebut. Mencit dibiarkan selama 48 jam. Sebelum di beri luka insisi, mencit diberi anastesi dahulu menggunakan injeksi intramuskular ketamin di bagian paha dan ditunggu hingga mencit tertidur. Kulit punggungnya kemudian dibasahi dengan etanol 70%, lalu dijepit dengan pinset, dan diberi sayatan melintang (dari sisi kiri/kanan punggung ke arah berlawanan) selebar 1 cm dengan blade steril. Bagian tengah luka segera dijahit menggunakan jarum jahit operasi dan benang jahit operasi. Gel scarless wound kemudian dioleskan sebanyak 0,1 mL pada luka sayatan dengan menggunakan spuit tanpa jarumnya. Pemberian sediaan dilakukan tiap 12 jam selama 48 jam. Setelah 48 jam, mencit dieutanasia dengan


20

inhalasi kloroform teknis berlebih. Kulit punggung diambil dengan ukuran 2x2 cm dan disimpan dalam pot berisi formalin 10%. 8.

Uji histopatologi – pengecatan Hematoxylin-Eosin (HE) a.

Trimming. Pemotongan tipis jaringan dengan pisau skalpel.

b.

Dehidrasi. Dehidrasi dilakukan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan dengan menggunakan reagen pembersih, lalu dilakukan impregnasi (penetrasi parafin ke dalam jaringan).

c.

Embedding dan cutting. Jaringan yang sudah didehidrasi diletakkan di atas sebuah balok kayu (embedding) sebagai alas pemotongan jaringan dengan pisau mikrotom (cutting).

d.

Staining. Rangkaian pewarnaannya adalah sebagai berikut: Xylol I (5 menit); Xylol II (5 menit); Xylol III (5 menit); alkohol absolut I (5 menit); alkohol absolut II (5 menit); akuades (1 menit); Harris Hematoxylin (20 menit); akuades (1 menit); acid alkohol (2-3 celupan); akuades (1 menit); akuades (15 menit); Eosin (2 menit); alkohol 96% I (3 menit); alkohol 96% II (3 menit); alkohol absolut III (3 menit); alkohol absolut IV (3 menit); Xylol IV (5 menit); Xylol V (5 menit).

e.

Mounting. Menutup object glass dengan cover glass.

f.

Pembacaan slide dengan mikroskop. Pengamatan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya (Olympus tipe BH-2, Olympus Corp., Jepang).


21

F. Tata Cara Analisis Hasil Pengukuran luas kolagen tiap preparat sampel dilakukan menggunakan instrumen perangkat lunak ImageJ. Secara skematis metode penghitungan ditampilkan pada Gambar 1:

Gambar 1. Skema dasar penghitungan luas kolagen

Keterangan gambar: a.

Garis IJ merupakan batas luar epidermis kulit mencit;

b.

Garis KL merupakan perbatasan antara lapisan epidermis dengan lapisan dermis kulit mencit;

c.

A dan E merupakan batas luka pada epidermis bagian dalam, pada penampang organ kulit mencit bagian kanan;

d.

D dan H merupakan batas luka pada epidermis bagian luar, pada penampang organ kulit mencit bagian kiri;

e.

Panjang masing-masing AB dan EF adalah 5 pixel;

f.

Ukuran panjang yang digunakan oleh instrumen Image-J adalah 62 ppi (pixel per inci);


g.

22

BC dan FG merupakan garis yang masing-masing tegak lurus terhadap AB dan EF;

h.

Sedangkan CDA dan GHE adalah garis yang terbentuk sesuai dengan bentuk penampang epidermis kulit;

i.

Dengan demikian, luas penampang epidermis yang dihitung adalah jumlah luas penampang epidermis ABCD dan EFGH;

j.

Perhitungan luas dilakukan menggunakan instrumen Image-J. Hasil penghitungan luas kolagen akan dilaporkan secara semikuantitatif.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran jenis tanaman yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian ini dengan cara membandingkannya dengan literatur. Hasil determinasi menunjukkan bahwa sampel tanaman yang digunakan adalah benar Anredera cordifolia (Ten.) Steenis. Surat hasil determinasi terlampir (Lampiran 1). Sampel daun binahong diambil dari Kebun Obat Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, pada bulan Desember 2014. Keterangan ini dicantumkan karena kandungan kimia yang terkandung di dalam tanaman dapat dipengaruhi oleh waktu dan faktor pemanenan lainnya, seperti lokasi, umur, dan sebagainya.

Gambar 2. Daun binahong (Sumartiningsih, 2011)

23


24

(a)

(b) Gambar 3. Proses elektrolisis (a) dan hasil elektrolisis (b)

B. Ekstraksi Serbuk simplisia sebanyak 200 gram diekstraksi dalam 1000 mL larutan penyari etanol 96%. Sifatnya yang non-polar diharapkan mampu menarik keluar zat-zat yang berguna dalam proses penyembuhan luka, seperti triterpenoid (Senthil, Kumar, Manasa, Kumar, Sravanthi, dan Deepa, 2011) dan asam ursolat


25

(Lin dkk., 1988; Lim dkk., 2007). Proses ekstraksi dilakukan selama 90 menit pada suhu tidak lebih dari 60oC agar tidak merusak zat-zat yang diinginkan. Pemanasan dilakukan untuk memperbesar kelarutan zat-zat tersebut dalam larutan penyari. Ekstraksi dilakukan di atas hotplate magnetic stirrer bersama sebuah stirrer di dalam wadah ekstraksi. Proses pemekatan berlangsung bersamaan dengan tahap elektrolisis. Tahap elektrolisis adalah suatu mekanisme penghilangan klorofil yang juga menghasikan panas. Elektrolisis dilakukan hingga volume ekstrak cair tersisa 250 mL saja. Hingga volume tersebut, ekstrak sudah mengental dan tidak lagi berwarna hijau. Mekanisme penghilangan klorofil atau peluruhan klorofil ini berlangsung sebagai berikut: Plat katode yang dihubungkan dengan kutub negatif sumber energi listrik akan menarik ion magnesium (Mg2+) dari inti molekul klorofil sehingga struktur klorofil luruh dan menyisakan residu pada dasar wadah elektrolisis. Hasil akhir rangkaian proses elektrolisis ini adalah suatu ekstrak kental

binahong

berwarna

kekuningan.

Elektrolisis

diperlukan

untuk

menghasilkan ekstrak dengan penampilan lebih menarik, terutama ketika sudah diformulasikan dalam sediaan gel.

C. Pembuatan gel scarless wound Formula sediaan gel scarless wound yang dibuat berasal dari formula sediaan gel wound healing pada penelitian Formulasi Sediaan Hidrogel Penyembuh Luka Ekstrak Etanol Daun Binahong. Sediaan penyembuh luka


26

termasuk dalam sediaan steril. Gel scarless wound pada penelitian ini diformulasi dalam suasana aseptis di dalam LAF yang telah dibersihkan dengan etanol dan didiamkan di bawah sinar UV selama 24 jam. Sterilisasi basis gel dengan autoklaf dilakukan pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit, sebab pada kondisi tersebut mikroorganisme yang berada di dalamnya akan mati akibat degradasi asam nukleat dan denaturasi enzim (Adji, Zuliyanti, dan Larashanty, 2007).

D. Uji Sterilitas Uji sterilitas dilakukan untuk mengetahui apakah sediaan yang telah diformulasi secara aseptis berhasil mempertahankan sterilitasnya atau tidak. Hal ini penting, mengingat sediaan akan diaplikasikan pada luka terbuka. Apabila sediaan tidak steril dikhawatirkan dapat terjadi infeksi, bukannya kesembuhan seperti yang diharapkan. Hasil pengamatan pada Gambar 4 menunjukkan bahwa semua sediaan steril.

E. Uji Sifat Fisis Uji sifat fisis yang dilaksanakan pada penelitian ini adalah uji viskositas, uji daya sebar, dan uji homogenitas. Parameter ini merupakan data pendukung yang diperlukan untuk menggambarkan sifat fisis sediaan yang akan digunakan selama penelitian. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan instrumen Rheosys Merlin II; pengukuran daya sebar dilakukan dengan metode lempeng paralel; sedangkan pengujian homogenitas dilakukan dengan mengguna-


(a)

27

(b)

(c) (d) Gambar 4. Hasil uji sterilitas: BinPirox (a); Pirox(b); Bin (c); dan Gel (d)

kan sepasang object glass. Pengukuran viskositas dilakukan tidak hanya untuk mengetahui nilai viskositas sediaan saja namun juga untuk melihat karakteristik rheologi sediaan. Hasil uji rheologi menunjukkan bahwa gel scarless wound termasuk dalam sifat alir non-Newtonian tipe pseudoplastis. Grafik hasil uji rheologi disajikan dalam Gambar 5.


28

Gambar 5. Grafik hasil uji rheologi Gel, Bin, Pirox, dan BinPirox

Pengukuran daya sebar dilakukan untuk menjamin gel scarless wound dapat tersebar merata saat diaplikasikan ke kulit, sedangkan pengujian homogenitas sediaan dilakukan untuk memastikan keseragaman dosis yang terabsorpsi ke setiap bagian kulit yang diolesi sediaan. Data rata-rata hasil pengukuran viskositas, daya sebar, dan homogenitas disajikan dalam Tabel II.

Tabel II. Rata-rata hasil uji viskositas dan daya sebar. Sediaan Viskositas ± SD Daya sebar ± SD Homogenitas (Pa.s) (cm) Gel 1,730 ± 0,033 5,633 ± 0,058 Homogen Bin 1,882 ± 0,031 5,400 ± 0,152 Homogen Pirox 2,754 ± 0,053 4,867 ± 0,052 Homogen BinPirox 2,695 ± 0,036 4,742 ± 0,218 Homogen

Gel memiliki viskositas 1,730 ± 0,033 Pa.s serta daya sebar 5,633 ± 0,058 cm, sementara Bin memiliki nilai viskositas 1,882 ± 0,031 Pa.s dan daya sebar 5,400 ± 0,152 cm. Viskositas Pirox adalah 2,754 ± 0,053 Pa.s dengan daya


29

sebar 4,867 ± 0,052 cm, sedangkan viskositas BinPirox adalah 2,695 ± 0,036 Pa.s dengan daya sebar 4,742 ± 0,218 cm. Hasil uji homogenitas menunjukkan bahwa semua sediaan homogen.

F. Kriteria dan Perlakuan terhadap Mencit Mencit yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut: Mencit putih galur Swiss Webster, usia 2-3 bulan, bobot minimal 25 gram, dengan deviasi bobot maksimal 3 gram. Usia menjadi perhatian khusus sebab pada usia tersebutlah aktivitas metabolisme mencit dikatakan optimal (DiPietro dan Burns, 2010). Hal ini menjadi penting karena yang menjadi fokus penelitian adalah proses penyembuhan luka, melibatkan aktivitas inflamasi, proliferasi, migrasi selsel ke jaringan yang terluka, dan sebagainya. Bobot juga dikontrol sedemikian rupa, sebab dengan usia yang sama (2-3 bulan), perbedaan bobot lebih dari 3 gram menyebabkan perbedaan ketebalan kulit yang signifikan (DiPietro dan Burns, 2010). Akibat perbedaan ketebalan ini, kecepatan penyembuhan luka juga menjadi terpengaruh dan menyebabkan hasil penelitian menjadi bias. Pemberian jumlah pakan harian juga dikontrol sama setiap mencitnya agar deviasi bobotnya tidak berubah. Mencit-mencit yang akan menerima perlakuan dipersiapkan terlebih dahulu dengan dicukur pada separuh bagian atas punggungnya, hingga sebelum bagian leher. Pencukuran dilakukan dengan menggunakan gunting terlebih dahulu, hingga menyisakan setipis mungkin bulu (± 1 mm saja). Hal ini dilakukan untuk mempermudah pengangkatan sisa bulu dengan krim depilatori, sebab bila


30

masih terlalu tebal, krim depilatori tidak dapat mengangkat keseluruhan bulu yang tersisa. Pemberian krim depilatori kembali sangat dihindari karena berisiko menyebabkan iritasi pada kulit mencit, sebagaimana diketahui, kulit mencit lebih sensitif daripada kulit manusia (DiPietro dan Burns, 2010). Mencit-mencit yang sudah dicukur punggungnya kemudian dibiarkan selama 48 jam untuk memastikan tidak ada lagi zat depilatori yang tersisa dan dapat mengganggu hasil penelitian nantinya. Mencit diberi anestesi intramuskular ketamin (dosis 40 mg/kgBB) terlebih dahulu di bagian paha untuk menjamin mencit tidak merasakan sakit saat diberi sayatan. Sayatan dibuat setinggi mungkin (mendekati leher) namun bukan pada bagian leher, sebab bila terlalu rendah dapat dijangkau oleh mulutnya sendiri (dan kemudian dijilat sampai habis), atau bila terlalu tinggi (bagian leher), proses penyembuhan luka menjadi lebih lambat karena leher merupakan bagian tubuh yang aktif bergerak. Pemberian gel yang diujikan dilakukan segera setelah penjahitan selesai, dan kemudian setiap 12 jam berikutnya hingga 48 jam (4 kali pemberian gel). Selama 48 jam tersebut mencit diletakkan dalam kandang kaca berukuran (panjang x lebar x tinggi) 15x15x15 cm untuk setiap mencitnya. Alasnya merupakan sekam padi yang ditutup dengan kawat nyamuk dengan ukuran lubang 0,5x0,5 cm, agar sekam tidak berhamburan dan melekat pada sediaan gel yang sedang diuji. Tutup kandang juga dibuat dari kawat nyamuk yang sama, sehingga pada kawat tersebut dapat diikatkan botol minum untuk mencit. Air minum


31

mencit merupakan air sumur, sedangkan jenis pakan adalah pelet BR yang dicampur remah jagung kering dengan perbandingan 1:1.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Gambar 6. Foto preparat hasil uji histopatologi: Neg (a); Biop (b); Gel (c); Bin (d); Pirox (e); BinPirox (f).


32

Mencit dikorbankan setelah 48 jam pemberian sediaan gel dengan menggunakan kloroform berlebih via inhalasi. Kulit punggung mencit diambil seluas 2 x 2 cm dengan bekas luka sayat di bagian tengahnya. Sampel kulit ini kemudian disimpan dalam pot berisi formalin 10% agar tetap awet sebelum diamati secara histopatologi dengan bantuan pengecatan Hematoxylin-Eosin.

G. Analisis Hasil Uji Histopatologi Preparat hasil uji histopatologi diamati menggunakan mikroskop cahaya (Olympus tipe BH-2, Olympus Corp., Jepang) yang terhubung dengan kamera (OptiLab Microscope Camera), sehingga pengamatan dapat dilakukan via monitor komputer (Gambar 6). Penghitungan dilakukan pada masing-masing sisi kulit yang dilukai, seperti yang telah dijelaskan secara mendetil dalam Gambar 1. Hasil penghitungan luas kolagen disajikan dalam Tabel III. Scar atau parut luka sendiri adalah

kondisi

produksi

kolagen-tak-beraturan

berlebih

yang

berfungsi

menyatukan kembali bagian kulit yang terbuka (Wilgus dkk., 2003), terjadi selama proses penyembuhan luka, utamanya pada fase remodelling jaringan (Shai dan Maibach, 2005).

Tabel III. Rata-rata hasil penghitungan luas kolagen. Sediaan Rata-rata ± SD (mm2) Neg 5,7522 ± 0,0828 Biop 6,8614 ± 0,0146 Gel 3,7393 ± 0,0225 Bin 7,7070 ± 0,0821 Pirox 5,7276 ± 0,0658 BinPirox 1,3020 ± 0,0232


33

Luas kolagen Biop atau Bioplacenton® (6,8614 ± 0,0146 mm2) lebih besar dari Neg dengan 5,7522 ± 0,0828 mm2. Hal ini menunjukkan bahwa Biop memang mampu menstimulasi regenerasi sel karena kandungan ekstrak plasentanya. Biop sendiri digunakan dalam penelitian ini sebagai perbandingan terhadap Bin, sebab Bin diketahui memiliki kandungan dengan aktivitas serupa, yaitu asam askorbat dan flavonoid yang berpotensi dalam aktivitas pembentukan kolagen dan percepatan epitelisasi. Penelitian ini tidak menggunakan kontrol positif sebab memang belum ada sediaan penyembuh luka sekaligus pencegah pembentukan parut luka yang beredar di pasaran. Berbeda dengan Biop, Gel (3,7393 ± 0,0225 mm2) menunjukkan luas kolagen yang lebih kecil dibandingkan dengan Neg. Bin dengan luas kolagen 7,7070 ± 0,0821 mm2 menjadi sediaan dengan hasil penghitungan luas kolagen tertinggi. Luas kolagen Bin lebih tinggi dibandingkan dengan Neg, disebabkan oleh kandungan asam askorbat dan flavonoidnya, seperti yang telah dijelaskan pada paragraf sebelumnya. Hal ini sejalan dengan apa yang telah disampaikan Yuliani (2012) dalam peneltiiannya, bahwa ekstrak binahong memiliki aktivitas penyembuhan luka. Hasil penghitungan luas kolagen Pirox menunjukkan angka 5,7276 ± 0,0658 mm2 atau tidak berbeda dengan Neg pada taraf kepercayaan 95%. Piroxicam tidak menunjukkan aktivitas antiinflamasi ketika ditambahkan ke dalam basis gel sediaan wound healing, namun kombinasi antara ekstrak binahong dengan piroxicam dalam BinPirox (1,3020 ± 0,0232 mm2) menunjukkan luas kolagen yang paling sedikit di antara semua sediaan yang diujikan, termasuk jika


34

dibandingkan dengan Neg. Hal ini menandakan bahwa penambahan piroxicam ke dalam sediaan wound healing mampu menurunkan aktivitas pembentukan kolagen. Meskipun demikian, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk memastikan terbentuk/tidaknya parut luka pada akhir proses penyembuhan luka.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Penambahan zat aktif antiinflamasi piroxicam ke dalam sediaan penyembuh luka gel binahong dapat memberikan efek pengurangan pembentukan parut luka. Penambahan piroxicam menghambat proses sintesis kolagen. Jumlah kolagen yang terbentuk merupakan ukuran untuk menyatakan suatu luka sembuh dengan atau tanpa parut luka. Luas kolagen yang terbentuk selama proses penyembuhan luka antara BinPirox dengan Bin menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik; luas kolagen yang terebentuk pada BinPirox lebih sedikit daripada Bin. Kombinasi keduanya menyebabkan penurunan aktivitas pembentukan kolagen secara drastis.

B. Saran Kelemahan utama penelitian ini adalah pada durasi penyembuhan lukanya. Empat puluh delapan jam tidak cukup untuk menunjukkan apakah parut luka terbentuk atau tidak, sebab proses penyembuhan luka masih berlangsung. Untuk itu, perlu dilakukan pengamatan berkala secara visual hingga luka benarbenar sembuh. Hal ini perlu dilakukan untuk memastikan terbentuk/tidaknya parut luka pada akhir proses penyembuhan luka. Selain itu juga perlu dilakukan penetapan kadar piroxicam dalam sediaan untuk mengetahui konsentrasi optimal piroxicam dalam sediaan tersebut. 35


36

DAFTAR PUSTAKA Abd-Allah, F.I., Dawaba, H.M., Mansour, A., dan Samy., A.M., 2011, Evaluation of the Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Piroxicam-loaded Microemulsion in Topical Formulations, Int J Pharm PharmSci, 3(2), 6670. Adji, D., Zuliyanti, dan Larashanty, H., 2007, Perbandingan Efektivitas Sterilisasi Alkohol 70%, Inframerah, Otoklaf dan Ozon terhadap Pertumbuhan Bakteri Bacillus subtilis, J. Sain Vet, 25(1), 17-24. Ariani, S., Loho, L., dan Durry, M.F., 2013, Khasiat Daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) terhadap Pembentukan Jaringan Granulasi dan Reepitelisasi Penyembuhan Luka Terbuka Kulit Kelinci, Jurnal eBM, 1(2), 914-919. Asgary, S., Naderi, G., Dashti, G., dan Paknahad, Z., 2005, Effect of Antiinflammatory Drug (Piroxicam) on some Biochemical Factors and Development of Experimental Atherosclerosis in Rabbits, ARYA Journal, 1(1), 1-4. Astuti, S.M., Sakinah, M., Andayani, R., dan Risch, A., 2011, Determination of Saponin Compound from Anredera cordifolia (Ten.) Steenis Plant (Binahong) to Potential Treatment for several Diseases, Journal of Agricultural Science, 3(4), 224-232. Boateng, J.S., Matthews, K.H., Stevens, H.N.E., dan Eccleston, G.M., 2008, Wound Healing Dressings and Drug Delivery Systems: A Review, Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(8), 2892-2923. Chaby, G., Senet, P., Vaneau, M., Martel, P., Guillaume, J.C., Meaume, S., dkk., 2007, Dressings for Acute and Chronic Wounds: A Systematic Review, Arch Dermatol., 143(10), 1297-1304. Cianfarani, F., Zambruno, G., Brogelli, L., Sera, F., Lacal, P.M., Pesce, M., Capogrossi, M.C., Failla, C.M., Napolitano, M., dan Odorisio, T., 2006, Placenta Growth Factor in Diabetic Wound Healing: Altered Expression and Therapeutic Potential, Am J Pathol, 169(4), 1167-1182. Dequeker, J., Hawkey, C., Kahan, A., Steinbruck, K., Alegre, C., Baumelou, E., dkk., 1998, Improvement in gastrointestinal tolerability of the selective cyclooxygenase (COX)-2 inhibitor, meloxicam, compared with piroxicam: Results of the safety and efficacy large-scale evaluation of COX-inhibiting therapies (SELECT) trial in osteoarthritis, British Journal of Rheumatology, 37, 946-951. Dewi, S.P., 2010, Perbedaan Efek Pemberian Lendir Bekicot (Achatina fulica) dan Gel Bioplacenton® terhadap Penyembuhan Luka Bersih pada Tikus Putih, Skripsi, Universitas Sebelas Maret, Surakarta, hal. 21.


37

DiPietro, L.A. dan Burns, L.A., 2010, Wound Healing: Methods and Protocols, Humana Press Inc, Totowa, NJ, p. 4. Eming, S.A., Krieg, T., dan Davidson, J.M., 2007, Inflammation in Wound Repair: Molecular and Cellular Mechanisms, Journal of Investigative Dermatology, 127, 514-525. Field, C.K. dan Kerstein, M.D., 1994, Overview of Wound Healing in a Moist Environment, The American Journal of Surgery, 167(1A), 2-6. Gadri, A., Mulyanti, D., dan Aprilianti, S., 2014, Formulasi Pembalut Luka Hidrogel Berbasis I-Karagenen dengan Metode Freezing and Thawing Cycle, Prosiding Seminar Nasional Penelitian dan PKM Sains, Teknologi, dan Kesehatan, 4(1), 163-170. Gauglitz, G.G., Korting, H.C., Pavicic, C., Ruzicka, T., dan Jeschke, M.G., 2011, Hypertrophic Scarring and Keloids: Pathomechanisms and Current and Emerging Treatment Strategies, MolMed, 17(1-2), 113-125. Greene, S.N., Ramos-Vara, J.A., Craig, B.A., Hooser, S.B., Anderson, C., Fourez, L.M., dkk., 2010, Effects of cyclooxygenase inhibitor treatment on the renal toxicity of cisplatin in rats, Cancer Chemoter Pharmacol, 65, 549556. Klang, S.H., Siganos, C.S., Benita, S., dan Frucht-Pery, J., 1999, Evaluation of a positively charged submicron emulsion of piroxicam on rabbit corneum healing process following alkali burn, Journal of Controlled Release, 57, 19-27. Lim, S.W., Hong, S.P., Jeong, S.W., Kim, B., Bak, H., Ryoo, H.C., dkk., 2007, Simultaneous effect of ursolic acid and oleanolic acid on epidermal permeability barrier function and epidermal keratinocyte differentiation via peroxisome proliferator-activated receptor-alpha, The Journal of Dermatology, 34, 625-634. Lin, H.-Y., Kuo, S.-C., Chao, P.-D.L., dan Lin, T.-D., 1988, A new sapogenin from Boussingaultia gracilis, Journal of Natural Products, 5, 797-798. Manoi, F., 2009, Binahong sebagai Obat, Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri, 15(1), 3-6. Mistry, D., 2005, Practical Scar Care, Wound Care Canada, 3(1), 14-16. Mitsui, T., 1997, New Cosmetics Science, Elsevier, Amsterdam, pp. 495-498. Prasetyo, S., Sunjaya, H., dan Yanuar, Y., 2012, Pengaruh Rasio Massa Daun Suji/Pelarut, Temperatur dan Jenis Pelarut pada Ekstraksi Klorofil Daun Suji secara Batch dengan Pengontakan Dispersi, LPPM Universitas Katolik Parahyangan, Bandung, hal. 10. Senthil, P., Kumar, A.A., Manasa, M., Kumar, K.A., Sravanthi, K., dan Deepa, D., 2011, Wound Healing Activity of Alcoholic Extract of “Guazuma


38

ulmifolia” Leaves on Albino Wistar Rats, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2(4), 34-38. Shai, A. dan Maibach, H.I., 2005, Wound Healing and Ullcers of the Skin, Springer Berlin Heidelberg, New York, pp. 7-12./ Shaw, J. dan Martin, P., 2009, Wound Repair at a Glance, Journal of Cell Science, 122(18), 3209-3213. Starr, F., Starr, K., dan Loope, L., 2003, Anredera cordifolia, Haleakala Field Station, Hawai’i, pp. 1-2. Sumartiningsih, S., 2011, The Effect of Binahong to Hematoma, World Academy of Science, 78, 743-745. Whelan, C., Stewart, J., dan Schwartz, B.F., 2005, Mechanics of Wound Healing and Importance of Vacuum Assisted Closure® in Urology, The Journal of Urology, 173, 1463-1470. Wilgus, T.A., Vodovotz, Y., Vittadini, E., Clubbs, E.A., dan Oberyszyn, T.M., 2003, Reduction of Scar Formation in Full-thickness Wounds with Topical Celecoxib Treatment, Wound Rep Reg, 11, 25-34. Yuliani, S.H., 2012, Ekstrak Etanol Daun Binahong, Disertasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.


LAMPIRAN

39


Lampiran 1. Surat pengesahan hasil determinasi tanaman

40


Lampiran 2. Certificate of Analysis piroxicam

41


Lampiran 3. Ethical Clearance dari LPPT UGM

42


Lampiran 4. Surat keterangan analisa data dengan instrumen “IBM SPSS Statistics 22 lisensi UGM”

43


Lampiran 5. Data hasil uji sifat fisis dan luas kolagen

Sediaan Gel Bin Pirox BinPirox

Sediaan Gel Bin Pirox BinPirox

Sediaan Neg Biop Gel Bin Pirox BinPirox

Tabel hasil uji daya sebar Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 (cm) (cm) (cm) 5,700 5,600 5,600 5,500 5,225 5,475 4,675 4,975 5,025 5,100 4,875 5,000

Rata-rata ± SD (cm) 5,633 ± 0,058 5,400 ± 0,152 4,892 ± 0,189 4,992 ± 0,113

Tabel hasil uji viskositas Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 (Pa.s) (Pa.s) (Pa.s) 1,707 1,715 1,767 1,917 1,858 1,870 2,140 2,043 2,062 2,673 3,637 2,546

Rata-rata ± SD (Pa.s) 1,730 ± 0,033 1,882 ± 0,031 2,082 ± 0,051 2,952 ± 0,597

Tabel hasil pengukuran jumlah luas kolagen Repetisi 1 Repetisi 2 Repetisi 3 Rata-rata ± SD (mm2) (mm2) (mm2) (mm2) 5,6567 5,8048 5,7950 5,7522 ± 0,0828 6,8677 6,8447 6,8719 6,8614 ± 0,0146 3,7468 3,7572 3,7140 3,7393 ± 0,0225 7,7443 7,7639 7,6129 7,7070 ± 0,0821 5,7793 5,7937 5,7279 5,7670 ± 0,0346 3,5311 3,5333 3,4932 3,5192 ± 0,0225

44


45

Lampiran 6. Data statistik penghitungan luas kolagen Descriptives Klp.

N

1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 Total 18

Mean

Std. Dev.

5.7522 .08282 6.8614 .01464 3.7393 .02255 7.7070 .08211 5.7276 .06585 1.3020 .02321 5.1816 2.18151

Std. Error .04782 .00845 .01302 .04741 .03802 .01340 .51419

95% Confidence Interval for Mean Lower Upper Bound Bound 5.5464 5.9579 6.8251 6.8978 3.6833 3.7953 7.5031 7.9110 5.5640 5.8912 1.2443 1.3597 4.0968 6.2664

Min.

Max.

5.66 6.84 3.71 7.61 5.66 1.28 1.28

5.80 6.87 3.76 7.76 5.80 1.33 7.76

Tests of Normality Shapiro-Wilk Statistic df Sig. 1 .799 3 .113 2 .863 3 .275 3 .918 3 .444 4 .846 3 .228 5 .997 3 .897 6 .961 3 .620 Lilliefors Significance Correction Kelompok

Keterangan Kelompok Label 1 Neg 2 Biop 3 Gel 4 Bin 5 Pirox 6 BinPirox

Tests of Homogeneity of Variances Levene 3.374 Statistic df1 5 df2 12 Sig. .039


t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances 1 2 Kelompok 5.7522 6.8614 Mean 0.0069 0.0002 Variance 3 3 Observations 0 Hypothesized Mean Difference 2 df -22.8438 t Stat 0.0010 P(T<=t) one-tail 2.9200 t Critical one-tail t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances 1 3 Kelompok 5.7522 3.7393 Mean 0.0069 0.0005 Variance 3 3 Observations 0 Hypothesized Mean Difference 2 df 40.6162 t Stat 0.0003 P(T<=t) one-tail 2.9200 t Critical one-tail t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances 1 4 Kelompok 5.7522 7.7070 Mean 0.0069 0.0067 Variance 3 3 Observations 0 Hypothesized Mean Difference 4 df -29.0327 t Stat 0.0000 P(T<=t) one-tail 2.1318 t Critical one-tail

46


t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances 1 5 Kelompok 5.7522 5.7276 Mean 0.0069 0.0043 Variance 3 3 Observations 0 Hypothesized Mean Difference 4 df 0.4022 t Stat 0.3541 P(T<=t) one-tail 2.1318 t Critical one-tail t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances 1 6 Kelompok 5.7522 1.3020 Mean 0.0069 0.0005 Variance 3 3 Observations 0 Hypothesized Mean Difference 2 df 89.6145 t Stat 0.0001 P(T<=t) one-tail 2.9200 t Critical one-tail

47


Lampiran 7. Foto-foto dokumentasi kegiatan penelitian

Formulasi sediaan

Uji sterilitas

48


Mencit sebelum dicukur

Kandang mencit

49


Proses penjahitan luka insisi pada punggung mencit

50


Mencit sesudah dieutanasia, siap diambil kulit punggungnya

Flakon berisi sampel kulit punggung mencit, siap diuji histopatologi

51


52

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Pembuatan dan Uji Aktivitas Sediaan Gel Scarless Wound dengan Ekstrak Binahong dan Zat Aktif Piroxicam” memiliki nama lengkap Ayaga Divadi. Dilahirkan di Jakarta pada tanggal 7 Februari 1994 dari pasangan Bapak Gunawan Vincentius Budisantoso dan Ibu Lucy Gunawan. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Citra Indonesia Bintaro pada tahun 1998 hingga 2000, lalu melanjutkan pendidikan di SD Santo Yusuf Tegal Jaya Dalung pada tahun 2000 hingga 2006. Penulis menempuh sekolah menengah di SMP Negeri 1 Denpasar pada tahun 2006 hingga 2009 kemudian melanjutkan ke tingkat menengah atas di SMA Pangudi Luhur van Lith Muntilan pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis melanjutkan pendidikan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2012 hingga 2015. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan dan kepanitiaan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents