PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS DPPH, UV PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK BUNGA KENANGA (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Surya Adhi Nugraha NIM: 118114003

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015



SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Surya Adhi Nugraha NIM: 118114003

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


Persetujuan Pembimbing


Skripsi yang diajukan oleh : Surya Adhi Nugraha NIM: 118114003

telah disetujui oleh

Pembimbing Utama

(Dr. rer. nat. Yosi Bayu Murti, Apt.)

Tanggal 19 Juni 2015

ii


HALAMAN PENGESAHAN

iii


HALAMAN PERSEMBAHAN “ When I was 5 years old, my mother always told me that happiness was the key to life. When I went to school, they asked me what I wanted to be when I grew up. I wrote down “happy”. They told me I didn’t understand the assignment, and I told them they didn’t understand life” John Lennon

Kupersembahkan Skripsi ini untuk: Tuhan yang selalu mendampingi dan memberi kekuatan Keluargaku yang selalu memberikan dukungan Agustine Kurniawaty yang selalu memberikan keceriaan dan dukungan

iv


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 19 Juni 2015 Penulis

Surya Adhi Nugraha

v


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Surya Adhi Nugraha Nomor Mahasiswa : 118114003 Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya berjudul:

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS DPPH, UV PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK BUNGA KENANGA (CANANGA ODORATA (LMK.) HOOK.F. & THOMS.) beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Dengan demikian peryataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 2 Agustus 2015 Yang menyatakan

(Surya Adhi Nugraha)

vi


PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan karena atas berkat dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas DPPH, UV Protection, dan Antibakteri Ekstrak Bunga Kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farnasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari berbagai pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada : 1.

Dr.rer.nat. Yosi Bayu Murti, Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan serta ilmu dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini.

2.

Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Penguji atas kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.

3.

Damiana Sapta Candrasari, S.Si, M.Sc. sebagai Dosen Penguji atas kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.

4.

Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

vii


5.

Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

6.

Agustine Kurniawaty, Setio Agustin, Elyn Prameswari dan Skolastika Feranda Wardani atas kerjasama yang telah kita lewati selama proses penelitian dan penyusunan skripsi.

7.

Teman- teman angkatan 2011, atas kerjasama, doa, semangat, kritik dan sarannya.

8.

Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan

dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari berbagai pihak. Akhir kata semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi. Yogyakarta, Juni 2015

Penulis

viii


DAFTAR ISI Halaman

HALAMAN JUDUL………………………………………………………………i PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. v LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA S ................. vi PRAKATA

........................................................................................................ vii

DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiv DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xix INTISARI

....................................................................................................... xxi

ABSTRACT ...................................................................................................... xxii BAB I PENGANTAR ............................................................................................. 1 A.

Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.

Permasalahan............................................................................................ 3

2.

Keaslian penelitian ................................................................................... 3

3.

Manfaat .................................................................................................... 5

ix


B.

Tujuan ...................................................................................................... 5 1.

Tujuan umum ........................................................................................... 5

2.

Tujuan khusus .......................................................................................... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...................................................................... 6 A.

Kenanga.................................................................................................... 6

1.

Klasifikasi tanaman .................................................................................. 6

1.

Deskripsi tanaman kenanga...................................................................... 7

2.

Kandungan kimia kenanga ....................................................................... 7

B.

Ekstraksi ................................................................................................... 8

C.

Antioksidan .............................................................................................. 8

1.

Definisi antioksidan ................................................................................. 8

2.

Metode penangkapan radikal DPPH ........................................................ 9

D. 1.

Definisi UV protection ........................................................................... 10

2.

Metode inhibition of bleaching of 𝜷-carotene ....................................... 11

E.

F.

UV Protection ........................................................................................ 10

Antibakteri.............................................................................................. 12 1.

Definisi antibakteri ................................................................................. 12

2.

Metode bioautografi ............................................................................... 12

3.

Metode difusi ......................................................................................... 13 Kromatografi .......................................................................................... 13

x


1.

Kromatografi lapis tipis (KLT) .............................................................. 13

2.

Kromatografi kolom ............................................................................... 15

G.

Keterangan Empiris ................................................................................ 15

BAB III METODE PENELITIAN........................................................................ 16 A.

Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................. 16

B.

Bahan dan Materi Penelitian .................................................................. 16 1.

Bahan penelitian ..................................................................................... 16

2.

Alat penelitian ........................................................................................ 17

C.

Tata Cara Penelitian ............................................................................... 17

1.

Determinasi sampel ................................................................................ 17

2.

Pengumpulan dan penyiapan bahan ....................................................... 17

3.

Ekstraksi ................................................................................................. 19

4.

Kromatografi lapis tipis ekstrak ............................................................ 20

5.

Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH ..................... 21

6.

Uji kualitatif aktivitas UV protection .................................................... 21

7.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri........................................................... 22

8.

Identifikasi golongan senyawa ekstrak .................................................. 25

9.

Pembersihan klorofil dengan karbon aktif ............................................. 25

10. Kromatografi kolom ............................................................................... 25 11. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH isolat .................... 27

xi


12. Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat ........................................... 28 13. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat ................................................. 28 14. Identifikasi golongan senyawa isolat ..................................................... 30 15. Bagan alur penelitian.............................................................................. 31 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 32

A.

Determinasi Sampel ............................................................................... 32

B.

Pengumpulan dan Penyiapan Bahan ...................................................... 32

C.

Ekstraksi ................................................................................................. 34

1.

Ekstraksi bunga kenanga ........................................................................ 34

2.

Susut pengeringan simplisia dan ekstrak bunga kenanga (C. odorata) . 35

3.

Pemerian ekstrak bunga kenanga ........................................................... 37

D.

Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak .......................................................... 37

E.

Uji Kualitatif Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas DPPH ................. 40

F.

Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection .................................................. 43

G.

Uji Kualitatif Aktivitas Antibakteri Metode Bioautografi ..................... 47

H.

Identifikasi Golongan Senyawa Ekstrak ................................................ 49

I.

Penghilangan Klorofil Ekstrak Bunga Kenanga dengan Karbon Aktif . 51

J.

Kromatografi Kolom .............................................................................. 54

K.

Hasil Deteksi Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 ........................................... 60

xii


L.

Hasil Uji Kualitatif Penangkapan Radikal Bebas DPPH Isolat 1, Isolat 2,

dan Isolat 3 ........................................................................................................ 62 M.

Uji Kualitatif UV Protection Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 ................. 64

N.

Uji Kualitatif Antibakteri Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 ........................ 65

O.

Hasil Identifikasi Golongan Senyawa Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 .... 66

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 71 A.

Kesimpulan ............................................................................................ 71

B.

Saran ....................................................................................................... 71

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 72 LAMPIRAN ........................................................................................................ 76 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 103

xiii


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I.

Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v) ........................................................................................................ 38

Tabel II.

Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak etil asetat:asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) ............................................. 38

Tabel III.

Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v) 38

Tabel IV.

Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ........................................................................................................ 40

Tabel V.

Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak kloroform:metanol (95 : 5 v/v) ....................................................... 42

Tabel VI.

Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak etil asetat: asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) ........................................................................................................ 42

Tabel VII.

Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak n-heksana: etil asetat (2:3 v/v) ........................................................ 42

Tabel VIII.

Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak ................................ 46

xiv


Tabel IX.

Hasil uji kualitatif aktivitas antibakteri dengan bakteri S. aureus .. 47

Tabel X.

Hasil uji kualitatif aktivitas antibakteri dengan bakteri E. coli ...... 48

Tabel XI.

Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada berbagai reagen ............................................................................... 50

Tabel XII.

Optimasi fase gerak kromatografi kolom ....................................... 56

Tabel XIII.

Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 dengan fase gerak nheksana : kloroform (50 : 50 v/v) .................................................. 58

Tabel XIV.

Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 2 dengan fase gerak nheksana : kloroform (50 : 50 v/v) ................................................... 59

Tabel XV.

Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 3 dengan fase gerak nheksana : kloroform (50 : 50 v/v) ................................................... 59

Tabel XVI.

Penggabungan isolat hasil kromatografi kolom ............................. 60

Tabel XVII. Hasil deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV 366 nm pada sistem fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ....... ........................................................................................................ 61 Tabel XVIII. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH ekstrak, isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 .................................................................... 63 Tabel XIX.

Hasil uji kualitatif UV protection ekstrak, isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada menit ke 15 ................................................................ 64

Tabel XX.

Hasil uji kualitatif antibakteri amoksisilin, isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 terhadap bakteri S. aureus.................................................. 66

xv


Tabel XXI.

Hasil identifikasi golongan senyawa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada berbagai reagen ...................................................................... 68

Tabel XXII. Rangkuman hasil uji kualitatif isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 ......... 69 Tabel XXIII. Tabel rangkuman deteksi dan identifikasi isolat ............................ 70

xvi


DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1.

Reaksi DPPH dengan radical scavengers ..................................... 10

Gambar 2.

Struktur senyawa β-karoten ............................................................ 12

Gambar 3.

Hasil optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ekstrak kenanga . ........................................................................................................ 38

Gambar 4.

Hasil optimasi fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)............ 39

Gambar 5.

Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH ............... 41

Gambar 6.

Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH pada fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ........................................... 41

Gambar 7.

Optimasi intensitas sinar UV .......................................................... 44

Gambar 8.

Hasil uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak pada menit ke 15 ........................................................................................................ 45

Gambar 9.

Hasil uji bioautografi ...................................................................... 47

Gambar 10. Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada berbagai reagen semprot ................................................................. 49 Gambar 11. Reaksi antara alumunium chloride dengan senyawa flavonoid membentuk kompleks senyawa yang berfluoresensi lebih terang.. 51 Gambar 12. Hasil penghilangan klorofil dengan karbon aktif ........................... 52 Gambar 13. Hasil optimasi fase gerak kromatografi kolom gradien.................. 55

xvii


Gambar 14. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ........................................... 57 Gambar 15.

Deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV 366 nm ............................................................................................ 61

Gambar 16. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal DPPH isolat 1, isolat 2, dan isolat 3............................................................................................. 62 Gambar 17. Hasil uji kualitatif UV protection isolat1, isolat 2, dan isolat 3 ..... 65 Gambar 18. Hasil identifikasi isolat 1 pada berbagai reagen ............................. 67 Gambar 19. Hasil identifikasi isolat 2 pada berbagai reagen ............................. 67 Gambar 20. Hasil identifikasi isolat 3 pada berbagai reagen ............................. 68

xviii


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi bunga kenanga (C. odorata) .......... 76 Lampiran 2. Gambar sampel penelitian yang digunakan .................................... 77 Lampiran 3. Perhitungan rendemen ekstraksi ..................................................... 78 Lampiran 4. Perhitungan susut pengeringan simplisia bunga kenanga .............. 79 Lampiran 5. Perhitungan susut pengeringan ekstrak bunga kenanga ................. 81 Lampiran 6. Penguapan air pada ekstrak bunga kenanga dengan perlakuan 1 kilogram batu gamping ................................................................... 84 Lampiran 7. Penimbangan ekstrak bunga kenanga untuk kromatografi lapis tipis (KLT) .............................................................................................. 85 Lampiran 8. Gambar parameter warna yang digunakan dalam uji kualitatif UV protection ........................................................................................ 86 Lampiran 9. Optimasi intensitas Sinar UV ......................................................... 87 Lampiran 10. Sertifikat hasil uji bakteri ............................................................... 88 Lampiran 11. Gambar kontrol uji kualitatif antibakteri pada metode bioautografi ........................................................................................................ 90 Lampiran 12. Data penimbangan pada tahap penghilangan klorofil ................... 91 Lampiran 13. Gambar kolom kromatografi yang digunakan ............................... 92

xix


Lampiran 14. Data penimbangan pada tahap kromatografi kolom gradien ........................................................................................................ 93 Lampiran 15. Hasil Uji Kualitatif UV protection isolat 1, isolat 2, isolat 3 pada menit ke 15 ..................................................................................... 94 Lampiran 16. Kontrol kontaminasi media dan kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus pada metode disk diffusion................................................. 96 Lampiran 17. Gambar uji kualitatif antibakteri pada metode disk diffusion dengan bakteri S. aureus ............................................................................. 97

xx


INTISARI

Bunga kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.) adalah salah satu tanaman tradisional khas Indonesia yang digunakan sebagai bahan kosmetik tradisional. Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa aktif pada ekstrak bunga kenanga yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhdrazyl (DPPH), UV protection, dan antibakteri. Bunga kenanga diekstraksi dengan pelarut etanol 90% v/v kemudian dipekatkan hingga membentuk ekstrak. Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan pada ekstrak bunga kenanga menggunakan fase gerak optimum kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan fase diam silika gel 60 F254. Selanjutnya, dilakukan isolasi senyawa aktif yang dipandu dengan uji aktivitas penangkap radikal DPPH, UV protection dengan metode inhibition of bleaching of 𝛽-carotene, dan antibakteri dengan metode bioautografi kontak. Isolasi senyawa aktif dilakukan dengan kromatografi kolom. Isolat diuji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection dengan metode inhibition of bleaching of 𝛽carotene, dan antibakteri dengan metode disc diffusion. Selanjutnya dilakukan uji identifikasi dengan menggunakan berbagai reagen semprot pada isolat aktif. Dengan kromatografi kolom, didapatkan hasil 3 isolat. Isolat 1 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH dan antibakteri. Isolat 2 dan isolat 3 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 merupakan senyawa golongan terpenoid. Kata kunci: Bunga kenanga (Cananga odorata), penangkap radikal bebas, UV protection, antibakteri.

xxi


ABSTRACT

Ylang-ylang or Cananga flower (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.) is used to be Indonesia traditional cosmetic ingredients. This research aimed to isolate and identify active compounds in cananga flower extract that has a free radical scavenging activity 2,2-diphenyl-1-picrylhdrazyl (DPPH), UV protection, and antibacterial. Cananga flowers extracted using ethanol 90% v/v, then evaporated to form the extract. Extracts of cananga flower separated in the thin layer chromatography (TLC) using optimum mobile phase chloroform : methanol (95: 5 v/v) and stationary phase silica gel 60 F254. The isolation of the active compound guided to DPPH radical scavenging activity test, UV protection with inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial with contact bioautografi method. Isolation of active compounds performed by column chromatography. Isolates tested qualitatively using DPPH free radical scavenging activity, UV protection with inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial with disc diffusion method. The active isolates was identified using various reagent. By column chromatography showed 3 isolates. Isolate 1 has DPPH free radical scavenging activity and antibacterial activity. Isolate 2 and isolate 3 have DPPH free radical scavenging activity, UV protection activity, and antibacterial activity. The result showed that isolate 1, isolate 2 and isolate 3 were terpenoid compounds. Keyword: Cananga flower (Cananga odorata), free radical scavengers, UV protection, antibacterial.

xxii


BAB I

PENGANTAR A.

Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang memiliki kekayaan hutan tropis terbesar kedua di dunia setelah Brazil. Indonesia memiliki lebih dari 30.000 spesies tumbuhan tingkat tinggi dari 250.000 spesies yang ada di muka bumi ini. Kekayaan alam Indonesia ini bisa dieksplorasi lebih lanjut karena setiap tumbuhan merupakan sumber bahan kimia hayati (chemical resources) yang dapat diolah menghasilkan bahan kimia berguna (chemical prospective) melalui serangkaian proses lebih lanjut (Ersam, 2004). Metabolit sekunder yang terkandung pada tumbuhan bersifat spesifik yang artinya tiap tumbuhan memiliki kekhasan tersendiri. Selain itu metabolit sekunder yang terdapat pada tumbuhan memiliki sifat bioaktif sehingga tidak akan pernah habis dan sangat menarik untuk dieksplorasi. Metabolit sekunder dapat digunakan sebagai lead compounds dalam usaha penemuan dan pengembangan obat baru (Atun, 2010). Menurut Tranggono (2007) perkembangan kosmetik akhir-akhir ini cukup pesat, disebabkan karena kosmetik dianggap sudah menjadi salah satu kebutuhan utama manusia untuk menjaga penampilan fisik. Kosmetik ada berbagai macam jenis misalnya pelembab, pembersih, pelindung, dan untuk keperluan merias diri. Alam Indonesia sejak berabad-abad yang lalu memberikan berbagai sumber perawatan kesehatan termasuk kecantikan. Nenek moyang kita telah meramunya menjadi berbagai macam jamu, termasuk jamu untuk perawatan kecantikan. Hal

1


2

ini menjadikan bukti bahwa nenek moyang kita sedari dulu telah mengolah bahan alam tradisional untuk perawatan kecantikan (Tilaar, 1999). Sediaan kosmetik diformulasikan untuk mengatasi penuaan dini pada kulit dan kelainan kulit, seperti munculnya jerawat dan munculnya noda hitam (Tranggono, 2007). Oleh karena itu, efektivitas kosmetik dapat dilihat dari kemampuannya terhadap beberapa aspek, yaitu antioksidan, UV protection, dan antibakteri. Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat aktivitas dari radikal bebas. Antioksidan bekerja dengan cara menghambat reaksi oksidasi. Apabila reaksi oksidasi ini tidak dihentikan maka akan mengakibatkan kerusakan sel sehingga sel akan menjadi abnormal (Kim, Lee, Lee, dan Lee, 2002). Indonesia merupakan negara yang memiliki iklim tropis sehingga mendapatkan paparan sinar matahari yang tinggi sepanjang tahun. Spektrum sinar matahari memancarkan energi pada rentang panjang gelombang tertentu. Spektrum sinar matahari ini disebut gelombang ultraviolet (UV) yang dapat berdampak buruk bagi kulit dan menjadi salah satu penyebab utama terjadinya eritema dan pigmentasi pada kulit manusia (Lim dan Draelos, 2009). Paparan jangka panjang dari radiasi sinar UV akan menyebabkan timbulnya efek penuaan dini pada kulit dan kanker kulit. Salah satu cara untuk mengurangi paparan radiasi sinar UV adalah dengan penggunaan tabir surya yang bersifat sebagai UV protector (Gadri, Darijono, Mauludin, dan Iwo, 2012). Penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri semakin lama semakin berkembang. Penyebab utama dari kasus tersebut adalah semakin tingginya tingkat resistensi bakteri terhadap obat-obatan yang ada. Hal tersebut menjadi


3

pemicu untuk terus melakukan kegiatan eksplorasi untuk menemukan obat-obatan yang memiliki aktivitas antibakteri (Fitriyah, Jose, dan Saryono, 2013). Di bidang perawatan kecantikan, senyawa yang memiliki kemampuan antibakteri sangat menarik untuk dieksplorasi. Hal ini disebabkan karena bakteri merupakan salah satu faktor yang dapat menyebabkan gangguan pada kulit, misalnya infeksi kulit dan jerawat. Berdasarkan uraian tersebut, penulis mempertimbangkan bahwa perlunya dilakukan pembuktian ilmiah efektivitas penggunaan suatu bahan alam sebagai salah satu bahan kosmetik tradisional. Penulis memilih bunga kenanga yang digunakan sebagai salah satu bahan dalam kosmetik tradisional dengan bentuk sediaan lulur. Penelitian terhadap bunga kenanga yang belum banyak dilakukan menjadi pemicu tersendiri untuk terus melakukan eksplorasi. 1.

Permasalahan

Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: a.

Apakah ekstrak bunga kenanga (C. odorata) mengandung senyawa yang

memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection dan antibakteri? b.

Golongan senyawa apakah yang bertanggung jawab terhadap aktivitas

penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection dan antibakteri ? 2.

Keaslian penelitian Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang C. odorata pernah

dilakukan oleh Indrakumar, Selvi, Gomathi, dan Karpagam (2012) yang bertujuan


4

untuk mengevaluasi kemampuan antibakteri ekstrak daun C. odorata secara in vitro. Beberapa kultur bakteri disiapkan untuk dilakukan pengujian dengan ekstrak daun dengan beberapa variasi pelarut, yaitu metanol, kloroform, dan petroleum eter. Metode yang digunakan adalah well diffusion. Pengujian yang dilakukan mendapatkan kesimpulan bahwa ekstrak yang paling efektif adalah ekstrak dengan pelarut metanol (Indrakumar dkk., 2012). Penelitian lain tentang C. odorata pernah dilakukan oleh Brokl, Fauconnier, Benini, Lognay, Jardin, dan Focant (2013). Penelitian ini bertujuan untuk melakukan karakterisasi kandungan kimia yang terdapat dalam minyak atsiri C. odorata. Karakterisasi dilakukan dengan instrumentasi GCxGC-TOFMS dan menghasilkan kesimpulan bahwa terdapat 161 senyawa kimia termasuk 75 senyawa baru yang terdiri dari terpen, terpenoid ester, dan alkohol. Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah penelitian ini menggunakan sampel bunga C. odorata yang diambil dari Boyolali. Setelah itu, dilakukan pembuatan simplisia, pembuatan ekstrak etanolik dengan etanol 90%, dilanjutkan dengan melakukan kromatografi lapis tipis (KLT) terhadap ekstrak C. odorata dengan menggunakan fase gerak hasil optimasi. Hasil pemisahan kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak C. odorata di uji kualitatif untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Bercak yang potensial terhadap aktivitas tersebut diisolasi dengan kromatografi kolom. Isolat yang dihasilkan diuji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Selanjutnya, isolat diidentifikasi golongan senyawa menggunakan beberapa reagen.


3.

5

Manfaat a.

Manfaat teoritis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

apakah bunga C. odorata memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri serta mengetahui golongan senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktivitasnya. b.

Manfaat praktis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

apakah penggunaan bunga C. odorata sebagai bahan baku kosmetik tradisional sudah efektif. B. 1.

Tujuan

Tujuan umum Membuktikan kebenaran ilmiah penggunaan bunga kenanga sebagai bahan baku kosmetik dilihat dari parameter aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri.

2.

Tujuan khusus a.

Mengetahui apakah ada komponen senyawa dalam ekstrak C. odorata

yang memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection, dan antibakteri. b.

Melakukan isolasi dan identifikasi golongan senyawa yang bertanggung

jawab terhadap aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. 1.

Kenanga

Klasifikasi tanaman Menurut United States Department of Agriculture (2014) klasifikasi

tanaman kenanga adalah sebagai berikut. Kingdom

: Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Sub Kelas

: Magnoliidae

Ordo

: Magnoliales

Famili

: Annonaceae

Genus

: Cananga

Spesies

: Cananga odorata (Lmk.) Hook. F. & Thomson

6


Sinonim

7

: menurut Plant Resources of South-East Asia (2015) sinonim dari

C. odorata yaitu Uvaria odorata Lamk (1785), Canangium odoratum (Lamk) Baillon (1868), Cananga scortechinii King (1922). 1.

Deskripsi tanaman kenanga Ciri-ciri tanaman kenanga adalah habitus pohon tahunan, batangnya besar

dengan diameter 0,1-0,7 m. Tinggi dapat mencapai 5-20 m. Daun bertangkai, berbentuk bulat telur memanjang dengan ujung dan pangkal runcing, pangkal membulat atau bentuk jantung, panjangnya 10-23 cm dan lebarnya 4,5-14 cm. Ciri-ciri bunga kenanga adalah bunga majemuk dalam karangan bunga yang berbentuk payung, pendek, menggantung, duduk di ketiak. Bunga mempunyai enam lembar daun mahkota yang berbentuk lanset, pada waktu masih muda berwarna hijau dan ketika sudah tua berubah menjadi warna kuning. Bunga kenanga mempunyai bau harum dan khas, buah 7-15, perkembangannya tidak sama, bulat telur terbalik dan berwarna hijau (Hembing, 2000). 2.

Kandungan kimia kenanga Minyak atsiri adalah komponen minyak esensial yang dapat diekstraksi

dari bunga C. odorata (Brokl et al, 2013). Minyak atsiri juga memiliki kemampuan sebagai agen antibakteri dan anti virus. Selain itu, minyak atsiri juga memiliki kemampuan untuk melawan infeksi virus RNA dan DNA. Minyak atsiri dapat berfungsi sebagai antioksidan yang dapat digunakan sebagai pengawet makanan dan menangkal beberapa penyakit akibat pengaruh paparan radikal bebas (Miguel, 2010).


8

Zat kimia yang terkandung pada bunga kenanga adalah minyak atsiri (Hariana, 2008). Kandungan kimia utama minyak atsiri yang terdapat pada bunga kenanga antara lain: geraniol, kresol, linalool, benzil alkohol, eugenol, isoeugenol, dan metil eugenol (Chooi, 2004). Sebagian besar monoterpen dan seskuiterpen dalam minyak atsiri cukup aman, namun dapat menyebabkan iritasi dan reaksi alergi pada beberapa orang yang sensitif. Lakton seskuiterpen merupakan senyawa yang dapat menyebabkan reaksi alergi dan sitotoksik (Heinrich, Barnes, Gibbons, dan Williamson, 2010). B.

Ekstraksi

Ekstraksi atau penyarian merupakan proses perpindahan massa atau zat aktif yang berada di dalam sel kemudian ditarik masuk ke dalam larutan penyari. Proses ekstraksi akan bertambah baik bila permukaan simplisia yang bersentuhan dengan pelarut semakin besar (Harborne, 1987). Syarat cairan penyari yang baik menurut Depkes RI (1986) adalah murah, mudah diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar, selektif, tidak berpengaruh terhadap zat berkhasiat, serta diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku. Metode penyarian dibedakan menjadi: infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan. C. 1.

Antioksidan

Definisi antioksidan Secara biologis, pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu

menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan


9

bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat (Winarsi, 2007). Secara umum, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan enzimatis dan non enzimatis. Antioksidan enzimatis contohnya superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase. Antioksidan non enzimatis dibagi menjadi 2, yaitu antioksidan larut lemak, dan antioksidan larut air. Antioksidan larut lemak contohnya tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin. Antioksidan larut air contohnya asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme (Winarsi, 2007). Radikal bebas diproduksi di dalam sel-sel tubuh dengan berbagai cara. Adanya radiasi sinar ultraviolet, sinar X, sinar gamma radioaktif adalah sumbersumber yang mempengaruhi. Radiasi ini akan memecah ikatan di antara atom sehingga terjadi berbagai radikal dengan elektron tunggal yang dapat menimbulkan reaksi berantai yang menimbulkan kerusakan sel (Youngson, 1998). 2.

Metode penangkapan radikal DPPH Senyawa 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH) adalah suatu radikal yang

memiliki kemampuan untuk direduksi oleh suatu antioksidan dan dapat diukur dengan melihat penurunan nilai absorbansi pada panjang gelombang 517 nm sehingga DPPH dapat digunakan untuk mengukur kapasitas penangkapan senyawa radikal (Duh, 1999). Metode DPPH dipilih karena mampu mendeteksi kemampuan antiradikal suatu senyawa karena hasilnya lebih akurat, reliabel, relatif cepat dan praktis (Trifena, 2012).


10

Parameter aktivitas antioksidan dilihat dari nilai IC. IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi DPPH awal (Sunarni, 2005).

Gambar 1.

Reaksi DPPH dengan radical scavengers (Marston, 2011)

Senyawa yang beraksi sebagai penangkal radikal bebas akan mereduksi DPPH dan mampu diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Perubahan warna terjadi ketika elektron ganjil dari radikal DPPH sudah berpasangan dengan hidrogen dari senyawa penangkal radikal bebas yang akan membentuk DPPH-H tereduksi (Molyneux, 2004). D. 1.

UV Protection

Definisi UV protection Penggunaan tabir surya dianjurkan di negara tropis untuk melindungi kulit

dari radiasi ultraviolet. Tabir surya berfungsi untuk mengurangi efek radiasi ultraviolet yang dapat menimbulkan kerusakan pada kulit seperti penuaan dini, kulit kering, hiperpigmentasi dan kanker kulit (Tranggono, 2007).


2.

11

Metode inhibition of bleaching of 𝜷-carotene Metode β-karoten adalah metode yang digunakan untuk memperkirakan

kemampuan relatif dari ekstrak terhadap oksidasi dari asam linoleat yang akan mengoksidasi β-karoten dalam emulsi. Akibat dari adanya oksidasi oleh asam linoleat ini maka β-karoten akan kehilangan warna karena putusnya ikatan rangkap sehingga terjadi perubahan warna (Miguel, 2010). Analisis bleaching β-karoten dilakukan secara kualitatif dengan cara menyemprotkan larutan β-karoten ke pelat KLT hasil elusi dari sampel yang diuji. Kemudian pelat KLT dipanaskan di bawah sinar matahari dan dihitung waktu yang diperlukan dari saat dipanaskan hingga warna oranye β-karoten hilang. Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dan UV protection adalah senyawa yang mampu mempertahankan warna β-karoten lebih lama (Rochmaulana dan Wahyudi, 2009).


Gambar 2.

Struktur senyawa β-karoten

E. 1.

12

Antibakteri

Definisi antibakteri Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) adalah suatu konsentrasi paling

rendah suatu zat yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme (Sacher, 2004). Kadar bunuh minimum (KBM) adalah kadar paling rendah suatu zat yang diperlukan untuk membunuh mikroba (Nugroho, 2012). 2.

Metode bioautografi Metode bioautografi dapat digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri

dan antikapang sekaligus mendeteksi golongan senyawa. Bioautografi dibedakan menjadi bioautografi kontak, bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung. Bioautografi kontak dilakukan dengan menempelkan kromatogram pada media padat berisi bakteri uji. Senyawa dengan aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan daerah jernih. Bioautografi agar overlay dilakukan dengan cara melapisi kromatogram dengan agar cair yang berisi bakteri uji dan setelah mengeras diberi pewarnaan. Adanya senyawa antibakteri ditunjukkan dengan adanya pita-pita yang terbentuk. Bioautografi langsung dilakukan dengan cara menyemprot kromatogram dengan bakteri uji dan dilakukan inkubasi. Adanya senyawa antibakteri ditunjukkan dengan bantuan pewarnaan menggunakan tetrazolium dye (Kusumaningtyas, Astuti, dan Darmono, 2008).


13

Keuntungan metode bioautografi dibandingkan metode yang lain adalah dapat digunakan untuk mengetahui secara langsung aktivitas biologi dari hasil pemisahan senyawa yang kompleks, cepat, mudah, dan murah untuk dilakukan. Selain itu interpretasi hasilnya juga mudah dan akurat (Kusumaningtyas, 2008). 3.

Metode difusi Salah satu metode difusi yang biasa dilakukan untuk menentukan aktivitas

antimikroba adalah dengan menggunakan cakram (disc). Zat yang akan diuji ditampung dalam cakram kertas yang ditempelkan pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri uji. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada waktu dan suhu tertentu sesuai persyaratan dan kondisi optimum mikroba uji. Hasil positif ditandai dengan adanya zona penghambatan berupa daerah bening di sekitar cakram kertas (Pelczar dan Chan, 1988). Prinsip penentuan aktivitas antimikroba dengan metode difusi adalah kemampuan difusi dari zat uji pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri tertentu. Hasil positif ditandai dengan adanya zona hambatan di sekeliling zat yang diuji setelah dilakukan inkubasi selama waktu tertentu (Brooks, Butel, Carrol, dan Morse, 2007). F. 1.

Kromatografi

Kromatografi lapis tipis (KLT) Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu bentuk kromatografi planar.

Pada KLT fase diam yang ada berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat


14

plastik. Fase gerak akan bergerak sepanjang fase diam diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar dan Rohman, 2007). Pemisahan pada KLT akan optimal apabila penotolan sampel dilakukan dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin sehingga menghasilkan resolusi yang baik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan manual bila jumlah sampel lebih dari 15 μl. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak menyebar dan puncak ganda (Gandjar dan Rohman, 2007). Bercak hasil pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Oleh karena itu, beberapa cara yang dapat dilakukan untuk mendeteksi bercak antara lain: 1.

Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan

bereaksi secara kimia dengan solut yang mempunyai gugus fungsi tertentu sehingga bercak menjadi berwarna khas. 2.

Mengamati lempeng di bawah sinar ultraviolet pada panjang gelombang

254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam. 3.

Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrit pekat lalu

dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik sehingga akan tampak bercak hitam hingga kecoklatan.


4.

15

Melakukan scanning lempeng hasil pemisahan menggunakan instrumen

densitometer. Solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai peak oleh recorder (Gandjar dan Rohman, 2007). 2.

Kromatografi kolom Kromatografi kolom merupakan metode pemisahan dengan menggunakan

kolom gelas diisi dengan adsorbent yang dilewatkan oleh desorbent berupa larutan campuran. Masing-masing komponen akan dipisahkan dalam kolom yang diatur dengan afinitas adsorpsi setiap komponen (Lazo, 1999). Solven murni dapat digunakan untuk mengelusi semua komponen. Selain itu, sistem gradien pelarut juga digunakan. Pada elusi gradien, polaritas sistem solven ditingkatkan secara perlahan dengan meningkatkan konsentrasi solven ke tingkat yang lebih polar. Pemilihan eluen tergantung pada jenis adsorben yang digunakan dan kemurnian senyawa yang dipisahkan. Pelarut harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Keberadaan pengganggu seperti air, alkohol, atau asam pada solven yang kurang polar mampu mengganggu aktivitas adsorben (Braithwaite dan Smith, 1995). G.

Keterangan Empiris

Bunga kenanga telah digunakan sebagai bahan baku kosmetik tradisional. Dari penelitian ini ingin diketahui komponen senyawa dalam bunga kenanga yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri serta mengetahui golongan senyawa yang bertangung jawab terhadap aktivitas tersebut.


BAB III

METODE PENELITIAN A.

Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksploratif. B. 1.

Bahan dan Materi Penelitian

Bahan penelitian a. Bahan utama berupa bunga kenanga yang berasal dari Boyolali, Jawa Tengah. b. Bahan kimia yang digunakan meliputi DPPH pro analitik dan 𝛽-karoten pro analitik yang berasal dari Sigma Chem. Co., USA. n-heksana, etanol, metanol, kloroform, NaCl, barium klorida, dan asam sulfat pro analitik yang berasal dari Merck, Jerman. Akuades berasal dari Brataco Chemica. Reagen Dragendorff, alumunium chloride, ferric chloride, sitroborat, iod, vanilin sulfat berasal dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata Dharma. Silika gel 60 F254 for thin layer chromatography dan silika gel 60 (0,040-0,063 mm) for column chromatography dari Merck, Jerman. Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 25922 yang berasal dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta. Amoksisilin berasal dari PT. Indofarma. Trypticasein soy broth (TSB) berasal dari Agarindo Biological

Company,

dan

agar

16

No.1

diperoleh

dari

Oxoid.


2.

17

Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa micro haematocrit

tubes, light meter (Lutron) LX-1118 Digital Instruments, lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm,vortex (Buchi),

mikropipet 1-10 mL (Acura Socorex),

mikropipet 10-1000 μL (Acura Socorex), timbangan analitik (Scaltec SBC 22 dan BP 160P), vacuum rotary evaporator (Buchi), blender, kertas saring, tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki), autoclave (YX-400Z), freezer, dan oven (WTB binder). C. 1.

Tata Cara Penelitian

Determinasi sampel Determinasi bunga kenanga dilakukan di Bagian Biologi Farmasi,

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Determinasi tersebut memastikan bahwa sampel yang digunakan untuk penelitian benar-benar bunga kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook. F. & Thoms.). 2.

Pengumpulan dan penyiapan bahan a.

Pengumpulan bahan Bahan utama berupa bunga kenanga yang berasal dari Boyolali, Jawa

Tengah. Bunga kenanga berumur 2 minggu dipanen dini hari pada bulan Juli 2014 yang berasal dari pohon kenanga berumur 7 tahun.


b.

18

Sortasi basah Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengotor yang mungkin

terdapat pada simplisia seperti kerikil, tanah, rumput, serta bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (batang dan daun), bagian tanaman lain, bahan yang rusak dan lain-lain. c.

Pencucian Bunga kenanga dicuci menggunakan air mengalir lalu dibersihkan

kotoran-kotoran yang melekat. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak tiga kali untuk menjamin kebersihan bahan. d.

Pengeringan Bunga kenanga yang masih basah diletakkan pada tampah bambu dengan

ketebalan seminimal mungkin. Tampah bambu ditutup dengan kain hitam yang diberi sedikit sirkulasi udara lalu dijemur dibawah sinar matahari. Akhir pengeringan ditandai dengan warna bahan menjadi lebih gelap dan mudah dipatahkan. e.

Sortasi kering Bunga kenanga yang sudah kering dipisahkan dari bahan-bahan lain

seperti tanah, kerikil, ranting, daun, bahan yang rusak dan lain-lain. f.

Pengepakan dan penyimpanan Simplisia bunga kenanga kemudian dibungkus dengan menggunakan

amplop kertas kedap udara yang diberi silika gel. Penyimpanan dilakukan pada suhu ruang.


g.

19

Susut pengeringan simplisia bunga kenanga Bobot tetap dilakukan terhadap cawan petri yang akan digunakan selama

60 menit menggunakan oven pada suhu 105°C. Setelah didapatkan bobot tetap petri, serbuk simplisia bunga kenanga ditimbang 1 g dan dilakukan replikasi 3 kali. Cawan berisi serbuk simplisia dipanaskan dalam oven bersuhu 105°C hingga bobot tetap. 3.

Ekstraksi a.

Ekstraksi bunga kenanga Simplisia bunga kenanga ditimbang sebanyak 1,0 kg dan diblender

dengan etanol 90% sampai seluruh bahan tercampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Dilakukan remaserasi dengan cara yang sama dengan tahap maserasi. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dan penguapan pelarut dengan vacuum rotary evaporator sehingga dihasilkan ekstrak. b.

Susut pengeringan ekstrak bunga kenanga Tiga cawan petri disiapkan, ditimbang dan dipanaskan hingga mencapai

bobot tetap pada oven dengan suhu 105°C. Silika yang telah dihaluskan disiapkan, lalu dipanaskan dahulu dalam oven bersuhu 105°C selama 60 menit. Bila cawan petri sudah mencapai bobot tetap, ekstrak ditimbang ± 0,5 g (replikasi 3 kali) dan masing-masing cawan yang berisi ekstrak tersebut ditambahkan ± 0,5 g silika. Cawan petri tersebut kemudian dimasukkan dalam oven bersuhu 50°C, hingga mencapai bobot tetap (selisih kadar air 0,25%).


20

Saat kadar air ekstrak yang diuji lebih dari 10%, maka pada ekstrak perlu dilakukan penguapan air dengan cara dimasukkan dalam desikator berisi batu gamping. c.

Pemerian ekstrak bunga kenanga Ekstrak bunga kenanga diamati warna, bau, bentuk dan rasa.

4.

Kromatografi lapis tipis ekstrak a.

Preparasi sampel Sebanyak 5 mg ekstrak bunga kenanga ditimbang lalu dilarutkan dalam

etanol p.a 1 mL. b.

Optimasi fase gerak Sampel ekstrak bunga kenanga ditotolkan sebanyak 3 spot pada pelat

KLT dengan jarak elusi 5 cm (Wolf, 2012). Sampel ditotolkan menggunakan pipa kapiler. Pelat KLT kemudian dielusi dengan 3 jenis fase gerak berikut : 1) Fase gerak nonpolar

= n-heksana: etil asetat (2:3 v/v)

2) Fase gerak semipolar

= kloroform:metanol (7:3 v/v)

3) Fase gerak polar

= etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air

(100:11:11:20 v/v) (Wagner

dan Bladt, 1996). c.

Deteksi pemisahan KLT Pelat KLT hasil elusi dikeringkan beberapa saat pada suhu ruang,

kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm dan 366 nm. Hasil elusi dari ketiga fase gerak tersebut kemudian dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi.


5.

21

Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH a.

Preparasi pereaksi semprot DPPH Pereaksi DPPH dibuat dengan konsentrasi 0,2% b/v dalam pelarut

metanol, lalu dimasukkan dalam wadah gelap dan tertutup (Marston, 2011). b.

Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal dengan pereaksi DPPH Pelat KLT hasil elusi yang telah kering disiapkan untuk disemprot

dengan pereaksi DPPH, hasil positif ditandai dengan adanya bercak kuning dengan latar ungu pada pelat KLT. 6.

Uji kualitatif aktivitas UV protection a.

Preparasi pereaksi 𝛽-karoten Pereaksi 𝛽-karoten dibuat dengan konsentrasi 0,05% b/v dalam pelarut

kloroform, lalu dimasukkan dalam wadah gelap dan tertutup (Marston, 2011). b.

Optimasi intensitas sinar UV Pelat KLT kosong disiapkan, kemudian pelat tersebut dicelupkan dalam

pereaksi 𝛽-karoten. Warna diukur dengan parameter warna lalu dicatat. Pelat tersebut kemudian disinari dengan menggunakan lampu UV. Perubahan warna yang terjadi diamati lalu diukur dengan parameter warna pada menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Posisi dari lampu UV diatur dalam posisi tinggi (100 cm), sedang (50 cm), rendah (35 cm) dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter. Tiap posisi lampu dilakukan uji dengan replikasi 5 kali. Perubahan warna yang terjadi dicatat lalu dihitung rata-rata dan SD.


c.

22

Uji kualitatif UV protection (𝛽-karoten bleaching test) Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan beberapa saat dicelupkan

dalam pereaksi 𝛽-karoten. Sebelum warna pelat KLT tersebut diukur dengan menggunakan parameter warna lalu dicatat. Pelat KLT tersebut kemudian disinari sinar UV dengan jarak sesuai hasil optimasi dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter. Perubahan warna yang terjadi diamati lalu diukur dengan parameter warna pada menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Replikasi 5 kali dilakukan dan perubahan warna yang terjadi dicatat lalu dihitung rata-rata dan SD. 7.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri a.

Pembuatan media TSB cair Sebanyak 3 g media TSB (30g/L) dilarutkan dalam 100 mL akuades,

diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoklaf. b.

Pembuatan media agar Sebanyak 3 g media TSB (30g/L) ditambahkan 1,2% b/v agar dilarutkan

dalam 100 mL akuades. Diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoklaf. c.

Pembuatan larutan McFarland 0,5 (1,6 x 108 CFU) Larutan barium klorida 1,175% (b/v) 0,05 mL ditambah 9,95 mL larutan

1% (b/v) asam sulfat (Schwalbe, Moore, dan Goodwin, 2007). d.

Pembuatan NaCl 0,9% (b/v) NaCl 0,9 g ditimbang kemudian dilarutan dalam 100 mL akuades.


e.

23

Preparasi bakteri uji Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Kultur bakteri

induk dari media miring diambil sebanyak 1 ose lalu dikulturkan pada media TSB cair. Kultur bakteri diinkubasi selama 18 jam. f.

Pembuatan larutan induk bakteri Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Sebanyak 2

tabung reaksi disiapkan, masing-masing diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya menggunakan larutan standar Mc Farland 0,5 (konsentrasi mikroba 1,6. 108 CFU/ml) dengan penambahan bakteri ke dalam tabung reaksi. g.

Penyimpanan kultur bakteri Sisa kultur bakteri yang belum digunakan untuk diuji, diambil 0,5 mL

lalu dimasukkan ke dalam microtube. Gliserol sebanyak 5% v/v dari 0,5 mL kultur bakteri ditambahkan, yaitu 25. 10-3mL pada masing-masing microtube. Campuran dihomogenkan lalu diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator bersuhu 37°C. Setelah itu kultur bakteri disimpan dalam freezer. h.

Pembuatan kontrol kontaminasi media Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara

pour plate lalu dibiarkan memadat. Media diinkubasi selama 18 jam. i.

Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan

memadat pada cawan petri steril. 100 µL bakteri diinokulasikan secara


24

spreading dengan menggunakan cotton buds steril. Inkubasi dilakukan selama 18 jam. j.

Pembuatan kontrol positif Media agar sebanyak 15 mL TSB lalu dibiarkan memadat. 100 mikroliter

bakteri diinokulasikan secara spreading menggunakan cotton buds steril. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL akuades. Sebanyak 75; 100;150 µg amoksisilin diambil lalu diteteskan pada paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri. Inkubasi dilakukan selama 18 jam. k.

KLT ekstrak bunga kenanga Ekstrak bunga kenanga dengan konsentrasi 5 mg/mL dalam etanol

disiapkan untuk ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 75; 100; 150 µg dengan menggunakan mikropipet. Pelat KLT dielusi dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Pelat KLT kemudian dikeringkan pada suhu ruang secara aseptis (dibuat 2 kali replikasi: sebagai acuan dan sebagai pelat

uji

bioautografi). l.

Bioautografi Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan secara aseptis ditempelkan

pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading. Kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut diangkat secara aseptis. Inkubasi dilakukan selama 18 jam dan dibandingkan kontrol negatif dan pelat KLT acuan. Hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media yang telah diinokulasikan bakteri.


8.

25

Identifikasi golongan senyawa ekstrak Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi menggunakan reagen semprot. Reagen semprot yang digunakan yaitu Dragendorff, alumunium chloride, ferric chloride, sitroborat, iodium, dan vanilin sulfat, kemudian diamati perubahan warna dan dihitung nilai Rf dari bercak.

9.

Pembersihan klorofil dengan karbon aktif Sebanyak 28 g ekstrak bunga kenanga diambil dan ditampung dalam gelas beaker. Sebanyak 1,6 g karbon aktif ditumbuk halus dan dipanaskan dalam oven dengan suhu 1050 C selama 30 menit. Ekstrak bunga kenanga dilarutkan dengan pelarut kloroform : metanol (1 : 1 v/v) sambil diaduk dengan batang pengaduk. Taburkan karbon aktif yang sudah diaktivasi lalu diaduk dengan batang pengaduk. Campuran disaring lalu filtrat dipekatkan menggunakan tangas air.

10.

Kromatografi kolom a.

Preparasi sampel untuk uji kromatografi lapis tipis Ekstrak hasil pembersihan klorofil ditimbang 2,5 mg dilarutkan dalam

0,5 mL metanol. b.

Uji kromatografi lapis tipis (KLT) untuk optimasi fase gerak kolom Hasil preparasi sampel ditotolkan pada pelat KLT. Disiapkan 4 fase

gerak yaitu: n-heksana : kloroform (50:50 v/v), n-heksana : kloroform (25:75 v/v), kloroform , dan kloroform : metanol (98:2 v/v). Pelat KLT dielusi dengan fase gerak tersebut dan diamati.


c.

26

Preparasi sampel untuk kromatografi kolom Ekstrak hasil sebanyak 300 mg pembersihan klorofil ditimbang dan

dicampurkan dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan perbandingan 1:1. d.

Preparasi kolom kromatografi Kolom kromatografi disiapkan dengan urutan dari bawah yaitu kapas

yang telah dibilas n-heksana, silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan tinggi 3 cm, sampel yang telah dicampur dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi 0,5 cm, silika gel 60 untuk kolom kromatografi 1 cm, dan ditutup dengan kapas yang telah dicuci dengan n-heksana. e.

Kromatografi kolom Kolom kromatografi yang telah disiapkan, dialiri fase gerak dengan

urutan sebagai berikut: n-heksana: kloroform (70 : 30 v/v), (60 : 40 v/v), (50:50 v/v), (40:60 v/v), kloroform, kloroform : metanol (90:10 v/v). Masing – masing fase gerak disiapkan 5 mL. Tiap 2 mL hasil elusi kolom kromatografi ditampung pada tabung yang telah diberi tanda. f.

Konfirmasi hasil kromatografi kolom dengan kromatografi lapis tipis

(KLT) Setiap tabung hasil kolom kromatografi yang dikumpulkan dilakukan KLT. Profil KLT hasil kolom kromatografi yang sama disatukan kemudian dipekatkan. Hasil pemekatan ditimbang lalu dihitung rendemen.


g.

27

Penyimpanan isolat Isolat hasil pemekatan dilarutkan pada pelarut sesuai dan dipindahkan

pada microtube dengan konsentrasi 1 mg/100 µL kemudian dipekatkan dan disimpan dalam freezer. 11.

Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH isolat a. Preparasi sampel Isolat disiapkan dengan

konsentrasi 1mg/mL

dengan

menggunakan

pelarut yang sesuai. b. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat Isolat di totolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) dengan mass loading sebesar 10, 20, dan 30 µg, dibandingkan dengan ekstrak bunga kenanga yang ditotolkan dengan mass loading sebesar 10 µg, dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan dikeringkan pada suhu ruang. c. Uji kualitatif penangkapan radikal DPPH Pelat KLT hasil elusi yang telah kering disiapkan. Pelat KLT disemprot menggunakan pereaksi DPPH 0,2% b/v dalam metanol. Hasil positif ditandai dengan timbulnya bercak kuning dengan latar ungu pada pelat KLT. Perubahan warna pada pelat KLT dari ungu menjadi kuning diamati, diukur, dan dicatat waktu perubahan warnanya.


12.

28

Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat a. Preparasi sampel Isolat disiapkan dengan konsentrasi 1 mg/mL dengan menggunakan pelarut yang sesuai. b. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat Isolat ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) dengan mass loading sebesar 10, 20, dan 30 µg, dielusi dengan jarak 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan dikeringkan pada suhu ruang. c.

Uji kualitatif UV protection Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan dicelupkan dalam pereaksi

𝛽-karoten 0,05% b/v dalam kloroform. Sebelum disinari dengan UV, warna pelat KLT diukur menggunakan parameter warna. Pelat KLT kemudian disinari dengan sinar UV dengan jarak sesuai hasil optimasi yaitu pada ketinggian 50 cm dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter. Perubahan warna yang terjadi diamati pada menit ke 1, 3, 6, 9, 12, dan 15. 13.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat a. Preparasi sampel Isolat disiapkan dengan konsentrasi 1 mg/mL menggunakan pelarut yang sesuai. b.

Pembuatan media agar Sebanyak 3 g media TSB (30g/L) ditambahkan 1,2% b/v agar lalu

dilarutkan dalam 100 mL akuades. Campuran diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen kemudian media tersebut diautoklaf.


c.

29

Pembuatan NaCl 0,9% b/v Sebanyak 0,9 g NaCl ditimbang dan dilarutan dalam 100 mL akuades.

d.

Pembuatan larutan induk bakteri Bakteri uji yang digunakan adalah S.aureus. Tabung reaksi yang diisi

dengan saline water 10 mL disiapkan dan setarakan kekeruhannya menggunakan larutan standar Mc Farland 0,5 (konsentrasi mikroba 1,6. 108 CFU/ml) dengan penambahan bakteri ke dalam tabung reaksi. e.

Pembuatan kontrol kontaminasi media Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam cawan petri steril

secara pour plate lalu dibiarkan memadat. Inkubasi dilakukan selama 18 jam. f. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Media agar TSB sebanyak 15 mL dalam tabung diambil, dibiarkan memadat pada cawan petri steril.100 µL bakteri diinokulasikan secara spreading dengan menggunakan cotton buds steril. Inkubasi dilakukan selama 18 jam. g.

Pembuatan kontrol positif Media agar sebanyak 15 mL diambil, TSB dalam tabung, dibiarkan

memadat pada cawan petri steril. 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara spreading menggunakan cotton buds steril. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 5 mL akuades. Sebanyak 75, 100, dan 150 µg diambil lalu masing-masing ditotolkan pada paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri. Inkubasi dilakukan selama 18 jam. h. Uji kualitatif antibakteri


30

Isolat dengan konsentrasi 1 mg/mL disiapkan dengan pelarut yang sesuai. Paper disc diletakkan dalam cawan petri steril dan diisikan isolat senyawa dengan massa isolat sebesar 50, 100, dan 200 µg secara aseptis. Paper disc dibiarkan kering dari sisa pelarut isolat. Paper disc diletakkan pada media yang telah diinokulasikan bakteri S. aureus secara aseptis. Inkubasi selama 18 jam dilakukan. Hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media tersebut. 14.

Identifikasi golongan senyawa isolat a. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat Isolat disiapkan dengan konsentrasi1 mg/mL. Tiap isolat ditotolkan 10 µL pada pelat KLT. Dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan dikeringkan pada suhu ruang. b.

Identifikasi senyawa dengan reagen semprot Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi senyawa dengan

menggunakan beberapa reagen yaitu reagen Dragendorff, alumunium chloride, ferric chloride, dan vanilin sulfat. Perubahan warna diamati dan dihitung nilai Rf dari bercak yang terbentuk.


15.

31

Bagan alur penelitian Bunga kenanga Proses pembuatan simplisia

Simplisia bunga kenanga Ekstraksi : - Maserasi - Penyaringan - Pemekatan Ekstrak bunga kenanga

Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection dan antibakteri

Penghilangan klorofil

Diketahui bercak KLT ekstrak bunga kenanga yang aktif Identifikasi

Ekstrak bebas klorofil Kromatografi kolom step gradien Isolat

Golongan senyawa

Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection dan antibakteri Isolat aktif

Identifikasi

Golongan senyawa


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.

Determinasi Sampel

Determinasi sampel dilakukan di Bagian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Tujuan dilakukan determinasi sampel adalah untuk memastikan kebenaran identitas sampel yang digunakan sehingga menghindari kesalahan analisis dalam fitokimia. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F.& Thoms.) dan dikenal dengan nama lokal bunga kenanga. B.

Pengumpulan dan Penyiapan Bahan

Bunga kenanga yang digunakan sebagai sampel penelitian berasal dari Boyolali, Jawa Tengah. Bunga kenanga dipanen pada bulan Juli waktu dini hari dari pohon kenanga berumur 7 tahun dengan umur bunga 2 minggu. Pengambilan sampel berasal dari daerah yang sama untuk menghindari variasi kandungan kimia tanaman yang disebabkan aspek lingkungan (edafik, tempat tumbuh, geografis, cuaca, dan iklim). Bunga kenanga yang dijadikan sebagai sampel penelitian memiliki karakteristik berwarna hijau semburat kuning yang menandakan bahwa bunga kenanga tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua. Bila sampel yang digunakan terlalu tua maka dikhawatirkan metabolit sekunder yang terkandung pada sampel

32


33

sudah banyak berkurang, sedangkan bila sampel terlalu muda maka dikhawatirkan metabolit sekunder yang terkandung pada sampel masih belum sempurna. Sampel bunga kenanga dipanen pada bulan Juli agar kandungan kimia pada sampel tetap maksimal sebab pemanenan yang ideal dilakukan pada musim kemarau. Secara umum, metabolit sekunder pada tanaman yang dipanen pada musim kemarau akan terkandung lebih banyak daripada saat musim hujan. Pemanenan bunga kenanga dilakukan pada dini hari untuk menghindari berkurangnya metabolit sekunder, sebab pada siang hari metabolit sekunder dapat berkurang karena mengalami proses penguapan atau kerusakan senyawa karena paparan radiasi UV. Selanjutnya sampel bunga kenanga dibuat dalam bentuk simplisia. Setelah pemanenan, dilakukan sortasi basah pada bunga kenanga. Sortasi basah dilakukan dengan cara memisahkan sampel yang hendak diambil dengan bahan-bahan lain yang kemungkinan terdapat pada sampel, misalnya batang, daun, kerikil, serta bagian tanaman dan bahan lain yang tidak diinginkan. Kemudian bunga kenanga dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan berbagai kotoran yang melekat pada sampel. Setelah bersih, bunga kenanga diletakkan pada tampah yang terbuat dari anyaman bambu dengan ketebalan seminimal mungkin. Bunga kenanga lalu dikeringkan dibawah sinar matahari. Tampah bambu diberi penutup kain hitam dengan sedikit sirkulasi udara dengan tujuan untuk meratakan pemanasan serta menghindari kerusakan senyawa kimia akibat paparan langsung dengan sinar matahari. Pengeringan dihentikan saat bunga kenanga sudah kering yang dicirikan dengan konsistensi rapuh dan mudah dipatahkan. Selanjutnya dilakukan sortasi


34

kering untuk memisahkan bunga kenanga dari pengotor yang kemungkinan melekat saat proses pengeringan atau pengotor yang belum dbersihkan pada proses-proses sebelumnya. Simplisia yang dihasilkan disimpan pada amplop kertas yang diberi penambahan silika pengering dengan tujuan menghindari adanya lembab. C. 1.

Ekstraksi

Ekstraksi bunga kenanga Prinsip ekstraksi adalah proses pengambilan senyawa-senyawa kimia yang

semula berada dalam sel, ditarik oleh larutan penyari sehingga senyawa-senyawa kimia berada dalam larutan penyari. Proses ekstraksi pada penelitian ini dilakukan dengan 2 tahap, yaitu simplisia diblender dengan larutan etanol 90% v/v lalu dilanjutkan dengan proses maserasi. Proses pemblenderan simplisia dilakukan untuk menyari langsung komponen minyak atsiri yang kemungkinan akan menguap apabila dilakukan penyerbukan simplisia. Selanjutnya dilakukan dengan maserasi untuk memaksimalkan penyarian. Pada proses maserasi, cairan penyari akan menembus dinding sel lalu masuk menembus rongga sel yang berisi senyawa kimia. Senyawa kimia tersebut akan larut dalam cairan penyari lalu berdifusi keluar sel hingga terjadi kesetimbangan senyawa di dalam dan luar sel. Adanya shaker pada proses maserasi bertujuan untuk meningkatkan energi mekanik sehingga seluruh serbuk hasil blender dapat terbasahi sehingga membantu proses difusi komponen senyawa. Maserasi dipilih karena selain mudah dilakukan, metode ini tidak melibatkan pemanasan sehingga kerusakan komponen kimia pada sampel dapat


35

dihindari. Hal ini sangat mendukung proses isolasi karena proses ekstraksi komponen kimia tumbuhan dapat berjalan optimal. Larutan penyari yang digunakan adalah etanol 90% v/v. Tujuan digunakan penyari etanol 90% v/v karena komposisi ini merupakan pelarut yang bersifat universal sehingga relatif dapat menyari komponen kimia yang cenderung lebih nonpolar maupun polar. Setelah proses maserasi selesai, hasil maserasi disaring menggunakan kain mori yang terlebih dulu dicuci dengan air mendidih yang bertujuan untuk menghilangkan komponen lilin yang melekat pada kain. Setelah itu filtrat disaring kembali dengan kertas saring Whatman nomor 41 sebelum kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator. Dengan alat ini, etanol yang digunakan sebagai pelarut dapat diuapkan dan dikondensasikan kembali sehingga etanol dapat diperoleh kembali dan sudah terpisah dari ekstrak. Adanya pompa vakum akan membuat tekanan pada sistem akan turun sehingga akan terjadi penguapan pelarut dibawah titik didih normal. Labu yang berputar pada proses ini berfungsi untuk meratakan pemanasan sehingga proses penguapan pelarut dapat berjalan dengan baik. Hasil dari pemekatan dengan vacuum rotary evaporator adalah ekstrak bebas penyari. 2.

Susut pengeringan simplisia dan ekstrak bunga kenanga (C. odorata) Prinsip susut pengeringan adalah pengukuran sisa bahan setelah dilakukan

pemanasan pada suhu 105°C hingga dicapai bobot tetap yang kemudian dinyatakan dalam persen. Tujuan dilakukan susut pengeringan adalah untuk mengetahui batas maksimal besarnya senyawa yang hilang dari bahan akibat


36

pemanasan. Keuntungan menggunakan metode susut pengeringan adalah cepat, mudah, murah, dan hanya membutuhkan jumlah sampel yang sedikit. Persentase yang diperoleh pada susut pengeringan simplisia dan ekstrak berturut-turut adalah 15,40 % b/b dan 24,61 % b/b. Berdasarkan monografi resmi terbitan Departemen Kesehatan RI, persyaratan kadar air pada simplisia yang akan digunakan sebagai bahan baku obat adalah tidak lebih dari 10% b/b. Karena penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi senyawa maka persentase susut pengeringan diatas dapat diterima. Selain itu metode susut pengeringan merupakan metode yang tidak spesifik untuk pengukuran kadar air dan hanya memberikan batasan maksimal untuk total senyawa yang menguap selama pemanasan. Sampel bunga kenanga memiliki banyak kandungan senyawa yang mudah menguap seperti minyak atsiri, sehingga bila diukur penetapan kadar air dengan metode yang lebih spesifik akan memberikan persentase hasil yang lebih rendah. Hal ini menyimpulkan bahwa proses pembuatan simplisia sudah cukup baik. Persentase susut pengeringan ekstrak yang didapatkan masih terlalu tinggi sehingga menggambarkan masih banyak kandungan air pada ekstrak. Apabila kandungan air pada ekstrak terlalu tinggi maka ada kemungkinan terjadi reaksi enzimatik yang membuat rusaknya senyawa kimia pada ekstrak. Rusaknya senyawa kimia pada ekstrak akan mengganggu proses isolasi. Oleh karena itu dilakukan penguapan kadar air dengan perlakuan dimasukkan dalam desikator yang berisi batu gamping. Hasil yang diperoleh adalah berat ekstrak turun dari 691 g menjadi 625,1 g yang menunjukkan bahwa telah terjadi penguapan air


37

sebanyak 65,9 g. Keuntungan menggunakan metode ini adalah menghindari pemanasan dalam melakukan pemekatan sehingga kerusakan senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak dapat diminimalisir. 3.

Pemerian ekstrak bunga kenanga Pada tahap ini, ekstrak yang dihasilkan diamati secara organoleptis.

Pengamatan organoleptis yang dilakukan pada ekstrak meliputi bentuk, warna, rasa, dan bau. Bentuk yang dihasilkan cairan kental, warna hijau kehitaman, rasa hambar, dan bau harum khas bunga kenanga. D.

Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak

Tahap selanjutnya adalah dilakukan optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis (KLT). Tujuan dilakukan optimasi fase gerak adalah untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik dari senyawa-senyawa kimia yang terkandung pada ekstrak. Prinsip kromatografi lapis tipis adalah pemisahan analit berdasarkan interaksi dengan fase diam dan fase gerak pada suatu lempeng pemisahan. Optimasi fase gerak dilakukan dengan melihat hasil pemisahan pada tiga jenis fase gerak, yaitu n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v), etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v), dan kloroform : metanol (7 : 3 v/v). Ketiga jenis fase gerak tersebut secara berurutan bersifat relatif nonpolar, polar, dan semipolar. Hasil optimasi fase gerak KLT dapat dilihat pada data dibawah ini.


38

Gambar 3. Hasil optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ekstrak kenanga (A = n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v) ; B = kloroform : metanol (7 : 3 v/v); C= etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 20 v/v))

Tabel I. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v)

Rf 0,72-0,76 0,80 - 0,84

UV 254 Meredam Meredam

UV 366 Merah Merah

Tabel II. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v)

Rf 0,35 - 0,43 0,90 - 0,95

UV 254 Meredam Meredam

UV 366 -

Tabel III. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v)

Rf 0,50 - 0,60 0,70 - 0,75 0,85 – 0,88

UV 254 Meredam Meredam Meredam

UV 366 Merah Merah


39

Dari ketiga jenis fase gerak diatas, hasil pemisahan yang paling optimal terjadi pada fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v) dimana terdapat 3 bercak dengan Rf tidak terlalu tinggi maupun terlalu rendah. Selanjutnya, dilakukan optimasi lanjutan dengan melakukan pemisahan dengan menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) untuk menurunkan Rf yang terbentuk pada pemisahan dengan fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v). Hasil pemisahan paling optimum didapatkan menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) yang dapat memisahkan 7 bercak dengan resolusi yang baik. Selain itu, pemilihan fase gerak optimum didukung dengan panduan uji aktivitas penangkapan radikal DPPH.

Gambar 4.

Hasil optimasi fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ( A= UV 254 nm; B= UV 366 nm; C= secara visual)


40

Tabel IV. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Rf 0,10 - 0,15

Visual -

UV 254 Meredam

0,20 - 0,25

-

Meredam

0,35 - 0,40 0,45 - 0,55

Hijau Kuning

Meredam Meredam

UV 366 Merah muda Merah muda Merah -

0,60 - 0,65 0,70 - 0,76 0,77 - 0,80

-

Meredam Meredam -

Merah Merah

E.

Keterangan Warna kuning lama kelamaan akan menghilang -

Uji Kualitatif Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas DPPH

Pada tahap ini dilakukan uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH hasil pemisahan ekstrak pada 3 sistem fase gerak. Tiga sistem fase gerak tersebut adalah n-heksana: etil asetat (2:3 v/v), kloroform : metanol (95 : 5 v/v), etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v). Metode DPPH dipilih karena merupakan metode yang relatif cepat, sensitif, dan mudah untuk skrining senyawa yang memiliki kemampuan menangkap radikal bebas. DPPH merupakan radikal bebas yang mampu bereaksi dengan senyawa - senyawa yang mampu mendonorkan atom hidrogen. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH dapat dilihat pada data dibawah ini.


41

Gambar 5. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH ( A= nheksana: etil asetat (2:3 v/v); B= fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v); C= etil asetat: asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) )

Gambar 6.

Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH pada fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)


42

Tabel V. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Rf 0,45 - 0,55

UV 254 Meredam

UV 366 -

0,60 - 0,65

Meredam

-

0,70 - 0,76

Meredam

Merah

Hasil Muncul bercak berwarna kuning pudar Muncul bercak berwarna kuning pudar Muncul bercak berwarna kuning pekat

Waktu muncul ± 24 jam

± 60 menit

± 5 menit

Tabel VI. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak etil asetat: asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v)

Rf 0,90 - 0,95

UV 254 Meredam

UV 366 -

Hasil Muncul bercak berwarna kuning pekat

Waktu muncul ± 10 menit

Tabel VII. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak n-heksana: etil asetat (2:3 v/v)

Rf

UV 254

UV 366

Hasil

Waktu muncul

-

-

-

-

-

Adanya elektron yang tidak berpasangan akan membuat DPPH memberikan serapan yang kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan maka absorbansi DPPH akan menurun. Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dapat mengubah warna DPPH yang semula ungu menjadi berwarna kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).


43

Berdasarkan hasil uji kualitatif penangkapan radikal DPPH, tampak bahwa hasil pemisahan dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) merupakan fase gerak yang optimum karena terdapat 3 bercak berwarna kuning dimana salah satu bercak dengan Rf antara 0,70 - 0,76 merupakan bercak yang diperkirakan memiliki kemampuan terkuat dalam menangkap radikal DPPH. Bercak berwarna kuning tersebut juga tampak pada hasil pemisahan dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) sebanyak 1 bercak sedangkan pada pemisahan dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v) tidak tampak ada bercak kuning. Hal ini juga menjadi dasar pertimbangan dalam menentukan fase gerak optimum. Fase gerak etil asetat:asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) memisahkan senyawa yang bersifat polar yang ada pada ekstrak namun hanya terdapat satu bercak kuning pada Rf yang tinggi yang menandakan pemisahan yang terjadi kurang optimal. Isolasi senyawa – senyawa yang bersifat terlalu polar seperti ini akan sulit untuk dilakukan. Tidak adanya bercak kuning pada pemisahan dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v) kemungkinan disebabkan karena senyawa yang terelusi adalah senyawa - senyawa lipid dan klorofil. Beberapa hal tadi memperkuat bahwa fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) merupakan fase gerak optimum dalam penelitian.

F.

Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection

Uji kualitatif aktivitas UV protection pada ekstrak didahului dengan melakukan optimasi intensitas sinar UV. Tujuan dilakukan optimasi intensitas


44

sinar UV adalah untuk memudahkan pengamatan yang dilakukan oleh peneliti. Jarak lampu UV menuju pelat KLT merupakan variabel yang diubah-ubah sebab semakin dekat jarak lampu UV akan semakin kuat intensitas sinarnya sehingga akan merusak warna 𝛽-karoten dengan cepat dan merubah warnanya menjadi pudar.

7

nomor parameter

6 5 4 3

intensitas rendah 5, 89 Lux

2

intensitas sedang 15,01 Lux

1

intensitas tinggi 30,48 Lux

0 0

1

3

6

9

12

15

waktu (menit)

Gambar 7.

Optimasi intensitas sinar UV

Hasil optimasi menunjukkan bahwa jarak optimum yang diperoleh adalah 50 cm (intensitas sedang) dengan rata-rata intensitas sinarnya 15,01 Lux. Pada kondisi ini warna 𝛽-karoten tidak memudar terlalu lambat ataupun terlalu cepat seperti yang ditunjukkan pada hasil optimasi pada jarak 100 cm dan 35 cm. Kondisi optimum akan mempermudah peneliti melakukan pengamatan perubahan warna menggunakan parameter warna. Parameter warna (terlampir) dibuat dengan mempertimbangkan gradasi warna dari kuning oranye hingga memudar.


45

Parameter warna memiliki 8 skala (skala 0 - 7), dimana skala tertinggi merupakan warna kuning oranye yang paling pekat sedangkan skala terendah merupakan warna paling pudar. Setelah melakukan optimasi intensitas sinar UV maka dilanjutkan dengan uji kualitatif UV protection ekstrak. Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dan UV protection adalah senyawa yang mampu mempertahankan warna βkaroten lebih lama (Rochmaulana dan Wahyudi, 2009). Tujuan uji kualitatif UV protection adalah melakukan skrining hasil pemisahan senyawa pada ekstrak yang mampu

mempertahankan

warna

β-karoten

sehingga

dianggap

memiliki

kemampuan sebagai UV protector. Hasil uji kualitatif UV protection ekstrak dapat dilihat pada data dibawah ini.

(Keterangan : Tanda panah menunjukkan letak bercak yang berperan sebagai UV protector)

Gambar 8. Hasil uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak pada menit ke 15 (A = replikasi 1; B= replikasi 2; C= replikasi 3; D = replikasi 4; E= replikasi 5)


Tabel VIII.

Waktu (menit)

46

Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak

Warna latar pelat KLT Rep 1

Rep 2

Rep 3

Rep 4

Rep 5

Rata -rata

SD

0 0 0 0,4 5 0 0 0

0 1 3 6

6 2 1 0

6 2 1 1

6 2 1 1

6 2 1 1

6 2 1 1 (2)

6 2 1 0,8

9 12 15

0 0 0 (1)

0 (1) 0 (1) 0 (1)

0 (2) 0 (1) 0 (1)

0 (1) 0 (1) 0 (1)

0 (1) 0 (1) 0 (1)

0 0 0

Rf aktif

0,70 - 0,76 0,70 - 0,76 0,70 - 0,76 0,70 - 0,76

0,70 0,76

(Keterangan : Angka dalam tanda kurung menunjukkan warna Rf aktif UV protection sesuai parameter warna. Intensitas sinar UV yang digunakan adalah 15,615 Lux ).

Hasil yang diperoleh adalah ada satu bercak yang aktif dan dianggap memiliki aktivitas UV protection. Bercak yang dimaksud adalah bercak dengan Rf 0,70 - 0,76 karena mampu mempertahankan warna β-karoten lebih lama dengan warna latar yang memudar.


G.

47

Uji Kualitatif Aktivitas Antibakteri Metode Bioautografi

Tahap selanjutnya adalah dilakukan uji kualitatif antibakteri menggunakan metode bioautografi kontak. Prinsip metode ini adalah difusi senyawa dari pelat KLT menuju media agar yang telah diinokulasikan bakteri uji dimana hasil positif ditandai dengan zona hambat yang tampak lebih jernih dibanding daerah lain. Hasil uji kualitatif antibakteri menggunakan metode bioautografi kontak dapat dilihat pada data dibawah ini.

(Keterangan : Tanda panah menunjukkan zona penghambatan yang dihasilkan) Gambar 9.

Tabel IX.

Hasil uji bioautografi (A= bakteri E. coli; B= bakteri S. Aureus)

Hasil uji kualitatif aktivitas antibakteri dengan bakteri S. aureus

Mass Loading ekstrak 75 µg 100 µg

Hasil Zona hambat tidak tegas Muncul zona hambat

150 µg

Muncul zona hambat

Rf 0,35 - 0,40 0,60 - 0,65 0,70 - 0,76 0,35 - 0,40 0,60 - 0,65 0,70 - 0,76


Tabel X.

48

Hasil uji kualitatif aktivitas antibakteri dengan bakteri E. coli

Mass Loading ekstrak 75 µg 100 µg 150 µg

Hasil Tidak muncul zona hambat Tidak muncul zona hambat Tidak muncul zona hambat

Rf -

Pengujian dilakukan dengan menggunakan dua bakteri yaitu S. aureus dan E. coli. Tujuan menggunakan kedua bakteri tersebut adalah untuk melihat kemampuan senyawa kimia yang diuji terhadap bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Pengujian dilakukan menggunakan 3 mass loading yaitu 75 µg, 100 µg, dan 150 µg. Hasil menunjukkan bahwa ada aktivitas antibakteri pada bakteri S. aureus sedangkan pada bakteri E. coli tidak nampak ada aktivitas. Hal ini disebabkan karena struktur bakteri Gram negatif lebih sulit ditembus oleh senyawa kimia karena memiliki outer membran yang lebih tebal daripada bakteri Gram positif. Keuntungan menggunakan metode ini adalah dapat melakukan skrining senyawa kimia yang memiliki kemampuan antibakteri secara cepat, mudah, dan akurat. Kerugian metode ini adalah ada kemungkinan difusi senyawa menuju media agar kurang optimal karena adanya interaksi senyawa kimia dengan silika pada pelat KLT.


H.

49

Identifikasi Golongan Senyawa Ekstrak

Tahap selanjutnya dilakukan identifikasi senyawa menggunakan berbagai reagen semprot. Tujuan dari pengujian identifikasi golongan senyawa ekstrak adalah mengetahui golongan senyawa yang terdapat dalam hasil pemisahan ekstrak menggunakan beberapa reagen. Hasil identifikasi golongan senyawa ekstrak dapat dilihat pada data dibawah ini.

Gambar 10. Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada berbagai reagen semprot (A= alumunium chloride ; B= Dragendorff; C= ferric chloride ; D= Sitroborat ; E= Vanilin Sulfat)


50

Tabel XI. Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada berbagai reagen

Rf

Sitroborat

0,10 - 0,15 0,20 - 0,25 0,35 - 0,40

Berpendar (+) Berpendar (+)

0,45 - 0,55 0,60 - 0,65 0,70 - 0,76

0,76 - 0,80

Dragen dorff -

-

-

AlCl3

FeCl3

Vanilin Sulfat -

Interpretasi Hasil Flavonoid

Berpendar (++) Berpendar (+++)

-

Ungu (++)

-

-

Flavonoid dan terpenoid -

-

Bercak pada Rf 0,35 - 0,40 dan 0,70 - 0,76 berpendar biru kehijauan pada deteksi UV 366 nm setelah diuji dengan reagen alumunium chloride

dan

sitroborat. Dengan demikian bercak pada Rf tersebut terdapat senyawa golongan flavonoid. Reagen alumunium chloride dan sitroborat merupakan reagen yang memiliki mekanisme memperjelas warna bercak sehingga dapat dideteksi. alumunium

chloride

akan

membentuk

kompleks

senyawa

yang

dapat

berfluoresensi dengan flavonoid sehingga akan berpendar lebih terang pada deteksi dengan UV 366 nm. Bercak yang semula tidak tampak, akan menjadi lebih terlihat dengan adanya reaksi dengan alumunium chloride ini (Markham, 1988).


51

Gambar 11. Reaksi antara alumunium chloride dengan senyawa flavonoid membentuk kompleks senyawa yang berfluoresensi lebih terang (Jork, Funk, Fischer, dan Wimmer, 1990).

Bercak pada Rf 0,70 - 0,76 menunjukkan hasil positif bila diuji dengan reagen vanilin sulfat. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu yang menunjukkan adanya senyawa golongan terpenoid pada bercak tersebut. Fungsi pemanasan pada suhu 100ºC dan penambahan asam sulfat sebagai pelarut dari vanilin adalah untuk mempercepat reaksi yang terjadi. Warna ungu yang terbentuk pada penambahan reagen vanilin sulfat menunjukkan adanya senyawa terpenoid. Selain digunakan untuk mendeteksi terpenoid, reagen ini dapat digunakan untuk mendeteksi flavonoid, asam lemak, dan kardenolida aglikon (Jork, Funk, Fischer, dan Wimmer, 1990).

I.

Penghilangan Klorofil Ekstrak Bunga Kenanga dengan Karbon Aktif Adanya klorofil yang ikut terelusi pada hasil pemisahan senyawa dengan

fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ditunjukkan dengan adanya bercak


52

berpendar berwarna merah yang dideteksi pada UV 366 nm. Klorofil merupakan senyawa yang dapat menjadi pengotor saat proses isolasi serta senyawa yang akan menjadi pengganggu saat analisis uji aktivitas. Karena alasan tersebut maka dilakukan penghilangan klorofil menggunakan karbon aktif. Hasil penghilangan klorofil dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

Gambar 12. Hasil penghilangan klorofil dengan karbon aktif (A= deteksi pada UV 254 nm dan B= deteksi pada UV 366 nm)

Target isolasi adalah bercak dengan Rf 0,70 - 0,76 dan bercak ini tertutup oleh bercak klorofil yang terletak pada Rf yang sama. Klorofil merupakan senyawa yang berukuran lebih besar dibandingkan dengan metabolit-metabolit sekunder lain yang ada pada bahan alam. Karena ukurannya yang relatif besar maka dengan adanya karbon aktif, klorofil akan terikat dan akan mengendap bersama karbon aktif sehingga dapat dipisahkan dari metabolit sekunder yang akan dianalisis. Hasil pada gambar menunjukkan bahwa usaha penghilangan


53

klorofil dengan karbon aktif berjalan baik. Hal ini tampak pada intensitas warna merah yang berkurang saat hasil pemisahan dideteksi pada UV 366 nm.


J. Kromatografi Kolom

Ekstrak hasil pembersihan klorofil 0,3179 g

Kromatografi kolom : -

Optimasi fase gerak Kromatografi kolom step gradien

KLT hasil kromatografi kolom Isolat 1

Isolat 2

Isolat 3

0,021 g

0,0036 g

0,002 g

Uji aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri

Isolat aktif aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri

54


55

Sebelum melakukan isolasi senyawa menggunakan kromatografi kolom, terlebih dulu dilakukan optimasi fase gerak. Optimasi fase gerak dilakukan menggunakan 4 jenis fase gerak dimulai dari yang bersifat nonpolar hingga polar. 4 jenis fase gerak tersebut adalah n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v), n-heksana : kloroform (25 : 75 v/v), kloroform, dan kloroform : metanol (98 : 2 v/v). Tujuan dilakukan optimasi fase gerak adalah untuk mengetahui kisaran polaritas fase gerak yang akan digunakan untuk memulai tahapan kromatografi kolom. Hasil optimasi fase gerak untuk kromatografi kolom dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

Gambar 13. Hasil optimasi fase gerak kromatografi kolom gradien (A= deteksi pada UV 254 nm; B= deteksi pada UV 366 nm; 1 = n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v); 2 = n-heksana : kloroform (25 : 75 v/v); 3 = kloroform; 4 = kloroform : metanol (98 : 2 v/v))

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa semakin naik polaritas fase gerak maka Rf bercak yang terelusi akan semakin naik. Dengan fase gerak n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) dapat dilihat bahwa setidaknya ada 2 bercak yang mulai terelusi. Untuk memulai tahapan isolasi dengan kromatografi kolom, maka


56

peneliti menggunakan fase gerak n-heksana : kloroform (70 : 30 v/v) yang bersifat lebih nonpolar daripada fase gerak yang digunakan saat optimasi dengan harapan bahwa senyawa akan terelusi lebih bertahap sehingga akan membuat hasil kromatografi kolom lebih optimal. Tabel XII.

Optimasi fase gerak kromatografi kolom

Fase gerak n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) n-heksana : kloroform (25 : 75 v/v) kloroform kloroform : metanol (98 : 2 v/v)

Rf 0,10

UV 254 Meredam

UV 366 -

0,16 0,66

Meredam Meredam

-

0,23 0,70 0,44 0,74

Meredam Meredam Meredam Meredam

-

Berdasarkan panduan uji aktivitas yang telah dilakukan, diambil kesimpulan bahwa senyawa kimia pada bercak dengan Rf 0,70 - 0,76 merupakan target isolasi karena memiliki aktivitas penangkap radikal DPPH, UV protection, dan antibakteri. Selain itu bercak pada Rf ini terlihat lebih tebal daripada bercak yang lain yang artinya komponen senyawa yang terdapat pada bercak ini kelimpahannya paling tinggi dibandingkan komponen senyawa pada bercak yang lain.Isolasi dilakukan dengan teknik kromatografi kolom step gradien. Prinsip dari teknik ini adalah elusi senyawa pada kolom kromatografi dengan polaritas fase gerak yang ditingkatkan secara bertahap. Bila dibandingkan dengan bercak yang lain, bercak pada Rf 0,70 - 0,76 bersifat paling nonpolar dilihat dari nilai Rf yang dihasilkan. Proses isolasi dengan kromatografi kolom step gradien akan mudah dilakukan bila mengisolasi senyawa


57

yang sifatnya relatif nonpolar. Proses isolasi dilakukan menggunakan urutan fase gerak sebagai berikut: N-heksana : kloroform (70 : 30 v/v), n-heksana : kloroform (60 : 40 v/v), n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v), n-heksana : kloroform (40 : 60 v/v), kloroform, dan kloroform : metanol (90 : 10 v/v). Setiap komponen fase gerak yang digunakan untuk mengelusi ditambahkan sebanyak 5 mL. Setiap 2 mL hasil elusi kolom ditampung dalam tabung untuk selanjutnya dilakukan pengecekan dengan KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v).

Gambar 14. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) (A = deteksi pada UV 254 nm; B = deteksi pada UV 366 nm)

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa ada 10 bercak yang memiliki Rf pada rentang 0,70 - 0,76. Pemisahan pada Rf yang terlalu tinggi menyebabkan resolusi pemisahan kurang baik, maka dilakukan elusi untuk tabung pada nomor 1 sampai 9 menggunakan fase gerak n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) untuk


58

menurunkan nilai Rf yang dihasilkan. Tabung nomor 10 tidak diuji karena dekat dengan nomor tabung dimana klorofil mulai muncul dengan pekat. Klorofil mulai muncul kembali dengan pekat pada tabung nomor 11. Tampak pada gambar bahwa klorofil sudah bersih dari bercak yang merupakan target isolasi. Untuk pengecekan hasil kolom proses 2 dan proses 3 cara yang digunakan sama dengan cara tersebut. Karena target isolasi adalah bercak dengan Rf 0,70 - 0,76 maka pada proses 2 dan proses 3 yang dielusi ulang menggunakan fase gerak n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) adalah bercak yang memiliki Rf tersebut. Tabel XIII. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 dengan fase gerak nheksana : kloroform (50 : 50 v/v)

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Rf 0,75 0,62 0,75 0,62 0,62 0,42 0,42 0,37 0,34 0,31

Visual -

UV 254 Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam

UV 366 -


59

Tabel XIV. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 2 dengan fase gerak nheksana : kloroform (50 : 50 v/v)

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Rf 0,74 0,60 0,57 0,52 0,31 0,31

Visual -

UV 254 nm Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam

UV 366 nm -

Tabel XV. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 3 dengan fase gerak nheksana : kloroform (50 : 50 v/v)

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Rf 0,74 0,60 0,57 0,54 0,48 0,48 0,31 0,31 0,20

Visual -

UV 254 Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam Meredam

UV 366 -

Setelah dilakukan kromatografi kolom sebanyak 3 kali, dilakukan pengumpulan dan pemekatan isolat menggunakan tangas air. Bercak yang memiliki Rf yang mirip pada elusi dengan fase gerak n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) pada tiap proses dikumpulkan dan dipekatkan dan didapatkan 10 isolat yang mendekati murni secara KLT.


Tabel XVI.

60

Penggabungan isolat hasil kromatografi kolom

Isolat Proses 1 1 3, 4 5, 6 9 7 8 -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tabung Proses 2 1 3 4 5 10, 11 -

Proses 3 1 2 3 4 9, 10 5, 6 11

Rendemen (%) b/b 6,61 1,13 0,63 0,19 0,06 0,13 0,03 0,03 0,16 0,03

Berdasarkan hasil penimbangan, didapatkan 3 isolat yang diperkirakan merupakan major compound pada bercak dengan Rf 0,70 - 0,76. 3 isolat yang merupakan major compound adalah isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 yang memiliki jumlah rendemen yang relatif lebih banyak daripada isolat lain. Selanjutnya ketiga isolat inilah yang akan dilanjutkan dengan uji kualitatif penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. K.

Hasil Deteksi Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3

Pada tahap ini dilakukan deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV 366 nm. Tujuannya adalah untuk melihat karakteristik isolat yang didapatkan pada proses isolasi. Hasil deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 dapat dilihat pada gambar dibawah ini.


61

Gambar 15. Deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV 366 nm (A1= deteksi isolat 1 pada UV 254 nm; A2= deteksi isolat 1 pada UV 366 nm; B1= deteksi isolat 2 pada UV 254 nm; B2= deteksi isolat 2 pada UV 366 nm; C1= deteksi isolat 3 pada UV 254 nm; C2= deteksi isolat 3 pada UV 366 nm)

Tabel XVII. Hasil deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV 366 nm pada sistem fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Isolat Rf 1 0,70 - 0,76 2 3

0,70 - 0,76 0,70 - 0,76

Visual -

UV 254 nm Meredam

-

Meredam Meredam

UV 366 nm Biru menyala (++++) Biru menyala (+) -


L.

62

Hasil Uji Kualitatif Penangkapan Radikal Bebas DPPH Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3

Pada tahap ini dilakukan uji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH pada isolat 1, isolat 2, dan isolat 3, tujuannya adalah melihat kemampuan masing – masing isolat sebagai penangkap radikal bebas. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 dapat dilihat pada data dibawah ini.

Gambar 16. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal DPPH isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 (A = isolat 1; B = isolat 2; C = isolat 3; 1 = mass loading 10 µg; 2 = mass loading 20 µg; 3 = mass loading 30 µg)


63

Tabel XVIII. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH ekstrak, isolat 1, isolat 2, dan isolat 3

No

Sampel uji

Waktu muncul bercak

Rf

Warna bercak

1

Ekstrak 10 µg

>24 jam 65 menit 6 menit 36 detik

0,54 0,63 0,74

Kuning pudar (+) Kuning pudar (+) Kuning pekat (++++)

2

Isolat 1 10 µg 20 µg

5 menit 15 detik 180 menit 2 menit 15 detik 180 menit 2 menit 15 detik

0,73 0,62 0,74 0,62 0,74

Kuning pekat (++) Kuning pudar (+) Kuning pekat (++++) Kuning pudar (+) Kuning pekat (++++)

16 menit 15 detik 60 menit 14 menit 30 detik 60 menit 14 menit

0,74 0,63 0,74 0,63 0,74

Kuning pudar (+) Kuning pudar (+) Kuning pudar (++) Kuning pudar (+) Kuning pudar (++)

25 menit 30 detik 50 menit 16 menit 20 detik 50 menit 16 menit 20 detik

0,76 0,62 0,74 0,62 0,74

Kuning pudar (+) Kuning pudar (+) Kuning pudar (+) Kuning pudar (+) Kuning pudar (++)

30 µg 3

Isolat 2 10 µg 20 µg 30 µg

4

Isolat 3 10 µg 20 µg 30 µg

(Keterangan ketebalan bercak : + = tipis; ++ = sedang; +++ = tebal; ++++ = sangat tebal)

Uji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH dilakukan terhadap isolat 1, isolat 2, dan isolat 3. Dari hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa ketiga isolat memiliki kemampuan menangkap radikal bebas DPPH, namun dengan kemampuan yang berbeda. Kemampuan isolat dalam menangkap radikal bebas DPPH dapat dilihat dari pengamatan bercak pada Rf 0,70 - 0,76. Pada isolat 1 bercak kuning yang terbentuk lebih tebal dan muncul pada waktu yang lebih cepat daripada isolat 2 dan isolat 3. Bercak kuning pada isolat 2 muncul lebih cepat daripada bercak kuning pada isolat 3 dengan ketebalan bercak yang hampir sama.


64

Dapat disimpulkan bahwa urutan kemampuan penangkapan radikal bebas DPPH dari yang terkuat sampai terlemah adalah isolat 1, isolat 2, dan isolat 3. Isolat 1 memiliki kemampuan yang lebih baik dalam menangkap radikal bebas DPPH bila dibandingkan dengan ekstrak. Hal ini dapat dilihat dari tebal dan waktu muncul bercak kuning pada Rf 0,70 - 0,76. Namun bila diamati muncul bercak kuning selain bercak pada Rf 0,70 - 0,76 yaitu bercak pada Rf0,60 – 0,65. Hal ini menunjukkan bahwa isolat yang diuji masih belum murni.

M.

Uji Kualitatif UV Protection Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3

Tujuan dari tahap ini adalah untuk melihat kemampuan isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 sebagai UV protector. Prinsip pengujian yang dilakukan sama dengan uji kualitatif UV protection ekstrak. Hasil uji kualitatif UV protection isolat dapat dilihat pada data dibawah ini. Tabel XIX. Hasil uji kualitatif UV protection ekstrak, isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada menit ke 15 Sampel Uji

Rf

Mass Loading 10 (µg) 20 (µg) 30 (µg) Ekstrak Isolat 1 Isolat 2 0,70 - 0,76 Positif Positif Positif kuning no. 2 kuning no. 2 kuning no. 2 Isolat 3 0,70 - 0,76 Positif Positif Positif kuning no. 2 kuning no. 2 kuning no. 2 (Keterangan : Intensitas sinar UV yang digunakan adalah 13,775 Lux). Berdasarkan data uji kualitatif diatas, dapat disimpulkan bahwa yang memiliki aktivitas UV protection adalah isolat 2 dan isolat 3. Isolat 2 memiliki aktivitas yang sebanding dengan isolat 3. Hal ini dapat dilihat dari warna β


65

karoten yang mampu dipertahankan oleh isolat 2 dan isolat 3 pada Rf 0,70 - 0,76. Pada Rf tersebut isolat 2 dan isolat 3 mampu mempertahankan warna bercak agar tidak semakin memudar. Ekstrak yang digunakan sebagai pembanding tidak mampu berperan sebagai UV protection karena pada mass loading yang digunakan terlalu kecil bila dibandingkan mass loading saat uji kualitatif ekstrak.

Gambar 17. Hasil uji kualitatif UV protection isolat1, isolat 2, dan isolat 3 (A= isolat 1; B= isolat 2; C= isolat 3; 1= mass loading 10 µg; 2= mass loading 20 µg; 3= mass loading 30 µg )

N.

Uji Kualitatif Antibakteri Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3

Selanjutnya dilakukan uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat 1, isolat 2, dan isolat 3. Uji kualitatif dilakukan dengan metode disk diffusion menggunakan paper disc. Prinsip pengujian ini adalah difusi senyawa uji dari paper disc menuju media agar yang telah diinokulasikan bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan pada uji ini adalah S. aureus karena mempertimbangkan hasil uji bioautografi kontak. Pembanding yang digunakan adalah amoksisilin karena terbukti sudah memiliki aktivitas antibakteri dan sering digunakan di pasaran. Hasil uji kualitatif antibakteri isolat dapat dilihat pada data dibawah ini.


66

Tabel XX. Hasil uji kualitatif antibakteri amoksisilin, isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 terhadap bakteri S. Aureus

Sampel uji Amoksisilin

Isolat 1

Isolat 2

Isolat 3

Massa (µg) 5 7,5 10 50 100 200 50 100 200 50 100 200

Rata – rata diameter zona hambat (mm)± SD 30,7 ± 0,58 34,7 ± 0,58 37,0 ± 1,00 7,67 ± 0,58 8,33 ± 0,58 6,67 ± 0,58 7,00 ± 0 7,33 ± 0,58

(Keterangan: diameter paper disc 5 mm) Hasil menunjukkan bahwa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 memiliki aktivitas antibakteri yang sebanding. Pada isolat 1 terdapat aktivitas pada massa uji 100 µg namun pada massa uji 200 µg tidak terdapat aktivitas dimungkinkan adanya perbedaan ketebalan bakteri yang diinokulasikan pada media uji. Selain itu hasil yang negatif bisa pula disebabkan karena massa uji yang menempel pada petri steril saat dilakukan penguapan pelarut. Hal ini menyebabkan massa uji yang berdifusi menuju media agar sudah berkurang.

O.

Hasil Identifikasi Golongan Senyawa Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 Isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 diidentifikasi golongan senyawa

menggunakan berbagai reagen semprot. Reagen semprot yang digunakan meliputi alumunium chloride, Dragendorff, ferric chloride, dan vanilin sulfat. Hasil identifikasi golongan senyawa isolat dapat dilihat pada data dibawah ini.


Gambar 18. Hasil identifikasi isolat 1 pada berbagai reagen (A = alumunium chloride; B = Dragendorff; C = ferric chloride; D = vanilin sulfat)

Gambar 19. Hasil identifikasi isolat 2 pada berbagai reagen (A = alumunium chloride; B = Dragendorff; C = ferric chloride; D = vanilin sulfat)

67


68

Gambar 20. Hasil identifikasi isolat 3 pada berbagai reagen (A = alumunium chloride ; B = Dragendorff; C = ferric chloride; D = vanilin sulfat)

Tabel XXI. Hasil identifikasi golongan senyawa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada berbagai reagen

Isolat

Rf

1 2 3

0,70 - 0,76 0,70 - 0,76 0,70 - 0,76

AlCl3 Dragendorff -

-

FeCl3 -

Vanilin Sulfat Ungu Ungu Ungu

Interpretasi Hasil Terpenoid Terpenoid Terpenoid

Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 merupakan senyawa golongan terpenoid yang ditunjukkan dengan adanya bercak warna ungu pada Rf 0,70 - 0,76 setelah penambahan reagen vanilin sulfat.


Tabel XXII.

No. Sampel

1 2 3

Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3

69

Rangkuman hasil uji kualitatif isolat 1, isolat 2, dan isolat 3

Penangkapan radikal DPPH mass Hasil loading minimal Positif Positif Positif

10 10 10

UV protection

Antibakteri

Hasil

mass loading minimal

Hasil

Massa Minimal

Negatif Positif Positif

10 10

Positif Positif Positif

100 100 100

Berdasarkan rangkuman hasil uji kualitatif aktivitas terhadap isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 maka dapat diambil beberapa kesimpulan. Isolat 1 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH dan antibakteri. Isolat 2 dan isolat 3 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri


Tabel XXIII. Tabel rangkuman deteksi dan identifikasi isolat

Isolat

Rf

Visual

UV 254

UV 366

1

0,70 - 0,76

-

Meredam

2

0,70 - 0,76

-

Meredam

3

0,70 - 0,76

-

Meredam

Biru menyala (++++) Biru menyala (+) -

Alumunium Dragendorff chloride -

70

Ferric chloride -

Vanilin sulfat Ungu

Interpretasi hasil Terpenoid

-

-

-

Ungu

Terpenoid

-

-

-

Ungu

Terpenoid


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. 1.

Kesimpulan

Ada komponen senyawa dalam ekstrak bunga kenanga yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri.

2.

Isolat 1 memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas DPPH dan antibakteri. Isolat 2 dan isolat 3 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 merupakan senyawa golongan terpenoid. B.

Saran

Perlu dilakukan uji kuantitatif aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, uji SPF (Sun Protection Factor), dan uji kuantitatif aktivitas antibakteri terhadap isolat yang didapatkan. Selain itu isolat perlu dimurnikan lagi lalu dilakukan karakterisasi lebih lanjut.

71


72

DAFTAR PUSTAKA

Atun, S., 2010, Pemanfaatan Bahan Alam Bumi Indonesia Menuju Riset yang Berkualitas Internasional, Seminar Nasional Kimia 2010, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam UNY, Yogyakarta. Braithwaite, A., dan Smith, F.J., 1995, Chromatographic Methods. Kluwer Academic Publishers, London. Brokl, M., Fauconnier, M.L., Benini, C., Lognay, G., Jardin, P., dan Focant, J.F., 2013, Improvement of Ylang-Ylang Essential Oil Characterization by GCxGC-TOFMS, Molecules, 18, 1783-1797. Brooks, G.F., Butel, J.S., Carrol, K.C., and Morse, S.A., 2007, Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology, 24th ed., Mc Graw Hill, USA, hal. 224. Chooi, O.H., 2004, Tumbuhan Liar: Khasiat Ubatan dan Kegunaan Lain, Kuala Lumpur, hal. 102. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60 (4),405-412. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986, Sediaan Galenik, Jilid 2, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta, hal. 11-12. Duh, P., Y. Tu, dan G. Yen, 1999, Antioxidant Activity of Water Extract of Harng Iyur (Chrysanthemum morifolium Ramat), Lebensm Wiss U Technol, 32: 269-277. Ersam, T., 2004, Keunggulan Biodiversitas Hutan Tropika Indonesia dalam Merekayasa Model Molekul Alami, Seminar Nasional Kimia VI, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam ITS, Surabaya. Fitriyah, D., Jose, C., dan Saryono, 2013, Skrining Aktivitas Antimikroba dan Uji Fitokimia dari Kapang Endofitik Tanaman Dahlia (Dahlia variabilis), J. Ind.Che.Acta, 3 (2), 50-55. Gadri, A., Darijono, S.T., Mauludin, R., dan Iwo, M.I., 2012, Formulasi Sediaan Tabir Surya dengan Bahan Aktif Nanopartikel Cangkang Telur Ayam Broiler, Jurnal Matematika & Sains, 17 (3), 89-97. Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 353-363.


73

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., hal. 47-109, Penerbit ITB, Bandung. Hariana, A.H., 2008, Tumbuhan Obat & Khasiatnya, Penebar Swadaya, Depok, hal. 47. Heinrich, M., Barnes, J., Gibbons, S., Williamson, E.M., 2010, Farmakognosi dan Fitoterapi, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, hal. 185. Hembing, P., 2000, Tumbuhan Berkhasiat Obat Indonesia, PT Prestasi Insan Indonesia (PRESTASI), Jakarta, hal. 109. Indrakumar, I., Selvi, V., Gomathi, R., dan Karpagam, S., 2012, Evaluation of Antimicrobial Activity of Cananga odorata (LAM.) Hook. F. & Thomson Leaf Extract: an In Vitro Study, Mintage Journal of Pharmaceutical & Medical Sciences, 21-22. Jork, H., Funk, W., Fischer, W., dan Wimmer, H., 1990, Thin Layer Chromatography Reagent and Detection Methods, volume 1, VCH, New York, hal. 148, 440. Kim, D.K., Lee, K.W., Lee, H.J., dan Lee, C.Y., 2002, Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity (VCEAC) of Phenolic Phytochemicals, J. Agric. Food Chem, 50, 3713-3717. Kusumaningtyas, E., Astuti, E., dan Darmono, 2008, Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay Dalam Penentuan Senyawa Antikapang, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 6: 75-79. Lazo, C., 1999, Simulation of Liquid Chromatography and Simulated Moving Bed (SMB) Systems. Tesis, Technische Universität Hamburg-Harburg, Hamburg, 2. Lim, H.W., Draelos Z.D., (Eds.), 2009, Clinical Guide to Sunscreens and Photoprotection, Informa Healthcare, New York, hal. 5. Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, Penerbit ITB, Bandung, hal. 25. Marston, A., 2011, Thin Layer Chromatography With Biological Detection in Phytochemistry, Journal of Chromatography A, 1218, 2676–2683. Miguel, M.G., 2010, Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Essential Oils: a Short Review, Molecules, 9252-9287. Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., Vol. 26, No. 2, Mar.-Apr. 2004, 212-217.


74

Nugroho, A.E., 2012, Farmakologi Obat-obat Penting dalam Pembelajaran Ilmu Farmasi dan Dunia Kesehatan, Pustaka Utama, Yogyakarta, hal. 192193. Pelczar, M.J., dan Chan, E.C.S., 1988, Element of Microbiology, 2th ed., diterjemahkan oleh Hadietomo, R.S., Imas, T., dan Tjitrosomo, S.S., hal 456-537, Penerbit Universitas Indonesia Press, Jakarta Plant Resources of South-East Asia, 2015, Plant database: Cananga odorata (Lamk) Hook.f. & Thomson,\http://proseanet.org/prosea/eprosea_detail.php?frt=&id=654, diakses tanggal 2 April 2015. Rochmaulana, R.A., dan Wahyudi, A., 2009, Sintesis Senyawa Turunan Kurkumin dan Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Bleaching βKaroten, Prosiding Skripsi Semester Genap 2009/2010, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya. Sacher, R.A., dan McPherson R.A., Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium, EGC, Jakarta, hal. 415. Schwalbe R., Moore, L.S., dan Goodwin, A.C., 2007, Antimicrobial Susceptibility Testing Protocol, Eds., CRC Press, USA, hal. 144. Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa Kecambah dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia 2, 53-61. Tilaar, M., 1999, Kecantikan Perempuan Timur, Indonesia Tera, Magelang, hal. 120. Tranggono, I.R., dan Latifah, F., 2007, Buku Pegangan Ilmu Pengetahuan Kosmetik, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, hal. 6, 48, 117. Trifena. 2012. Analisis Uji In Vitro dan In Vivo Ekstrak Kombinasi Kulit Manggis (Garcinia mangostanaL.) dan Pegagan (Centella asiatica L.) Sebagai Krim Antioksidan, Tesis, 37-39, Program Studi Magister Herbal Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, Depok. United States Department of Agriculture NRCS, 2014, Plant database: IlangIlang, http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=CAOD, diakses tanggal 10 Februari 2014 Pukul 21:45. Wagner, H., dan Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, Springer, Munich, hal. 74, 92, 240, 258, 318. Wolf, J., 2012, Mikro-Dȕnnschicht-Chromatographie, Govi-Verlag, Berlin. Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami & Radikal Bebas, Kanisius, Yogyakarta, hal 78-80.


75

Youngson, R., 1998, Antioxidants: Vitamins C & E for Health, diterjemahkan oleh Susi Purwoko, hal. 20, Arcan, Jakarta.


LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi bunga kenanga (C. odorata)

76


Lampiran 2. Gambar sampel penelitian yang digunakan

a.

b.

Gambar bunga kenanga

Gambar simplisia bunga kenanga

77


Lampiran 3. Perhitungan rendemen ekstraksi Berat (g) Berat wadah 506,7 Berat wadah + ekstrak 1197,7 Berat ekstrak 691 Bobot simplisia yang digunakan = 1151,29 g Rendemen ekstraksi =

𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒔𝒊𝒎𝒑𝒍𝒊𝒔𝒊𝒂 𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒈𝒖𝒏𝒂𝒌𝒂𝒏 𝟔𝟗𝟏 𝒈

x 100%

= 𝟏𝟏𝟓𝟏,𝟐𝟗 𝒈 x 100% = 60,02 % b/b

78


Lampiran 4. kenanga a.

Perhitungan

Bobot cawan Replikasi 1 (g) 47,162 47,148 47,147

0 30 60

simplisia

bunga



Penimbangan susut pengeringan serbuk bunga kenanga (C. odorata) t (menit) 0 30 60 90 120 150 180

c.

pengeringan

Penimbangan bobot tetap cawan menggunakan oven bersuhu 105°C t (menit)

b.

susut

79

Replikasi 1 (g) 48,151 48,033 48,023 48,013 47,997 47,994 47,995

Replikasi 2 (g) 48,496 48,378 48,366 48,361 48,348 48,347 48,347

Perhitungan bobot tetap simplisia bunga kenanga

Replikasi 1 30 menit = 60 menit = 90 menit =

𝟏,𝟎𝟎𝟒−𝟎,𝟖𝟖𝟔

𝟏,𝟎𝟎𝟒−𝟎,𝟖𝟕𝟔 𝟏,𝟎𝟎𝟒 𝟏,𝟎𝟎𝟒−𝟎,𝟖𝟔𝟔

120 menit = 150 menit = 180 menit = Replikasi 2

𝟏,𝟎𝟎𝟒

𝟏,𝟎𝟎𝟒

x 100% = 11,75 %

x 100%= 12,75 % x 100% = 13,75 %

𝟏,𝟎𝟎𝟒−𝟎,𝟖𝟓𝟎 𝟏,𝟎𝟎𝟒 𝟏,𝟎𝟎𝟒−𝟎,𝟖𝟒𝟕 𝟏,𝟎𝟎𝟒 𝟏,𝟎𝟎𝟒−𝟎,𝟖𝟒𝟖 𝟏,𝟎𝟎𝟒

x 100% = 15,34 % x 100% = 15,64 % x 100% = 15,54 %

Replikasi 3 (g) 41,054 40,938 40,926 40,917 40,901 40,899 40,898


30 menit = 60 menit = 90 menit =

𝟎,𝟗𝟗𝟔−𝟎,𝟖𝟕𝟖 𝟎,𝟗𝟗𝟔

𝟎,𝟗𝟗𝟔−𝟎,𝟖𝟔𝟔 𝟎,𝟗𝟗𝟔 𝟎,𝟗𝟗𝟔−𝟎,𝟖𝟔𝟏 𝟎,𝟗𝟗𝟔

120 menit = 150 menit=

x 100% = 13,05 % x 100% = 13,55 %

𝟎,𝟗𝟗𝟔−𝟎,𝟖𝟒𝟖 𝟎,𝟗𝟗𝟔

𝟎,𝟗𝟗𝟔−𝟎,𝟖𝟒𝟕 𝟎,𝟗𝟗𝟔

180 menit =

x 100% = 11,85 %

x 100% = 14,86 %

x 100% = 14,96 %

𝟎,𝟗𝟗𝟔−𝟎,𝟖𝟒𝟕 𝟎,𝟗𝟗𝟔

x 100% = 14,96 %


𝟎,𝟗𝟗𝟒−𝟎,𝟖𝟕𝟖 𝟎,𝟗𝟗𝟒

𝟎,𝟗𝟗𝟒−𝟎,𝟖𝟔𝟔 𝟎,𝟗𝟗𝟒 𝟎,𝟗𝟗𝟒−𝟎,𝟖𝟓𝟕

120 menit=

𝟎,𝟗𝟗𝟒

180 menit=

x 100% = 12,88 % x 100% = 13, 78 %

𝟎,𝟗𝟗𝟒−𝟎,𝟖𝟒𝟏 𝟎,𝟗𝟗𝟒

150 menit =

x 100% = 11,67 %

x 100% = 15, 39 %

𝟎,𝟗𝟗𝟒−𝟎,𝟖𝟑𝟗 𝟎,𝟗𝟗𝟒

𝟎,𝟗𝟗𝟒−𝟎,𝟖𝟑𝟖 𝟎,𝟗𝟗𝟒

Kadar air simplisia =

x 100% = 15,59 %

x 100% = 15, 69 % 𝟏𝟓,𝟓𝟑𝟕 % +𝟏𝟒,𝟗𝟔 %+𝟏𝟓,𝟔𝟗𝟒 % 𝟑

= 15,40 % b/b

80


81

Lampiran 5. Perhitungan susut pengeringan ekstrak bunga kenanga a. Penimbangan bobot tetap cawan menggunakan oven bersuhu 105°C t (menit) 0 30 60




Bobot silika Replikasi 2 (g) 0,249 0,751 0,251 0,500


b. Penimbangan silika

Kertas Kertas + isi Kertas + sisa Isi c.


Penimbangan ekstrak bunga kenanga (C. odorata) Replikasi 1 (g) 0,494

d.

Replikasi 2 (g) 0,498

Replikasi 3 (g) 0,493

Penimbangan susut pengeringan ekstrak bunga kenanga (C. odorata) +

silika t (menit) 0 30 60 90 120 150 180 210

Replikasi 1 (g) 49,255 49,043 48,985 48,977 48,972 48,970 48,968 48,966

Replikasi 2 (g) 40,113 39,920 39,910 39,908 39,899 39,894 39,892 39,891

Replikasi 3 (g) 49,144 48,995 48,975 48,964 48,961 48,956 48,951 48,949


e.

Perhitungan bobot tetap ekstrak bunga kenanga


𝟎,𝟗𝟒𝟏−𝟎,𝟕𝟐𝟗 𝟎,𝟗𝟒𝟏

𝟎,𝟗𝟒𝟏−𝟎,𝟔𝟕𝟏 𝟎,𝟗𝟒𝟏 𝟎,𝟗𝟒𝟏−𝟎,𝟔𝟔𝟑 𝟎,𝟗𝟒𝟏

120 menit = 150 menit = 180 menit = 210 menit =

x 100% = 22,53 %

x 100%= 28,69 % x 100% = 29,54 %

𝟎,𝟗𝟒𝟏−𝟎,𝟔𝟓𝟖 𝟎,𝟗𝟒𝟏 𝟎,𝟗𝟒𝟏−𝟎,𝟔𝟓𝟔 𝟎,𝟗𝟒𝟏 𝟎,𝟗𝟒𝟏−𝟎,𝟔𝟓𝟒 𝟎,𝟗𝟒𝟏 𝟎,𝟗𝟒𝟏−𝟎,𝟔𝟓𝟐 𝟎,𝟗𝟒𝟏

x 100% = 30,07 % x 100% = 30,29 % x 100% = 30,50 % x 100% = 30,71 %

Replikasi 2 30 menit =

𝟎,𝟗𝟑𝟗 𝟎,𝟗𝟑𝟗−𝟎,𝟕𝟑𝟔

60 menit = 90 menit =

𝟎,𝟗𝟑𝟗−𝟎,𝟕𝟒𝟔

𝟎,𝟗𝟑𝟗 𝟎,𝟗𝟑𝟗−𝟎,𝟕𝟑𝟒 𝟎,𝟗𝟑𝟗 𝟎,𝟗𝟑𝟗−𝟎,𝟕𝟐𝟓

120 menit= 150 menit=

180 menit = 210 menit =

𝟎,𝟗𝟑𝟗

x 100% = 20,55 % x 100% = 21,62 %

x 100% = 21,83 % x 100% = 22,79 %

𝟎,𝟗𝟑𝟗−𝟎,𝟕𝟐𝟎 𝟎,𝟗𝟑𝟗

x 100% = 23,32 %

𝟎,𝟗𝟑𝟗−𝟎,𝟕𝟏𝟖 𝟎,𝟗𝟑𝟗 𝟎,𝟗𝟑𝟗−𝟎,𝟕𝟏𝟕 𝟎,𝟗𝟑𝟗

x 100% = 23,54 % x 100% = 23,64 %

82



𝟏,𝟎𝟎𝟏−𝟎,𝟕𝟒𝟔 𝟏,𝟎𝟎𝟏

𝟏,𝟎𝟎𝟏−𝟎,𝟖𝟑𝟐 𝟏,𝟎𝟎𝟏 𝟏,𝟎𝟎𝟏−𝟎,𝟖𝟐𝟔

120 menit=

𝟏,𝟎𝟎𝟏

180 menit= 210 menit=

x 100% = 16,88 % x 100% = 17,48 %

𝟏,𝟎𝟎𝟏−𝟎,𝟖𝟏𝟖 𝟏,𝟎𝟎𝟏

150 menit =

x 100% = 25 %

x 100% = 18,28 %

𝟏,𝟎𝟎𝟏−𝟎,𝟖𝟏𝟑 𝟏,𝟎𝟎𝟏

𝟏,𝟎𝟎𝟏−𝟎,808 𝟏,𝟎𝟎𝟏 𝟏,𝟎𝟎𝟏−𝟎,𝟖𝟎𝟔 𝟏,𝟎𝟎𝟏

Kadar air ekstrak =

x 100% = 18,78 %

x 100% = 19,28 % x 100% = 19,48 %

𝟑𝟎,𝟕𝟏𝟐 % +𝟐𝟑,𝟔𝟒𝟐 %+𝟏𝟗,𝟒𝟖𝟎 % 𝟑

= 24,61 % b/b

83


84

Lampiran 6. Penguapan air pada ekstrak bunga kenanga dengan perlakuan 1 kilogram batu gamping t (hari) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Bobot wadah + ekstrak (g) 1197,7 1145,5 1145,4 1145,3 1144,4 1143,7 1143,3 1141,9 1141,4 1140,9 1140,1 1139,4 1139,3 1132,7 1131,8

Berat wadah Berat wadah + ekstrak Berat ekstrak final

Berat (g) 506,7 1131,8 625,1


85

Lampiran7. Penimbangan ekstrak bunga kenanga untuk kromatografi lapis tipis (KLT)

Bobot ekstrak (g)

Optimasi fase gerak KLT 0,0054

Reagen semprot

Uji UV protection

Bioautografi (E. coli)

Bioautografi (S. aureus)

0,0053

0,0051

0,0054

0,0055


86

Lampiran 8. Gambar parameter warna yang digunakan dalam uji kualitatif UV protection


87

Lampiran 9. Optimasi intensitas sinar UV Intensitas Sinar

Waktu (menit)

Rendah (100 cm) Max: 5,97 Lux Min : 5,82 Lux Rata-rata : 5,895 Lux

0 1 3 6 9 12 15

Rep 1 7 5 3 3 2 2 2

Sedang (50 cm) Max: 3,4 Lux Min : 4,88 Lux Rata-rata : 3,01 Lux

0 1 3 6 9 12 15 0 1 3 6 9 12 15

6 3 2 2 2 1 1 6 2 1 0 0 0 0

Tinggi (35 cm) Max: 30,36 Lux Min : 30,0 Lux Rata-rata : 30,48 Lux

Warna pelat KLT Rep Rep Rep 2 3 4 6 6 6 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 6 2 2 1 1 1 1 6 2 1 0 0 0 0

6 2 2 2 1 1 1 6 1 1 0 0 0 0

6 3 2 1 1 1 1 6 2 1 0 0 0 0

SD Rep 5 6 2 3 2 2 1 1

Ratarata

0,45 1,10 0,55 0,45 0 0,45 0,55

6.2 3.2 2.6 2.2 2 1.8 1.4

6 2 2 2 1 1 1 6 1 1 0 0 0 0

0 0,55 0 0,55 0,45 0 0 0 0,55 0 0 0 0 0

6 2.4 2 1.6 1.2 1 1 6 1.6 1 0 0 0 0


Lampiran 10. Sertifikat hasil uji bakteri a.

Sertifikat hasil uji bakteri Escherichia coli ATCC 25922

88


b.

Sertifikat hasil uji bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923

89


Lampiran 11. bioautografi

90

Gambar kontrol uji kualitatif antibakteri pada metode

a. Gambar kontrol dalam uji kualitatif antibakteri pada bakteri S.aureus (A= kontrol media; B= kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus; C= kontrol positif)

b. Gambar kontrol dalam uji kualitatif antibakteri pada bakteri E.coli (A= kontrol media; B= kontrol pertumbuhan bakteri E.coli; C= kontrol positif)


Lampiran 12. a.

Data penimbangan pada tahap penghilangan klorofil

Penimbangan ekstrak bunga kenanga

Wadah Wadah + isi Isi b.

Berat (g) 61,9422 90,7055 28,7633

Penimbangan karbon aktif Berat (g) Wadah Wadah + isi Isi

c.

40,072 41,672 1,600

Penimbangan ekstrak hasil pemekatan

Wadah Wadah + isi Isi

Berat (g) 38,950 65,950 27

91


Lampiran 13. Gambar kolom kromatografi yang digunakan

92


Lampiran 14. Data penimbangan pada tahap kromatografi kolom a. Penimbangan ekstrak bunga kenanga Berat (g) Wadah

188,2100

Wadah + isi

188,5279

Isi

0,3179

b. Penimbangan silika untuk kromatografi kolom Berat (g) Wadah

55,021

Wadah + isi

55,321

Isi

0,300

93


94

Lampiran 15. Hasil Uji Kualitatif UV protection isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada menit ke 15 Mass loading sampel No

1.

Sampel

Ekstrak

Waktu (menit) 0 1 3 6 9 12 15

Warna latar pelat KLT 6 2 1 0 0 0 0

Hasil Faktor retardasi (Rf) 2.

3.

4.

Isolat 1

0 1 3 6 9 12 15

6 2 1 0 0 0 0

Hasil Faktor retardasi (Rf) Isolat 2 0 5 1 2 3 1 6 0 9 0 12 0 15 0 Hasil (Warna bercak aktif) Faktor retardasi (Rf) Isolat 3 0 5 1 1 3 1 6 0 9 0 12 0 15 0

10 µg -

20 µg -

30 µg -

Negatif -

Negatif -

Negatif -

-

-

-

Negatif + + + + + Positif (2) 0,76 + + + +

Negatif + + + + + Positif (2) 0,76 + + + +

Negatif + + + + + Positif (2) 0,76 + + + + +


Hasil (Warna bercak aktif) Faktor retardasi (Rf)

Positif (2) 0,75

Positif (2) 0,76

95

Positif (2) 0,75


96

Lampiran 16. Kontrol kontaminasi media dan kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus pada metode disk diffusion


97

Lampiran 17. Gambar uji kualitatif antibakteri pada metode disc diffusion dengan bakteri S. aureus a. Gambar kontrol amoksisilin (A= massa uji 5 µg; B= massa uji 7,5 µg; C= massa uji 10 µg)

b. Gambar uji kualitatif isolat 1(A= massa uji 50 µg; B= massa uji 100 µg; C= massa uji 200 µg)


98

c. Gambar uji kualitatif isolat 2(A= massa uji 50 µg; B= massa uji 100 µg; C= massa uji 200 µg)

d. Gambar uji kualitatif isolat 3(A= massa uji 50 µg; B= massa uji 100 µg; C= massa uji 200 µg)


Lampiran 18. Penimbangan isolat hasil kromatografi kolom a.

Penimbangan isolat 1 Berat (g) Flakon

18,5485

Flakon + isi

18,5695

Isi

0,021 𝟎,𝟎𝟐𝟏

Rendemen isolat 1 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 6,61 % b/b b.


18,0361

Flakon + isi

18,0397

Isi

0,0036 𝟎,𝟎𝟎𝟑𝟔

Rendemen isolat 2 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 1,13 % b/b c.


18,0581

Flakon + isi

18,0601

Isi

0,002 𝟎,𝟎𝟎𝟐

Rendemen isolat 3 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 0,63 % b/b

99


d.


15,1603

Flakon + isi

15,1609

Isi

0,0006 𝟎,𝟎𝟎𝟎𝟔

Rendemen isolat 4 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 0,19 % b/b e.


11,0735

Flakon + isi

11,0737

Isi

0,0002 𝟎,𝟎𝟎𝟎𝟐

Rendemen isolat5 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 0,06 % b/b f.


10,9426

Flakon + isi

10,9430

Isi

0,0004 𝟎,𝟎𝟎𝟎𝟒

Rendemen isolat6 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 0,13 % b/b

100


g.


10,9568

Flakon + isi

10,9569

Isi

0,0001 𝟎,𝟎𝟎𝟎𝟏

Rendemen isolat7 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 0,03 % b/b h.


12,3684

Flakon + isi

12,3685

Isi

0,0001 𝟎,𝟎𝟎𝟎𝟏

Rendemen isolat8 = 𝟎,𝟑𝟏𝟕𝟗x 100% = 0,03 % b/b i.


12,2387

Flakon + isi

12,2392

Isi

0,0005 𝟎,𝟎𝟎𝟎𝟓


101


j.


8,1996

Flakon + isi

8,1997

Isi

0,0001 𝟎,𝟎𝟎𝟎𝟏


102


103

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas DPPH, UV protection, dan Antibakteri Ekstrak Bunga Kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms” memiliki nama lengkap Surya Adhi Nugraha lahir di Yogyakarta, 3 September 1993 dari pasangan A. Budi Sugiharjo dan F. Any Hartati. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Mutiara Persada pada tahun 1997 hingga 1999. Penulis melanjutkan pendidikan dasar di SD Tarakanita Bumijo pada tahun 1999 hingga 2005, kemudian penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMP Stella Duce 1 pada tahun 2005 hingga 2008 dan SMA Kolese De Britto Yogyakarta pada tahun 2008 hingga 2011. Penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011 hingga 2015. Selama menjadi mahasiswa Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain: sebagai peserta Program Kreativitas Mahasiswa Kewirausausahaan (PKM-K) lolos didanai Hibah Direktorat Pendidikan Tinggi (Dikti) dengan judul “Mollusca Crispy Sebagai Camilan Sumber Protein dan Peningkatan Kesehatan Otak” (2014), panitia Donor Darah Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (2011), Divisi Keuangan ISMAFARSI JOGLOSEPUR (2012-2014), panitia Titrasi (2012), panitia Paingan Festival (2012), Kaderisasi Kepengurusan ISMAFARSI Komisariat Sanata Dharma (2012/2013), Ketua Latihan Kepemimpinan Tingkat I Fakultas Farmasi USD (2013), Ketua Umum Titrasi (2013); dan Asisten Praktikum Farmakognosi Fitokimia (2014).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents