PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL MENGGUNAKAN DEOKSIRIBOSA DAN PENENTUAN KADAR FLAVONOID TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT BUAH KETAPANG (Terminalia catappa L.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Diajukan oleh : Yovita Dwi Arini NIM : 038114128

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

\

i


PersetujuanSkripsi

UJI AKTIVITAS AF{TIOKSIDAF{ DENGAI{ METODE SPEKTROFOTOMETRI WSIBEL MENGGT]NAKAIYDEOKSIRIBOSA DAN PEIIENTUAII KADAR F'LAVONOID TOTAL F'RAKSI ETIL ASETAT BUAH KETAPANG (TerminaliacatappaL)

Disusunoleh: YovitaDwi arini NIM:038114128

Telahdisetujuioleh

Pembimbing Utama

Dr. C.J.Soegihardjo, Apt. Tanggal: 7O Z@B fanuor\ U

11

,)


PengesahanSkripsi

UJI AKTIYITAS ANTIOKSIDAN Df,NGAI{ METODE SPEKTROFOTOMETRI WSIBEL MENGGT]NAKAN DEOKSIRIBOSA DAN PEIIENTUAN KADAR FLAVONOID TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT BUAH KETAPAI\EC (Terminalia catappaL)

""",,111,,*',

NIM:038114128

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas SanataDharma padatanggal: 25 Januari 2008

Mengetahui, Fakultas Farmasi

.&g",J,nu PembimbingUtama: Dr. C.J.Soegihardjo, Apt.

PanitiaPenguji : 1. Dr. C.J.Soegihardjo, Apt.

2. Drs. Sulasmono, Apt.

3. Ema Tri Wulandari,M.Si., Apt. .\ \

\ /...

/

111


\

iv


LEMBAR PERI{YATAA 1N PIRSSTUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAFIAIftI}EMTS Yary bertandatangandi bawahini, sayamahasiswa UniversitasSanaaDharma: Nmra

: YovitaDwi Arini

Homorlvlahasiswa : 038114128 Demi pengembangan iknu pengetahuan, sayameurberil€nkepadaPerpusbkaan UniversitasSanataDbamn karyaikniahsayaymg berjudul: AF{TIOKSIDAN DSNGAIIi METODE "UJT AKTIVITAS STEKTROFOTOMETRI WSISEL MENGCT}NAKAITII'EOKSIRIB$SA DA}T PENENTUAN KANDTJNGANF'LAVONOID TOTAL FRAI{SI ETIL ASITAT BUAH KETAPANG {TerminaliaeunppaL}! be$saaperangkatyangdiperlukan(bila ada).Dengandemikim sayamernberikan k€padaPerpustakaan UniversitasSanataDhama hak untuk meryinrpan,mengalit*an dalambert* medialain, mengelolanya dalambsrtuk pffigtielafldst4 mendi$ribusikansecaraterbatas,danmerrpublikasika*ryadi Internetdau media lais untuk kepentinganakademistanpaperlu memintaijin dari sayarnaupul memb€nkanroyalti ke,padasayaselamatetapmencantumkmtramasaya#gai penulis.Demikiarpemyataan ini yangsayabuatde,ngan sebewnya. Dibuatdi Yogyakara Padatanggal: 30 Januari2008 Ymgmenyatakan

l


PRAKATA Puji dan Syukur Penulis panjatkan kepada Allah Bapa yang senantiasa mendampingi,

membimbing,

memberikan

berkat,

anugerah,

kasih

dan

pertolonganNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi

dengan

judul

Uji

Aktivitas

Antioksidan

Dengan

Metode

Spektrofotometri Visibel Menggunakan Deoksiribosa Dan Penentuan Kadar Flavonoid Total Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang (Terminalia catappa L.) disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Bapak Dr. C.J. Soegihardjo, Apt selaku Dosen Pembimbing yang dengan sabar telah bersedia membimbing, mengoreksi, memberi masukan, bantuan dan saran mulai dari awal persiapan hingga akhir penyusunan skripsi ini. Bahan-bahan yang bapak berikan sungguh berguna. 3. Bapak Drs. Sulasmono, Apt., selaku Dosen Penguji yang bersedia berdiskusi, menguji, memberikan saran, kritik selama penyusunan skripsi. 4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang bersedia berdiskusi,

menguji,

memberikan

saran,

masukan,

penyusunan skripsi. Terima kasih untuk kesabarannya.

\

v

kritik

selama


5. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah mendukung, memotivasi, membantu dan memberikan pengarahan selama kuliah. 6. Seluruh staf pengajar dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Terima kasih atas pengalaman, ilmu, dan pengetahuannya. 7. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Sarwanto, Mas Kunto, Mas Parlan, terima kasih atas kerja sama, bantuan, dan pendampingan selama penulis “ngelab” di lantai tiga dan empat. Untuk Mas Andri, Mas Heru, Mas Parjiman, Mas Kayat, Mas Yuwono, Pak Musrifin, Pak Iswandi dan Mas Ottok, terima kasih atas peminjaman alat, kerja sama dan sapa ramahnya. 8. My sisters and brothers yang selalu menanyakan ’kapan selesai, kapan wisuda?’, yang merupakan motivator untuk maju dan terus berusaha. 9. Teman-teman seperjalan hidup empat tahun ini, yanti ’nduke’, rachel ’ndut’, nopha ’nyet2’, tatik ’item’, mbak dias, mbak pepi, mbak sisca, mbak estri, rita, tutu, vira. Cerita, tawa, kebersamaan dan kekompakan yang akan selalu kurindukan. 10. Kelas C angkatan 2003 (kami menyebutnya Che_mistry), rasanya tak habis-habis aku bercerita tentang semua yang kita lakukan empat tahun ini. Canda, cerita, tugas, praktikum, ”dolan”, dan lainnya, pasti akan buat aku kangen. Terima kasih buat persahabatan, kebersamaan, perhatian, doa, semangat, kekompakkan dan kegilaannya. Tetap jadi sahabatku.

\

vi


11. Anggara Eka Nugraha, yang selalu memberi motivasi, bantuan, kritik, saran, semangat ketika penulis sedang putus asa. Terima kasih buat sayang, perhatian, doa, waktu, dukungan, dan pendampingannya serta karya-karyanya yang sungguh ’cantik’. 12. Adik-adik angkatan baik yang menemani penulis saat ”ngelab”, sehingga suasana di laboratorium lebih hidup dan ramai maupun yang selalu menyapa penulis sehingga penulis termotivasi dan bersemangat kembali. 13. Mas Prasojo, yang mau memberikan ilmu tentang mekanisme reaksi dan mas Ardian yang membantu memastikan metode yang digunakan. 14. Pak Yahya di UGM yang memberi ijin dan bersedia memetik ketapang untuk penulis. Serta untuk semua pribadi yang membantu penulis dalam banyak hal untuk menyelesaikan skripsi ini, dan terima kasih untuk semuanya. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari berbagai pihak. Akhirnya besar harapan penulis semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu farmasi Yogyakarta, Januari 2008

Yovita Dwi Arini

\

vii


PERNYATAAT{KEASLIAN KARYA

Sayamenyatakan dengnnsesungguhnya bahwaslsip$iya$gsayatulis ini lffiya dau bagiankar,,aoranglain, kwuali yaogtelah disejbutkffi tidak menouat layaknyakaryailmiah. datronkutipm dm daftarpustaka,sebagaimma

Yoryakarh,Januari2008

Ylll


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL........................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... iv PRAKATA....................................................................................................... v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... viii DAFTAR ISI.................................................................................................... ix DAFTAR TABEL............................................................................................ xii DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvi INTISARI......................................................................................................... xvii ABSTRACT....................................................................................................... xviii BAB I. PENGANTAR ..................................................................................... 1 A. Latar Belakang ............................................................................................ 1 B. Permasalahan............................................................................................... 4 C. Manfaat Penelitian....................................................................................... 4 D. Keaslian Penelitian...................................................................................... 5 E. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 5 BAB II. PENELAHAAN PUSTAKA.............................................................. 6 A. Tanaman Ketapang..................................................................................... 6

\

ix


1. Nama tanaman ....................................................................................... 6 2. Sistematika tanaman .............................................................................. 7 3. Kandungan kimia .................................................................................. 7 4. Kegunaan dan khasiat ........................................................................... 7 B. Flavonoid..................................................................................................... 8 1. Kerangka dasar dan pengertian flavonoid ............................................. 8 2. Penyebaran flavonoid ............................................................................ 9 3. Penggolongan dan sifat flavonoid ........................................................ 10 4. Penyarian flavonoid .............................................................................. 12 5. Deteksi dan identifikasi flavonoid ........................................................ 16 6. Kegunaan flavonoid .............................................................................. 16 C. Antioksidan ................................................................................................ 16 1. Radikal bebas ........................................................................................ 16 2. Definisi dan aktivitas antioksidan ......................................................... 18 3. Penggolongan antioksidan .................................................................... 18 4. Metode pengujian daya antioksidan ...................................................... 22 D. Deoksiribosa ............................................................................................... 24 E. Metode Penyarian ....................................................................................... 26 F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................................ 29 G. Spektrofotometri UV-Vis ........................................................................... 32 H. Keterangan Empirik ................................................................................... 38 H. Keterangan Empirik Yang Diharapkan ....................................................... 39

\

x


BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ................................................. ..... 40 A. Jenis dan Rancangan Penelitian …………………………………….. ...... 40 B. Variabel - Variabel Penelitian …………………………………………40 1. Variabel bebas........................................................................................ 40 2. Variabel tergantung ............................................................................... 40 3. Variabel pengacau ................................................................................. 40 C. Definisi Operasional …………………………………………………... 41 1. Uji aktivitas antioksidan ........................................................................ 41 2. Fraksi etil asetat ..................................................................................... 41 3. Kadar senyawa flavonoid total .............................................................. 41 4. buah ketapang ........................................................................................ 41 D. Bahan Penelitian ......................................................................................... 42 E. Alat Penelitian ............................................................................................ 42 F. Tata Cara Penelitian .................................................................................... 43 1. Determinasi tanaman............................................................................ 43 2. Pengumpulan bahan ............................................................................ 43 3. Pembuatan ekstrak etanol buah ketapang ........................................... 43 4. Pembuatan fraksi etil asetat buah ketapang ........................................ 44 5. Uji kualitatif kandungan flavonoid dengan metode KLT .................... 44 6. Pembuatan buffer fosfat ...................................................................... 44 7. Pembuatan pereaksi ............................................................................. 45 8. Optimasi metode ................................................................................. 47

\

xi


9. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang ........................................................................... 48 10. Penentuan kadar flavonoid total .......................................................... 49 G. Analisis Hasil ............................................................................................. 50 BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ............................... 51 A. Hasil Determinasi Tanaman

.............................................................. 51

B. Hasil Pengumpulan Bahan ........................................................................ 51 C. Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Ketapang................................................ 52 D. Hasil Pembuatan Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang.................................. 57 E. Hasil Uji Kualitaif Flavonoid dengan metode KLT .................................. 58 F. Optimasi Metode ....................................................................................... 61 1. Penentuan waktu operasi ..................................................................... 61 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ............................ 66 G. Hasil Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa .............................................................................................. 68 H. Penentuan Kadar Senyawa Flavonoid Total ............................................. 74 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 79 A. Kesimpulan ............................................................................................... 79 B. Saran .......................................................................................................... 79 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 80 LAMPIRAN..................................................................................................... 85 BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………… .... 101

\

xii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Warna bercak beberapa flavonoid setelah disemprot dengan pereaksi besi (III) klorida .............................................................. 13 Tabel II.

Penafsiran warna bercak dari segi struktur flavonoid .................... 15

Tabel III. Beberapa macam ROS dan antioksidan yang menetralkan............ 17 Tabel IV. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat buah ketapang dengan berbagai konsentrasi........................ 69 Tabel V.

Persen scavenging fraksi etil asetat buah ketapang ....................... 71

Tabel VI. Kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan dengan aluminium klorida dalam suasana basa ......................................... 76 Tabel VII. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat dihitung sebagai %b/b ekivalen kuersetin .......................................................................... 77

\

xiii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Kerangka dasar flavonoid .......................................................... 9

Gambar 2.

Kerangka tipe-tipe flavonoid ...................................................... 11

Gambar 3.

Pembentukan struktur kuinoid flavonoid karena uap ammonia . 13

Gambar 4.

Reaksi pembentukan kompleks flavonoid (flavon, 5-OH flavon, flavonol) dengan pereaksi aluminium klorida ................ 14

Gambar 5.

Senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan ............ 21

Gambar 6.

Struktur kimia beberapa antioksidan sintetik ............................. 21

Gambar 7.

Struktur deoksiribosa ................................................................. 24

Gambar 8.

Tingkat energi elektronik ............................................................ 34

Gambar 9.

Struktur rutin ............................................................................... 58

Ganbar 10. Kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: butanol-asam asetat-air (4:1:5) v/v, deteksi: uap amonia ................................................. 59 Gambar 11. Kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetatair (4:1:5) v/v, deteksi: pereaksi semprot besi (III) klorida ...... 60 Gambar 12. Kurva

hubungan

waktu

(menit)

dengan

absorbansi

kromogen MDA-TBA................................................................. 62 Gambar 13. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA ................................ 63 Gambar 14. Reaksi pembentukan MDA ......................................................... 64 Gambar 15. Mekanisme reaksi pembentukan MDA-TBA ............................. 65

\

xiv


Gambar 16. Struktur kromogen MDA-TBA .................................................. 66 Gambar 17. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA................................................................. 67 Gambar 18. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang dengan absorbansi kromogen MDA-TBA 70 Gambar 19. Kurva hubungan kenaikan konsentrasi fraksi etil asetat dengan % Scavenging ............................................................................. 71 Gambar 20. Mekanisme penangkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dan efek resonansi yang terjadi pada flavonoid................................. 73 Gambar 21. Reaksi kopling radikal fenoksil.................................................... 74 Gambar 22. Reaksi yang terjadi dalam penetapan kadar flavonoid ............... 75 Gambar 23. Kurva kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan dengan aluminium klorida dalam suasana basa .......................... 76 Gambar 23. Pohon ketapang ........................................................................... 94 Gambar 24. Buah ketapang ............................................................................. 94 Gambar 25. Daun ketapang ............................................................................. 94 Gambar 26. Bunga ketapang ........................................................................... 94 Gambar 27. Ekstrak kental buah ketapang ...................................................... 95 Gambar 29. Fraksi etil asetat buah ketapang .................................................. 95 Gambar 30. Perkolator ..................................................................................... 95

\

xv


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Tabel nilai koefisien korelasi (r) ................................................. 85 Lampiran 2. Perhitungan rendemen ................................................................ 85 Lampiran 3. Gambar kromatogram uji kualitatif flavonoid............................. 86 Lampiran 4. Contoh perhitungan % scavenging fraksi etil asetat buah ketapang ...................................................................................... 86 Lampiran 5. Perhitungan nilai ES50 fraksi etil asetat ...................................... 87 Lampiran 6. Contoh perhitungan kadar flavonoid fraksi etil asetat ................ 87 Lampiran 7.Perhitungan A (1%, 1 cm) ............................................................ 88 Lampiran 8. Foto-foto ...................................................................................... 94 Lampiran 9. Surat determinasi ......................................................................... 96 Lampiran 10. Sertifikat analisis deoksiribosa .................................................. 97 Lampiran 11. Sertifikat analisis rutin............................................................... 98 Lampiran 12. Sertifikat analisis kuersetin........................................................ 99 Lampiran 13. Asam urat sebagai antioksidan .................................................. 100

\

xvi


INTISARI Antioksidan adalah senyawa yang menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh, akibatnya kerusakan sel dan jaringan dapat dicegah. Ketapang merupakan salah satu tanaman, dimana buahnya memiliki kadar senyawa fenolik dan flavonoid yang digunakan untuk obat sakit kepala, pencahar, rematik, dan lepra. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat buah ketapang serta menentukan kadar flavonoid total. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan dalam persen penangkapan (% scavenging) dan nilai penangkapan efektif (effective scavenging) radikal hidroksil sebesar 50% (ES50). Metode penangkapan radikal hidroksil yang digunakan adalah metode spektrofotometri visibel menggunakan deoksiribosa. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil, membentuk malondialdehid (MDA) dalam suasana asam dan adanya asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen MDA-TBA berwarna merah muda yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 532 nm. Data kromatografi berupa hRf dan warna bercak sebelum dan sesudah ditambah pereaksi (uap amonia dan besi (III) klorida), diamati dengan sinar tampak maupun dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm. Kadar flavonoid total dihitung menggunakan persamaan regresi linear kurva baku kuersetin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat buah ketapang memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil dengan ES50 sebesar 69,39µg/mL. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang adalah 3,302 %b/b ekivalen kuersetin. Kata kunci : buah ketapang (Terminalia catappa L.), fraksi etil asetat, flavonoid total, antioksidan, metode deoksiribosa

\

xvii


ABSTRACT Antioxidant is a compound which habbits free radical reaction inside the body, so it prevents body cells and tissues damage. Ketapang is one of plants, which its fruit contents phenolic and flavonoid compounds, used for treating headache, laksantia, gout, and leprosy. This research aimed to find out the antioxidant activity of the ethyl acetate fraction of ketapang fruit, and also to determine the total consentrations of flavonoid. The activity value of hydroxyl radical scavenging activity is state in percent (%) scavenging and hydroxyl radical effective scavenging value is in 50% (ES50). The hydroxyl radical scavenging method that is spectrophotometry visible method used deoxyribose. The principle of this method is the deoxyribose degradation by the hydroxyl radical, forms the malondialdehyde (MDA) in acid condition, and also by the existence of thiobarbituric acid (TBA) produces the pink chromogent which has 532 nm for the length of the maximum wave, after the absorbance is measured. The chromatography data is the form of hRf and spots colour on before and after being added with reagent (ammonia vapor and iron (III) chloride), is being observed by the normal beam or even UV lights on 254 nm and 366 nm. The total contents of flavonoid is analyzed using the regretion linear equation quercetin. The result of the research indicates that the ethyl acetate fraction of ketapang fruit has 93.39 % μg/ml for ES50 the activity of hydroxyl radical scavenging. The total flavonoid consentrations of ethyl acetate fraction from ketapang fruit is 3.302 % b/b equivalent quercetin. Key words : ketapang fruit (Terminalia catappa L.), ethyl acetate fraction, total flavonoid, antioxidant, deoxyribose method

\

xviii


1

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Oksigen merupakan atom yang sangat reaktif dan dapat berubah menjadi suatu molekul perusak yang sering disebut ‘radikal bebas’. Radikal bebas dapat menyerang sel-sel tubuh yang sehat dan menyebabkan sel-sel tersebut kehilangan fungsi dan strukturnya. Radikal bebas yang sangat reaktif ini akan mencuri (menangkap atau mengambil) elektron dari senyawa lain seperti protein, lipid dan DNA untuk menetralkan diri. Radikal bebas yang masuk dalam tubuh akan menyerang selaput lipid yang melindungi sel, kemudian merusak protein, enzim dan inti sel dimana DNA dibentuk (Kumalaningsih, 2007). Kerusakan sel yang disebabkan radikal bebas menjadi kontributor utama dalam penuaan dan penyakit degeneratif seperti kanker, penyakit kardiovaskular, katarak, penurunan sistem imun dan kerusakan otak (Percival, 1998). Reactive Oxygen Species (ROS) merupakan bentuk yang terdiri dari radikal yang sangat reaktif, molekulnya mengandung oksigen dan merupakan radikal bebas yang umum dihasilkan dalam sistem biologi. ROS juga dapat dihasilkan oleh sumber eksogen seperti komponen makanan dan radiasi ultraviolet. Beberapa macam ROS: radikal superoksid (O2•-), anion peroksid (HOO-), radikal hidroksil (•OH), radikal peroksil (ROO•), radikal peroksinitrit (O=NOO•-), radikal oksida nitrit (NO•), oksigen singlet (O•), radikal hipoklorid (ClO4-), peroksida nitrit (Percival, 1998). Diantara ROS yang telah disebutkan, yang paling reaktif adalah radikal hidroksil (Halliwell and Gutteridge, 1999).

1


2

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat reaksi berantai radikal bebas dalam tubuh manusia dan dapat memberikan elektronnya kepada molekul radikal bebas tanpa terganggu fungsinya (Kumalaningsih, 2007). Antioksidan merupakan first line dalam pertahanan terhadap kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas karena berfungsi menstabilkan atau mendeaktivasi radikal bebas sebelum menyerang sel (Percival, 1998). Ketapang merupakan tanaman pelindung yang biasa ditanam di daerah pantai sebagai peneduh, memperindah pantai dan produsen edible nuts (kacangkacangan), karena bijinya dapat dimakan. Banyak tumbuh didaerah tropis dan subtropis. Mudah beradaptasi dengan tanah tempat tumbuh dan kadar garam, cepat tumbuh dan perawatannya minimal sehingga mudah dibudidayakan (Thomson, 2006). Ketapang merupakan tanaman yang memiliki kandungan fenolik, yaitu tanin dan flavonoid. Buahnya digunakan untuk obat sakit kepala, leprosy (lepra), rematik, mual saat perjalanan, laksantia (pencahar) (Anonim, 2006a). Daun tanaman ketapang memiliki kegunaan sebagai antikanker dan antioksidan sebaik sifat anticlastogenic (pencegah pemutusan ikatan) (Anonim, 2006b). Dalam beberapa penelitian buah ketapang mempunyai efek sebagai anti HIV, anti asmathik, anti katarak, antidiabetik, xanthin oxidase inhibitor, aldose reductase inhibitor. Kombinasi dari daun dan batang tanaman ketapang memiliki aktivitas antikanker-antioksidan (Nagappa, Thakurdesai, Venkat Rao, Singh, 2006). Kemungkinan dalam buah ketapang memiliki aktivitas yang sama atau mirip dengan daun yang merupakan bagian tanaman ketapang yang lain.


3

Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi yang tidak tersubstitusi atau suatu gula. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, etil asetat, dimetilsulfoksida, dimetilformamid, dan air (Markham, 1988). Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Beberapa tahun belakangan ini diteliti kemampuan flavonoid sebagai antioksidan untuk merubah atau mereduksi radikal bebas dan juga sebagai antiradikal bebas (Giorgio, 2000). Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan untuk digunakan dalam proses pemurnian (Robinson, 1995). Glikosida dan beberapa aglikon flavonoid larut dalam etil asetat (Mabry, Markham, and Thomas, 1970). Aktivitas antioksidan daun ketapang dalam fraksi etil asetat lebih tinggi dibandingkan pentana atau diklorometana (Chyau, Tsai, Ko, and Mau, 2002). Dalam penelitian tentang antioksidan herba ketul (Bidens pilosa L.), didapatkan fraksi etil asetat memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang paling tinggi dibandingkan rutin, fraksi klorofom dan ekstrak metanoliknya (Nusarini, 2007; Wiyatsih, 2007). Metode pengujian yang dipilih adalah metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan deoksiribosa sebagai model biomolekul dari gula DNA yang terdapat dalam tubuh sehingga secara tidak langsung memberikan gambaran reaksi radikal hidroksil dalam tubuh. Selain itu, metode ini relatif sederhana dan mudah. Adanya aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang diketahui dengan persen scavenging yang diperoleh dari selisih


4

absorbansi larutan kontrol (tanpa sampel) dan larutan dengan sampel dibagi absorbansi kontrol dikalikan 100%. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dapat dinyatakan dalam aktivitas penangkapan efektif 50% radikal hidroksil atau effective scavenging 50% (ES 50 ). Semakin kecil nilai ES 50 maka sampel tersebut mempunyai nilai keefektifan sebagai penangkap radikal hidroksil (sebagai antioksidan) yang lebih baik

B. Permasalahan 1.

Apakah fraksi etil asetat buah ketapang mempunyai aktivitas antioksidan melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa?

2.

Berapa besar kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang?

C. Manfaat Penelitian 1. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi bagi penelitian lebih lanjut maupun masyarakat luas mengenai potensi buah ketapang sebagai antioksidan alami. 2. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan pada perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi, khususnya tentang penggunaan metode deoksiribosa dalam menguji aktivitas antioksidan.


5

D. Keaslian Penelitian Penelitian terhadap buah ketapang sejauh ini belum banyak dilakukan terutama penelitian terhadap kadar flavonoid total serta uji aktivitas antioksidan dengan metode deoksiribosa. Adapun penelitian yang telah dilakukan adalah aktivitas antidiabetes buah ketapang (Nagappa, et.al, 2006)

E. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan : 1. Mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat buah ketapang melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa. 2. Mengetahui kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang.


6

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Ketapang 1. Nama tanaman Nama latin : Terminalia catappa L. Sinonim :

Phytolacca javanica Osbeck. Terminalia mauritiana Blanco. Terminalia moluccana Lamk. Terminalia procera Roxb.

(Thomson and Evans, 2006)

Nama daerah: Sumatera: beowa, kilaulu, geutapang, ketapang, hatapang, katapang, lahapang, katafa, ketapas, ketapieng. Jawa: katapang, ketapang. Nusatenggara: katapang, klihi. Sulawesi: tarisei, salrise, talisei, kanaunggang, katapang, atapang, lisa. Maluku: wewa, wew, sadina, sarina, saliha, sertalo, kayane, sirisa, sarisa, sarisalo, lisa, tasi, klis, klais, kris, ngusu, id. Irian: ruge (Anonim, 1989). Common Name: Tropical Almond, India Almond, Umbrella Tree, Badam Amandier De Cayenne, Wild Almond, Hulu Kwang, Sea Almond, Bengal Almond, Singapore Almond, Malabar Almond, Tropical Almond, Alite, ‘Autara’a, ‘Aua, ‘Auari’iroa, Kamani Haole, Kamani‘ula, False Kamani, Kauariki, Kaukauariki, Taraire, Ma’i’i, Koa’i’i, Ta’ie, Natapoa, Talie, Talise, Tavola, Tivi, Telie. (Anonim, 2006a; Gilman and Watson, 2006; Thomson and Evans, 2006).

6


7

2. Sistematika tanaman Klasifikasi tanaman ketapang dalam sistematika tumbuhan. Regnum : Plantae Divisio

: Magnoliophyta

Classis

: Magnoliopsida

Ordo

: Myrtales

Familia

: Combretaceae

Genus

: Terminalia

Species

: Terminalia catappa L. (http://www.naturia.per.sg/buloh/plants/sea_almond.htm)

3. Kandungan kimia Daun mengandung beberapa flavonoid (seperti kaemferol dan kuersetin), beberapa tanin (seperti punicalin, punicalagin, atau tercatin), saponin, dan fitosterol (Anonim, 2006b). Buah mengandung cyanidin-3-glucoside, corilagin, ellagic-acid, asam galat, pentosa, brevifolin-carboxyclic-acid eugenic acid, flavonoid, tanin, dan βkaroten (Nagappa et al., 2006). 4. Kegunaan dan khasiat a. Daun Daun mengandung senyawa untuk mencegah kanker dan antioksidan sebaik sifat anticlastogenic (Anonim, 2006b). Sebagai obat rematik, antiinflamasi, mengatasi masalah mata, luka baru, mencegah pendarahan setelah cabut gigi, daun yang sudah gugur dan berwarna merah digunakan untuk


8

mengobati penyakit hati (hepatitis), daun muda sebagai pencahar, obat penyakit kulit (dermatitis), scabies (Anonim, 2006a; Lin, Hsu, Lin, and Hsu, 2001). b. Buah Buahnya digunakan untuk obat sakit kepala, leprosy (lepra), mual saat perjalanan, laksantia (pencahar), rematik dan dapat juga dikonsumsi langsung (Anonim, 2006a). Dalam beberapa penelitian buah ketapang mempunyai efek sebagai anti HIV, anti asmathik, anti katarak, antidiabetik, Xanthin oxidase inhibitor, aldose reductase inhibitor, berpotensi untuk treatment DB (Nagappa et al., 2006). c. Batang Batangnya digunakan untuk obat mulut dan tenggorokan, sakit perut dan diare, demam, disentri (Anonim, 2006a). d. Kombinasi Daun dan batang telah dilaporkan mempunyai aktivitas sebagai antikanker-antioksidan,

anti-HIV

reverse

transcriptase,

hepatoprotektif,

antiinflamasi, hepatitis dan aphrodisiac (Nagappa et al., 2006). Buah, batang dan daun untuk mengobati disentri (Asia Tenggara), rematik (Indonesia, India). Buah dan batang untuk mengobati batuk (Samoa) dan asma (Mexico). (http://www.naturia.per.sg/buloh/plants/sea_almond.htm B. Flavonoid 1. Kerangka dasar dan pengertian flavonoid Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang strukturnya merupakan turunan dari inti aromatik flavon atau 2-fenilbenzopiren. Golongan flavonoid


9

dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C 6 -C 3 -C 6 . Artinya, kerangka karbon terdiri atas dua gugus C 6 (cincin benzen tersubstitusi) disambungkan dengan rantai alifatik tiga karbon (Robinson, 1995).

C

C C

Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid (Robinson, 1995)

Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika senyawasenyawa ini bereaksi dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Dengan demikian fase propagasi yang meliputi reaksi radikal berantai dapat dihambat (Cuvelier, Richards, and Besset, 1991). 2. Penyebaran flavonoid Flavonoid merupakan kandungan khas tumbuhan hijau, kecuali untuk golongan algae. Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kulit, kayu, tepung sari, bunga, buah dan biji. Hanya sedikit saja catatan yang melaporkan adanya flavonoid pada hewan (Harborne, 1987). Penyebaran flavonoid pada golongan tumbuhan yang tersebar yaitu Angiospermae (Markham, 1988). Penyebaran flavonoid sebagai salah satu senyawa aktif tumbuhan sering diakibatkan oleh lingkungan tempat tumbuh yang berbeda, karena pertumbuhan suatu tumbuhan sering diakibatkan oleh lingkungan


10

tempat tumbuh yang berbeda, karena pertumbuhan suatu tanaman dipengaruhi oleh tinggi tempat, keadaan tanah dan cuaca. Senyawa ini dalam jaringan tumbuhan lazimnya ditemukan sebagai campuran dari berbagai turunannya dan jarang ditemukan sebagai senyawa tunggal (Harborne, 1987). Flavonoid dalam tumbuhan terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid, mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida. Karena alasan itu maka dalam menganalisis flavonoid biasanya lebih baik ekstrak tumbuhan dihidrolisis terlebih dahulu untuk mendapatkan bentuk flavonoid sebagai aglikon sebelum memperhatikan kerumitan glikosida yang mungkin terdapat dalam ekstrak asal (Harborne, 1987). 3. Penggolongan dan sifat flavonoid Penggolongan flavonoid berdasarkan pada substituen cincin heterosiklik yang mengandung oksigen dan perbedaan distribusi gugus hidroksil pada atom C 3 . Perbedaan di bagian atom C 3 menentukan sifat, khasiat dan golongan flavonoid, yaitu flavon, flavanon, flavonol, flavanolnol, isoflavon, auron, dan khalkon (Markham, 1988). Flavonoid merupakan fitokimia tumbuhan yang tidak dapat disintesis oleh manusia. Senyawa ini mempunyai efek positif terhadap kesehatan manusia. Flavonoid sering merupakan senyawa pereduksi yang baik, karena menghambat banyak reaksi oksidasi, baik secara enzimatis maupun non enzimatis. Flavonoid bertindak sebagai penampung yang baik radikal hidroksil dan superoksida, dan dengan demikian melindungi lipid membran terhadap reaksi yang merusak (Robinson, 1995).

11


O

O

O

OH

OH O

O

flavan-3-ol

Flavanon

O

Dihidroflavonol

O

O

OH

OH

O

O

Flavone

flavon-3-ol

OH

Anthocyanidin

O O OH

O

O

Isoflavon

Khalkon

Neoflavon

3' 2' 8 7

A

B

4' 5'

O 6'

C 3

6 5

4

Flavonoid

Gambar 2. Kerangka tipe-tipe flavonoid (Bors, Michel, and Stettmainer, 2005)

4. Penyarian flavonoid Penyarian flavonoid dari dalam simplisia tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut polar, semi polar, maupun non polar sesuai dengan


12

kelarutan flavonoid yang diekstraksi. Kelarutan flavonoid berbeda-beda sesuai golongan dan substitusinya (Robinson, 1995). Pelarut yang kurang polar digunakan untuk mengekstraksi aglikon flavonoid, sedangkan pelarut yang lebih polar digunakan untuk glikosida flavonoid atau antosianin. Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi yang tidak tersubstitusi atau suatu gula. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, etil asetat, dimetilsulfoksida, dimetilformamid, dan air (Markham, 1988). Penyarian flavonoid dari tumbuhan didasarkan polaritas kandungan yang akan disari dan asal bahan (dari mana substansi tersebut berasal). Flavonoid yang berasal dari vakuola sel umumnya bersifat hidrofilik sehingga penyarian dapat dilakukan dengan air atau pelarut-pelarut alkoholik. Jika flavonoid terdapat pada kloroplas, pelarut yang dipergunakan untuk penyarian adalah pelarut-pelarut non polar sebelum dilakukan penyarian dengan alkohol. Bahan segar dapat diekstraksi dengan alkohol 96%. Bahan kering dan berkayu dapat menggunakan campuran alkohol dengan air, hal ini disesuaikan glikosida flavonoidnya (Harborne, 1987). 5. Deteksi dan identifikasi flavonoid Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenolik, oleh karena itu dapat memberikan reaksi dengan pereaksi untuk fenol antara lain membentuk warna khas dengan besi (III) klorida (FeCl 3 ), aluminium klorida (AlCl 3 ), larutan asam sulfanilat terdiasotasi, sitroborat, vanilin HCl dan senyawa asam sulfat pekat (Harborne, 1987). Flavonoid dapat dideteksi dengan ammonia, jika tidak bercampur dengan pigmen lain. Timbulnya warna ini disebabkan oleh


13

pembentukan garam dan struktur kuinoid pada cincin B. Reaksi ini memberi warna spesifik untuk masing-masing golongan. Flavon dan flavonol akan memberikan warna kuning, antosian berwarna lembayung biru. Flavanon tidak berwarna namun akan menjadi merah bila dipanaskan. Flavanolol akan berwarna coklat hingga jingga, dan adanya khalkon atau auron akan menimbulkan warna merah mendadak dalam suasana asam (Robinson, 1995). Tabel I. Warna bercak beberapa flavonoid setelah disemprot dengan pereaksi besi (III) klorida (Mabry, Markham, and Thomas, 1970)

Tipe Flavonoid Naringenin Hesperitin Eriodictiol Dihidrokuersetin Dihidrofisetin Dihidrorobinetin Deodarin (Dihidroflavonol) Dihidrokhalkon Flavanon

Warna Bercak Merah-violet Biru-violet Abu-abu dan biru tua Ungu intensif Merah Hijau-coklat

Flavonoid akan membentuk kompleks jika direaksikan dengan pereaksi sitroborat atau dengan pereaksi aluminium klorida. Kompleks yang terbentuk berwarna kuning (Mabry, et.al., 1970). OH

O

O

O

OH

O

O

O

- H2O

O

O

Gambar 3. Pembentukan struktur kuinoid flavonoid karena uap ammonia (Robinson, 1995)


O

OH

Al HO

O OH

AlCl3 HO

Cl

O O

HCl encer O

O OH

O Al

HO

O

HO OH

OH

Cl

O O

AlCl3

O

O

O Al

Cl

5 - OH - Flavon

Cl

HCl encer

HO

OH

O OH

O

O Al

Cl

Berwarna kuning

Cl

OH

O Al

HO

O OH

HO

Cl

O O

AlCl3

OH

O

O

O

Al

Flavonolol

Cl

HCl encer OH

HO

O OH

O O

Al Cl

Berwarna kuning

Gambar 4. Reaksi pembentukan kompleks flavonoid (flavon, 5-OH flavon, flavonol) dengan pereaksi AlCl 3 (Mabry et al, 1970)

14


15

Tabel II. Penafsiran warna Bercak dari segi struktur flavonoid (Markham, 1988)

Warna Bercak Dengan Sinar UV Sinar UV tanpa Sinar UV dengan NH 3 NH 3

Jenis Flavonoid yang mungkin

a. Biasanya 5-OH flavon atau dihidroflavon (tersulih pada 3-H dan mempunyai 4’-OH) b. Kadang-kadang 5-OH flavonon dan 4’OH khalkon tanpa OH pada cincin B a. Biasanya flavon atau flavonol tersulih pada 3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas b.beberapa 6- tatau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta Perubahan warna sedikit mengandung 5-OH Lembayung Gelap atau tanpa perubahan c. Isoflavon, dihidroflavonol, biflavonil dan warna beberapa flavanon yang mengandung 5OH d. Khalkon yang mengandung 2’- dan atau 6’-OH tetapi tidak mengandung 2- atau 4OH bebas Biru muda Beberapa 5-OH flavanon Khalkon yang mengandung 2- dan atau 4Merah atau jingga OH bebas a. Flavon dan flavanon yang tak Fluorosensi hijau-kuning mengandung 5-OH, misal 5-OH glikosid atau kuning-biru b. Flavonol tanpa 5-OH bebnas tetapi tersulih pada 3-OH Fluorosensi biru muda Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan Isoflavon yang mengandung 5-OH bebas warna Fluorosensi biru muda Isoflavon yang mengandung 5-OH bebas Tak Nampak Fluorosensi biru muda Isoflavon tanpa 5-OH bebas Flavonol yang mengandung 3-OH bebas Kuning redup dan Perubahan warna sedikit dan mempunyai atau tak mempunyai 5-OH kuning, atau atau tanpa perubahan bebas (kadang-kadang berasal dari fluorosensi jinga warna dihidroflavon) Auron yang mengandung 4’-OH bebas dan Fluorosensi kuning Merah atau jingga beberapa 2- atau 4-OH khalkon a. Auron yang tak mengandung 4’-OH Hijau-Kuning, Perubahan warna sedikit bebas dan flavanon tanpa 5-OH bebas Hijau-biru, atau atau tanpa perubahan b. Flavonol yang mengandung 2-OH bebas hijau warna dan disertai atau tanpa 5-OH bebas Merah jingga redup Antosianidin 3,5-diglikosid Biru atau merah senduduk Merah jambu atau Sebagian besar antosianidin 3,5-diglikosid Biru fluorosensi kuning Kuning, atau hijau

hijau-kuning


16

6. Kegunaan flavonoid Flavonoid dalam tanaman bertindak sebagai tabir surya alami, melindungi terhadap kerusakan sinar ultraviolet, karena berada pada permukaan atau sel epidermis daun hijau (Bors et al., 2007). Cuvelier et al. (2005) menyatakan bahwa ketika flavonoid bereaksi dengan radikal bebas, akan terbentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Dengan demikian fase propagasi yang meliputi reaksi berantai radikal dihambat. Aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Selanjutnya, Hudson (dalam Achmad, 1990) menyatakan bahwa aktivitas tersebut ditentukan oleh gugus –OH ganda (gugus fenolik), terutama dengan gugus C=O pada posisi C-3 dengan gugus –OH pada posisi C-2 atau pada posisi C-5. Sistem gugus fungsi demikian memungkinkan terbentuknya kompleks dengan logam. Flavonoid merupakan senyawa penangkap radikal superoksida yang kuat dan dapat bereaksi dengan radikal peroksi menyebabkan terminasi reaksi berantai pada autooksidasi lemak tak jenuh ganda. Selain itu dapat berfungsi sebagai penangkap radikal –OH yang merupakan radikal bebas yang reaktif (Buhler and Miranda, 2007). C. Antioksidan 1. Radikal bebas Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak stabil (mempunyai satu elektron atau lebih yang tidak berpasangan), sehingga untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak


17

jaringan. Radikal bebas yang terbentuk cenderung untuk mengadakan reaksi berantai yang bila terjadi dalam tubuh dapat menimbulkan kerusakan-kerusakan yang serius. Senyawa radikal tersebut timbul akibat berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh, berupa hasil sampingan dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernafas; metabolisme sel, 90% ROS digunakan sel untuk transpor elektron oleh mitokondria; peradangan, terjadi fagositosis oleh sel darah putih, karena mekanisme terbunuhnya virus dan bakteri serta denaturasi protein asing (antigen); metabolisme xenobiotik (zat asing yang berasal dari luar tubuh, seperti obat, toksikan); atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan (Percival, 1998). Tabel III. Beberapa macam ROS dan antioksidan yang menetralkan (Percival, 1998) ROS

Neutrazilizing Antioxidants

Radikal Hidroksil

Vitamin C, gluthatione, flavonoid, liopic acid

Radikal Superoksid

Vitamin C, gluthatione, flavonoid, SOD

Peroksida Hidrogen Peroksida Lipid

Vitamin C, gluthatione, flavonoid, beta karoten, vitamin E, lipoic acid Vitamin

E,

beta

karoten,

ubiquinone,

flavonoid, gluthatione peroxidase

Radikal bebas dan oksidan mempunyai sifat yang mirip. Aktivitas kedua senyawa ini sering menimbulkan akibat yang sama meskipun melalui proses yang berbeda. Oksidan merupakan senyawa penerima elektron (elektron acceptor), yaitu senyawa-senyawa yang dapat menarik elektron (Syahbana dan Bahalwan, 2002).


18

2. Definisi dan aktivitas antioksidan Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat oksidasi yang diperantarai oleh oksigen. Oksidasi memegang peranan penting dalam pertahanan tubuh terhadap penyakit. Hal tersebut disebabkan senyawa antioksidan dapat mencegah pengaruh buruk yang disebabkan oleh senyawa-senyawa radikal bebas. (Percival, 1998). Menurut Halliwel dan Auroma (1993) antioksidan memiliki aktivitas dengan cara sebagai berikut. (a). Menurunkan konsentrasi oksigen, (b). mencegah inisisasi rantai pertama dengan menangkap radikal penyerang yang pertama kali dalam reaksi seperti radikal hidroksil, (c). mengikat ion logam dalam bentuk yang tidak akan menurunkan spesies penginisiasi seperti radikal hidroksil dan tidak medekomposisi peroksida lipid menjadi radikal peroksi atau alkoksi, (d). mendekomposisi peroksida dengan mengubah menjadi produk non radikal seperti alkohol, dan (e). memecah rantai pada radikal intermediet seperti radikal peroksi dan alkoksi yang ditangkap untuk mencegah abstraksi hidrogen selanjutnya. 3. Penggolongan antioksidan Manusia mempunyai sistem antioksidan yang mampu melindungi tubuh dari radikal bebas. Sistem antioksidan ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari superoxide dismutase (SOD), katalase dan glutathione peroxidase. Antioksidan


19

non-enzimatik terdiri dari vitamin E, A, provitamin A (beta karoten), dan vitamin C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005). Antioksidan sintetik seperti BHA (butyl hydroxy anisol), PG (propil galat), TBHQ (tert-butyl hydroquinone) dapat meningkatkan karsinogenisitas. Sebagai contoh BHA, merupakan inhibitor lipid peroksidasi yang poten, tetapi ketika dikonsumsi berlebihan menyebabkan kanker, karena terjadi kerusakan oksidatif pada DNA sehingga memicu terjadinya mutasi. Hal ini menyebabkan penelitian eksplorasi antioksidan yang berasal dari bahan alami seperti buah, sayuran dan tanaman mengalami peningkatan (Amarowicz, Naczk, dan Fereiodon, 2000). Sistem pertahanan internal tubuh terhadap radikal bebas adalah antioksidan. Dari asal terbentuknya antioksidan dapat dibedakan menjadi dua yaitu intraseluler dan ekstrasesuler. Dari sini antioksidan dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan sebagai berikut. a. Antioksidan primer, yaitu antioksidan yang dapat menghalangi pembentukan radikal bebas baru dan mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas ini sempat bereaksi. Contoh golongan ini adalah enzim SOD (Superoksid Dismutase), Glutation Peroksidase, protein pengikat metal seperti ferritin dan ceruroplasmin. b. Antioksidan sekunder atau penangkap radikal (radical scavenger) adalah antioksidan yang menekan terjadinya reaksi rantai baik pada awal pembentukan rantai maupun pada fase propagasi. Kelompok ini termasuk


20

antioksidan ekstraseluler yang kebanyakan berasal dari makanan seperti vitamin E, vitamin C, β-karoten, asam urat, bilirubin, dan albumin. c. Antioksidan tersier adalah antioksidan yang memperbaiki kerusakankerusakan sel dan jaringan karena radikal bebas. Contoh: enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel yaitu metionin sulfoksidan reduktase yang berguna untuk mencegah penyakit kanker (Niki et al. cit Ariyanto, 2006) Menurut Percival (1998), proteksi antioksidan dapat berasal dari dalam maupun luar tubuh dimana secara sinergis dan interaktif menetralkan radikal bebas. Yang termasuk didalamnya antara lain: a. nutrient-derived antioxidant biasa disebut dietary antioxidant, misalnya asam askorbat (vitamin C), tokoferol (vitamin E) dan tokotrienol, karotenoid, dan komponen lain yang membunyai bobot molekul rendah seperti glutation dan lipoic acid (thiol dan biothiol). Vitamin C berfungsi dalam menetralkan ROS dalam fase air sebelum reaksi peroksidasi awal. Vitamin E berfungsi dalam memutus reaksi berantai karena melindungi membran asam lemak dari peroksidasi lipid. β-karoten dan karotenoid lain berfungsi untuk memberikan proteksi antioksidan pada jaringan yang kaya lipid; b. antioxidant enzymes, seperti superoksid dismutase, gluthation peroksidase, gluthation reductase, lipoic acid (thiol dan biothiol) yang mengkatalis reaksi pemadaman (quenching) radikal bebas. Merupakan pertahanan endogen yang membantu melindungi kerusakan sel dari radikal bebas. Aktivitas katalitiknya akan meningkat jika ada mikronutrient seperti selenium, besi, tembaga, zinc dan mangaan yang berfungsi sebagai kofaktor;


21

c. metal binding protein, seperti ferritin, laktoferin, albumin, ceruroplasmin yang mengikat besi, tembaga dan logam pro-oksidan, yang berfungsi mengkatalisis reaksi oksidasi; d. beberapa phytonutrient antioksidan dalam berbagai makanan seperti senyawa fenolik, flavonoid.

O CH3 CH3

CH3 C H2

C H

C

(CH2)3

O

H C

CH3 (CH2)3

H C

(CH2)3

CH3

Vitamin K CH3

O OCH3

H C

CH3

CH3

O CH3

OCH3

(CH2

C H

C

CH3 CH2)nH

CH3

O

R OH

O

CH3

Ubikuinon

R = CH2(CH2CH2CHCH2)2CH2CH(CH3)2 tokoferil-quinon

Gambar 5. Senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan (Pokorni, Yanishilieva, and Gordon, 2001)

OH

OH

COOC3H2

OH

HO OH

OCH3

4-metoksi-2-tert-butil fenol (2-BHA)

2,6-di-tert-butil-p-hidroksitoluen (BHT)

tert-butilhidrokuinon (TBHQ)

Gambar 6. Stuktur kimia beberapa antioksidan sintetik (Pokorni et al., 2001)

OH OH

propil galat (PG)


22

4. Metode pengujian daya antioksidan Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui apakah suatu senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas. Metode ini dapat untuk memisahkan campuran antioksidan yang kompleks sekalipun. Pereaksi semprot yang digunakan untuk deteksi dapat dibedakan menjadi empat kelompok, yaitu : (a). senyawa-senyawa yang dapat membentuk warna ketika tereduksi (kalium permanganat, ferri-sianida, ferri-dipiridil, dan asam fosfomolibdat); (b). senyawa yang dapat berikatan dengan senyawa fenol, seperti senyawa diazo, pereaksi diazo, magnesium sulfat, aldehid aromatik-anisaldehid, vanillin dan pereaksi Gibbs yang membentuk indofenol (akan membentuk garam berwarna dalam kondisi basa); (c). radikal bebas stabil yang menerima radikal hidrogen dari antioksidan (1,1difenil-2-pikrilhidrazil); (d). senyawa-senyawa yang membentuk senyawa adisi yang berwarna (palladium klorida dan pentadium klorida) (Davidek, 1997). Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara spektrofotometri. Beberapa uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan antara lain: (1). pengujian panangkapan radikal (radical scavenging test), dilakukan dengan cara mengukur penangkapan radikal sintetik dalam pelarut organik polar seperti metanol atau etanol pada suhu kamar. Radikal


23

sintetik yang sering digunakan adalah DPPH (2,2’- difenil-1-pikril hidrazil) dan ABTS (2,2’-azinobis (3-etil benzotiazolin-asam sulfonat)). Dasarnya adalah kemampuan suatu senyawa untuk menangkap radikal DPPH. DPPH memberikan warna violet pada panjang gelombang 517 nm. Penangkapan radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil. Reaksi yang terjadi DPPH• + AH Æ DPPH-H + A• DPPH• + R Æ DPPH-R (1). pengujian amtivitas antioksidan dengan system linoleat tiosianat, dasar : pengukuran intensitas warna kompleks feritiosianat yang terbentuk dari reaksi ion feri dengan amonium tiosianat. Ion feri terbentuk dari oksidasi ion fero oleh peroksida ysng berasal dari oksidasi asam linoleat. Kompleks feritiosianat yang berwarna merah diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490 nm. Semakin tinggi absorbansinya (warna merah yang terbentuk semakin pekat) menunjukkan semakin banyak peroksida yang teerbentuk. Dengan adanya senyawa yang berperan sebagai antioksidan intensitas warna ynag terbentuk semakin rendah. (2). pengujian dengan asam thiobarbiturat, dasar uji ini adalah reaksi malondialdehid dengan asam thiobarbiturat menghasilkan kromogen merah muda yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm. Malondialdehid terbentuk dari asam lemak bebas tidak jenuh dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan


24

rangkap. Adanya senyawa yang bersifat antioksidan akan menghambat terbentuknya malondialdehid dari asam lemak bebas tidak jenuh. (3). pengujian dengan sistem β-karoten-linoleat pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan pemucatan warna βkaroten. Karotenoid dapat meredam oksigen yang reaktif menghasilkan oksigen yang lebih stabil. Energi dari oksigen tersebut dipindahkan ke senyawa karotenoid. Energi tersebut dilepaskan melalui interaksi rotasional dan vibrasional antara karotenoid dengan pelarut untuk mengembalikan karotenoid ke ground state. Reaksi yang terjadi: O 2 reaktif + karotenoid Æ O 2 stabil + karotenoid* karotenoid* Æ karotenoid + energi termal D. Deoksiribosa Deoksiribosa (2-deoksi-D-ribosa) merupakan gula yang mempunyai lima atom karbon yang merupakan turunan dari suatu gula pentosa, yaitu ribose. Gula ini merupakan bagian dari DNA. HO OH O H

H

H

H OH

H

Gambar 7. Struktur deoksiribosa

Beberapa produk degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada pH rendah terdekomposisi menjadi malondialdehid (MDA), yang dapat terdeteksi dengan penambahan asam thiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen MDA-TBA


25

yang berwarna merah muda. Pembentukan MDA dari deoksiribosa menjadi dasar uji penangkapan radikal hidroksil (Halliwel dan Gutteridge, 1999). Proses degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil terjadi melalui beberapa tahap. Tahap-tahap ini terjadi pada saat campuran reaksi yang terdiri dari pereaksi Fenton (FeCl 3 , EDTA, H 2 O 2 , vitamin C) dan deoksiribosa diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Tahap-tahap reaksi tersebut adalah reaksi pembentukan radikal hidroksil dari reaksi fenton dan degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil (Halliwel dan Gutteridge, 1999). Tahap I. Reaksi pembentukan radikal hidroksil. Radikal hidroksil dihasilkan melalui reaksi Fenton. Dalam reaksi Fenton, vitamin C berfungsi sebagai reduktor yang mempercepat proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+. Fe2+ akan bereaksi dengan H 2 O 2 dan menghasilkan radikal hidroksil. Penambahan suatu ligan (EDTA) pada besi dapat meningkatkan konstante kecepatan reaksi antara Fe2+ dengan H 2 O 2 . Tahap II. Degradasi Deoksiribosa. Radikal hidroksil akan menyerang deoksiribosa dan mendegradasinya menjadi fragmen-fragmen. Semua posisi pada struktur gula deoksiribosa memungkinkan untuk diserang oleh radikal hidroksil membentuk radilkal deoksiribosa melalui reaksi abstraksi hidrogen yang dengan adanya O 2 akan diubah secara cepat menjadi radikal gula peroksil. Selanjutnya terjadi serangkaian reaksi yaitu disproporsionasi, penataan ulang, eliminasi air, dan pemecahan ikatan C-C menghasilkan produk karbonil yang bervariasi. Konstante kecepatan reaksi orde dua dari reaksi antara radikal hidroksil dengan gula deoksiribosa pada pH 7,4 adalah 3,1 x 109 M-1s-1. Beberapa produk


26

degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada pH rendah akan terdekomposisi menjadi MDA (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Adanya MDA dapat dideteksi dengan mereaksikan campuran tersebut dengan TBA dalam suasana asam. Molekul MDA dengan TBA membentuk kromogen berwarna merah muda yamg absorbansinya dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Reaksi kopling ini terjadi antara dua molekul MDA dan satu molekul TBA (Halliwell, Gutteridge, and Auroma, 1987). E. Metode Penyarian Penyarian merupakan peristiwa pemindahan massa zat aktif yang semula berada dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif dalam cairan penyari tersebut. Pada umumnya penyarian akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari makin luas. Dengan demikian, makin halus serbuk simplisia, seharusnya makin baik penyariannya. Menurut Anonim (1995) serbuk harus dapat melewati ayakan 20. Tetapi dalam pelaksanaannya tidak selalu demikian karena penyarian masih tergantung juga pada sifat fisik dan kimia simplisia yang bersangkutan. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi: infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan (Anonim, 1986). 1. Infundasi Merupakan proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Sari yang dihasilkan tidak stabil dan mudah tercemari oleh kapang dan kuman. Oleh karena itu, sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam.


27

Infundasi dibuat dengan cara menyari simplisia dengan air pada suhu 90oC selama 15 menit (Anonim, 1986). 2. Maserasi Cara maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengnan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan pendesakan larutan terpekat dari dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Dapat dilakukan modifikasi terhadap teknik maserasi, misalnya teknik remaserasi. Pada teknik ini, cairan dibagi menjadi dua kemudian seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Anonim, 1986). 3. Perkolasi Merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Cairan penyari akan mengalir dari atas ke bawah melalui serbuk kemudian cairan akan melarutkan zat aktif di dalam sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Serbuk simplisia yang akan diperkolasi dibasahi terlebih dahulu dengan cairan penyari kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat perkolasi (perkolator) sambil tiap kali ditekan. Serbuk kemudian ditutup dengan kertas saring dan cairan penyari dialirkan hingga di atas permukaan serbuk masih terdapat lapisan cairan penyari.


28

Setelah 24 jam, keran dibuka dan diatur hingga kecepatan tetesannya adalah 1 ml permenit. Akhir proses perkolasi ditentukan dengan pemeriksaan zat secara kualitatif pada perkolat terakhir (Anonim, 1986). 4. Penyarian berkesinambungan Proses ini merupakan gabungan antara proses untuk menghasilkan ekstrak cair dan proses penguapan. Alat yang digunakan misalnya soxhlet. Pada penyarian ini, cairan penyari dipanaskan hingga mendidih, kemudian uap penyari akan naik ke atas kemudian akan menggembun karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun akan turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktif serbuk simplisia (Anonim, 1986). Cairan pelarut yang baik adalah pelarut yang dapat melarutkan zat aktif dari ekstrak dengan demikian ekstrak bebas dari senyawa lain yang tidak diinginkan. Faktor pertimbangan dalam pemilihan penyari adalah selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan dan aman (Anonim, 2000). Menurut Anonim (1986) kriteria cairan penyari yang baik adalah murah dan mudah didapat, stabil secara fisika dan kimia, netral, tidak mudah menguap atau terbakar, selektif, tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan diperbolehkan oleh peraturan. Pelarut yang diperbolekan sesuai peraturan yang berlaku adalah air, etanol dan campuran etanol air, metanol (dan yang segolongan), kloroform, eter, heksan, aseton (Anonim, 2000). Etanol dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida kurkumin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak,


29

malam, tanin, dan saponin hanya sedikit larut dalam etanol. Campuran etanol dan air dapat digunakan untuk meningkatkan penyarian (Anonim, 1986). Separasi dan pemurnian bertujuan untuk menghilangkan senyawa yang tidak dikehendaki seoptimal mungkin tanpa mempengaruhi kandungan senyawa yang diinginkan, sehingga diperoleh ekstrak yang murni. Proses dari tahap ini adalah pengendapan, pemisahan dua cairan yang tidak saling campur (ekstraksi), sentrifugasi, dekantasi dan filtrasi (Anonim, 2000). Ekstraksi adalah suatu metode pemisahan komponen dari suatu campuran dengan menggunakan suatu pelarut. Dalam praktek digunakan untuk memisahkan senyawa organik dari larutan air atau suspensi. Metode ini paling sering digunakan untuk proses pemisahan. Alat yang digunakan tidak khusus dan rumit. Jika tidak dinyatakan lain alat yang digunakan untuk pemisahan adalah corong pisah (Khopkar, 1990).

F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi merupakan suatu metode yang sering digunakan untuk memisahkan dan mendeteksi suatu campuran senyawa berdasarkan proses fisikakimia. Salah satu sistem kromatografi yang digunakan adalah kromatografi lapis tipis yang merupakan pemisahan pada lapisan tipis dengan suatu penyangga. Lapisan yang memisahkan terdiri atas partikel-partikel- sebagai fase diam yang ditempatkan pada penyangga yang berupa lempeng gelas, logam, pelat polimer atau lapisan lain yang cocok. Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan


30

bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum. Lapisan ini berfungsi sebagai permukaan padat yang menyerap (Grittter, Bobbit, and Schwarting, 1991). Kromatografi lapis tipis adalah metode kromatografi cair yang paling sederhana dan mempunyai beberapa kelebihan. Kelebihan KLT adalah sampel yang digunakan sedikit, diperoleh pemisahan senyawa yang amat berbeda (seperti senyawa organik alam, senyawa organik sintetik, komplek anorganik-organik dan bahkan ion anorganik), waktu yang dibutuhkan singkat, serta jumlah pelarut yang digunakan sangat sedikit. KLT dapat digunakan untuk dua tujuan. Pertama, untuk hasil kuantitatif, kualitatif dan preparatif. Kedua, digunakan untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Grittter et al., 1991). Dalam KLT, pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi solut antara fase diam dengan fase gerak yang terjadi secara kompetitif. Kemampuan fase diam mengadsorpsi sangat bergantung pada topografi gugus aktif yang terdapat pada masing-masing komponen. Senyawa yang terikat kuat pada fase diam akan dielusi paling lama dan mempunyai nilai Rf (Retention factor) yang kecil, sedangkan senyawa yang tidak terikat kuat pada fase diam akan terelusi lebih dahulu dan mempunyai nilai Rf yang besar. Bercak yang mempunyai nilai Rf sama kemungkinan merupakan senyawa yang sama. Bilangan Rf didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan fase pengembang (Markham, 1988). Hasil elusi sampel oleh fase gerak menghasilkan bercak yang dapat diamati dan digunakan untuk analisis senyawa. Akan tetapi, terkadang bercak


31

yang dihasilkan pada lempeng fase diam masih sulit untuk dideteksi. Masalah tersebut dapat diatasi dengan menambahkan pereaksi yang mampu memperjelas bercak, sehingga memudahkan dalam pendeteksian. Senyawa-senyawa yang sering digunakan untuk pereaksi pendeteksi dalam KLT antara lain amonia, AlCl 3 , FeCl 3 , sitroborat, dan berbagai pereaksi lain yang cukup banyak macamnya (Mabry et al., 1970). KLT Densitometri Merupakan metode penetapan kadar suatu senyawa dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang bersangkutan, yang terlebih dahulu dipisahkan dengan cara KLT. Untuk menetapkan kadar suatu senyawa dengan KLT densitometri, ada dua cara. Pertama, penotolan dilakukan bersamaan antara senyawa baku dan senyawa yang bersangkutan, kemudian dielusi. Kadar senyawa bersangkutan ditentukan dengan membandingkan harga AUC (Area Under Curve) senyawa dengan baku. Cara kedua yaitu dengan membuat kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC (Wardani, 2003). Kurva baku diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada lempeng KLT dengan bermacam-macam konsentrasi. Bercak yang diperoleh dicari nilai AUCnya, dari kurva baku diperoleh persamaan Y= bX + a. Dimana Y adalah AUC dan X adalah banyaknya zat yang ditotolkan (Supardjan, 1987). Alat TLC scanner memiliki sumber sinar yang dapat digerakkan di atas bercak-bercak pada lempeng KLT atau lempeng KLT dapat digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari sumber sinar. Teknik pengukurannya dapat


32

didasarkan atas sinar yang diserap (absorbansi), sinar yang dipantulkan (reflaktansi), atau sinar yang difluoresensikan. Sinar yang datang sebagian besar diserap atau dipantulkan. Banyaknya sinar yang diserap sebanding dengan jumlah zat pada bercak yang terkena sinar (Wardani, 2003). G. Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri visibel adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 380-780 nm. Spektrofotometri UV-Vis lebih banyak digunakan untuk analisis kuantitatif daripada kualitatif karena melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis (Mulja dan Suharman, 1995). Bila cahaya jatuh pada suatu senyawa, maka sebagian dari cahaya tersebut akan diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul. Setiap senyawa memiliki tingkat energi yang spesifik. Bila cahaya yang mengenai senyawa memiliki energi yang sama dengan perbedaan energi antara keadaan tingkat dasar dan energi keadaan tereksitasi, maka elektron-elektron pada keadaan dasar akan dieksitasi ke tingkat energi eksitasi dan sebagian energi cahaya yang sesuai dengan panjang gelombang ini diserap. Frekuensi yang diserap setiap senyawa sangat spesifik karena perbedaan energi antara tingkat dasar dan tingkat eksitasi setiap senyawa juga spesifik (Sastrohamidjojo, 2001). Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) akan menghasilkan transisi elektromagnetik dan spectra absorbansi elektromagnetik. Jumlah radiasi


33

elektromagnetik yang diserap akan sebanding dengan jumlah molekul penyerapnya, sehingga spectra absorbansi dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Panjang gelombang cahaya UV-Vis lebih pendek daripada panjang gelombang radiasi inframerah. Spectrum visibel atau tampak mempunyai absorbansi antara 400-800 nm, sedangkan spectrum UV mempunyai absorbansi antara 100-400 nm. Kuantitas energi yang diserap oleh suatu senyawa berbanding terbalik dengan panjang gelombang radiasi (Fessenden dan Fessenden, 1995). Bila suatu molekul senyawa organik menyerap sinar UV atau tampak, maka di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan (transisi elektron) dari berbagai jenis tingkat energi orbital dari molekul tersebut (Sastrohamidjojo, 2001). Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi antara gelombang cahaya (foton) dan atom/molekul. Proses absorbsi cahaya UVVis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan tingkat energi elektronik tertentu ke orbital lain dengan tingkat energi elektronik yang lebih tinggi. Secara umum, ada tiga macam distribusi elektron dalam suatu senyawa organik yaitu orbital pi (π), sigma (σ) dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila radiasi elektromagnetik mengenai molekul, maka akan terjadi eksitasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron antibonding (Mulja dan Suharman, 1995).


34

σ* (anti-bonding) π* (anti-bonding) n (non-bonding) π (bonding) σ (bonding)

energi

Gambar 8. Tingkat energi elektronik

Macam-macam transisi elektron yang terjadi adalah sebagai berikut. a. Transisi σ → σ*. Transisi jenis ini terjadi pada orbital ikatan sigma. Energi yang dibutuhkan untuk transisi ini sangat besar, sesuai dengan sinar yang mempunyai frekuensi pada daerah ultraviolet vakum (<180 nm). b. Transisi n → σ*. Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (ikatan n). energi yang diperlukan untuk transisi ini lebih kecil dari transisi σ → σ*, sehingga sinar yang diserap memiliki panjang gelombang lebih besar dari 200 nm. Pengaruh pelarut pada transisi jenis ini adalah pergesaran puncak absorbansi pada panjang gelombang yang lebih pendek dalam pelarut yang lebih polar. Pergesaran ini disebut pergesaran biru atau hipsochromic shift. c. Transisi n → π* dan π → π*. Untuk memungkinkan terjadinya jenis transisi ini, maka molekul organik harus mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital ikatan π yang diperlukan. Jenis transisi ini merupakan jenis yang paling sesuai untuk


35

analisis karena memiliki absorbansi pada 200-700 nm dan panjang gelombang ini secara teknis dapat diaplikasikan pada spektofotometer (Sastrohamidjojo, 2001). Secara sederhana, komponen-komponen spektrofotometer berkas ganda dapat dijelaskan sebagai berikut. a. Sumber radiasi Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada keseluruhan kisaran panjang gelombang. Sumber radiasi cahaya tampak biasanya menggunakan lampu filament tungsten yang menghasilkan suatu sumber yang berpijar yang memancarkan radiasi terlihat pada daerah cahaya tampak pada panjang gelombang 400-700 nm. Sumber radiasi ultraviolet banyak menggunakan lampu hidrogen dan lampu deuterium, kedua lampu ini menghasilkan radiasi kontinu pada daerah panjang gelombang 180-350 nm (Sastrohamidjojo, 2001). b. Monokromator Ada dua alat untuk mengubah radiasi yang polikromatik menjadi monokromatik yaitu penyaring dan monokromator. Penyaring dibuat dari benda khusus yang hanya meneruskan radiasi pada daerah panjang gelombang tertentu dan menyerap radiasi dari panjang gelombang yang lain. Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang menguraikan radiasi polikromatik menjadi panjang gelombang tunggalnya dan memisahkan panjang gelombang tersebut menjadi jalur yang sangat sempit (Sastrohamidjojo, 2001).


36

c. Tempat cuplikan Tempat cuplikan biasa disebut sel atau kuvet. Untuk daerah ultraviolet biasanya

menggunakan

Quartz

atau

kuvet

dari

silica

yang

dilebur

(Sastrohamidjojo, 2001), sedangkan untuk daerah cahaya tampak biasanya menggunkan Quartz atau gelas silikat (Skoog, Holler, and Nieman, 1998). d. Detektor Fungsi detektor adalah untuk mengubah sinyal radiasi yang diterima menjadi sinyal elektronik. Persyaratan-persyaratan penting untuk detektor adalah sensitivitas tinggi, waktu respon pendek, stabilitas panjang dan sinyal elektronik yang mudah diperjelas. Detektor yang digunakan dalam ultraviolet disebut detektor fotolistrik (Sastrohamidjojo, 2001). Analisis spektrofotometer UV-Vis melibatkan pembacaan absorban radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan. Keduanya dikenal sebagai absorban (A) tanpa satuan dan transmitan dengan satuan persen. Hubungan antara intensitas radiasi elektromagnetik yang diserap oleh sistem (I 0 ) dengan intensitas radiasi yang ditransmisikan (I t ) dapat dijelaskan dengan hukum Lambert-Beer, sebagai berikut : Dengan T = persen transmitan; I 0 = intensitas radiasi yang datang; I t = intensitas radiasi yang diteruskan; ε = daya serap molar (L.mol-1.cm-1); c = konsentrasi (mol/L); b = panjang sel (cm); A = serapan.

T=

It = 10 −ε .b.c Io

A = log

1 = ε .b.c T


37

Jika konsentrasi (c) dalam mol/L dan panjang sel dalam cm, persamaannya menjadi A = ε.b.c Jika konsentrasi (c) dalam g/L, persamaannya menjdi A = a.b.c Jika a adalah daya serap, hubungan dengan daya serap molar ditunjukkan dengan persamaan ε = a.M Dimana M adalah bobot molekul. (Silverstein, 1991) Daya serap (L/g/cm) adalah absorbansi dari 1 g/L larutan dalam sel dengan panjang 1 cm. Serapan jenis (A 1%, 1 cm) adalah serapan dari larutan 1 % zat terlarut dalam sel dengan ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada panjang gelombang tertentu dalam suatu pelarut merupakan sifat dari zat terlarut (Anonim, 1995). Hubungannya dengan daya serap ditunjukkan dengan persamaan a=

A (1%, 1 cm ) ε = 10 mol wt

(Clarke, 1986) Kromofor merupakan group kovalen yang tidak jenuh (unsaturated) yang bertanggung jawab atas serapan elektron, contoh: C=C, C=O, NO 2 . auksokrom adalah saturated group yang mempunyai elektron bebas, ketika tertarik oleh kromofor, panjang gelombang dan intensitas serapan dapat berubah, contoh: -OH, -Cl, NH 2 . Pergeseran batokromik adalah pergeseran serapan ke panjang


38

gelombang yang lebih panjang karena penggantian (substitusi) atau efek pelarut (pergeseran merah). Pergeseran hipokromik adalah pergeseran serapan ke apnjang gelombang yang lebih pendek karena penggantian (substitusi) atau efek pelarut (pergeseran biru). Efek hipokromik adalah peningkatan intensitas serapan. Efek hipokromik adalah penurunan intensitas serapan (Silverstein, 1991). H. Keterangan Empirik Antioksidan sintetik seperti BHA, PG, TBHQ dapat meningkatkan karsinogenisitas. Sebagai contoh BHA, merupakan inhibitor lipid peroksidasi yang poten, tetapi ketika dikonsumsi berlebihan menyebabkan kanker, karena terjadi kerusakan oksidatif pada DNA sehingga memicu terjadinya mutasi. Hal ini menyebabkan penelitian eksplorasi antioksidan yang berasal dari bahan alami seperti buah, sayuran dan tanaman mengalami peningkatan. Secara umum, aktivitas flavonoid sebagai antioksidan disebabkan adanya gugus hidroksi fenolik pada strukturnya. Gugus ini berperan besar dalam mendonorkan atom hidrogennya ketika diserang oleh radikal hidroksil, flavonoidflavonoid tersebut akan membentuk radikal bebas baru yang lebih stabil yaitu radikal fenoksil (FIO•) dan molekul air yang stabil. Radikal fenoksil tersebut akan mengalami efek resonansi pada cincin aromatiknya, hal inilah yang menyebabkan radikal fenoksil lebih stabil daripada radikal hidroksil. Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan untuk digunakan dalam proses pemurnian. Glikosida dan beberapa aglikon flavonoid larut dalam etil asetat. Aktivitas antioksidan daun ketapang dalam fraksi etil asetat lebih tinggi dibandingkan pentana atau diklorometana.


39

Diharapkan buah juga memiliki aktivitas yang sama dengan daun yang merupakan bagian tanaman ketapang. Gula deoksiribosa merupakan substrat yang ditargetkan akan diserang oleh radikal hidroksil dalam metode deoksiribosa. Jika ada suatu senyawa yang dapat berperan sebagai antioksidan dan mempunyai kemampuan untuk menangkap radikal hidroksil (seperti flavonoid) dimasukkan ke dalam sistem, maka produk degradasi deoksiribosa (MDA) akan berkurang. Hal ini dikarenakan senyawa tersebut akan menangkap sebagian radikal hidroksil dalam sistem. Penurunan intensitas warna dan absorbansi yang terjadi menunjukkan berkurangnya kromogen MDA-TBA yang terbentuk. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan % scavenging dan nilai aktivitas penangkapan efektif 50% radikal hidroksil atau effective scavenging 50% (ES 50 ). Flavonoid dapat ditentukan kadarnya dengan menggunakan senyawa pengompleks AlCl 3 . Sehingga flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat dapat ditetapkan kadarnya dengan metode pengompleksan warna menggunakan AlCl 3 . I. KETERANGAN EMPIRIS YANG DIHARAPKAN Fraksi etil asetat buah ketapang mempunyai aktivitas antioksidan melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dapat dijadikan sebagai sumber baru senyawa antioksidan alami. Kandungan senyawa flavonoid buah ketapang mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan


40

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena ada subjek uji yang dikenakan perlakuan. B. Variabel - Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas adalah variabel yang direncanakan untuk diteliti pengaruhnya terhadap variabel tergantung. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang. 2. Variabel tergantung Variabel tergantung adalah pusat persoalan yang merupakan kriteria dari penelitian ini. Variabel tergantung dari penilitian ini adalah aktivitas antioksidan buah ketapang, dilihat dari persen scavenging. 3. Variabel pengacau Variabel pengacau adalah variabel yang secara teoritis diketahui memiliki pengaruh terhadap hasil dan tidak dikehendaki. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur buah yang dipanen, cara panen, cara pengeringan dan pembuatan simplisia, jumlah (g) simplisia yang digunakan, suhu dan waktu inkubasi larutan uji. Variabel pengacau tak terkendali adalah cahaya matahari, cuaca/musim, curah hujan.


41

C. Definisi Operasional 1. Uji aktivitas antioksidan Uji aktivitas antioksidan adalah uji untuk menentukan ada tidaknya senyawa antioksidan dalam buah ketapang dan seberapa besar kemampuan buah ketapang dalam menangkap radikal hidroksil, sehingga didapatkan nilai penangkapan efektif (effective scavenging) radikal hidroksil sebesar 50% (ES50) yang menggambarkan kekuatan antioksidan buah ketapang. 2. Fraksi etil asetat Fraksi etil asetat adalah hasil dari fraksinasi ekstrak etanol buah ketapang dengan menggunakan etil asetat. 3. Kandungan senyawa flavonoid total Kandungan senyawa flavonoid total adalah jumlah keseluruhan senyawa polifenol yang mempunyai kerangka karbon dengan dua gugus C6 disambungkan oleh rantai alifatik 3 karbon yang diperoleh dari perbandingan antara besarnya resapan yang terbaca pada spektrofotometer visibel dengan berat cuplikan, dinyatakan sebagai gram ekivalen kuersetin dalam setiap 100 gram berat kering ekstrak (g Ekivalen Kuersetin/100 g). 4. Buah ketapang Buah ketapang adalah buah dari tanaman ketapang yang berbentuk oval (seperti almond), berwarna hijau, panjangnya 3,5-7 cm dan lebar 2-5,5 cm, yang memiliki eksokarpium berupa kulit buah yang berwarna hijau, mesokarpium berupa serat-serat yang tersusun menjadi serabut yang tebal, berwarna kuning gading, endokarpium berupa lapisan keras (seperti batok kelapa) yang melindungi


42

biji yang terdapat di dalamnya, berwarna coklat, dan yang paling dalam adalah biji yang berwarna putih D. Bahan Penelitian Bahan uji yang digunakan adalah: buah ketapang yang diambil dari Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Bahan-bahan kualitas p.a.(E.Merck): dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, asam thiobarbiturat,

asam

trikloro

asetat,

ferri

klorida

heksahidrat,

etilendiamintetraasetat garam dinatrium dihidrat, hidrogen peroksida (Larutan 30% H2O2), L (+) asam askorbat (vitamin C), etil asetat, natrium nitrit, aluminium klorida, natrium hidroksida, selulosa. Bahan-bahan kualitas p.a.(Sigma): 2-deoksiD-ribosa, kuersetin. Bahan-bahan farmasetis : etanol 96% (CV. General Labora) dan aquades. E. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: spektrofotometer UVVis (Perkin Elmer Lamda 20), pH meter (Metrohm), Vacuum rotary evaporator (Buchi rotavapor), waterbath (Labo-tech, Heraeus), hot plate, neraca analitik (scaltec SBC 22, BP 160P), oven, vorteks (Janke & Kunkel), mikropipet 10-100 μL dan 100-1000μL (Acura 825), mikropipet 0,5-5,0 mL (Socorex), tabung reaksi bertutup (Schott-Germany), alat ultrasonic (Retsch tipe T 460 No.V935922013 EY) alat-alat untuk KLT dan alat-alat gelas (Pyrex-Germany dan Iwaki).


43

F. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman ketapang dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi USD menurut buku Flora of Java (Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965). 2. Pengumpulan bahan Buah ketapang diperoleh dari fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta pada bulan Mei 2007. Buah yang digunakan adalah buah yang masih muda. Dikumpulkan pagi hari, pukul enam pagi. 3. Pembuatan ekstrak etanol buah ketapang Ekstrak etanol disari dengan menggunakan cara perkolasi. Sebanyak 150 g serbuk buah ketapang yang telah dihaluskan dan diayak dengan menggunakan ayakan dengan derajat halus 8/24, direndam dalam cairan penyari yaitu etanol 70% (campuran etanol air (7:3)) dan didiamkan selama 24 jam dalam bejana tertutup. Massa serbuk dan cairan penyari kemudian dimasukkan ke dalam perkolator. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan tetesan 1 mL tiap menit. Perkolat yang didapat ditampung, kemudian ampas diberi cairan penyari kembali sampai perkolat yang keluar sudah jernih. Perkolat yang didapat dipekatkan dengan vaccum rotaevaporator (rotavapor). Proses dilakukan sampai seluruh etanol diperkirakan telah menguap. Ekstrak yang didapat, dikumpulkan dan diuapkan di atas waterbath dengan suhu maksimum 50oC hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapat, ditimbang untuk didapatkan rendemen dan disimpan dalam eksikator.


44

4. Pembuatan fraksi etil asetat buah ketapang Ekstrak kental yang didapat dilarutkan dalam 100 mL air panas. Larutan ekstrak didinginkan kemudian dimasukkan dalam corong pisah. Ditambahkan etil asetat sebanyak 100 mL, kemudian digojog selama 15 menit dan didiamkan 5 menit. Ekstraksi dilakukan selama 9 kali (berdasarkan optimasi). Didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat dipekatkan dengan rotavapor. Proses dilakukan sampai seluruh etil asetat diperkirakan telah menguap. Fraksi yang didapat, dikumpulkan dan diuapkan di atas waterbath dengan suhu maksimum 50oC hingga diperoleh fraksi kental. Fraksi kental yang didapat, ditimbang untuk mendapatkan rendemen dan disimpan dalam eksikator. 5. Uji kualitatif kandungan flavonoid dengan metode KLT Disiapkan larutan fraksi etil asetat buah ketapang. Sebanyak 10 µL larutan tersebut ditotolkan pada lempeng selulosa dengan rutin (konsentrasi 0,05%) sebagai pembanding. Lempeng KLT tersebut dielusi dengan fase gerak Nbutanol-Asam Asetat-Air (BAA) dengan perbandingan 4:1:5. Setelah dielusi bercak diamati pada cahaya tampak, UV 365 nm, dan UV 254 nm. Deteksi dengan uap amonia dan pereaksi semprot FeCl3 dilakukan untuk memperjelas bercak. Bercak juga diamati pada cahaya tampak, UV 365nm, dan UV 254 nm. 6. Pembuatan buffer fosfat Buffer fosfat dibuat dengan bantuan pH meter a. Pembuatan dinatrium hidrogen fosfat 20 mM Timbang saksama 1,42 g Na2HPO4 dan larutkan dalam akuades hingga 500,0mL.


45

b. Pembuatan kalium dihidrogen fosfat 20mM Timbang saksama 0,68g KH2PO4 dan larutkan dalam akuades hingga 250,0mL. Larutan KH2PO4 ditambahkan secara bertetes-tetes pada larutan Na2HPO4 hingga tercapai pH 7,4. 7. Pembuatan pereaksi a. Larutan FeCl3 1 mM Sebanyak lebih kurang 13,52 mg FeCl3.6H2O ditimbang saksama dan dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 2,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu dibuat baru. b. Larutan EDTA 1 mM Sebanyak lebih kurang 18,61 mg Na2EDTA.2H2O ditimbang saksama dan dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 2,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. c.

Larutan vitamin C 1mM Sebanyak lebih kurang 17,61 mg vitamin C ditimbang saksama dan dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu dibuat baru.


d.

46

Larutan H2O2 20 mM Sebanyak 0,045 mL larutan H2O2 30% dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0mL dan ditambahkan akuades hingga tanda. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.

e.

Larutan TCA 5% Sebanyak 1,25 g TCA ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 25,0 mL dalam labu ukur.

f. Larutan TBA 1% Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam beaker glass 100 mL, ditambahkan akuades secukupnya kemudian dipanaskan di atas hot plate pada suhu 50-55oC hingga larut. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL dan ditambah akuades hingga tanda. g. Pembuatan larutan kuersetin 8,16 mg/mL Sebanyak 816,0 mg serbuk kuersetin dimasukkan dalam labu takar 100,0mL dan ditambahkan metanol hingga batas tanda. h. Pembuatan larutan natrium nitrit 10%. Sebanyak 10,0g natrium nitrit dilarutkan dengan aquades secukupnya dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 100,0mL dan ditambahkan aquades hingga batas tanda.


47

i. Pembuatan larutan aluminium klorida 10% Sebanyak 5,0 g aluminium klorida dilarutkan dengan aquades secukupnya dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 50,0mL dan ditambahkan aquades hingga batas tanda. j. Pembuatan larutan natrium hidroksida 10% Sebanyak 10,0 g natrium hidroksida dilarutkan dengan aquades secukupnya dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 100,0mL dan ditambahkan aquades hingga batas tanda. 8. Optimasi Metode a. Penentuan waktu operasi Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600μL larutan Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5 %, vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teoritis 532 nm selama 30 menit. b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM.


48

Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5 %, vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya dari panjang gelombang 400-600 nm. 9. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang a. Pembuatan larutan kontrol Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5%, vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. b. Penentuan aktivitas penangkapan radikal hidroksil Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan Deoksiribosa 2,5mM dan fraksi etil asetat buah ketapang sebanyak 200, 400, 600, 800, dan 1000 μL, kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, buffer fosfat pH 7,4 (penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume fraksi etil asetat yang ditambahkan sehingga volume akhir larutan 6 mL), dan


49

300μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5%, vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. 10. Penentuan kadar flavonoid total a. Pembuatan kurva baku kuersetin Dibuat larutan induk kuersetin dengan konsentrasi 8,16 mg/mL dalam aquades. Sebanyak 100; 200; 300; 400; 500; 600; 750; dan 900 μL larutan induk dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL, ditambahkan 4,0 mL aquades dan 0,30 mL larutan NaNO2 10%, lalu dibiarkan selama 6 menit. Kemudian ditambahkan dengan 4,0 mL NaOH 10% dan aquades sampai volume 10,0 mL. Larutan dibiarkan selama 15 menit dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 510 nm. b. Penentuan kadar flavonoid total dalam fraksi etil asetat Ditimbang lebih kurang fraksi etil asetat sebanyak 25 mg kemudian ditambahkan metanol dalam labu ukur sampai 100 mL, sehingga konsentrasi awal 0,025 g/100 mL. Diambil 250 µL larutan fraksi, ditambahkan metanol dalam labu ukur 10 mL sampai tanda, sehingga konsentrasinya menjadi 0,00625 g/100 mL = 6,25 mg/100 mL = 6,25 mg%. Larutan kedua yang digunakan dalam penentuan kadar flavonoid total, yang selanjutnya dinamakan sampel.


50

Diambil 250 μL sampel dan dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku. Kadar flavonoid total dinyatakan sebagai gram ekuivalen kuersetin dalam setiap 100g berat kering ekstrak (g Ekivalen Kuersetin/100g).

G. Analisis Hasil 1. Data kromatografi berupa hRf dan warna bercak sebelum dan sesudah ditambah pereaksi, diamati dengan sinar tampak maupun dengan sinar UV 254 nm dan 365 nm, lalu dianalisis berdasarkan kriteria yang terdapat dalam pustaka untuk memperkirakan kandungan flavonoid. 2. Hasil absorbansi senyawa uji dengan absorbansi kontrol diolah menggunakan analisis regresi linear antara konsentrasi senyawa uji (x) dengan aktivitas antioksidan (y) untuk mendapatkan ES50. 3. Kadar senyawa flavonoid total dianalisis menggunakan persamaan regresi linear dengan data kurva baku secara intrapolasi.


51

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi tanaman merupakan langkah awal yang dilakukan dalam suatu penelitian yang menggunakan sampel berupa tumbuhan. Determinasi bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan digunakan dalam penelitian untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel analis fitokimia. Determinasi tanaman ketapang dilakukan di laboratorium biologi farmasi menurut buku Flora of Java (Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965). Hasil determinasi tanaman ketapang sebagai berikut: 1b-2b-3b-4b-12b-13b-14b-17b-18b-19b-20b-21b-22b-23b-24b-25b-26b-27b799b-800b-801b-802b-806b-807b-809b-810b-811b-825b-826b-829b-830b831b-832b-833b-834b-983b-984b-986b-991b-992b-993b-994b-995b-1014a1017a-1018b-1026b-1027b-1028b…..87. Combretaceae 1b….. Terminalia 1b-3b….. T. catappa L. B. Hasil Pengumpulan Bahan Buah ketapang yang akan digunakan diperoleh dari Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Buah dipetik pada pagi hari (pukul enam pagi) ketika proses fotosíntesis belum terjadi. Pada saat dipetik, dipilih buah yang tua tetapi belum matang dan masih berwarna hijau (tidak berwarna kuning atau 51


52

coklat). Umumnya kandungan flavonoid belum terbentuk maksimal ketika masih muda dan akan berkurang ketika sudah matang. Pada saat pemilihan dilakukan seleksi, buah yang akan digunakan pada kulit buahnya tidak terdapat bekas ulat, tidak

berjamur,

ataupun

busuk.

(konversi/biodegradasi/biotransformasi)

Karena

dapat

senyawa

atau

terjadi zat

aktif

perubahan sehingga

mempengaruhi mutu simplisia maupun ekstrak yang dibuat, dan dapat menjadi kontaminan (cemaran). Karena mutu ekstrak dipengaruhi bahan baku yang digunakan (Anonim, 2000). C. Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Ketapang Simplisia yang digunakan dalam proses penyarian adalah simplisia kering yang berupa serbuk. Karena lebih tahan lama dalam penyimpanannya dan tidak mudah rusak. Buah ketapang memiliki bagian-bagian. Dari luar ke dalam bagian-bagian buah ketapang sebagai berikut. Bagian eksokarpium berupa kulit buah yang berwarna hijau. Bagian mesokarpium berupa serat-serat yang tersusun menjadi serabut yang tebal, berwarna kuning gading. Bagian endokarpium berupa lapisan keras (seperti batok kelapa) yang melindungi biji yang terdapat di dalamnya, berwarna coklat. Terakhir adalah biji yang berwarna putih. Semua bagian dari buah ketapang digunakan dalam penelitian ini. Buah ketapang yang diperoleh dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan pengotor yang menempel pada kulit buah. Setelah bersih, air yang masih menempel pada buah ketapang dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Untuk memudahkan dalam pengeringan, buah ketapang yang sudah kering,


53

dihancurkan menggunakan alat penghancur (palu). Pengeringan untuk buah ketapang yang telah hancur dilakukan di dalam oven dengan suhu maksimal 55oC. Bahan simplisia dapat dikeringkan pada suhu 30oC sampai 90oC, tetapi suhu yang terbaik tidak melebihi 60oC (Anonim, 1985). Proses pengeringan dihentikan ditandai dengan mudah dipatahkannya buah ketapang. Penyerbukan buah ketapang yang telah kering menggunakan blender. Tujuan dari penyerbukan adalah untuk memperluas permukaan simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari dan untuk mempermudah cairan penyari menembus simplisia (Anonim, 1985). Luas permukaan yang besar akan mengoptimalkan pembasahan serbuk simplisia oleh cairan penyari sehingga hasil penyarian juga optimal. Simplisia lunak lebih mudah ditembus oleh cairan penyari, sedangkan simplisia keras perlu dilakukan penyerbukan untuk mempermudah cairan penyari menembus simplisia. Serbuk yang didapat kemudian diayak dengan pengayak berukuran mesh 8/24. Derajat halus yang dinyatakan dengan 2 nomor (8/24) mempunyai pengertian semua serbuk dapat melalui ayakan dengan nomor terendah (8) dan tidak lebih dari 40% melewati ayakan nomor tertinggi (24). Penggunaan nomor mesh yang berbeda ini tidak memberikan pengaruh yang berarti pada hasil penyarian karena meskipun serbuk lebih halus namun serbuk masih dapat tersaring dan tidak masuk ke dalam perkolat saat proses penyaringan. Serbuk yang dipakai dalam penyarian adalah serbuk yang dapat melalui ayakan dengan nomor mesh 8 dan serbuk yang tidak lebih dari 40%nya melewati ayakan dengan nomor mesh 24.


54

Makin halus serbuk simplisia, proses ekstraksi makin efektif, namun semakin halus serbuk, makin rumit dalam tahap filtrasi (penyaringan), karena butir-butir halus tersebut membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dari hasil penyarian (Anonim, 1986); Anonim, 2000). Dalam Anonim (1986) menyebutkan, simplisia yang terlalu halus akan memberikan kesulitan pada proses penyarian. Pada proses perkolasi, bila serbuk terlalu halus cairan penyari tidak dapat turun, karena ruang antar sel berkurang, dimana ruang antar sel merupakan jalan yang mudah ditembus oleh cairan penyari. Hal ini meyebabkan pemilihan ayakan dengan nomor mesh 8/24. Penyarian dilakukan dengan metode perkolasi. Penyarian bertujuan untuk mendapatkan senyawa aktif yang diinginkan. Metode perkolasi memiliki keuntungan yaitu karena menggunakan pelarut yang selalu baru maka terjadi peningkatan derajat perbedaan konsentrasi sehingga lebih efektif untuk menyari senyawa aktif karena memungkinkan zat yang larut dalam pelarut tersari hampir seluruhnya. Proses penyariannya tidak menggunakan panas sehingga senyawa yang tidak tahan panas, tidak akan rusak. Penyari yang digunakan adalah etanol 70% dengan pertimbangan kombinasi etanol-air mempunyai sifat polar yang diharapkan mampu menyari senyawa polar maupun yang semi polar. Campuran etanol-air digunakan untuk meningkatkan penyarian (Anonim, 1986). Pelarut etanol dapat dengan efisien berpenetrasi ke dalam membran sehingga mendorong terekstraksinya sejumlah besar komponen endoseluler (Silva et.al, 1998). Senyawa polifenol (misal flavonoid) merupakan senyawa yang cenderung bersifat polar karena banyak mengandung gugus hidroksi sehingga diharapkan senyawa


55

flavonoid dalam buah ketapang dapat tersari ke dalam etanol 70%. Selain itu etanol bersifat universal, selektif, aman dan lebih ekonomis. Etanol bersifat universal karena dapat melarutkan sebagian besar kandungan kimia (senyawa organik) dalam simplisia. Selektif artinya etanol bersifat polar sehingga dapat menyari senyawa yang bersifat polar yaitu flavonoid sehingga penyarian dapat optimal. Aman karena dibandingkan pelarut yang lain etanol lebih aman bagi kesehatan dan lingkungan serta tidak beracun. Bersifat ekonomis karena etanol lebih murah harganya. Serbuk simplisia yang akan diperkolasi tidak langsung dimasukkan ke dalam bejana perkolasi (perkolator), tetapi dibasahi atau direndam dulu dengan cairan penyari dalam bejana tertutup selama 24 jam (Anonim, 1986). Bila serbuk simplisia tersebut langsung dialiri dengan cairan penyari maka cairan penyari tidak dapat menembus sel dengan sempurna. Jika serbuk simplisia telah tebasahi dengan sempurna maka aliran cairan penyari tidak akan mengalami hambatan sehingga aliran cairan penyari akan merata dan dapat menembus sel dengan sempurna. Pembasahan juga bertujuan untuk memberikan kesempatan sebesarbesarnya kepada cairan penyari memasuki seluruh pori-pori simplisia sehingga memudahkan penyarian selanjutnya. Selama proses perkolasi, perkolator ditutup rapat yang bertujuan untuk mencegah masuknya kontaminan dari luar dan untuk mencegah penguapan dari cairan penyari. Perkolator juga diletakkan pada tempat yang terlindung dari cahaya matahari. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kerusakan


56

senyawa-senyawa akibat terpapar cahaya matahari atau untuk mencegah terjadinya reaksi beberapa senyawa dengan bantuan cahaya matahari. Penetesan pada keran diatur dengan kecepatan tetesan 20-30 tetes per menit (1mL per menit) (Anonim, 1986). Jika terlalu cepat, penyarian tidak sempurna dan jika terlalu lambat akan membuang waktu dan kemungkinan penguapan cairan penyari lebih besar. Proses penyarian dilakukan sampai perkolat yang menetes warnanya sama dengan cairan penyari (jernih). Hal ini menunjukkan bahwa sudah tidak ada lagi senyawa aktif dalam serbuk simplisia yang dapat dilarutkan oleh cairan penyari. Perkolat yang didapatkan sebelum dipekatkan disaring dulu dengan kertas saring. Tujuan adalah untuk menghilangkan pengotor yang didapat dari lingkungan ataupun serbuk yang lolos dari perkolator. Pemekatan menggunakan rotavapor sampai hampir semua etanol menguap. Kelebihan dari rotavapor adalah dengan penguapan pada tekanan rendah suhu yang digunakan juga rendah (<50oC) sehingga senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan tidak rusak. Setelah proses penguapan dianggap cukup, perkolat yang didapatkan dikentalkan di atas penangas air dengan suhu maksimal 50oC sampai didapat ekstrak kental, yang selanjutnya disebut ekstrak etanol. Pemekatan dengan rotavapor bertujuan untuk meningkatkan jumlah senyawa terlarut dalam pelarut, didapat ekstrak pekat, sedangkan penangas air digunakan untuk mengentalkan ekstrak, karena diinginkan ekstrak kental untuk digunakan dalam penelitian. Ketika dipanaskan dengan penangas air semua pelarut dihilangkan. Berat ekstrak etanol 27,07 g


57

dengan rendemen sebesar 18,05%. Ekstrak disimpan dalam eksikator untuk melindungi dari uap air udara. D. Hasil Pembuatan Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang Pembuatan fraksi etil asetat menggunakan proses ekstraksi dengan menggunakan dua pelarut yang tidak saling campur. Ekstrak kental etanol yang didapat dilarutkan terlebih dahulu dengan 100 mL air hangat, dan kemudian disebut sebagai fraksi air. Tujuan dari proses separasi adalah menghilangkan (memisahkan) senyawa yang tidak dikehendaki semaksimal mungkin tanpa berpengaruh pada senyawa kandungan yang dikehendaki, sehingga diperoleh ekstrak yang lebih murni (Anonim, 2000). Proses separasi dilakukan dengan menggojok fraksi air dalam corong pisah menggunakan pelarut etil asetat. Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan untuk digunakan dalam proses pemurnian (Robinson, 1995). Pada saat pemisahan fraksi etil asetat berada di atas sedangkan fraksi air berada di bawah. Hal ini disebabkan karena berat jenis air (0,997) lebih besar dari etil asetat (0,898). Fraksi air diekstraksi dengan etil asetat sebanyak 100 mL, ekstraksi diulang 9 kali. Etil asetat yang ditambahkan sebanding dengan air yang ditambahkan ketika pertama akan mempartisi, sebanyak 100 mL. Ekstraksi dilakukan berulang dengan jumlah pelarut yang sedikit dimaksudkan untuk mengefektifkan separasi artinya senyawa yang diinginkan akan didapat dalam jumlah yang lebih banyak. Sembilan kali ekstraksi merupakan hasil optimasi. Pada saat menggojog, kekuatan yang diberikan tidak terlalu keras (hanya penggojogan lemah saja) untuk menghindari terjadinya emulsi, karena proses


58

pemisahan akan berlangsung lebih lama ketika terbentuk emulsi. Selanjutnya, fraksi air dibuang dan fraksi etil asetat dikentalkan (diuapkan di atas penangas air) sampai didapat ekstrak kental etil asetat, yang selanjutnya disebut fraksi etil asetat. Berat fraksi etil asetat 4,28 g, dengan rendemen 2,85%. E. Hasil Uji Kualitaif Flavonoid dengan metode KLT

Gambar 9 . Struktur rutin

Pada penelitian ini dilakukan uji kualitatif terhadap fraksi etil asetat untuk mengetahui apakah di dalam buah ketapang mengandung flavonoid. Sebagai pembanding digunakan rutin yang merupakan senyawa golongan flavonoid. Rutin merupakan glikosida flavonol yang pada umumnya terdapat dalam tanaman, dan terdiri atas kuersetin (aglikon) dan disakarida rutinosa. Metode yang digunakan adalah metode KLT, dengan selulosa sebagai fase diam dan n-butanol-asam asetat-air (BAA) 4:1:5 v/v sebagai fase gerak. Fase diam tidak menggunakan silika gel GF 254 karena dapat membentuk ikatan dengan flavonoid. Hal ini menyebabkan flavonoid tidak dapat terelusi dengan baik. Ikatan yang terjadi adalah ikatan dengan Ca (kalsium) yang terdapat pada gipsum (perekat) pada silika gel GF 254. Fase geraknya BAA karena disarankan untuk pemeriksaan awal keberadaan flavonoid. Penjenuhan menggunakan kertas saring. Tujuan dari


59

penjenuhan chamber adalah untuk mempercepat elusi sehingga waktu yang digunakan lebih singkat.

1

2

100

100

90

90

80

80

70

70

60 50 40 30 20 10

1

2 100 90 80 70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

0

0

hRf

hRf

A

B

hRf

C

Gambar 10 Foto kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air (4:1:5)v/v, deteksi: uap amonia, pengembangan: 10cm. Keterangan:A: cahaya tampak, B: UV 365, C: UV 254 1: rutin, 2: fraksi etil asetat

Deteksi bercak menggunakan uap amonia. Warna kedua bercak tidak nampak ketika dilihat pada cahaya tampak baik sebelum maupun setelah diuapi amonia. Warna kedua bercak nampak ketika dilihat pada UV 365 dan UV 254 setelah diuapi amonia. Kedua bercak memberikan warna kuning tua ketika diamati baik pada UV 365 dan UV 254. hRf rutin: 63 dan hRf fraksi etil asetat: 64. Hal tersebut diatas menunjukkan dalam fraksi etil asetat terdapat flavonoid, dapat dilihat dari warna bercak yang sama dan hRf yang berdekatan.


60

100 100

90

90

80

80

70

70

60

60 50 40 30 20 10

100 90 80 70 60

50

50

40

40

30

30

20

20

10

10

0

0

hRf

0

hRf

Gambar 11 Foto kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air (4:1:5) v/v, deteksi: pereaksi semprot besi (III) klorida, pengembangan: 10 cm. Keterangan: A: cahaya tampak, B: UV 365, C: UV 254 1: rutin, 2: fraksi etil asetat

Penyemprotan dengan besi (III) klorida memberikan kromatogram dengan empat bercak, tiga bercak berasal dari fraksi etil asetat dan yang satu adalah rutin yang digunakan sebagai pembanding. Rutin dengan warna coklat kekuningan memberikan hRf: 68. Untuk fraksi etil asetat ketiga bercak memberikan warna yang berbeda-beda. Bercak a berwarna ungu dengan hRfa: 69, untuk bercak b dan c berwarna biru tua dengan hRfb: 85 dan hRfc: 95. Hal tersebut diatas menunjukkan dalam fraksi etil asetat terdapat flavonoid, dapat dilihat dari hRf yang berdekatan antara bercak a dan rutin. Bercak b dan c diperkirakan masuk dalam golongan flavonol (kuersetin atau erictodiol). Kesimpulan dalam analisis kualitatif ini adalah dalam buah ketapang terdapat flavonoid yang tersari dalam fraksi etil asetat.

hRf


61

F. Optimasi Metode 1. Penentuan waktu operasi Penentuan waktu operasi (operating time) bertujuan untuk mendapatkan waktu pengukuran absorbansi dengan nilai stabil. Waktu operasi ditentukan pada saat terbentuknya warna yang stabil, ditandai dengan nilai absorbansi yang stabil dari senyawa yang diukur. Penentuan waktu operasi dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan kontrol dengan tujuan mendapatkan waktu operasi senyawa kromogen MDA-TBA tanpa adanya gangguan senyawa lain. Pengukuran absorbansi setelah larutan kontrol diinkubasi pada suhu 80oC kemudian didinginkan 5 menit dibawah air mengalir. Waktu pengukuran absorbansi kontrol adalah 30 menit. Hasil pengukuran absorbansi menunjukkan pada menit ke 0 sampai menit ke 30 memberikan nilai absorbansi yang stabil, yaitu 0,981. Kestabilan nilai absorbansi menunjukkan bahwa jumlah kromogen MDATBA relatif stabil. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA dipercepat dengan adanya panas. Pada penelitian ini, panas yang diterima larutan berasal dari pemanasan dengan waterbath pada suhu 80oC. Setelah 30 menit melalui tahap pemanasan, larutan didinginkan selama 5 menit sehingga suhu larutan sama dengan suhu lingkungan . Ketiadaan panas ini memperlambat reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA.


62

Gambar 12. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA

Pada metode deoksiribosa, proses degradasi deoksiribosa menjadi MDA terjadi pada saat larutan campuran diinkubasi pada suhu 37oC. Selanjutnya penambahan TCA menyebabkan larutan dalam suasana asam (pH rendah). MDA kemudian akan bereaksi dengan TBA membentuk kromogen MDA-TBA. Selain memberikan suasana asam TCA menghambat proses oksidasi vitamin C sehingga proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+ terhambat pula. Terhambatnya reaksi ini mengakibatkan terhambatnya pembentukan radikal hidroksil sehingga terjadi penurunan kecepatan degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil. Reaksi yang terjadi sebagai berikut.


Fe3+ EDTA + Asam Askorbat

63

Fe2+ EDTA + Asam Dehidro Askorbat

.

Fe2+ EDTA + H 2 O 2

Fe3+ EDTA + -OH + OH

Radikal hidroksil yang terjadi akan menyerang deoksiribosa dengan cara abstraksi (pemisahan) hidrogen dan membentuk suatu radikal deoksiribosa kemudian dengan adanya oksigen akan secara cepat diubah menjadi radikal gula peroksil. Selanjutnya radikal gula peroksil akan mengalami serangkaian reaksi yang meliputi disproposionasi, penataan ulang, eliminasi air dan pemecahan ikatan C-C menjadi malondialdehid (MDA) dan produk yang lain (Purwantoko, 2007). Selain memberikan suasana asam, penambahan TCA berfungsi sebagai katalis pembentukan kromogen MDA-TBA. Adanya H+ mengakibatkan pengubahan salah satu gugus keton pada TBA menjadi lebih reaktif sehingga TBA dapat bereaksi dengan MDA.

H S

N

H O

H

S

N

O H

N

+H

N H

H O

H

H O

Gambar 13. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA

64


OH

OH H

H

O

H2C

OH

O

H2C

OH

H2O

OH H

HO

HO

deoksiribosa

OH O

H2C

H

OH

H

H OH

O

H2C

O

H

H HO

HO

OH OH OH

H2C

O

OH

H2C

O

H

H

H2O

H

O

- H2O

OH

O

O OH

H2C

O

HO

oksidasi

H

OH

O

O

H H

H

H

O

O

H

OH

OH H

O

malondialdehid

Gambar 14. Reaksi pembentukan MDA

65


S

H

O

H

S

H

N

O

+H

O

H

H

H

N H

H

O

O

H

O

O

TBA

S

N

H

+

N

N H

O OH

+

H

H

N

TBA

H

MDA

O

+H H

H S

O

N

O H

H

H N

- H2 O

N

OH

H

H

H N H

H

O

O

H

O

OH

OH

H O

N

S

N

+H

H S

O

N

- H2O

H

H H

O

+H

N O

H

H S

S

N

H

O H

N

S

N

S

O

O

H

N

+H

N

N

H

N

N H

O

H

H S

H

H

O

O

O

+H

H HS

OH

N

HO

S

S

N

N

H OH

HO

S

N

+H N

N OH

OH

N

N

H

H OH

H

OH

MDA-TBA warna merah muda

Gambar 15. Mekanisme reaksi pembentukan MDA-TBA (Purwantoko, 2006)


66

Senyawa MDA yang dihasilkan dari reaksi degradasi deoksiribosa merupakan senyawa yang tidak berwarna. Reaksi pengkoplingan MDA dengan TBA membentuk kromogen yang berwarna merah muda. Warna ini terbentuk karena ada perpanjangan gugus kromofor dan penambahan gugus auksokrom. N

HS

OH

HO

S

N

N

N

gugus kromofor OH

OH

gugus auksokrom

Gambar 16. Struktur kromogen MDA-TBA

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Menurut Kunchandy dan Rao (1998), panjang gelombang serapan maksimum teoritis kromogen MDA-TBA adalah 532 nm. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dalam penelitian ini dilakukan untuk verifikasi terhadap panjang gelombang serapan maksimum teoritis karena terdapat beberapa kondisi percobaan yang berbeda antara penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan. Perbedaan itu antara lain perbedaan waktu, iklim dan perbedaan individu yang melakukan. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan kontrol, yaitu larutan tanpa penambahan sampel dengan tujuan mendapatkan panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda tanpa gangguan senyawa lain yang ada dalam sampel. Dari hasil scanning


67

yang dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm didapatkan panjang gelombang maksimum untuk kromogen MDA-TBA dalam penelitian ini adalah 532,2 nm. Panjang gelombang yang didapat mendekati panjang gelombang teoritis yaitu 532nm. Selisih panjang gelombang teoritis dengan hasil penelitian adalah 0,2 nm, selisih nilai ini masih memenuhi selisih yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi IV, yaitu kurang dari 2 nm. Karena hal diatas, panjang gelombang yang diperoleh dapat digunakan dalam penelitian.

Gambar 17. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA

Panjang gelombang serapan maksimum merupakan faktor penting di dalam analisis kimia dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Tujuan


68

menentukan panjang gelombang maksimum dalam penelitian ini adalah untuk mencari panjang gelombang saat kromogen MDA-TBA dapat memberikan serapan yang optimum. Panjang gelombang yang didapat akan digunakan untuk mengukur serapan kompleks yang dianalisis. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang bersifat karakteristik. Panjang gelombang maksimum tidak tergantung pada struktur molekul suatu senyawa tetapi bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UV-Vis sehingga jika ada dua senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama, belum tentu kedua senyawa tersebut sama. Hal inilah yang menyebabkan panjang gelombang maksimum digunakan sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif. Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum karena perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum. Selain itu kurva serapan disekitar panjang gelombang serapan maksimum tersebut relatif lebih datar sehingga jika dilakukan pengukuran ulang atau replikasi, kemungkinan kesalahan yang terjadi makin kecil (Mulja dan Suharman, 1995). G. Hasil Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa Metode deoksiribosa yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan prosedur kerja maupun konsentrasi mengarah pada penelitian Purwantoko (2006). Berdasarkan penelitian Purwantoko (2006), metode deoksiribosa memilki akurasi,


69

presisi dan linearitas yang baik sehingga dapat digunakan untuk menguji aktivitas penangkapan radikal hidroksil. Berdasarkan tabel IV, absorbansi larutan kontrol lebih tinggi daripada larutan sampel karena pada larutan kontrol tidak terdapat senyawa penangkap radikal hidroksil sehingga deoksiribosa langsung didegradasi oleh radikal hidroksil. Pada larutan sampel, dimungkinkan terdapat senyawa penangkap radikal hidroksil yang mengakibatkan penurunan jumlah degradasi deoksiribosa. Terbukti dengan adanya penurunan absorbansi kromogen MDA-TBA dari larutan sampel pada berbagai konsentrasi. Tabel IV. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat buah ketapang dengan berbagai konsentrasi

I

Konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang (mg/mL) 0 0,033 0,067 0,100 0,133 0,167 1,070 0,448 0,436 0,426 0,405 0,387

II

1,072

0,515

0,448

0,413

0,365

0,330

III IV V

1,071 1,070 1,073

0,582 0,545 0,577

0,559 0,510 0,535

0,509 0,461 0,516

0,455 0,431 0,478

0,438 0,405 0,451

VI

1,071

0,582

0,552

0,526

0,486

0,457

Rata-rata SD

1,071 0,001

0,542 0,048

0,507 0,053

0,475 0,049

0,437 0,046

0,411 0,048

Replikasi


70

absorbansi

1.2

0.8

0.4

0.0 0

0.05

0.1

0.15

0.2

konsentrasi (mg/ml)

Gambar 18. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang dengan absorbansi kromogen MDA-TBA

Semakin besar konsentrasi fraksi etil asetat yang ditambahkan maka terjadi penurunan

absorbansi.

Penurunan

absorbansi

ini

disebabkan

peristiwa

penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang. Peristiwa ini mengakibatkan penurunan jumlah radikal hidroksil yang akan mendegradasi deoksiribosa akibatnya terjadi penurunan MDA. Adanya penurunan jumlah MDA mengakibatkan penurunan jumlah kromogen MDA-TBA yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi larutan dengan sampel pada berbagai konsentrasi dibandingkan dengan larutan kontrol. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dinyatakan dalam persen scavenging. Nilai persen scavenging dihitung dari selisih antara purata absorbansi sampel (fraksi etil asetat) pada konsentrasi tertentu, dibagi purata absorbansi blangko dikalikan 100%.


71

Tabel V. Persen scavenging fraksi etil asetat buah ketapang

Konsentrasi Fraksi Etil Asetat (mg/mL)

% Scavenging Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang

0,033 0,067 0,100 0,133 0,167

46,51 49,66 52,83 56,61 59,19

Persamaan Regresi Linear

Y= 96,711 X + 43,289 A = 43,289 B = 96,711 r = 0,9985

% scavenging

80

60

40

20

0 0

0.05

0.1

0.15

0.2

konsentrasi (mg/ml)

Gambar 19. Kurva hubungan kenaikan konsentrasi fraksi etil asetat dengan % scavenging

Persamaan regresi linear yang didapat adalah Y= 96,711X + 43,289 dengan r = 0,9985 lebih besar dari r tabel (db = 4; P’ = 0,05), sebesar 0,811 (Muth, 1999), sehingga persamaan di atas dapat digunakan untuk menghitung nilai ES 50 dari fraksi etil asetat buah ketapang. Nilai ES 50 berbanding terbalik dengan kemampuan senyawa untuk menangkap radikal hidroksil. Semakin kecil nilai ES 50 maka sampel tersebut mempunyai nilai keefektifan sebagai penangkap radikal hidroksil (sebagai antioksidan) yang lebih baik. Nilai ES 50 fraksi etil asetat buah ketapang 0,06939 mg/mL = 69,39 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa dengan konsentrasi 69,39 µg/mL fraksi etil asetat buah ketapang dapat menangkap 50% radikal hidroksil yang terdapat dalam larutan.


72

Jika dibandingkan dengan ES 50 fraksi etil asetat teh hijau sebesar 0,22 mg/ml (Dewi, 2007) dan ES 50 fraksi etil asetat teh hitam sebesar 0,22 mg/ml (Leny, 2007), fraksi etil asetat buah ketapang mempunyai nilai keefektifan sebagai penangkap radikal hidroksil (sebagai antioksidan) yang lebih baik. Hal ini dikarenakan nilai ES 50 fraksi etil asetat buah ketapang, yaitu sebesar 69,39 µg/mL lebih kecil dibandingkan ES 50 fraksi etil asetat teh hijau dan teh hitam. Flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat buah ketapang dapat mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan. Karena flavonoid yang terkandung dalam fraksi etil asetat dalam bentuk aglikon dan yang terikat gula. Mekanisme penangkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dalam fraksi etil asetat disebabkan karena terdapat gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Gugus ini berperan besar dalam mendonorkan atom hidrogennya ketika diserang oleh radikal hidroksil, flavonoid-flavonoid tersebut akan membentuk radikal bebas baru yang lebih stabil yaitu radikal fenoksil (FIO•) dan molekul air yang stabil. FIOH + •OH

FIO• + H 2 O

Radikal fenoksil tersebut akan mengalami efek resonansi pada cincin aromatiknya, hal inilah yang menyebabkan radikal fenoksil lebih stabil daripada radikal hidroksil. Radikal fenoksil juga akan melakukan terminasi yaitu penggabungan dengan radikal bebas lain. Reaksi terminasi ini dapat terjadi antara radikal fenoksil dengan radikal hidroksil maupun dengan radikal fenoksil lainnya. FIO• + •OH

FIO-OH

FIO• + FIO•

FIO-FIO


73

Fase propagasi dari radikal hidroksil dapat dihambat karena flavonoid memiliki kemampuan menangkap radikal hidroksil. Hal inilah yang menyebabkan berkurangnya radikal hidroksil yang menyerang deoksiribosa ketika penambahan fraksi etil asetat buah ketapang ke dalam campuran pereaksi fenton dan deoksiribosa. Setiap konsentrasi fraksi etil asetat meningkat, absorban yang terbaca menjadi menurun. Hal ini menunjukkan semakin meningkat konsentrasi berarti semakin banyak flavonoid yang terkandung di dalamnya, sehingga radikal hidroksil yang akan menyerang deoksiribosa akan semakin berkurang. Menyebabkan deoksiribosa yang didegradasi berkurang, sehingga kromogen MDA-TBA yang terbentuk juga semakin sedikit dan menyebabkan ansorbansinya berkurang.

O

O H O

O

OH

+

OH

OH

H 2O

O

O

O O

OH O

O O

OH O

Gambar 20. Mekanisme penegkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dan efek resonansi yang terjadi pada flavonoid


74 O

O

O O

O

+

O OH

OH O

OH

O

O O HO

O O

Gambar 21. Reaksi kopling radikal fenoksil

H. Penentuan Kadar Senyawa Flavonoid Total Tujuan dari penentuan kadar flavonoid total adalah untuk melihat korelasi antara aktivitas antioksidan dengan kadar flavonoidnya. Dasar penetapan flavonoid menggunakan spektrofotometri visibel adalah terbentuknya kompleks antara flavonoid dengan logam Al menghasilkan warna kuning yang bila direaksikan dengan basa kuat (NaOH) memberikan warna merah muda. Intensitas warna yang terbentuk dapat diukur pada panjang gelombang 510 nm. AlCl 3 dapat membentuk kompleks yang stabil dengan atom C nomor 3 dan atom C nomor 5 pada flavonoid. Namun pada golongan yang mengandung sistem ortohidroksi pada cincin A dan B, akan membentuk kompleks yang tidak stabil dan akan terdekomposisi dengan penambahan asam. Aglikon flavonoid yang sifatnya kurang polar jika dibandingkan dengan gula akan lebih banyak tersari ke dalam fraksi etil asetat. Gula dari flavonoid akan lebih tersari ke dalam air, dimana air lebih polar jika dibandingkan dengan etil asetat. Keberadaan gugus gula pada glikosida flavonoid menyebabkan rintangan sterik sehingga menghambat reaksi penangkapan radikal yang digambarkan

75


dengan ES 50 yang tinggi. Hal ini menyebabkan glikosida flavonoid kurang efektif sebagai antioksidan dibanding bentuk aglikonnya. Selain itu, aktivitas antioksidan flavonoid disebabkan karena adanya gugus hidroksi pada struktur molekulnya. Flavonoid dengan gugus hidroksi bebas mempunyai aktivitas sebagai penangkap radikal dan adanya gugus hidroksi lebih dari satu terutama pada cincin B akan meningkatkan aktivitas antioksidannya. Reaksi yang terjadi antara flavonoid dengan logam Al dalam suasana basa adalah sebagai berikut. O OH

Al HO

HO

O O

O OH

AlCl3 netral

O

OH OH

O

O

O

Al

Al

Kuersetin

Cl Cl

Cl

Cl

Kompleks kuersetin - AlCl3 (Kuning) NaOH O Al O

Cl

O O O O

O

Al

Al Cl

Cl Cl Cl

Merah muda

Gambar 22. Reaksi yang terjadi dalam penetapan kadar flavonoid

Natrium nitrit (NaNO 2 ) digunakan sebagai buffer yang bertujuan untuk mempertahankan pH larutan karena jika pH larutan sangat asam, kompleks AlCl 3

Cl


76

dengan kuersetin terbentuk tidak optimum. Penambahan basa (NaOH) dimaksudkan untuk meningkatkan intensitas warna kompleks yang terbentuk. Tabel VI. Kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan dengan AlCl 3 dalam suasana basa

Kadar Kuersetin (mg/100 ml) 0,1632 0,2448 0,3264 0,4080 0,4896 0,6120 0,7344

Absorbansi

0,188 0,284 0,353 0,417 0,484 0,548 0,685

Persamaan regresi linear

Y= 0,821 X + 0,073 r = 0,995 X = kadar kuersetin (mg/mL) Y = absorbansi

Gambar 23. Kurva kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan dengan AlCl 3 dalam suasana basa

Persamaan regresi linear yang diperoleh adalah Y= 0,821 X + 0,073 ditulis sebagai kurva baku kuersetin disajikan pada gambar 16. Dari tabel V diperoleh nilai koefisien korelasi, r = 0,995; lebih besar dari r tabel (db = 6; P’ = 0,05), sebesar 0,707 (Muth, 1999), sehingga persamaan di atas dapat digunakan untuk menghitung kadar flavonoid total dari fraksi etil asetat buah ketapang. Kadar flavonoid dalam fraksi etil asetat disajikan dalam tabel berikut.


77

Mula-mula, menimbang fraksi etil asetat sebanyak 25 mg kemudian ditambahkan metanol dalam labu ukur sampai 100 mL, sehingga konsentrasi awal 0,025 g/100 mL. Diambil 250 µL larutan fraksi, ditambahkan metanol daalm labu ukur 10 mL sampai tanda, sehingga konsentrasinya menjadi 0,00625 g/100 mL = 6,25 mg/100 mL. Larutan kedua yang digunakan dalam penentuan kadar flavonoid total, yang selanjutnya dinamakan sampel. Diambil 250 μL sampel dan dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku. Selanjutnya didapatkan absorbansi sampel. Contoh perhitungan penentuan kadar flavonoid total fraksi etil asetat replikasi pertama dengan absorbansi 0,246. dari persamaan regresi linear dari kurva baku kuersetin Y= 0,821 X + 0,073 didapat X = 0,2107 mg/100 ml Kadar flavonoid total =

kadar flavonoid x 100 % kadar fraksi etil asetat

Kadar flavonoid total =

0,2107 mg / 100 ml x 100% 6,25 mg / 100 ml

= 3,376 % b/b Tabel VII. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat dihitung sebagai % b/b ekivalen kuersetin

Sampel Fraksi etil asetat 0,25%

Faktor pengenceran 40x

0,246

X (mg/100ml) 0,2107

Kadar (% b/b) 3,376

0,243

0,2071

3,313

0,238

0,2010

3,216

Absorbansi

X ± SD

3,302 ± 0,0806

Dengan kadar flavonoid sebesar 3,302 ± 0,0806 sudah dapat memberikan aktivitas antioksidan sebesar 69,39 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa flavonoid


78

yang berada dalam fraksi etil asetat dapat memberikan kontribusi sebagai antioksidan. Untuk mengetahui kepastian dari flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat buah ketapang dapat diketahui dengan menggunakan pendekatan perhitungan serapan jenis (A1%,1cm). Dengan perhitungan serapan jenis, dapat diketahui serapan jenis untuk flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat berbeda atau tidak dengan serapan jenis untuk kuersetin. Serapan jenis (A1%,1cm) adalah serapan dari larutan 1 % zat terlarut dalam sel dengan ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada panjang gelombang tertentu dalam suatu pelarut merupakan sifat dari zat terlarut (Anonim, 1995). Data serapan jenis yang diperoleh diuji dengan uji Kolmogorov-Smirnov untuk melihat kenormalan distribusi data. Hasil analisis menunjukkan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p > 0,05 yaitu sebesar 0,052, maka analisis dapat dilanjutkan dengan uji Anava satu arah dengan taraf kepercayaan 95 %. Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan antar kelompok. Uji Anava satu arah memiliki p < 0,05 yang menunjukkan adanya perbedaan antar kelompok. Karena nilai p = 0,180, maka flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat buah ketapang tidak berbeda dengan kuersetin.


79

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

1. Kesimpulan 1. Fraksi etil asetat buah ketapang memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang dapat diketahui dari nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil yang dinyatakan sebagai ES 50 adalah 69,39µg/mL. 2. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang sebesar 3,302 %b/b ekivalen kuersetin.

2. Saran 1.

Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat buah ketapang dengan metode yang lain seperti metode penangkapan radikal DPPH.

2. Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi lebih lanjut untuk mengetahui senyawa flavonoid yang terkandung di dalam fraksi etil asetat buah ketapang. 3. Perlu dilakukan identifikasi jenis flavonoid (dengan melihat struktur) yang terkandung dalam fraksi etil asetat dengan spektrofotometri massa dan NMR.

79


80

DAFTAR PUSTAKA Amarowicz, R., Naczk, M., dan Fereiodon, Shahidi., 2000, Antioxidant Activity of Crude Tannins of Canola and Repessed Hulls, JAOCS, 77, 957-961 Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid V, 482-485, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, 9-12, Departemen Kesehatan RI, Rektorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Direktorat Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim,

2006a, Sea Almond Tree, http://www.naturia.per.sg/buloh/plants/sea_almond.htm. Diakses pada 13 Oktober 2006

Anonim,

2006b, Terminalia http://en.wikipedia.org/wiki/Terminalia_catappa, Oktober 2006

Diakses

Catappa, pada 13

Backer, C.A., and Brink, R.C. Bakhuizen van den., 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only), volume I, Published Der The Auspices of The Ruksherbakiu, Wolters Noordhoff, NVP, Groningen De Netherlands Bast, Aalt., 1991, Oksidant and Antioksidant : State of Art, The American Journal of Medicine, Preceeding of A Symposium Oxicant and Antioxidant : Patophysiologic Detyerminants and Therapeutics Agents, pp.25,30 Buhler, Dr. Donald R., and Miranda, Dr. Cristobal, Antioxidant Activities of Flavonoids, The Linus Pauling Institute, Oregon State University, [email protected], diakses 30 Juni 2007 Bors, Wolf., Michel, Christa., and Stettmainer, Kurt., The Virtual Free Radical School Flavonoids and Their Free Radical Reactions, Inst. Strahlenbiol., GSF Research Center, Neuherberg, Germany, diakses 15 April 2005 Caillet, S., Salmieri, S., dan Lacroix, M., 2006, Evaluation of Free RadicalScavenging Properties of Commercial Grape Phenol Extracts by A Fast Colorimetric Method, J.Food Chem., 95, 1-6


81

Chyau, Charng-Cherng., Tsai, Shu-Yao., Ko, Pei-Tzu., 2002, Mau, Jeng-Leun., Abstract: Antioxidant Properties of Solvent Extracts from Terminalia catappa leaves, J. Food chemistry, 78(4), 483-488 Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1991, Comparison of The Antioxidative of Some Acid Phenols : Structure Activity Relathionship, Biosci. Biotech. Biochem., 5 (2), 324-325 Davidek, 1997, in Macek, K., 1972, Pharmaceutical Ahallications Of Thin Layer Chromatography, 569, 608-611, Elseiver Publishing Company, Amsterdam, London, New York Dewi, Aprilliana Sari., 2006, Uji Antioksidan Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Etanol Teh Hijau Melalui Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, 119-220, diterjemahkan oleh Pujaatmaka, A.H., edisi ke 3, Penerbit Erlangga Jakarta Fouad,

T., 2005, Antioxidant, Nature and Chemistry, http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant, diakses tanggal 25 juni 2005

Gilman, Edward F., and Watson, Dennis G., Terminalia catappa - Tropical Almond, Fact Sheet ST-626, Environmental Horticulture department, Florida Cooperative Department, diakses tanggal 13 Oktober 2006 Giorgio, P., 2000, Flavonoid as Antioxidant, Journal National Product, 63: 10351042 Grittter, R., Bobbit, J.M., dan Schwarting, A., 1991, Pengantar Kromatografi, 725, diterjemahkan oleh Padwaninata, K., Penerbit ITB, Bandung Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., and Auroma, O.I., 1987, The Deoxyribose Method : A Simple ‘Test-Tube’ Assay for Deteminations of Rate Constants for Reaction of Hydroxyl Radical, Anal. Biochem, 165, 215219, Academic Press, London Halliwell, B, 1991, Reactive Oxigent Spesies In Living System : Source Biochemistry and Role in Human Disease, The American Journal of Medicine, Preceeding of A Symposium Oxicant and Antioxidant : Patophysiologic Detyerminants and Therapeutics Agents, pp.3, 12, 20


82

Halliwel, B. dan Auroma O.I., 1993, DNA and Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd ed, 1-231, 353-425, Oxford University Press Inc., New York Halliwell, B., and Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and Medicine, Third Edition, 368-369, Oxford University Press, New York Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, 47-109, diterjemahkan oleh Padwaninata, K., Penerbit ITB, Bandung Hertiani, T., 2000, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Antioksidan dari Daun Plantago major L., Tesis, Program Pasca Sarjana UGM, Yogyakarta Kahkonen, M.P., Hopia, A.I., Vuorela, H.J., Rauha, J.P., Pihlaja, K., Kujala, T.S., dan Heinomen, M., 1999, Antioxidant Activity of Extract Containing Phenolic Compounds, J. Agric. Food Chem., 47, 3954-3962 Kikuzaki, H., Hasimoto, M., Hirose, K., Akiyama, K., dan Taniguchi, H., 2002, Antioxidant Properties of Ferulic Acid and Its Related Compounds, J Agric. Food Chem., 50, 2161-2168 Kumalaningsih, Sri., 2007, Antioksidan Alami, Penangkal Radikal Bebas, 2-22, Trubus Agrisarana, Surabaya Kunchandy, Elizabeth., and Rao, M.N.A., Oxygen Radical Svavenging Activity of Curcumin, International Journal of Pharmaceutics, 58(1990), 237240 Lin, Chun-Ching., Hsu, Yu-Fang., Lin, Ta-Chen., Hsu, Hsue-Yin., 2001, Abstract: Antioxidant and Hepatoprotective Effects of Punicalagin and Punicalin on Acetaminophen-Induced Liver Damage in Rats, Phytoterapy Research, 15 (3), 206-212 Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic Identification of Flavonoid, 1-343, Springe-Verlag, New York Madhujith, T., and Fereiodon, Shahidi., 2005, Antioxidant of Pea Beans (Phaseolus vulgaris L.), J.Food Sci., 70(1), S85-S90 Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, 1-103, diterjemahkan oleh Padwanita, K., Penerbit ITB, Bandung


83

Mulja, M., dan Suharman., 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya Nagappa, A.N., Thakurdesai, P.A.,Venkat Rao, N., Singh, Jiwan., 2006, Antidiabetic Activity of Terminalia Catappa Fruits, J. of Ethnopharmacology, 88, 45-50 Nusarini, Ni Made Rahayu., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Percival, Dr. Mark., 1998, Antioxidant, Advanced Nutrition Publication, Inc. Pokorni, J., Yanishilieva, N., and Gordon, M., 2001, Antioxidant in Food, Practical Ahallications, 1-123, Wood Publishing Limited, Cambridge England Purwantoko, Ardhyan., 2006, Validasi Metode Deoksiribosa sebagai Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Vitamin C secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Robert, K.M, 1990, Harper’s Biochemistry, 20th edition, Pretice Hall International Inc, USA, pp 138,139,228 Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 191-213, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung Sastrohamidjojo, 2001, Spektroskopi, Edisi Kedua, 39-42, Liberty, Yogyakarta Setyawati, Leny., 2006, Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Silva, Lee, and Kinghorn, 1998, Special Problems with The Extraction of Plants, in Cannel, R.J.P. (Ed), Natural Product Isolation, 343-351, Humana Press Inc., New Jersey Silverstein R.M. dab Bassler, 1991, Spectrometric Identification of Organic Compounds, John Willey And Sons, Inc., New York Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental Analysis, 5th Ed, 11-14, 314-344, Harcourt Brace College, Philadelphia Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Mikroskopi (terjemahan), 3-17, 241-252, Penerbit ITB, Bandung


84

Supardjan, A. M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Uraiannya dalam Sediaan Tetrasiklin secara KLT Densitometri, Laporan Penelitiani, Lembaga Penelitian, Penerbit Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Syahbana, D dan Bahalwan, R.R., 2002, Seri Referensi Herbal: Pesona Tradisional dan Ilmiah Buah Mengkudu (Morinda citifolia L.), 5-20, Salemba Medika, Jakarta Thompson, Lex A.J., Evans, Barry., Terminalia Cattappa (tropical almond), www.traditionaltree.org, diakses tanggal 13 April 2006 Wardani, T., 2003, Pengaruh Penambahan EM-4 (Effective Microorganism-4) terhadap Kadar Kurkumin pada Maserasi Rimpang Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yoyakarta Wiyatsih, Esti., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Kloroform Ekstrak Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta


85

Lampiran 1. Tabel nilai koefisien korelasi (r) Nilai kepercayaan (r) pada beberapa taraf kepercayaan disajikan pada tabel berikut (Muth, 1999).

Derajat bebas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,1 0,988 0,900 0,805 0,730 0,669 0,622 0,582 0,549 0,521 0,497

Taraf Kepercayaan 0,5 0,01 0,001 0,997 0,999 1,000 0,950 0,990 0,999 0,878 0,959 0,991 0,811 0,917 0,974 0,755 0,875 0,951 0,707 0,834 0,925 0,666 0,798 0,898 0,632 0,765 0,872 0,602 0,735 0,847 0,576 0,708 0,823

Lampiran 2. Perhitungan rendemen Bobot serbuk

= 150 g

Bobot ekstrak etanol = 27,07 g Re ndemen =

bobot ekstrak kental x 100 % bobot serbuk

=

27,07 g x 100% 150 g

= 18,05%. Bobot fraksi etil asetat = 4,28 g Re ndemen =

bobot fraksi kental x 100 % bobot serbuk

=

4,28 g x 100% 150 g

= 2,85%.


86

Lampiran 3. Gambar kromatogram uji kualitatif flavonoid Pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air (4:1:5) v/v, pengembangan: 10 cm. Deteklsi: A: uap amonia, B: besi (III) klorida 1: rutin, 2: fraksi etil asetat

hRf

hRf c b a

1

2

1

A

2 B

Lampiran 4. Contoh perhitungan % scavenging fraksi etil asetat buah ketapang Rumus yang menyatakan besar penangkapan radikal hidroksil : % Scavenging =

Absorbansi laru tan kontrol − Absorbansi laru tan sampel Absorbansi

laru tan kontrol

% Scavenging

Konsentrasi 0,033 mg/ml =

1,071 - 0,542 x 100% = 46,51 % 1,071


1,071 - 0,507 x 100% = 49,66 % 1,071


1,071 - 0,475 x 100% = 52,83 % 1,071

x 100%

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Konsentrasi 0,133 mg/ml =

1,071 - 0,437 x 100% = 56,61 % 1,071


1,071 - 0,411 x 100% = 59,19 % 1,071

Lampiran 5. Perhitungan nilai ES50 fraksi etil asetat Persamaan regresi linear dari % scavenging Y = 96,711 X + 43,289 Y = aktivitas antioksidan X = konsentrasi fraksi etil asetat ES50 adalah nilai X pada saat Y = 50

X =

Y − 43,289 96,711

X =

50 − 43,289 96,711

X = 0,06939 mg/mL = 69,39 µg/mL

Lampiran 6. Contoh perhitungan kadar flavonoid fraksi etil asetat Data penimbangan sampel fraksi etil asetat replikasi 1 Neraca Analytical balance Wadah Wadah + zat Semi micro balance Wadah Wadah + zat Zat

Bobot Fraksi (g) 27,6264 27,6514 27,63255 27,65759 0,02494

87


88

Mula-mula 25 mg ad 100 ml Æ 0,025 g/100 mL

Diambil 250 µL ad 10 mL Æ 0,00625 g/100 mL = 6,25 mg/100 mL Konsentrasi fraksi etil asetat 6,25 mg% Absorbansi = 0,246 Persamaan regresi linear dari kurva baku kuersetin Y= 0,821 X + 0,073 Y = absorbansi larutan X = kadar flavonoid ekivalen dalam mg%

X =

Y − 0,073 0,821

X =

0,246 − 0,073 0,821

X = 0,2107 mg %


kadar flavonoid x 100% kadar fraksi etil asetat


0,2107 mg % x 100% 6,25 mg %

= 3,376 %

Lampiran 7. Perhitungan A (1%, 1 cm) Serapan jenis (A 1%, 1 cm) adalah serapan dari larutan 1 % zat terlarut dalam sel dengan ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada panjang gelombang tertentu dalam suatu pelarut merupakan sifat dari zat terlarut. Jika a adalah daya serap.


a=

A b.c

A 1% = a x BM A = absorbansi a = serapan jenis b = tebal kuvet = 1 cm c = konsentrasi (mg %) Untuk Kuersertin 1 BM = 338,27 c = 0,2448 mg % A = 0,248 a=

A b.c

a=

0,248 1 cm × 0,2448 mg %

a = 1,01307cm-1 mg %-1 A (1%, 1 cm) = a x BM = 1,01307 x 338,27 = 342,691

Untuk Kuersertin 2 BM = 338,27 c = 0,4080 mg %

89

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI A = 0,417 a=

A b.c

a=

0,417 1 cm × 0,4080 mg %

a = 1,02206 cm-1 mg %-1 A (1%, 1 cm) = a x BM = 1,02206 x 338,27 = 345,732 Untuk Kuersertin 4 BM = 338,27 c = 0,2448 mg % A = 0,284 a=

A b.c

a=

0,284 1 cm × 0,2448 mg %

a = 1,16013 cm-1 mg %-1 A (1%, 1 cm) = a x BM = 1,16013 x 338,27 = 392,437

Untuk flavonoid fraksi etil asetat replikasi 1 BM = 338,27 c = 0,2107 mg %

90

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI A = 0,246 a=

A b.c

a=

0,246 1 cm × 0,2107 mg %

a = 1,16754 cm-1 mg %-1 A (1%, 1 cm) = a x BM = 1,16754 x 338,27 = 566,738 Untuk flavonoid fraksi etil asetat replikasi 2 BM = 338,27 c = 0,2071 mg % A = 0,243 a=

A b.c

a=

0,243 1 cm × 0,2071 mg %

a = 1,17335 cm-1 mg %-1 A (1%, 1 cm) = a x BM = 1,17335 x 338,27 = 396,909

Untuk flavonoid fraksi etil asetat replikasi 3 BM = 338,27 c = 0,2010 mg %

91


92

A = 0,238 a=

A b.c

a=

0,238 1 cm × 0,2010 mg %

a = 1,18408 cm-1 mg %-1 A (1%, 1 cm) = a x BM = 1,18408 x 338,27 = 400,539

Jenis flavonoid

A

c

a

A (1%, 1 cm)

Kuersetin 1

0,248

0,2448

1,01307

342,691

Kuersetin 2

0,284

0,2448

1,16013

392,437

Kuersetin 4

0,417

0,4080

1,02206

345,732

Fraksi replikasi 1

0,246

0,2107

1,16754

566,738

Fraksi replikasi 2

0,243

0,2071

1,17335

396,909

Fraksi replikasi 3

0,238

0,2010

1,18408

400,539

NPar Tests One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test SRPN N Normal Parameters a,b Most Extreme Differences

Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative

Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.

6 407.5077 82.17024 .367 .367 -.215 .899 .394


93

Oneway Descriptives SRPN

N 1.0000 2.0000 Total

Mean 360.2867 454.7287 407.5077

3 3 6

Std. Deviation 27.8844916 97.0199067 82.1702518

Std. Error 16.09912 56.01447 33.54586

95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound 291.017750 429.555584 213.717858 695.739476 321.275276 493.740057

Test of Homogeneity of Variances SRPN Levene Statistic 7.477

df1

df2 1

Sig. .052

4

ANOVA SRPN

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 13378.937 20380.814 33759.751

df 1 4 5

Mean Square 13378.937 5095.204

F 2.626

Sig. .180

Minimum 342.6910 396.9090 342.6910

Maximum 392.4370 566.7380 566.7380

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 8. Foto-foto

Gambar 24. Pohon ketapang

Gambar 26. Daun ketapang

Gambar 25. Buah ketapang

Gambar 27. Bunga ketapang

94


Gambar 28. Ekstrak kental buah ketapang

Gambar 29. Fraksi etil asetat buah ketapang

Gambar 30. Perkolator

95

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 9. Surat determinasi

96

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 10. Sertifikat analisis deoksiribosa

Product Name

2-Deoxy-D-ribose, cell culture tested

Product Number

D5899

Product Brand

Sigma

CAS Number

533-67-5

Molecular Formula

C5H10O4

Molecular Weight

134.13

Storage Temp

2-8°C

TEST

SPECIFICATION

LOT 084K0971 RESULTS

APPEARANCE

WHITE TO OFF-WHITE POWDER

OFF-WHITE POWDER

SOLUBILITY

CLEAR TO SLIGHTLY HAZY COLORLESS TO LIGHT YELLOW SOLUTION AT 100MG/ML IN WATER

CLEAR FAINT YELLOW

SPECIFIC ROTATION

-54 TO -58 DEG (C = 1 IN WATER AT 20DEGC)

-57 DEG

PURITY BY GAS CHROMATOGRAPHY

NLT 99%

99%

CELL CULTURE TEST

PASS

QC RELEASE DATE

PASS AUGUST 2004

97

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 11. Sertifikat analisis rutin

Product Name

Rutin hydrate, ≥95% (HPLC), powder

Product Number

R5143

Product Brand

Sigma

CAS Number

207671-50-9

Molecular Formula

C27H30O16 · xH2O

Molecular Weight

610.52 (anhydrous basis)

TEST

SPECIFICATION


APPEARANCE

YELLOW-GREEN POWDER

CONFORMS

SOLUBILITY

CLEAR TO SLIGHTLY HAZY YELLOW TO BROWN SOLUTION AT 50MG/ML IN PYRIDINE

CLEAR BRIGHT YELLOW

LOSS ON DRYING

5.5 TO 9.0%

6.6%

UV-VIS SPECTRUM *

EMM = 21.8 TO 22.8 AT LAMBDA EMM = 22.5 AT LAMBDA MAX MAX 256 TO 258NM IN 257NM METHANOL

PURITY BY HPLC

MINIMUM 95%

97%

* DRY BASIS QC RELEASE DATE

JULY 2003

98

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 12. Sertifikat analisis kuersetin

Product Name

Quercetin dihydrate, ≥98% (HPLC), powder

Product Number

Q0125

Product Brand

Sigma

CAS Number

6151-25-3

Molecular Formula

C15H10O7 · 2H2O

Molecular Weight

338.27

TEST

SPECIFICATION


APPEARANCE

YELLOW TO YELLOW WITH A GREEN TO BROWN CAST POWDER

YELLOW POWDER

SOLUBILITY

DARK RED SOLUTION AT 200 MG PLUS 4 ML OF 1 M SODIUM CONFORMS HYDROXIDE

PURITY BY HPLC

NOT LESS THAN 98%

99%

QC RELEASE DATE

JANUARY 2005

PRODUCT CROSS REFERENCE INFORMATION

REPLACEMENT FOR ALDRICH #171964

99


100

Lampiran 12. Asam urat sebagai antioksidan Sebagai chain breaking antioxidant, akan bereaksi dengan radikal peroksil ROO•, dan merupakan donor elektron.

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Biografi Penulis

Penulis skripsi berjudul Uji Aktivitas Antioksidan dan Penentuan Kandungan Senyawa Flavonoid Total Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang (Terminalia cattapa L.) bernama lengkap Yovita Dwi Arini. Dilahirkan pada tanggal 2 Februari 1985, di Tanjung Selor, Kabupaten Bulungan, Kalimantan Timur. Penulis merupakan anak kedua dari enam bersaudara pasangan MC. Putut Supriyanto H.S dan Herce Olga Rondonuwu. Riwayat pendidikan penulis dimulai tahun 1989 - 1991 di TK Katolik Santa Maria, Rembang. Tahun 1991-1997 di SDK Santa Maria Rembang. Pada Tahun 1997-2000 melanjutkan di SLTPN 2 Rembang. Tahun 2000-2003 merantau ke kota Surakarta dan menempuh pendidikan di SMU Regina Pacis ”Ursulin” Solo. Tahun 2003 penulis melanjutkan pendidikan S1 di Fakultas Farmasi Univevrsitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama menjalani masa perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai kegiatan antara lain : PSF Veronica sebagai penyanyi alto; Apotek Music ’04 sebagai sie. Publikasi dan Dokumentasi; Panitia Pelepasan Wisuda bulan November ’04 sebagai sie. Penerima Tamu; Panitia Bakti Sosial 5 Fakultas di Paingan; Panitia Ziarah 6 Fakultas tahun 2004 (Koordinator sie. konsumsi) dan 2005 (Bendahara); Herba Garden Team, pernah menjabat menjadi ketua pada tahun 2005; Pharmacy Performance ’05 sebagai Koordinator sie. Keamanan; TITRASI ’05 sebagai bendahara. Menjabat pengurus BEMF 2004-2005 sebagai bendahara 2 dan pada periode 2005-2006 menjabat sebagai bendahara 1. Pernah juga menjadi Panitia Misa Raya Mahasiswa se Jogja tahun 2004 sebagai sie. Dekorasi. Menjadi Asisten praktikum Botani Dasar, praktikum Farmakologi dan praktikum Analisis Sediaan Obat Tradisional selama menjalani masa perkuliahan.

101

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents