PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

OPTIMASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS KINERJA TINGGI-DENSITOMETRI UNTUK PENETAPAN KADAR ASAM KAFEAT HASIL HIDROLISIS EKSTRAK AIR SEDUHAN BIJI KOPI ARABIKA (Coffea arabica L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh: Marshella NIM : 118114119

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

YOU MAY NOT SEE THE FINISH LINE AT A VERY MOMENT, BUT THERE IS NOTHING HAPPEN WITHOUT AN END. EVERYTHING HAS ITS FINISH LINE

~I can cope with the hardship of life because I know my believe, faith and hope in Jesus Christ won’t be in vain~ This little gift is dedicated to my Jesus Christ my beloved Mom and Dad who never lose hope in me, my lovely brother, everyone who loves me, and My wonderful University iv


v


vi


PRAKATA

Puji syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang karena kasih serta penyertaan-Nya yang tak berkesudahan sehingga penulis dapat dengan baik menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Optimasi Metode Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi-Densitometri untuk Penetapan Kadar Asam Kafeat Hasil Hidrolisis Ekstrak Air Seduhan Biji Kopi Arabika (Coffea arabica L.)” ini dari awal hingga akhir. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menyadari bahwa selama proses pengerjaan skripsi ini, penulis tidak dapat melakukan semuanya dengan baik tanpa bantuan, dukungan, motivasi, arahan, kritik, saran serta doa dari banyak pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1.

Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma..

2.

Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing dan dosen penguji atas kesabaran, bimbingan, arahan, masukan, perhatian, semangat dan waktu yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3.

Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan waktu, kritik dan saran yang bermanfaan untuk skripsi ini.

4.

Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan waktu, kritik dan saran yang bermanfaan untuk skripsi ini.

vii


5.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboraturium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang selalu mendukung, membantu dan memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian skripsi ini.

6.

Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku DPA yang telah mendukung selama proses perkuliahan sampai proses pembuatan skripsi ini.

7.

Papa, mama, adik atas segala dukungan dan doa yang tiada henti kepada peneliti selama penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini.

8.

Dewi Setyaningsih, M.Sc., Apt. atas bantuan dan sarannya kepada peneliti selama proses penelitian berlangsung.

9.

Fansisca Z. Tielman, Elyn Prameswari dan Andung P. Vidityo yang dengan murah hati meluangkan waktu dan tenaga untuk membantu peneliti selama penelitian berlangsung.

10. Wirna, Satrio, dan Mbak Yolanda teman seperjuangan selama penelitian di laboraturium kimia analisis instrumental. 11. Debby A. Tania, Jane O. Kamadinata, Karina Ghozali, Lola Marsela, Rachael Fortunata, Rasmi, Theresia L. Lorensa, Ken Hashigata, dan Albert Timotius, selaku para sahabat, teman berbagi cerita dan pemberi semangat bagi penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. 12. Teman-teman kost Flaurent: Ci Prisca, Ci Amel, Ci Fifi, Greta, Nonitha, Sonia, dan Septiayuka atas doa, semangat serta dukungan kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

viii


13. Dinas Pertanian, Perkebunan, dan Kehutanan, Kabupaten Temanggung dan Bapak Mukidi atas bantuannya dalam pengambilan sampel yang berguna dalam penelitian. 14. Seluruh staff laboraturium, staff keamanan dan staff kebersihan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, terutama Mas Bimo, Mas Kunto, Pak Parlan, Mas Agung, dan Mas Wagiran yang telah membantu dan memberikan dukungan selama pelaksanaan penelitian ini. 15. Teman-teman Fakultas Farmasi angkatan 2011, terima kasih atas doa dan dukungannya. 16. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Karenanya, penulis dengan terbuka menerima segala kritik dan saran yang bersifat membangun di kemudian hari bagi penyempurnaan skripsi ini. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca serta demi majunya ilmu pengetahuan. Terima kasih.

Penulis Marshella

ix


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL .……..…............…...……….…...……...……….

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……...……………….

ii

HALAMAN PENGESAHAN .……...…………...……...……………..

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .……...………………...……...……...

iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .……...……………………….

v

LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI KARYA .……...…………..

vi

PRAKATA ...……...….……..…............…...……….…...……...……..

vii

DAFTAR ISI ...……...….……..…............…...……….…...……...…...

x

DAFTAR TABEL ...……...……...……...….……..…............…...……

xiv

DAFTAR GAMBAR ...……...……...……...….……..…............…......

xvi

DAFTAR LAMPIRAN ...……...……...……...….……..…............…...

xviii

INTISARI ...……...……...……...….……..…............…...……….........

xxi

ABSTRACT …...……...……...……...….……..…............…...………...

xxii

BAB I PENGANTAR …...……...……...……...….……..….................

1

A. Latar Belakang …...……...……...……...….……..….......................

1

1. Permasalahan …...……...……...……...…….….........................

4

2. Keaslian Penelitian ……...……...……...……...….……..…......

4

3. Manfaat Penelitian……...……...……...……...………………...

6

B. Tujuan Penelitian ……...……...……...……...….……..…...………

6

BAB II PUSTAKA ……...……...……...……...….……..…...………...

7

A. Kopi ……...……...……...……...….……..…...……………………

7

B. Polifenol ……...……...……...……...….……..…...………………..

8

x


C. Asam Kafeat .....……...……...……...….……..…...……………….

10

D. Ekstrak Biji Kopi ……...…….…...……...….……..…...…………..

11

E. Hidrolisis ……...……...……...……...……..…...…………………..

13

F. Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi …...……...……...……....

13

1. Fase Diam …...……...……...……...……...….……..…...……..

15

2. Fase Gerak …...……...……...……...……...….……..…...…….

17

G. Densitometri .……...……...……...……...….……..…...…………..

18

H. Optimasi .……...……...……...……...….……..…...……………….

20

I. Landasan Teori …........……...……...……...….……..…...………..

22

J. Hipotesis .……...……...……...……...….……..…...………………

23

BAB III METODOLOGI PENELITIAN …...…….…...……...…….....

24

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .……...……...……...……...….…..

24

B. Variabel Penelitian ..……...……...……...……...….……..…...……

24

C. Definisi Operasional …...……...……...….……...….……..….........

25

D. Bahan Penelitian ...……...……...……...……...….……....…...……

25

E. Alat Penelitian ...……...……...……...……...………...…..…..........

26

F. Tata Cara Penelitian .....……...……...……...……...……………….

26

1. Pembuatan larutan NaOH 1 N ……...………...……...……...…

26

2. Pembuatan larutan baku asam kafeat ……...……...……...…….

26

a. Pembuatan larutan stok asam kafeat (1 mg/mL) ……...…...

26

b. Pembuatan seri larutan baku ..……………………….……..

27

3. Preparasi sampel ..……………………………………………...

27

a. Metode ekstraksi I …………..……………………………..

27

xi


b. Metode ekstraksi II ..……………………………………….

28

4. Hidrolisis sampel ..……………………………………………..

29

5. Penentuan panjang elusi ………………..……………………...

29

6. Optimasi metode KLTKT-Densitometri ……………………….

30

a. Pembuatan fase gerak ......…………………………………

30

b. Optimasi pemisahan asam kafeat dalam larutan ekstrak biji kopi ...…………………………………………...………… c. Ripitabilitas fase gerak hasil optimasi ..........................

30 32

G. Analisis Hasil ………………………………………………………

32

1. Bentuk Puncak ………………………..………………………

33

2. Faktor Retardasi (Rf) ………………..………………………...

33

3. % Koefisien Variasi (%KV) ………………………………......

34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..………………………….....

35

A. Jenis dan Komposisi Fase Gerak ..…………………………............

35

B. Pembuatan Seri Larutan Baku ..…………………………………....

36

C. Preparasi Larutan Sampel ..………………………………………...

39

D. Hidrolisis .…………………………………………………………..

40

E. Penentuan Panjang Elusi dan Lama Deteksi ……..………………..

41

F. Optimasi Fase Gerak pada Pemisahan Asam Kafeat Hasil Hidrolisis Ekstrak Air Seduhan Biji Kopi arabika dengan KLTKT Densitometri ……………………………………………………..…

47

1. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak kloroform : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) …………….………………….………..

48

2. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluene : etil asetat : asam format (5 : 3 : 2) ….….……………………………………

50

xii


3. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluena : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) …………………………………………..

51

4. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluene : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada lempeng KLTKT ………………......

53

5. Ripitabilitas asam kafeat dengan fase gerak toluena : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada lempeng KLTKT .………….

55

G. Pembuatan Kurva Baku Asam Kafeat ……………………………..

59

H. Perhitungan Kadar Asam Kafeat …………………………………..

62

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………….

66

A. Kesimpulan ………………………………………………………...

66

B. Saran ……………………………………………………………….

66

DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………….

67

LAMPIRAN ………………………………………………..………….

72

BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………

118

xiii


DAFTAR TABEL Tabel I.

Kepolaran dan karakteristik gugus dari beberapa senyawa fenolik natural ………………………………………………...

10

Tabel II.

Jenis fase diam yang digunakan pada tahun 1979-1985 ……….

16

Tabel III.

Karakteristik lempeng yang biasa digunakan dalam KLT ….....

16

Tabel IV.

Jenis dan komposisi fase gerak ...………...……………………

30

Tabel V.

Rf dan AUC dari seri larutan baku yang diukur pada  330 nm dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) (trek 1 (0,03); trek 2 (0,05); trek 3 (0,08); trek 4 (0,1); trek 5 (0,15); trek 6 (0,2); trek 7 (0,25); trek 8 (0,28); dan trek 9 (0,3) mg/mL) ………..……………………………………………....

38

Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan menggunakan syphon serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 5 cm ……………………………………….

42

Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan menggunakan syphon serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 8 cm …..…………………………………...

43

Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan diseduh serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 5 cm …..………………………………………………...

44

Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan diseduh serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 8 cm …..……………………………………………….....

45

Tabel VI.

Tabel VII.

Tabel VIII.

Tabel IX.

xiv


Tabel X.

Nilai Rf, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm …..……………………………..

56

Nilai Rf, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm ..................…………………......

57

Nilai Rf, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm ..................…………………......

57

Nilai Rf, As, dan AUC dari larutan sampel hasil hidrolisis ekstraksi biji kopi arabika dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) ………………………………………...

58

Tabel XIV.

Data replikasi kurva baku asam kafeat pada  325 nm ………...

59

Tabel XV.

Data replikasi kurva baku asam kafeat pada  330 nm ………...

60

Tabel XVI.

Data replikasi kurva baku asam kafeat pada  335 nm …….…..

60

Tabel XVII.

Data perhitungan kadar sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika pada  325 nm ……………………..

62


63


63

Tabel XI.

Tabel XII.

Tabel XIII.

Tabel XVIII.

Tabel XIX.

.

xv


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Tanaman kopi arabika dan biji kopi arabika (Coffea Arabica L.)….........................................................................................

7

Gambar 2.

Struktur kimia senyawa asam fenolat …….…………………..

8

Gambar 3.

Asam kafeat (3,4-dihidroxycinnamic acid) …………………..

10

Gambar 4.

Struktur Silika gel …….…………………………...…………

16

Gambar 5.

Prinsip pengukuran dari densitometri; (A) Cahaya diserap, (B) Cahaya dipantulkan, (C) Cahaya disebar …………….………

19

Jalur cahaya melewati scanner KLT. 1. Lampu seleksi, 2. Sistem masuk lensa, 3. Celah masuk monokromator, 4. Kisi monokromator, 5. kaca, 6. Celah disk lubang lensa, 7. Sistem lensa, 8. Kaca, 9. Pemecah cahaya, 10. Photomultiplier referensi, 11. Objek scanning, 12 Photomultiplier penghitung, 13. Photodiode (ditransmisikan) ………………...…………...

20

Gambar 7.

Bentuk Gaussian band ……………………………………….

21

Gambar 8.

Menentukan nilai faktor asimetris ............................................

33

Gambar 9.

Kromatogram seri larutan baku yang diukur pada  330 nm dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) (dari depan 0.03; 0.05; 0.08; 0.1; 0.15; 0.2; 0.25; 0.28; dan 0.3 mg/mL)..................................................................................... 38

Gambar 6.

Gambar 10. Reaksi hidrolisis asam klorogenat menjadi natrium kuinat dan asam kafeat …………………………………………………..

40

Gambar 11. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak kloroform : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) …..……………………………………………………

49

Gambar 12. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (5 : 3 : 2) …..………………………………………………………..

50

xvi


Gambar 13. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) ………………………………………………………..……

52

Gambar 14. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada plat KLTKT ……………………………...………....

53

Gambar 15. Interaksi asam kafeat dengan fase diam ……………………... 54 Gambar 16. Interaksi asam kafeat dengan fase gerak ……………………...

55

Gambar 17. Hubungan antara konsentrasi asam kafeat dengan AUC (replikasi II) …………………………………………………. Gambar 18. Hubungan antara konsentrasi asam kafeat dengan AUC (replikasi I) …………………………………………………...

56

Gambar 19. Hubungan antara konsentrasi asam kafeat dengan AUC (replikasi III) …………………………………………………

xvii

62 62


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1

Certificate of Analysis baku asam kafeat Sigma-Aldrich ….

73

Lampiran 2

Certificate of Analysis plat KLT E.Merck …………………

74

Lampiran 3

Certificate of Analysis plat KLTKT E.Merck ………....…..

75

Lampiran 4

Surat determinasi biji kopi ………………………………...

76

Lampiran 5

Data penimbangan baku dan sampel serta perhitungan seri konsentrasi baku …………………………………………...

77

Lampiran 6

Sistem KLTKT-Densitometri yang digunakan ……………

78

Lampiran 7

Densitogram hasil elusi dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak kloroform : etil asetat: asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm .............................................

81

Densitogram hasil elusi dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat: asam format (5 : 3 : 2) yang dideteksi pada  330 nm …...….……………………...

82

Lampiran 8

Lampiran 9

Lampiran 10

Lampiran 11

Lampiran 12

Lampiran 13

Lampiran 14

Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm ……. Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm …...….…………………………...…............

84

86

Densitogram hasil elusi baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat: asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm ……........…

88

Densitogram hasil elusi baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm ………………..…...

89

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi I dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm ………………………….…….......

91

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi II dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm …………………………………… 92

xviii


Lampiran 15

Lampiran 16

Lampiran 17

Lampiran 18

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi III dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat: asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm ...…………………................ Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm …....................................... Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm ………..….........…............ Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi I dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm……………………….…...

94

96

97

98

Lampiran 19

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi II dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm …………………...…...…. 100

Lampiran 20

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi III dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm ……….………..…...… 101

Lampiran 21

Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm …………………………... 103

Lampiran 22

Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm …..……….…..………….. 104

Lampiran 23

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi I dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm ……..…..………………... 106

Lampiran 24

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi II dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm …………..………………. 107

xix


Lampiran 25

Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi III dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm ……………………….. 109

Lampiran 26

Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm .…...….....…......……….... 110

Lampiran 27

Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm …………..……................. 112

Lampiran 28

Perhitungan faktor asimetris (As) dan %KV pemisahan sampel asam kafeat dan baku asam kafeat fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) ……………...………………. 113

Lampiran 29

Data perhitungan kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak 116 air seduhan biji kopi arabika ………………………

xx


INTISARI Asam kafeat merupakan salah satu senyawa polifenol yang terdapat di dalam biji kopi arabika (Coffea arabica L.). Asam kafeat memiliki efek farmakologis yang baik bagi orang yang mengkonsumsinya. Akan tetapi belum banyak yang meneliti kandungan asam kafeat di dalam biji kopi. Oleh karena itu, diperlukan suatu metode untuk menganalisis kandungan asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi. Metode yang dipilih untuk analisis kandungan asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika adalah metode Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi (KLTKT) Densitometri. Penelitian ini bertujuan mengetahui kondisi optimal dari fase gerak dan membandingkan efektivitas metode ekstraksi yang digunakan untuk dapat menetapkan kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan perlakuan yang diberikan kepada subjek uji berupa perbedaan jenis ekstraksi serta perbedaan jenis dan komposisi fase gerak. Sistem KLTKT yang digunakan adalah fase normal dengan fase diam silica gel 60 F256 dan beberapa jenis fase gerak berupa perbandingan antara kloroform : etil asetat : asam format 98% (7 : 2 : 1); toluen : etil asetat : asam format 98% (5 : 3 : 2) dan (7 : 2 : 1). Setelah dilakukan pemisahan dengan KLTKT dilakukan analisis kuantitatif menggunakan densitometer. Pembacaan dilakukan pada panjang gelombang 330 nm untuk mendapatkan parameter pemisahan yang baik. Sistem optimal untuk komposisi dan jenis fase gerak yang diperoleh adalah toluen : etil asetat : asam format 98% (7 : 2 : 1) dengan jarak elusi 8 cm dengan jumlah penyemprotan 0,1 L dan panjang penyemprotan 6 mm dalam bentuk pita (band). Ekstrak mengalami proses hidrolisis menggunakan NaOH 1N sebelum disemprotkan. Puncak asam kafeat yang dihasilkan mengalami fronting tetapi di sekitar puncak tersebut tidak terdapat puncak senyawa lain. Rata-rata kadar asam kafeat pada  330 untuk hasil hidrolisis ekstraksi menggunakan syphon sebesar 0,00208% b/b dengan %KV 3,22 dan untuk hasil hidrolisis ekstraksi seduhan adalah sebesar 0,00196% b/b dengan %KV 3,59.

Kata Kunci: asam kafeat, KLTKT, densitometri, optimasi, ekstraksi, hidrolisis, fase gerak

xxi


ABSTRACT Caffeic acid is one of the polyphenol contained in Arabica coffee beans (Coffea arabica L.). Caffeic acid has a good pharmacological effect for people who consume it. However, there are not many researches about caffeic acid content in coffee beans. Therefore, a method for determining caffeic acid’s concentration in boiled water hydrolyzed extract of coffee beans needs to be developed. The chosen method for determining caffeic acid’s concentration in boiled water hydrolyzed extract of coffee beans is using High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) Densitometry. This study aims to obtain an optimum condition of mobile phase and compare the effectiveness of extraction method to gain caffeic acid content inside boiled water hydrolyzed extract of Arabica coffee beans. This study was conducted with an experimental plan with the treatment given to the test subject in form of different type of extraction and different type and composition of mobile phase. HPTLC system which was used was normal phase with silica gel 60 F256 as stationary phase and some difference types of mobile phase with composition as chloroform : ethyl acetic : formic acid 98% (7 : 2 : 1); toluene : ethyl acetic : formic acid 98% (5 : 3 : 2) and (7 : 2 : 1). After separation with HPTLC, quantitative analysis was done with densitometer in wavelength 330 nm to gain good separation parameter. The optimum system for composition and type of mobile phase was toluene : ethyl acetic : formic acid 98% (7 : 2 : 1) with 8 cm elution length with 0,1 L spraying amounts and 6 mm spraying length in band form. The extract was hydrolyzed with NaOH 1N before sprayed. Caffeic acid peak which obtain was fronting but no other peak found around the caffeic acid peak. The average content of caffeic acid was at  330 for hydrolyzed syphon extraction is 0.00208% w/w with % CV 3.22 and for hydrolyzed boiled extraction is 0.00196% w/w with % CV 3.59. Keywords: caffeic acid, HPTLC, densitometry, optimization, extraction, hydrolysis, mobile phase

xxii


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Kopi merupakan salah satu minuman favorit masyarakat dunia, khususnya masyarakat Indonesia. Seseorang dapat mengkonsumsi ± 300 mL kopi bahkan lebih dalam sehari. Oleh karena itu, telah banyak penelitian yang di lakukan terkait kandungan yang terdapat di dalam biji kopi (Lestari, Haryanto, dan Mawardi, 2009). Asam kafeat merupakan salah satu senyawa fenolik yang termasuk dalam golongan flavonoid yang terdapat di dalam biji kopi (Olthof, Hollman and Katan, 2001). Secara luas telah diketahui bahwa senyawa fitokimia fenolik memiliki sifat antioksidan yang dapat menghambat baik kanker, penyakit jantung, maupun penyakit-penyakit lain (Kang et al., 2009). Akan tetapi, belum banyak orang yang meneliti asam kafeat di dalam biji kopi meski asam kafeat di dalam biji kopi merupakan senyawa yang bermanfaat untuk kesehatan. Oleh karena itu, perlu dilakukan analisis kandungan asam kafeat yang terdapat di hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi. Hal ini dilakukan untuk memberikan informasi kepada penikmat kopi terkait kandungan asam kafeat di dalam air seduhan biji kopi yang dikonsumsi. Untuk mendapatkan asam kafeat yang akan diteliti di dalam biji kopi arabika, diperlukan metode ekstraksi yang tepat sehingga asam kafeat dapat terdeteksi. Ada berbagai macam cara ekstraksi yang dapat dilakukan untuk analisis

1


2

tanaman, menurut Shah and Seth (2010) antara lain dengan cara maserasi, perkolasi, sokletasi, super critical fluid extraction. Cara ekstraksi lain adalah melalui infusion dan steam and hydrodistillation. (Tiwari et al., 2013) Dalam penelitian ini, proses ekstraksi serbuk biji kopi yang digunakan disesuaikan dengan cara penyajian yang biasa dilakukan oleh masyarakat pada umumnya dalam mengkonsumsi kopi. Cara ekstraksi serbuk biji kopi yang digunakan adalah menggunakan syphon (infusion) dan dengan cara diseduh biasa (decoction) sehingga diharapkan, asam kafeat yang terdeteksi dapat mewakili jumlah asam kafeat yang tersari menggunakan air seduhan seperti pada saat pembuatan kopi pada umumnya. Asam kafeat di yang terdapat di dalam biji kopi didapatkan melalui proses hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika karena di dalam ekstrak air seduhan biji kopi, asam kafeat berada dalam bentuk esternya yaitu asam klorogenat. Metode yang dipilih untuk analisis kandungan asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi adalah dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi (KTLKT) densitometri. Pemilihan KLTKT densitometri sebagai metode untuk pengukuran asam kafeat didasarkan pada pertimbangan bahwa pengerjaan menggunakan KLTKT lebih cepat, memiliki presisi yang baik serta metode yang tergolong murah untuk menganalisis obat-obatan herbal dan telah sering digunakan untuk mendeteksi senyawa aktif dari suatu tanaman obat (Rastogi, Pandey, and Rawat, 2008). Keuntungan lain metode KLTKT adalah tidak memerlukan proses clean up yang panjang dan lama, bahkan pada analisis kuantitatif ekstrak kasar tanaman (Unnikrishnan, Raja, and Balachandran, 2008). Selain itu, analisis menggunakan KLTKT lebih dapat diandalkan untuk pengujian


3

sampel yang berasal dari ekstrak tanaman, karena analisis sampel ekstrak tanaman menggunakan KCKT dalam jumlah banyak dan berkali-kali dapat menyebabkan tersumbatnya kolom KCKT dan harus dilakukan penggantian kolom untuk dapat melanjutkan penelitian (Lehrfeld, 1989). Penelitian terkait asam kafeat yang telah dipublikasikan antara lain adalah identifikasi asam kafeat pada biji kopi panggang menggunakan KCKT Fase Terbalik (Bennat, Engelhardt, Kiehne, Wirries, and Maier, 1994); penentuan jumlah polifenol dan kafein di dalam 18 merk kopi dengan menggunakan KCKT (Kreicbergs, Dimins, Mikelsone, and Cinkmanis, 2011); determinasi asam kafeat dalam tanaman Ilex paraguariensis dengan menggunakan metode KCKT (Rivelli, da Silva, Ropke, Miranda, and Almeida, 2007); determinasi paralel rosmarinik dan asam kafeat dengan menggunakan KLT Densitometri (Janisak and Mathe, 1997); determinasi flavonoid, asam fenolat, dan ksantin di dalam Mate Tea (Ilex paraguariensis) dengan menggunakan KLT (Bojic, Haas, Saric, and Males, 2013). Berdasarkan data di atas dapat diinformasikan bahwa penelitian terkait penetapan kadar asam kafeat menggunakan metode KLTKT-Densitometri pada hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika belum pernah dilakukan. Sebenarnya metode analisis menggunakan KLTKT-Densitometri merupakan metode analisis yang telah banyak diaplikasikan dalam penelitian-penelitian analisis. Oleh karena itu, penelitian ini perlu dilakukan untuk mengembangkan suatu metode analisis baru yang teroptimasi untuk penetapan kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika menggunakan metode KLTKTDensitometri.


4

1. Permasalahan Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, permasalahan yang muncul adalah: 1. Dapatkah dilakukan perbandingan efektifitas ekstraksi asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) melalui metode ekstraksi syphon dan seduh? 2. Bagaimana kondisi yang optimum untuk melakukan pemisahan asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) dari senyawa-senyawa fenolik lain agar dapat ditetapkan kadarnya menggunakan metode KLTKT-Densitometri?

2. Keaslian Penelitian Berdasarkan studi literatur mengenai penelitian sebelumnya, penelitian penetapan kadar asam kafeat di dalam hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) dengan metode KLTKT belum pernah dilakukan. Penelitian terkait analisis asam kafeat yang pernah dilakukan antara lain, identifikasi asam kafeat di dalam roasted coffee menggunakan KCKT Fase Terbalik dengan detektor UV 324 nm (Bennat et al., 1994). Kreicbergs et al. (2011) meneliti senyawa polifenol total di dalam roasted coffee menggunakan KCKT dengan detektor DAD SPD M20A dan kolom C18 dan Rivelli et al. (2007) menggunakan KCKT dengan detektor UV dan kolom C18 untuk mendeteksi asam klorogenat, asam kafeat dan kafein di dalam ekstrak hidroalkoholik dan ekstrak air


5

dari Ilex paraguariensis. Pada penelitian tersebut, diketahui bahwa panjang gelombang maksimum asam kafeat adalah 330 nm. Determinasi asam kafeat oleh Janisak and Mathe (1997) menggunakan KLT Densitometri pada lima spesies tanaman Saliva. Faktor retensi (R f) yang didapat pada penelitian tersebut untuk asam kafeat adalah 0,50 dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (5 : 4 : 1) dan dideteksi dengan metode densitometri pada panjang gelombang antara 290-330 nm. Rastogi et al. (2008) pada penelitiannya melakukan determinasi asam fenolat (asam galat, asam kafeat, dan asam siringat) pada tanaman Syzygium aromaticum dengan menggunakan metode KLTKT dan dideteksi menggunakan metode densitometri pada panjang gelombang 280 nm. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam kafeat dalam penelitian tersebut adalah metanol sebanyak 25 mL. Hasil yang didapatkan adalah koefisien variansi asam kafeat yaitu 0,64%. Penelitian lain terkait asam kafeat adalah penelitian Bojic et al. (2013) yaitu determinasi senyawa flavonoid, asam fenolat dan ksantin di dalam Ilex paraguariensis dengan menggunakan metode KLTKT-densitometri. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan tanaman Ilex paraguariensis adalah metanol dan diketahui Rf asam kafeat yaitu 0,30 dengan panjang gelombang maksimal 330 nm.


6

3. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut: a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat ilmiah sebagai metode peneletian alternatif pada penetapan kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.). b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk memberikan informasi kandungan asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi serta untuk penelitian lebih lanjut terkait analisis kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) dengan metode KLTKT-Densitometri.

B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Melakukan perbandingan efektifitas ekstraksi asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) melalui metode ekstraksi syphon dan seduh. 2. Mengetahui kondisi yang optimum untuk melakukan pemisahan asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) dari senyawa-senyawa fenolik lain agar dapat ditetapkan kadarnya menggunakan metode KLTKT-Densitometri.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kopi Kopi merupakan semak atau pohon kecil yang tumbuh di hutan di lereng gunung dengan curah hujan tinggi. Kopi memiliki warna daun hijau kehitaman dan mengkilap. Buahnya berbentuk elips. Perkembangan buah kopi antara 7-9 bulan. Di dalam buah kopi tersebut, terdapat 2-3 biji kopi berwarna hijau keabu-abuan yang memiliki panjang antara 12-15 mm. Satu kilo buah kopi mengandung ± 389 gram biji kopi. Persentase berat kering satu kilogram biji kopi segar adalah 19,1 %. Kopi mulai berbiji ketika berumur tiga tahun dan dapat terus berbuah selama bertahun-tahun bahkan 15 sampai 20 tahun (Boer, 1998).

Gambar 1. Tanaman kopi arabika dan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) (Prastowo, Elna, Rubijo, Siswanto, Indrawanto, dan Munarso, 2010)

Kopi yang telah diolah menjadi minuman, sangat populer dikonsumsi oleh masyarakat di seluruh dunia. Kopi memiliki ratusan genus dan hanya memiliki dua spesies, yaitu arabika (Coffee arabica L.) dan robusta (Coffee canemphora). Biji kopi arabika memiliki warna hijau pucat dan memiliki bentuk oval sedangkan biji kopi robusta memiliki bentuk yang bulat dan berwarna coklat (Butt, Ahmed, Imran, Yasin and Imran, 2011).

7


8

B. Polifenol Polifenol adalah kelompok terbesar dalam senyawa fitokimia dan banyak ditemukan pada tanaman yang digunakan sebagai bahan makan yang menyumbangkan banyak manfaat untuk orang yang menkonsumsinya. Sebagian besar molekul polifenol berbentuk sederhana seperti asam fenolat namun ada juga yang dalam bentuk molekul kompleks (Cheynier, 2005; Tsao, 2010). Fenol biasanya memiliki satu atau lebih gugus hidroksil (bagian polar) yang secara langsung terikat dengan gugus aromatis (bagian non polar) (Galanakis, Goulas, Tsakona, Manganaris and Gekas, 2013).

Derivat asam benzoat

Derivat asam sinamat

Gambar 2. Struktur kimia senyawa asam fenolat (Pirera, Valentao, Pirera and Andrade, 2009)

Asam fenolat (Gambar 2) dibagai menjadi dua kelas yaitu derivat asam benzoat serta derivat asam sinamat yang berupa asam hidroksisinamat dan lignan. Sebagian besar derivat asam benzoat dan derivat asam sinamat di dalam tanaman berada dalam ikatan ester ataupun eter (Manach, Scalbert, Morand, Rémésy, and Jimenez, 2004; Patra, 2012). Asam hidroksisinamat terutama terdiri dari asam p-kumarat, asam kafeat, asam ferulat dan asam sinapik. Asam kafeat baik dalam bentuk teresterkan maupun dalam bentuk bebas merupakan asam fenolat yang paling banyak ditemukan di


9

dalam buah-buahan, teh, dan kopi. Bentuk ester asam kuinat dan asam kafeat adalah asam klorogenat yang lebih banyak ditemukan di dalam tanaman secara bebas karena hanya sedikit dari asam-asam tersebut dapat ditemukan secara bebas di dalam buah-buahan, teh ataupun kopi, sehingga diperlukan proses hidrolisis untuk memecah ikatan konjugasinya (Antolovich, Prenzler, Robards, Ryan, 2000; de la Rosa, Alvarez-Parrilla, and Gonzalez-Aguilar, 2010; Manach et al., 2004; Patra, 2012). Asam fenolat dengan perbedaan kompleksitas matriks serta ikatan yang berbeda-beda memiliki cara ekstraksi yang berbeda-beda pula. Metode ekstraksi yang digunakan antara lain hidrolisis asam, basa ataupun enzimatik, serta ekstraksi menggunakan pelarut (Xu and Howard, 2012). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Galanakis et al. (2013) kecenderungan kelarutan suatu senyawa fenolik tidak tergantung polaritas senyawanya, karena keterkaitan antara koefisien aktivitas dan polaritas senyawa fenolik sangatlah rendah. Hal tersebut disebabkan karena kencenderungan kelarutan senyawa fenolik tergantung pada stereokimianya yaitu berdasarkan bagian polar dan bagian non-polar di dalam molekul masing-masing senyawa serta gaya antar molekul dalam senyawa (terutama ikatan hidrogen) yang muncul antara senyawa fenolik dengan pelarutnya.


10

Tabel I. Kepolaran dan karakteristik gugus dari beberapa senyawa fenolik natural (Galanakis et al., 2013)

Fenol Natural Asam Hidroksisinamat asam sinamat asam p-kumarat asam kafeat asam ferulat asam sinapik asam rosmarinik Asam Hidroksibenzoat asam p-hidroksibenzoat asam protokatekuat asam galat asam vanilik asam siringat Asam Hidroksifenilasetat asam p-hidroksifenilasetat tirosol hidroksitirosol oleuropetin

log p

grup (-OH)

grup (-COOH)

grup (-OCH3)

1,98 1,54 1,15 1,42 1,29 2,07

0 1 2 1 1 4

1 1 1 1 1 2

0 0 0 1 2 0

2,27 0,82 0,47 1,35 0,95

1 2 3 1 1

1 1 1 1 1

0 0 0 1 2

1,15 1,35 0,96 - 0,11

1 1 2 2

1 1 1 2

0 0 0 2

C. Asam Kafeat

Gambar 3. Asam kafeat (3,4-dihidroxycinnamic acid) (Kang et al., 2009)

Asam kafeat (3,4-dihidroxycinnamic acid) (Gambar 3) merupakan fitokimia fenolik yang juga merupakan antioksidan natural yang banyak terdapat di berbagai jenis tanaman serta makanan, termasuk di dalam biji kopi (Kang et al., 2009 ; Fathi, Mirlohi, Varshoaz, and Madani, 2013). Asam kafeat memiliki bentuk kristal berwarna kuning yang akan meleleh pada suhu 1940C dan terdekomposisi pada suhu 223-2250C (Kar, 2007).


11

Asam kafeat memiliki beberapa manfaat untuk kesehatan yaitu, efek antioksidan yang tinggi ketika terabsorbsi dan termetabolisme di dalam tikus dan manusia, efek antibakteri dan antiviral serta dapat mengurangi kemungkinan terjadinya tumor dan penyakit kardiovaskular (Natella, Nardini, Belelli, and Scaccini, 2007; Butt et al., 2011; Sun, Qiao, Ye, Liu, Zhang, and Huang, 2013). Asam kafeat secara umum memiliki jumlah terbanyak di dalam buahbuahan, sayur-sayuran dan kopi diantara turunan asam hidoksinamat lain (de la Rosa et al., 2010). Asam kafeat merupakan senyawa yang kelarutannya buruk dalam air dingin, mudah larut di dalam etanol dingin dan air panas (Fathi et al., 2013). Akan tetapi, asam kafeat memiliki kelarutan yang lebih tinggi di dalam air jika dibandingkan dengan asam ferulat dan asam trans-sinamat. Hal ini disebabkan karena ikatan hidrogen yang terbentuk pada setiap molekul air dengan asam kafeat yang memiliki dua gugus hidroksil (Mota, Queimada, Pinho, and Macedo, 2008). Peningkatan suhu juga akan meningkatkan kelarutan asam kafeat (Kar, 2007; Zhang, Gong, Wang, and Qu, 2012).

D. Ekstrak Biji Kopi Ekstraksi dapat dibagi dua yaitu ekstraksi padat-cair dan ekstraksi cair-cair. Proses ekstraksi yang terjadi pada ekstraksi padat cair adalah zat aktif dari dalam padatan diekstraksi keluar dengan menggunakan pelarut organik ataupun air. Proses ekstaksi tersebut dinamakan leaching, dengan prinsip ekstraksi yang digunakan adalah proses ekstraksi senyawa aktif dari zat yang berbentuk padat yang dilarutkan baik pada pelarut organik maupun air sebagai cairan pengekstraksi. Leaching dapat


12

digunakan baik untuk mengekstraksi minyak pada sayuran, pewarna makanan, maupun untuk mengeksraksi biji kopi menggunakan air panas. Pada biji kopi, jika ekstraksi diselesaikan pada titik didih pelarut, maka ekstraksi tersebut disebut decoction (Rao, 2010). Metode ekstraksi decoction dapat dilakukan dengan cara: material tanaman yang akan diekstraksi direndam di dalam air pada suhu ruangan, dicampurkan dan diletakkan di dalam sebuah waterbath (Waksmundzka-Hajnos and Sherma, 2011). Metode ekstraksi lain yang biasa digunakan adalah metode infusion. Proses ekstraksi ini menggunakan suhu yang lebih tinggi dibandingkan dengan suhu ruangan (sampai dengan 100C) dalam waktu tertentu (menit sampai jam) dan pelarut yang biasa digunakan adalah air. Setelah proses ekstraksi selesai, campuran yang didapatkan disaring (Tiwari, Brunton, and Brenan, 2013). Jika senyawa aktif yang akan diekstraksi berada di dalam serpihan dari suatu zat padat, untuk meningkatkan efisiensi ekstraksinya, maka zat padat tersebut harus dipecahkan menjadi partikel-partikel yang lebih kecil agar pelarut yang digunakan dapat mencapai lokasi tempat beradanya senyawa aktif yang akan diekstraksi. Dalam ekstraksi padat-cair pada tanaman (ekstraksi pelarut), pelarut akan berdifusi ke dalam sel tanaman dan metabolitnya yang berisi senyawa aktif akan terlarut di dalam pelarut yang digunakan dan kemudian dihantarkan keluar oleh pelarut tersebut keluar dari sel tanaman (Liu, 2011; Rao, 2012).


13

E. Hidrolisis Hidrolisis adalah pemecahan ikatan kimia akibat reaksi yang terjadi dengan air. Reaksi hidrolisis biasanya lambat namun dengan adanya bantuan asam atau basa, laju reaksinya akan meningkat (Cairns, 2008). Pada sebagian besar minuman, proses hidrolisis diperlukan untuk membebaskan sebagian besar asam fenolat dari bentuk ikatannya. Pada kopi, untuk mendapatkan asam kafeat diperlukan proses hidrolisis pada asam klorogenat yang terekstrak secara langsung pada minuman (Mattila, Hellstrom, and Torronen, 2006). Hidrolisis pada polifenol selain berguna untuk menyederhanakan profil polifenol dari ekstrak juga berguna untuk menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Hidrolisis menggunakan basa kuat biasa digunakan pada fitokimia dalam bentuk ester dan untuk melepaskan ikatan beberapa polifenol yang berada dalam bentuk kompleksnya. Hidrolisis basa (saponification) biasa menggunakan satu sampai empat Molar NaOH pada suhu ruangan dengan rentang waktu dari 15 menit sampai satu malam. (Tiwari et al.,2013; Waksmundzka-Hajnos, Sherma, Kowalska, 2008; Watson, 2014).

F. Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi Kromatografi lapis tipis kinerja tinggi adalah teknik analisis instrumental yang didasari kemampuan kromatografi lapis tipis yang lebih maksimal dan baik (Srivastava, 2011). Kromatografi lapis tipis adalah kromatografi planar yang fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang


14

didukung oleh lempeng kaca, lempeng aluminium, ataupun lempeng plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada KLTKT metode pemisahan jauh lebih baik dibanding dengan KLT karena KLTKT dapat melakukan pemisahan dengan lebih efisien karena lempeng KLTKT memiliki ukuran partikel yang lebih kecil, waktu yang dibutuhkan untuk pengembangan lempeng lebih singkat dan tidak membutuhkan banyak fase gerak karena ukuran lempeng KLTKT yang lebih kecil yaitu 10 x 10 atau 10 x 20 cm, sehingga hanya diperlukan pengembangan selama 7-20 menit yang membuat metodel KLTKT menjadi metode yang efisien dalam pelaksanaannya. (Srivastava, 2011). Untuk identifikasi suatu senyawa, bercak hasil pemisahan yang dilakukan oleh fase gerak akan dikarakterisasi berdasarkan nilai faktor retensinya (Rf). Nilai Rf adalah rasio jarak yang dipindahkan oleh pelarut pada suatu zat terlarut yang dibandingkan terhadap jarak yang dipindahkan oleh garis depan pelarut selama waktu yang sama. Nilai batas Rf adalah 1 ≤ Rf ≥ 0, karena ketika Rf = 0, berarti noda tidak berpindah dari posisi awalnya dan jika Rf = 1 maka noda tidak tertahan oleh fase diam dan berpindah bersama tarikan terdepan pelarut (Day dan Underwood, 2002 ; Poole, 2003). Terdapat dua tipe fase pemisahan di dalam kromatografi yang didasarkan pada perbedaan polaritas antara fase diam dan fase gerak. Tipe yang pertama adalah


15

kromatografi fase normal dimana fase diam akan cenderung lebih polar dibandingkan dengan fase gerak. Fase diam polar yang biasa digunakan antara lain alumina serta silika dengan fase gerak seperti heksan ataupun propileter. Tipe kedua adalah kromatografi fase terbalik dimana fase diam akan cenderung lebih non-polar dibandingkan dengan fase gerak. Fase diam non polar yang biasa digunakan antara lain adalah hidrokarbon dengan fase gerak yang relatif polar seperti air, metanol, atau asetonitril (Skoog, 1986). Pada kromatografi fase normal, komponen yang bersifat non polar akan terbawa fase gerak terlebih dahulu. Sebaliknya, pada kromatgrafi fase terbalik, komponen yang bersifat lebih polar akan cenderung terbawa oleh fase gerak terlebih dahulu (Skoog, 1986). 1. Fase Diam Pada KLTKT, fase diam yang digunakan berukuran sangat halus serta memiliki pori-pori seragam serta ketebalan lapisannya hanya 0,1 mm, ukuran partikel fase diam pada KLTKT juga lebih kecil, dan juga lebih tipis. Sampel yang digunakan untuk penotolan hanya sedikit. Bercak penotolannya berdiameter antara 0,1-0,5 mm sehingga dengan lempeng 10 x 10 saja sudah dapat melakukan analisis. Pada KLTKT resolusi pemisahan sudah dapat terlihat jelas pada jarak pengembangan sampel antara 3-6 cm yang menunjukkan pemisahan yang lebih cepat, mengurangi zona difusi, efisiensi pemisahan yang lebih baik, batas deteksi yang lebih kecil, dan dapat menotolkan banyak sampel dalam satu lempeng (Gandjar dan Rohman, 2007; Sherma and Fried, 1996).


16

Tabel II. Jenis fase diam yang digunakan pada tahun 1979-1985 (Spangernberg, Poole, and Weins, 2011)

Tipe Fase Diam Gel Silika G dan H Selulosa Poliamida Fase Terikat Aluminium Oksida kieselguhr Gel

TLC (%) 73,3 5,2 1,8 5,5 2,6 0,3 0,4

HPTLC (%) 73,5 3,1 1,4 22,0

Dalam sistem KLTKT fase diam yang biasa digunakan adalah uncoated silica gel. Fase diam lain selain silica gel adalah aluminium oksida, kieselguhr, magnesium oksida dan magnesium silica (Florisil®) juga merupakan fase diam yang sering digunakan dalam KLT (Spangernberg et al., 2011). Gugus silanol tunggal Dua gugus silanol

Tiga gugus silanol Gambar 4. Struktur Silika gel (Eastman, 2010) Tabel III. Karakteristik lempeng yang biasa digunakan dalam KLT (Spangernberg et al., 2011)

Parameter ukuran lempeng (cm) ketebalan lempeng (m) ukuran partikel (m) volume penotolan (mL) jarak pemisahan (cm) maksimal diameter penotolan (mm) waktu pemisahan (menit) tinggi lempeng (m) totolan per lempeng limit deteksi dalam reflektan (ng) limit deteksi dalam fluoresens (pg)

TLC 20 x 20 100–250 8–10 1–5 6-15 3–6 30–200 35–75 10 1–5 50–100

HPTLC 10 x 10 100–200 6–8 0,1-5 3-7 1–1,5 3–20 23–25 9–18 0,5–1 5–10

UTLC 6 x 3,6 10 0,01-0,1 1-3 0,5–1 1–5 6 0,5 5


17

2. Fase Gerak Pelarut dalam kromatografi memiliki dua fungsi yaitu sebagai pembawa sampel dan untuk memfasilitasi suatu sistem pemisahan. Fase gerak akan mengaliri fase diam dan memfasilitasi transpor sampel yang ditotolkan. Oleh karena itu, kekuatan pelarut mempengaruhi kemampuannya untuk membawa sampel melalui sistem dan selektivitasnya dalam menentukan apakah pemisahan dapat dilakukan. Sebagai pembawa, sampel harus terlarut ke dalam fase gerak dan untuk terjadinya pemisahan, sampel harus tertahan oleh fase diam. Pada keadaan elusi yang ideal, setiap perpindahan dari sampel tidak saling mempengaruhi dengan sampel lain yang ditotolakan pada lempeng tersebut (Bollinger, Brenner, Ganshirt, Mangold, Seiler, Stahl, Waldi, 1962; Spangernberg et al., 2011). Untuk mendapatkan komposisi fase gerak yang optimal yang dapat memisahkan campuran, pemilihan pelarut dapat didasari atas beberapa alasan, antara lain: a. Komposisi pelarut harus dapat memisahkan analit sampai dengan nilai Rf yang baik yang terlihat berdasarkan kekuatan pelarutnya. b. Komposisi pelarut yang selektif yang terlihat dari resolusi dua campuran yang sama-sama dapat terpisah. Parameter selektivitas akan mempengaruhi nilai resolusinya. c. Difusi harus sekecil mungkin selama pemisahan dan waktu yang diperlukan untuk memisah juga harus sesingkat mungkin. (Spangernberg et al., 2011)


18

Beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak: a. Fase gerak harus memiliki kemurnian yang sangat tinggi karena KLT adalah metode yang sangat sensitif. b. Daya elusi fase gerak harus diatur untuk membentuk Rf yang berkisar antara 0,2-0,8 agar pemisahannya maksimal. c. Untuk pemisahan dengan fase diam polar seperti silika gel, polaritas larutan akan mempengaruhi kecepatan migrasi sampel yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan nili Rf secara signifikan. d. Sampel-sampel

ionik

dan

sampel-sampel

polar

lebih

baik

menggunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. (Gandjar dan Rohman, 2007)

G. Densitometri Densitometri adalah pendeteksian sampel yang terelusi oleh fase gerak pada fase diam dan menghasilkan kurva yang dapat digunakan untuk analisis baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Perhitungan yang dilakukan adalah perhitungan kerapatan optik (intensitas) penotolan sampel pada lempeng. Jumlah cahaya yang kembali dari lempeng ke photomultiplier (detektor) dihitung dan direkam sebegai sebuah fungsi dari posisi. Karenanya, densitometer juga dikatakan sebagai detektor (Reich and Schibli, 2007).


19

Prinsip pengukuran densitometri adalah ketika cahaya mengenai permukaan lempeng KLT/KLTKT yang terbentuk dari partikel kecil silika gel yang tidak rata, cahaya tersebut dapat diserap, direfleksikan atau di sebar (Reich and Schibli, 2007). Perhitungan metode densitometri pada KLT dilakukan berdasarkan absorbansi. Rentang terendah sinar UV yang biasa digunakan adalah sekitar 300 nm sampai 190 nm (Sherma and Fried, 2003; Sherma and Fried, 1999).

A

B

C

Gambar 5. Prinsip pengukuran dari densitometri; (A) Cahaya diserap, (B) Cahaya dipantulkan, (C) Cahaya disebar (Reich and Schibli, 2007)

Secara umum, seluruh instrumen densitometer memiliki sumber cahaya baik monokromator maupun filter dan dapat juga keduanya. Sistem optis akan membentuk berkas cahaya menjadi sebuah celah yang tetap, satu atau lebih detektor fotosensing, sebuah sistem readout, dan sebuah pengontrol yang memindahkan lempeng berbingkai melewati cahaya monokromatik sampai melewati detektor. Biasanya ditambah dengan baseline corrector, linearizer, intergrator serta komputer (Sherma and Fried, 1999).


20

Gambar 6. Jalur cahaya melewati scanner KLT. 1. Lampu seleksi, 2. Sistem masuk lensa, 3.Celah masuk monokromator, 4. Kisi monokromator, 5. kaca, 6. Celah disk lubang lensa, 7. Sistem lensa, 8. Kaca, 9. Pemecah cahaya, 10. Photomultiplier referensi, 11. Objek scanning, 12 Photomultiplier penghitung, 13. Photodiode (ditransmisikan) (Sherma and Fried, 2003)

H. Optimasi Optimasi adalah memaksimalkan atau meminimalkan respon dengan mengubah satu atau lebih variabel. Ketika sebuah proses dioptimasi, hasil akhir dapat dipantau secara berkelanjutan. Jika terjadi ketidaksesuaian pada saat pemantauan, proses yang telah dioptimasi tersebut dapat digunakan untuk mengkoreksi dan mengatasi ketidaksesuaian hasil dikemudian hari (Hibbert, 2007). Optimasi pemisahan yang dilakukan pada metode analisis adalah optimasi pemisahan yang berkaitan dengan pemilihan parameter yang tepat terkait dengan pemisahan tersebut (Sherma and Fried, 2003). Parameter optimasi yang perlu dimaksimalkan pada metode analisis adalah resolusi, bentuk puncak, faktor asimetri, waktu elusi, dan keseluruhan kemampuan untuk melakukan kuantifikasi analit tertentu yang dikehendaki (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada KLT terdapat beberapa faktor yang perlu diperhatikan untuk optimasi. Faktor yang paling penting


21

adalah sistem pelarut dan komposisinya, waktu pemisahan yang optimal, suhu dan pada beberapa kasus, kelembaban relatif (Sherma and Fried, 2003).

Gambar 7. Bentuk Gaussian band (Heftmann, 1992)

Bentuk puncak hasil pemisahan di dalam kromatografi seharusnya mendekati bentuk Gausiaan (Gambar 7) namun karena beberapa faktor yang terjadi saat penelitian menyebabkan perubahan pada bentuk puncak. Seluruh bentuk puncak di dalam kromatografi searusnya berbentuk simetris yaitu 0,9 < As < 1,2. Akan tetapi, dalam keadaan tertentu, bentuk puncak yang tidak terlalu simetris masih dapat diterima yaitu 0,8 < As < 1,5 akan tetapi As > 1,5 menandakan adanya masalah dalam sistem kromatografi yang digunakan yang dapat menyebabkan pemisahan yang buruk dan kesulitan dalam proses kuantifikasi (Heftmann, 1992).


22

I. Landasan Teori Asam kafeat merupakan senyawa polifenol berupa asam fenolat yang terdapat di dalam biji kopi yang memiliki efek antioksidan, antibakteri dan antiviral juga dapat menghambat terjadinya tumor dan penyakit kardiovaskular. Terdapat beberapa cara ekstraksi kopi yang dapat dilakukan untuk mendapatkan asam kafeat di dalam ekstrak air seduhan serbuk biji kopi arabika. Oleh karena itu, diperlukan suatu optimasi metode ekstraksi untuk mendapatkan asam kafeat dalam ekstrak air seduhan biji kopi. Meski begitu, hasil ekstraksi yang didapatkan memerlukan proses hidrolisis terlebih dahulu hingga asam kafeat dapat terdeteksi secara bebas di dalam ekstrak biji kopi karena asam kafeat terikat di dalam bentuk ester yaitu dalam bentuk asam klorogenat. Analisis kuantitatif yang dipilih untuk menentukan kadar asam kafeat dalam hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika adalah metode KLTKTDensitometri karena dapat melakukan pemisahan dengan lebih baik dibanding dengan pemisahan yang dihasilkan metode KLT biasa. Lempeng KLTKT memiliki ukuran partikel yang lebih kecil, waktu yang dibutuhkan untuk pengembangan lempeng lebih singkat dan tidak memerlukan banyak fase gerak karena ukuran lempeng KLTKT yang lebih kecil dibanding ukuran lempeng KLT. Disamping itu, metode KLTKT lebih dipilih dibandingkan dengan metode KCKT karena merupakan metode yang cepat pengerjaannya serta biaya pengerjaannya lebih terjangkau. Metode KLTKT didasarkan pada metode KLT yang merupakan prosedur pemisahan senyawa melalui pengembangan fase diam dengan menggunakan fase


23

gerak yang merambat karena pengaruh kapilaritas untuk memisahkan analit yang ditotolkan pada fase diam. Metode KLTKT-Densitometri dapat memisahkan dan mendeteksi analit dengan menghitung kerapatan optik dari hasil pemisahan yang dihasilkan. Dalam penelitian ini, pengembangan metode analisis senyawa asam kafeat didasarkan pada asam kafeat yang memiliki gugus kromoforik yang dapat menyerap radiasi elektromagnetik (absorbsi) dari cahaya yang dipancarkan oleh detektor densitometer pada panjang gelombang tertentu dan dapat merefleksikan cahaya sisa serapan tersebut sehingga terbaca oleh detektor. Optimasi metode KLTKT-Densitometri untuk penetapan kadar asam kafeat dalam hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika perlu dilakukan untuk mendapatkan kondisi yang optimal sehingga dapat digunakan untuk menganalisis asam kafeat. Proses optimasi dilakukan dengan mengoptimasi fase gerak dan komposisinya berdasarkan parameter optimasi berupa faktor asimetris, serta faktor reterdasi dari puncak yang dihasilkan serta membandingkan efektifitas cara ekstraksi yang digunakan untuk memperoleh asam kafeat agar dapat ditetapkan kadarnya menggunakan metode KLTKT-Densitometri. J. Hipotesis 1. Dapat dilakukan perbandingan efektifitas ekstraksi asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) melalui metode ekstraksi syphon dan seduh. 2. Metode KLTKT-Densitometri dengan jenis dan komposisi fase gerak yang optimal dapat menghasilkan pemisahan puncak asam kafeat yang dapat ditetapkan kadarnya.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental dengan rancangan penelitian eksperimental murni. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental karena ada perlakuan terhadap sampel uji yaitu pembedaan cara ekstraksi dan variasi jenis serta komposisi fase gerak pada pemisahan secara KLTKT. Rancangan penelitian bersifat eksperimental murni karena ada randomisasi saat pengambilan sampel.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah cara ekstraksi biji kopi serta jenis dan komposisi fase gerak yang akan dioptimasi. 2. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah pemisahan asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi yang dilihat dari bentuk puncak, nilai faktor asimetris (As), nilai Rf, dan % KV. 3. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini: a. Kemurnian pelarut, digunakan pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi. b. Ketidakstabilan larutan baku asam kafeat, pembuatan larutan baku yang selalu baru setiap dilakukan penelitian.

24


25

C. Definisi Operasional 1. Asam kafeat merupakan salah satu senyawa polifenol hasil hidrolisis ekstrak biji kopi arabika. 2. Sistem KLTKT yang digunakan adalah seperangkat alat KLTKT normal dengan fase diam Silica Gel 60 F254 dengan fase gerak digunakan yaitu toluen: etil asetat : asam format (Rastogi et al., 2008) dengan perbandingan yang optimum (hasil optimasi). 3. Hidrolisis yang dilakukan berupa penambahan larutan NaOH pada larutan sampel untuk mengurai asam klorogenat di dalam ekstrak biji kopi menjadi asam kafeat dan asam ferulat agar asam kafeat dapat terdeteksi. 4. Densitometri merupakan pendeteksian substansi yang terpisah pada lempeng KLT dengan mengukur kerapatan bercak yang terpisah tersebut. 5. Optimasi pemisahan asam kafeat dilakukan dengan mengubah-ubah metode ekstraksi kopi serta jenis dan perbandingan komposisi fase gerak. 6. Parameter pemisahan yang optimum pada metode KLTKT-Densitometri adalah bentuk puncak (peak) yang dilihat dari nilai faktor retardasi (Rf) ; nilai faktor asimetris (As); dan nilai %KV.

D. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain baku pembanding asam kafeat dengan kemurnian 98% (p.a. Sigma-Aldrich), toluen, asam format 98% dan etil asetat (p.a E. Merck), lempeng KLTKT Silica Gel 60 F254 glass 10 x 10, lempeng KLT Silica Gel 60 F254 alumunium 20 x 20 (E. Merck), etanol 98% (CV.


26

Genera Labora), aquabidest (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta), kertas saring, sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi hitam arabika (Coffea arabica L.).

E. Alat Penelitian Alat penelitian yang digunakan antara lain neraca analitik (OHAUS, Pioneer, PA214, max 210 g; min 0.0001 g), densitometer (CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No. 160602), autosampler (Linomat 5 CAT. No. 022.7808 SER. No. 170610), perangkat lunak WinCats (V.1.4.4), makropipet (Acura® manual 835), bejana kromatografi, Coffee grinder (cyprus Barwell KH, GR-0063), Coffee Syphon (Akebonno, TCA-3H), pH meter (Checker® HI 1270), kompor listrik, pengaduk magnetik, kertas saring, pompa vakum, corong Buchner dan alat-alat gelas yang lazim digunakan dalam analisis (Pyrex).

F. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan larutan NaOH 1 N NaOH sebanyak 2 g ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam gelas Beaker kemudian dilarutkan dengan aquabidest. Larutan NaOH tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL dan dilarutkan dengan aquabidest sampai batas tanda, sehingga diperoleh larutan NaOH dengan konsentrasi 1 N. 2. Pembuatan larutan baku asam kafeat a. Pembuatan larutan stok asam kafeat (1 mg/mL)


27

Asam kafeat lebih kurang 25,0 mg ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam gelas Beaker, kemudian dilarutkan dengan aquabidest panas bersuhu ± 80C di atas kompor listrik. Larutan berisi baku dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL dan di add dengan aquabidest sampai batas tanda, sehingga diperoleh larutan baku asam kafeat dengan konsentrasi 1 mg/mL. b. Pembuatan seri larutan baku Diambil 0,8; 1,3; 1,8; 2,3; 2,8; 3,3 mL larutan stok asam kafeat 1 mg/mL (a) dengan menggunakan makropipet dan masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL kemudian diencerkan dengan aquabidest sampai batas tanda. Maka didapatkan larutan dengan konsentrasi asam kafeat masing-masing 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33 mg/mL. 3. Preparasi sampel Sejumlah biji kopi diambil dari dalam wadah kaca yang telah digojog sebelumnya untuk menghomogenkan biji kopi yang ada di dalam stoples. Biji kopi diambil dari dalam stoples untuk digiling menggunakan coffee grinder hingga menjadi serbuk dan diayak dengan ayakan mesh 50 agar mendapatkan serbuk yang lebih halus. Hasil ayakan diambil dan ditimbang sejumlah yang diinginkan. a. Metode ekstraksi I (ekstraksi serbuk biji kopi arabika dengan metode infusion) Serbuk yang telah didapat dari proses pemisahan sebelumnya ditimbang dengan seksama sebanyak 6 g dan diekstraksi dengan 250 mL aquabidest panas menggunakan syphon. Aquabidest yang telah dipanaskan terlebih dahulu dengan menggunakan kompor listrik hingga mencapai suhu ± 90C dimasukkan ke labu


28

alas bulat di bagian bawah syphon. Lampu spiritus yang terdapat pada bagian bawah syphon dinyalakan untuk mendidihkan aquabidest panas pada bagian bawah syphon hingga menjadi uap air dan naik ke tabung di bagian atas syphon. Aquabidest panas yang naik ke bagian atas syphon diukur suhunya sampai ± 95C kemudian serbuk kopi yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam tabung pada bagian atas syphon yang telah berisi aquabidest panas yang naik dari bagian bawah syphon dan ditunggu sampai 1 menit, kemudian air beserta serbuk kopi diaduk dan lampu spiritus dimatikan. Ekstrak air seduhan serbuk kopi yang berada pada bagian atas tabung syphon ditunggu sampai turun kembali ke labu alas bulat pada bagian bawah syphon melalui saringan yang berada di tengah-tengah antara tabung dan labu alas bulat untuk memisahkan endapan serbuk kopi dari cairan hasil ekstraksi. Ekstrak air seduhan yang didapat diambil untuk dilanjutkan dengan proses hidrolisis sebelum dilakukan penotolan diatas lempeng KLTKT. b. Metode ekstraksi II (ekstraksi serbuk biji kopi arabika dengan metode decoction) Serbuk biji kopi yang telah didapat dari proses pemisahan sebelumnya ditimbang dengan seksama sebanyak 6 g kemudian diekstraksi dengan 250 mL aquabidest pada suhu ± 95C di atas kompor listrik dengan bantuan magnetic stirrer (5000 rpm) selama 30 menit. Hasil ekstraksi kemudian disaring degan menggunakan kertas saring dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Hasil ekstraksi yang telah disaring kemudian dimasukkan ke dalam gelas Beaker untuk kemudian dilanjutkan dengan proses hidrolisis sebelum digunakan untuk penotolan diatas lempeng KLTKT.


29

4. Hidrolisis sampel Sampel hasil kedua ekstraksi (3a dan 3b) serta replikasinya dipanaskan di atas waterbath bersuhu ± 85C selama 15 menit dengan sebelumnya diukur pHnya menggunakan pH meter. Masing-masing sampel kemudian ditambahkan 4 mL larutan NaOH 1 N. Kemudian dipanaskan kembali selama 15 menit di atas waterbath. Setelah itu, masing-masing sampel dan replikasinya diukur kembali pHnya menggunakan pH meter sampai pH ±12 (Checker® HI 1270). 5. Penentuan panjang elusi Sampel hasil hidrolisis beserta ketiga replikasinya serta larutan baku 1 mg/mL, masing-masing ditotolkan ke atas lempeng KLTKT sebanyak 1,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nL/sec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dengan panjang totolan 6 mm dan penotolan diposisikan 15 mm dari bagian bawah lempeng dan 15 mm dari bagian samping lempeng yang kemudian dikembangkan dalam bejana kromatografi dengan fase gerak toluen p.a. : etil asetat p.a.: asam format p.a. (7 : 2 : 1). Volume fase gerak yang digunakan adalah 50 mL. Pengembangan dilakukan setinggi 5 cm dan 8 cm. Lempeng KLTKT silika gel 60 F254 kemudian dikeluarkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama 5 menit. Bercak dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007), 325 nm dan 335 nm dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.


30

6. Optimasi metode KLTKT-Densitometri a. Pembuatan fase gerak Masing-masing fase gerak yang digunakan, diambil dengan perbandingan voume dan jenis fase gerak seperti yang tertera pada tabel IV dan dicampur dalam erlenmeyer bertutup kemudian digojog, yaitu: Tabel IV. Jenis dan komposisi fase gerak

Campuran Fase Gerak Komposisi 1 Komposisi 2 Komposisi 3

Kloroform p.a (mL)

Toluen p.a (mL)

Etil asetat p.a (mL)

Asam format p.a (mL)

35 -

25 35

10 15 10

5 10 5

b. Optimasi pemisahan asam kafeat dalam larutan ekstrak biji kopi 1) Larutan baku asam kafeat 1 mg/mL beserta sampel dari masingmasing ekstraksi yang telah dihidrolisis (pelarut aquadest panas), ditotolkan sebanyak 2,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 50 nL/sec pada lempeng KLT silika gel 60 F254 dengan panjang totolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 1 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.


31

2) Larutan baku asam kafeat 1 mg/mL beserta sampel dari masingmasing ekstraksi yang telah dihidrolisis (pelarut aquadest panas), ditotolkan sebanyak 2,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 50 nL/sec pada lempeng KLT silika gel 60 F254 dengan panjang penotolan 4 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 2 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3. 3) Larutan baku asam kafeat 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33 mg/mL beserta sampel hasil hidrolisis ditotolkan sebanyak 1,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nL/sec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dengan panjang totolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 3 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.


32

c. Ripitabilitas fase gerak hasil optimasi Larutan baku asam kafeat 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33 mg/mL direplikasi sebanyak tiga kali beserta sampel hasil hidrolisis dan ketiga replikasinya ditotolkan sebanyak 1,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nL/sec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dengan besar penotolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.menggunakan fase gerak hasil optimasi hingga mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu 500C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) 325 nm dan 335 nm dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3. Parameter optimal dihitung berdasarkan nilai faktor retardasi (Rf) ; nilai faktor asimetris (As) dan % KV nilai AUC.

G. Analisis Hasil Hasil optimasi metode pemisahan asam kafeat dalam larutan sampel dapat dilihat dari densitogram hasil pemisahan berdasarkan variasi jenis dan komposisi fase gerak yang telah ditentukan. Parameter-parameter dasar pemisahan yang baik dan optimal dapat dilihat berdasarkan bentuk puncak yang ditentukan dari nilai faktor asimetris (As); nilai faktor retardasi (Rf); nilai resolusi (Rs) dan nilai % KV.


33

1. Bentuk Puncak Bentuk puncak yang baik adalah simetris. Kesimetrisan puncak dapat dilihat dari nilai faktor asimetri (As). Untuk menentukan asimetri puncak dan digunakan rumus di bawah ini:

(1) Gambar 8. Menentukan nilai faktor asimetris (Synder and Dolan, 2007)

Dimana: As = nilai faktor asimetris A = lebar sebelum puncak puncak pada ketinggian 10% dari bawah B = lebar setelah puncak puncak pada ketinggian 10% dari bawah

2. Faktor Retardasi (Rf) Rf =

𝑍𝑠 𝑍𝑓−𝑍0

(2) (Sherma and Fried, 2003)

Dimana: Zs = jarak perpindahan sampel (mm) Zf = jarak perpindahan pelarut (mm) Z0 = jarak antara garis penotolan dengan sampel awal (mm)


34

3. % Koefisien Variansi (%KV) % KV =

𝑆𝐷

𝑋 100

(4)

𝑋

(Harmita, 2004) Dimana: % KV = Koefisien Variasi SD = Standar deviasi X = rata-rata


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Jenis dan Komposisi Fase Gerak Komposisi fase gerak yang optimal diperlukan dalam melakukan analisis menggunakan metode kromatografi. Fase gerak berperan penting dalam elusi karena menentukan pemisahan yang terjadi pada sampel yang dianalisis telah baik atau belum untuk dilakukan penetapan kadar. Pemisahan yang dihasilkan akan menunjukkan asam kafeat yang akan dianalisis telah benar-benar terpisah dari senyawa lain yang berada di dalam sampel. Variasi komposisi fase gerak yang menggabungkan antara fase gerak non polar dengan fase gerak polar akan memberikan perbedaan polaritas fase gerak dan menyebabkan perbedaan interaksi antara fase diam dengan sampel untuk mendapatkan pemisahan optimum. Komposisi serta jenis fase gerak yang dioptimasi pada penelitian ini terdiri dari 3 komposisi fase gerak. Komposisi pertama terdiri dari campuran kloroform : etil asetat : asam format dengan perbandingan 7 : 2 : 1. Komposisi kedua dan ketiga terdiri dari campuran toluen : etil asetat : asam format dengan perbandingan 5 : 3 : 2 dan 7 : 2 : 1. Kloroform dan toluen dipilih sebagai fase gerak karena sifat non polar yang dimiliki berguna untuk mengelusi terlebih dahulu senyawa-senyawa non polar lain yang berada pada matriks sampel (hasil hidrolisis ekstrak biji kopi arabika) yang dapat mengganggu pemisahan pada saat elusi sehingga dengan tertariknya

35


36

senyawa-senyawa non polar di dalam matriks sampel oleh toluen dapat menghasilkan pemisahan yang baik. Etil asetat dipilih sebagai komponen fase gerak karena sifatnya yang semi polar dapat menarik asam kafeat dari matriks sampel agar ikut terelusi pada lempeng silika dan tidak tertahan pada matriks sampel sehingga dapat terdeteksi. Pemilihan ini juga didasarkan pada sifat asam kafeat yang cenderung polar sehingga lebih mudah terelusi oleh etil asetat yang bersifat semi polar. Asam format dipilih sebagai fase gerak karena struktur asam format yang dapat membentuk ikatan hidrogen. Seperti yang dikatakan oleh Galanakis et al. (2013) bahwa kecenderungan senyawa fenolik untuk membentuk ikatan berdasarkan stereokimianya dan ikatan yang sering muncul adalah ikatan hidrogen dengan senyawa pelarutnya sehingga asam kafeat yang merupakan senyawa fenolik akan lebih mudah terbawa oleh asam format karena ikatan hidrogen yang terbentuk diantara kedua senyawa tersebut.

B. Pembuatan Seri Larutan Baku Pembuatan larutan baku dilakukan dengan melarutkan baku asam kafeat dengan kemurnian ≥ 98.0% ke dalam pelarut aquabidest panas. Penggunaan aquabidest panas sebagai pelarut karena asam kafeat dapat larut di dalam aquabidest panas dan untuk menyamakan pelarut yang digunakan pada sampel yang diuji. Pemilihan aquabidest sebagai pelarut dengan pertimbangan kemurnian air aquabidest lebih tinggi dibandingkan dengan aquadest sehingga diharapkan dapat mengurangi pengotor yang ikut muncul pada saat pendeteksian yang dapat


37

mengganggu proses analisis karena kemunculan pengotor yang terdeteksi pada detektor dapat menyebabkan pengukuran menjadi kurang sensitif. Tujuan pembuatan larutan baku adalah untuk memastikan analit yang akan dianalisis benar berada di dalam matriks sampel. Caranya dengan membandingkan puncak hasil serapan baku dengan sampel yang muncul setelah proses elusi. Serta untuk melakukan penetapan kadar analit yang berada di dalam matriks sampel yaitu dengan pembuatan seri konsentrasi larutan baku. Larutan baku asam kafeat dibuat dengan konsentrasi 1 mg/mL yang kemudian diencerkan untuk membuat seri konsentrasi larutan baku. Pemilihan konsentrasi 1 mg/mL karena belum diketahuinya jumlah analit di dalam matriks sampel yang mungkin terdeteksi sehingga diperlukan konsentrasi yang agak besar agar analit di dalam matriks sampel dapat dipastikan merupakan analit yang diinginkan. Seri konsentrasi larutan baku yang pertama kali dibuat adalah 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,28; dan 0,3 mg/mL. Seri konsentrasi tersebut dibuat dengan tujuan untuk melihat konsentrasi terkecil yang masih dapat dideteksi oleh TLC Scanner serta untuk menentukan konsentrasi yang dapat digunakan untuk membuat kurva baku. Penentuan seri konsentrasi didasarkan pada analit yang terdeteksi pada saat orientasi.


38

Gambar 9. Kromatogram seri larutan baku yang diukur pada  330 nm dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) (dari depan trek 1 (0,03); trek 2 (0,05); trek 3 (0,08); trek 4 (0,1); trek 5 (0,15); trek 6 (0,2); trek 7 (0,25); trek 8 (0,28); dan trek 9 (0,3) mg/mL)

Pendeteksian seri konsentrasi baku asam kafeat dilakukan pada  330 nm (tabel V), Berdasarkan pendeteksian tersebut, konsentrasi 0,03 mg/mL (trek 1; gambar 9; tabel V) tidak dapat terdeteksi dan konsentrasi 0,05 mg/mL (trek 2; tabel V) terdeteksi sangat kecil sehingga pada pembuatan seri konsentrasi yang akan digunakan untuk pembuatan kurva baku, konsentrasi 0,03 dan 0,05 mg/mL tidak lagi digunakan. Tabel V. Rf dan AUC dari seri larutan baku yang diukur pada  330 nm dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) (trek 1 (0,03); trek 2 (0,05); trek 3 (0,08); trek 4 (0,1); trek 5 (0,15); trek 6 (0,2); trek 7 (0,25); trek 8 (0,28); dan trek 9 (0,3) mg/mL) Track 2 3 4 5 6 7 8 9

Peak 1 1 1 1 1 1 1 1

Max Position 0,26 Rf 0,27 Rf 0,27 Rf 0,26 Rf 0,26 Rf 0,26 Rf 0,27 Rf 0,27 Rf

Max Height 23,3 AU 42,9 AU 55,0 AU 57,0 AU 85,2 AU 99,8 AU 124,3 AU 127,1 AU

Area 715,1 AU 1228,7 AU 1560,6 AU 1592,5 AU 2411,9 AU 2691,3 AU 3417,4 AU 3520,5 AU


39

Pada konsentrasi 0,08 mg/mL (trek 3) dan konsentrasi 0,1 mg/mL (trek 4) AUC yang terbaca menunjukkan angka yang kurang lebih sama. Padahal seharusnya dengan adanya perbedaan konsentrasi sebanyak 0,02 mg/mL, AUC yang terbaca pada konsentrasi 0,08 mg/mL seharusnya lebih kecil dibandingkan dengan AUC yang terbaca pada konsentrasi 0,1 mg/mL. Penyebab kesalahan pengukuran ini karena pipet yang digunakan untuk membuat konsentrasi 0,08 mg/mL dari larutan stok 1 mg/mL adalah mikropipet sedangkan untuk konsentrasi 0,1 mg/mL adalah makropipet sehingga pada pembuatan seri konsentrasi yang akan digunakan untuk pembuatan kurva baku, pipet yang digunakan hanya makropipet untuk seluruh seri konsentrasi. Seri konsentrasi yang kemudian digunakan untuk pembuatan kurva baku adalah 0,08, 0,13, 0,18, 0,23, dan 0,28 mg/mL yang didasarkan pada respon analit di dalam sampel yang didapat saat orientasi.

C. Preparasi Larutan Sampel Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.). Ekstrak air seduhan tersebut diperoleh dengan dua cara ekstraksi antara lain dengan metode decoction dan infusi. Kedua jenis metode ekstraksi ini menggunakan aquabidest panas sebagai pelarut dengan tujuan agar hasil yang didapat semirip mungkin dengan metode pembuatan kopi yang biasa disajikan oleh masyarakat. Pemilihan aquabidest sebagai pelarut juga dikarenakan asam klorogenat yang merupakan bentuk ester dari asam kafeat (Patra, 2012) dihasilkan cukup banyak di dalam air dibanding senyawa fenolik lain (Ohno et al., 2012).


40

Prinsip infusion pada penelitian ini dilakukan dengan mengekstraksi serbuk kopi menggunakan syphon coffee maker dimana serbuk kopi yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam syphon setelah suhu aquabidest mencapai ± 950C dan dibiarkan selama satu menit dalam keadaan mendidih tersebut baru kemudian disaring dan ditunggu sampai dingin. Pada prinsip decoction, aquabidest dipanaskan di atas kompor sampai suhu ± 950C kemudian kompor dimatikan. Serbuk kopi diekstraksi pada air panas tersebut sambil diaduk selama 30 menit kemudian dibiarkan mendingin.

D. Hidrolisis Asam kafeat di dalam ekstrak biji kopi, tidak dapat langsung ditemukan, sehingga diperlukan proses hidrolisis dari bentuk ester asam kafeat yaitu asam klorogenat untuk mendapatkan asam kafeat dalam bentuk bebas. Hidrolisis yang digunakan pada penelitian ini adalah hidrolisis basa yang mengacu pada penelitian Wang et al. (2009) dengan modifikasi. Basa yang digunakan untuk proses hidrolisis adalah NaOH 1N dengan bantuan pemanasan menggunakan waterbath. Reaksi hidrolisis yang terjadi pada asam klorogenat untuk membentuk asam kafeat ditunjukkan pada gambar 10.

Gambar 10. Reaksi hidrolisis asam klorogenat menjadi natrium kuinat dan asam kafeat


41

Sebagai hasil dari reaksi hidrolisis tersebut, terbentuk garam-garam basa yang berikatan dengan gugus Na+ dari NaOH yang terion di dalam air. Asam kafeat yang diinginkan dimungkinkan terbentuk setelah proses pengasaman yang terjadi pada saat elusi dengan bantuan asam format yang merupakan salah satu komponen fase gerak yang digunakan. Proses Hidrolisis basa dipilih karena beberapa asam fenolat tidak stabil pada kondisi asam kuat serta dapat menyebabkan senyawa seperti asam hidroksisinamat terdegradasi pada kondisi tersebut serta pada hidrolisis asam, perbedaan kondisi hidrolisis dapat menyebabkan perbedaan kandungan asam fenolat yang terdeteksi (Xu and Howard, 2012).

E. Penentuan Panjang Elusi dan Lama Deteksi Penentuan panjang elusi perlu dilakukan di dalam sistem KLTKT untuk melihat perbedaan pemisahan yang terjadi ketika terjadi perbedaan panjang elusi. Pada penelitian ini panjang elusi yang dibandingkan adalah antara panjang elusi 5 cm dengan panjang elusi 8 cm pada hasil hidrolisis ekstraksi menggunakan syphon (tabel VI dan tabel VII) dan hasil hidrolisis ekstraksi menggunakan metode seduhan biasa (tabel VIII dan tabel IX).


42

Tabel VI. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan menggunakan syphon serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 5 cm Hasil Hidrolisis Ekstraksi Syphon Panjang Jarak Elusi (cm)

 (nm)

325

5

330

335

Sampel

Deteksi Langsung Rf

AUC

Replikasi I

0,16

Replikasi II

Lama Elusi (menit)

Deteksi Setelah 30 Menit Rf

AUC

1797,3

0,17

1875,9

0,16

1949,2

0,17

1888,5

Replikasi III Baku 1 mg/mL Replikasi I

0,16

2511,8

0,17

1847,1

0,16

10598,6

0,17

9754,7

0,16

1735,5

0,17

1736,8

Replikasi II

0,16

1890,2

0,17

1781,6

0,17

1762,2

10

Replikasi III Baku 1 mg/mL Replikasi I

0,16

2424,1

0,16

10197,3

0,17

9233,8

0,16

1653,4

0,17

1717,0

Replikasi II

0,16

1753,9

0,17

1761,0

Replikasi III Baku 1 mg/mL

0,16

2233,6

0,17

1713,4

0,16

9822,6

0,17

9030,4

Lama Elusi (menit)

10

Perbedaan jarak elusi antara 5 cm dan 8 cm menyebabkan perbedaan R f pada saat deteksi. Terlihat pada tabel VI, jarak elusi 5 cm untuk hasil hidrolisis metode ekstraksi menggunakan syphon menghasilkan Rf yang lebih dekat yaitu 0,16 pada deteksi langsung setelah pengeringan dan 0,17 pada deteksi 30 menit setelah pengeringan sedangkan pada jarak elusi 8 cm untuk hasil hidrolisis metode ekstraksi menggunakan syphon (tabel VII) Rf yang dihasilkan adalah 0,32 – 0,33 pada deteksi langsung setelah pengeringan dan 0,26 – 0,27 pada deteksi 30 menit setelah pengeringan. Berdasarkan Gandjar dan Rohman (2007) Rf yang baik adalah yang memiliki pemisahan sekitar 0,2 sampai dengan 0,8 karena itu, jarak elusi 5 cm tidak memenuhi persyaratan Rf yang baik untuk pemisahan.


43

Tabel VII. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan menggunakan syphon serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 8 cm Panj ang Jara k Elusi (cm)

 (nm)

325

8

330

335

Sampel

Replikasi I Replikasi II Replikasi III Baku 1 mg/mL Replikasi I Replikasi II Replikasi III Baku 1 mg/mL Replikasi I Replikasi II Replikasi III Baku 1 mg/mL

Hasil Hidrolisis Ekstraksi Syphon Lama Deteksi Deteksi Setelah Elusi Langsung 30 Menit (menit) Rf

AUC

Rf

AUC

0,32 0,32 0,32

3038,40 2749,30 3037,30

0,26 0,26 0,26

2672,30 2883,30 2768,70

0,33

14248,60

0,27

13780,80

0,32 0,32 0,32

2848,60 2552,70 2829,20

0,26 0,26 0,26

2652,90 2913,80 2800,60

0,33

13827,90

0,27

13850,60

0,32 0,32 0,32

2691,30 2413,10 2617,20

0,27 0,27 0,26

2553,80 2798,60 2707,20

0,33

13039,90

0,27

13079,30

20

Lama Elusi (menit)

20

Perbandingan Rf antara jarak elusi 5 cm untuk hasil hidrolisis metode ekstraksi seduhan biasa (tabel VIII) dengan jarak elusi 8 cm untuk hasil hidrolisis metode ekstraksi seduhan biasa (tabel IX) tidak dapat digunakan sebagai penentu karena pada jarak elusi 5 cm, R f yang terdeteksi pada 330 nm pada saat deteksi langsung setelah pengeringan adalah 0,42 – 0,45 sedangkan pada jarak elusi 8 cm Rf yang terdeteksi pada 330 nm pada saat deteksi langsung adalah 0,25 - 0,26. Kemudian pada jarak elusi 5 cm dengan 8 cm pada pendeteksian 30 menit setelah pengeringan tidak berbeda jauh, yaitu 0,24 – 0,25 untuk jarak elusi 5 cm dan 0,27 untuk jarak elusi 8 cm. Hal tersebut disebabkan karena pembuatan fase gerak yang berbeda-beda untuk setiap elusi.


44

Tabel VIII. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan diseduh serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 5 cm Hasil Hidrolisis Ekstraksi Seduh Panja ng Jarak Elusi (cm)

 (nm)

325

5

330

335

Deteksi Langsung Sampel Rf

AUC

Replikasi I

0,26

Replikasi II

Lama Elusi (menit)


AUC

1902,40

0,24

2011,80

0,26

1838,30

0,24

1938,90

Replikasi III

0,25

1857,20

0,24

1935,80

Replikasi IV Baku 1 mg/mL Replikasi I

0,25

1784,10

0,24

1942,30

0,27

10868,40

0,25

10854,20

0,45

1845,40

0,24

1956,30

Replikasi II

0,44

1801,40

0,24

1837,40

Replikasi III

0,43

1811,10

0,24

1874,20

Replikasi IV Baku 1 mg/mL Replikasi I

0,42

1680,30

0,24

1911,30

0,42

10736,60

0,25

10779,00

0,26

1716,10

0,24

1830,60

Replikasi II

0,26

1663,40

0,24

1757,70

Replikasi III

0,25

1664,50

0,24

1753,20

Replikasi IV Baku 1 mg/mL

0,25

1582,40

0,24

1833,20

0,27

10027,20

0,25

10038,50

10

Lama Elusi (menit)

10

Pada proses penentuan panjang elusi ini, fase gerak dibuat sebanyak empat kali. Pertama pada saat panjang elusi 5 cm untuk ekstraksi menggunakan syphon. Kedua adalah pada saat panjang elusi 8 cm untuk ekstraksi menggunakan syphon. Ketiga adalah pada saat panjang elusi 5 cm untuk ekstraksi menggunakan metode seduhan. Keempat adalah pada saat 8 cm untuk ekstraksi menggunakan metode seduhan. Masing-masing fase gerak digunakan untuk mengelusi lempeng baik yang akan digunakan untuk deteksi langsung setelah proses pengeringan maupun lempeng yang akan dideteksi 30 menit setelah pengeringan.


45

Tabel IX. Nilai Rf, AUC dan lama elusi larutan sampel yang diekstraksi dengan diseduh serta larutan baku 1 mg/mL yang dideteksi pada  325 nm, 330 nm dan 335 nm menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada panjang jarak elusi 8 cm Hasil Hidrolisis Ekstraksi Seduh Panja ng Jarak Elusi (cm)

 (nm)

325

8

330

335

Deteksi Langsung Sampel

Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Baku 1 mg/mL Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Baku 1 mg/mL Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Baku 1 mg/mL

Rf

AUC

0,26 0,26 0,26 0,26

Lama Elusi (menit)


AUC

1883,10 1647,10 1664,30 1519,60

0,27 0,27 0,27 0,27

1897,40 1920,30 1963,30 1995,30

0,26

12826,50

0,27

13382,80

0,25 0,26 0,26 0,26

1751,00 1488,90 1497,30 1440,80

0,27 0,27 0,27 0,27

1760,40 1851,60 1934,30 1869,30

0,26

11727,90

0,27

12259,30

0,26 0,26 0,26 0,26

1723,50 1461,80 1486,20 1330,70

0,27 0,27 0,27 0,27

1780,20 1804,20 1843,00 1820,60

0,26

11993,10

0,27

11974,50

20

Lama Elusi (menit)

20

Fase gerak pada penentuan panjang elusi ini dibuat dengan mencampurkan fase gerak secara langsung ke dalam labu takar 50 mL dengan menggunakan pipet volume dengan ukuran yang berbeda-beda sesuai jumlah yang telah ditentukan sebelumnya. Selama proses pengambilan larutan-larutan fase gerak dengan menggunakan pipet, volume pengambilan dapat berbeda-beda dan dapat menyebabkan perbedaan polaritas yang dapat terjadi karena fase gerak polar yang terlalu banyak maupun karena fase gerak non polar yang terlalu banyak. Untuk menghindari perbedaan polaritas yang dapat menyebabkan bias pada saat pengukuran, maka pembuatan fase gerak pada elusi selanjutnya dilakukan dengan menuangkan larutan-larutan fase gerak terlebih dahulu ke dalam gelas ukur


46

sejumlah yang telah ditentukan kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmayer bertutup untuk kemudian dihomogenkan dengan penggojogan. Setelah proses elusi, lempeng dikeringkan dengan cara pemanasan di dalam oven pada suhu 50C selama 5 menit dengan tujuan untuk mengeringkan lempeng dan menguapkan pelarut sehingga diharapkan yang terdeteksi di lempeng hanya analit yang telah terelusi saja. Pendeteksian lempeng yang lebih kering akan mengurangi noise yang mungkin muncul karena pelarut (Ranny, 1952). Pada bagian ini juga dilihat perbedaan pendeteksian langsung setelah lempeng dikeringkan dengan deteksi 30 menit setelah pengeringan. Berdasarkan tabel VI dan tabel VII serta tabel VIII dan tabel IX, perbedaan selang waktu deteksi tidak memberikan pengaruh berarti pada kadar yang terdeteksi (tidak terjadi penurunan kadar). Akan tetapi, terjadi pergeseran Rf puncak antara hasil dideteksi langsung dengan hasil dideteksi 30 menit setelah pengeringan. Hal ini dapat disebabkan karena suhu ruangan saat proses elusi, kelembaban udara di sekitar chamber, serta tekanan di dalam chamber tidak dapat dikontrol selama proses elusi. Meskipun hasil pendeteksian langsung dan pendeteksian 30 menit setelah pengeringan tidak menunjukkan perubahan yang dapat mengganggu proses perhitungan kadar, untuk keefisienan waktu, deteksi pada proses selanjutnya tetap dilakukan langsung setelah proses pengeringan. Pendeteksian dilakukan pada panjang gelombang yang berbeda untuk membandingkan profil kurva yang terbentuk serta serapan yang dihasilkan pada panjang gelombang mana yang lebih baik serta untuk melihat pada panjang


47

gelombang mana noise yang terdeteksi lebih sedikit. Panjang gelombang pengamatan yang digunakan adalah 325 nm, 330 nm, dan 335 nm.

F.

Optimasi Fase Gerak pada Pemisahan Asam Kafeat Hasil Hidrolisis Ekstrak Air Seduhan Biji Kopi Arabika dengan KLTKT Densitometri Optimasi fase gerak dilakukan dengan menggunakan KLTKT densitometri

pada panjang gelombang 330 nm dengan sistem kromatografi adsorbsi fase normal dengan fase diam yang lebih polar dibandingkan fase gerak yang digunakan. Teknik kromatografi yang digunakan adalah secara ascending dengan jarak pengembangan 8 cm di dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak dengan bantuan kertas saring (untuk mengamati kejenuhannya). Tujuan penjenuhan chamber adalah untuk membantu mempercepat proses elusi karena yang digunakan untuk proses elusi adalah fase uap dari fase gerak serta menjaga kestabilan tekanan uap di dalam chamber sehingga proses elusi dapat berlangsung stabil dan tidak terhenti sebelum batas elusi yang ditentukan. Fase diam yang digunakan pada penelitian ini adalah silica gel 60 F254 yang merupakan fase diam yang umum digunakan pada KLT. Sebelum digunakan, fase diam dipanaskan terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100 0C dengan tujuan untuk mengaktivasi silica gel yang terdeaktivasi karena tertutup oleh air yang terserap permukaan lempeng karena kelembaban udara di lingkungan. Fase gerak optimal yang didapatkan dari proses optimasi adalah toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1).


48

Pada tahap awal optimasi, lempeng yang digunakan adalah lempeng KLT silica gel 60 F254 untuk menentukan fase gerak optimal yang akan digunakan sebelum sistem dipindahkan ke plat KLTKT silica gel 60 F254. Pemisahan telah dikatakan optimal ketika dihasilkan betuk puncak yang simetris (nilai As berada pada rentang 0,8 - 1,5) (Heftmann, 1992), sempit dan tajam, tidak terganggu oleh puncak lain di sekitarnya, memiliki nilai Rf antara 0,2-0,8 (Gandjar dan Rohman, 2007) serta nilai %KV ≤ 2. Berikut ini adalah penjelasan hasil elusi yang telah dilakukan untuk mengoptimasi komposisi serta jenis fase gerak yang akan digunakan untuk analisis asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika. 1. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak kloroform : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) Fase gerak yang digunakan ini berdasarkan penelitian Bojic et al. (2013) untuk memisahkan asam kafeat dari senyawa lain di dalam matriks sampel. Densitogram hasil elusi baku dan sampel menggunakan fase gerak tersebut adalah sebagai berikut:


49

B

A

C

Gambar 11. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak kloroform : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) A. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi syphon (Rf 0,76) B. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi seduh (Rf 0,74) C. Baku asam kafeat 1 mg/mL (Rf 0,72)

Komposisi fase gerak kloroform : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) menghasilkan puncak asam kafeat yang cukup baik (gambar 11 C) dengan tidak adanya pengotor di sekitar puncak baku asam kafeat yang menandakan kemurnian tinggi yang dimiliki baku. Akan tetapi, pada sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon (gambar 11 A) dan pada sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh (gambar 11 B) terdeteksi pengotor yang ditunjukkan pada beberapa puncak di sekitar puncak asam kafeat serta terdapat puncak lain yang tidak terpisah di samping puncak asam kafeat pada sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh (gambar 11 B). Hal ini dapat disebabkan karena kepolaran kloroform belum cukup kuat untuk dapat memisahkan


50

senyawa lain yang memiliki kepolaran yang mirip dengan asam kafeat maupun senyawa-senyawa yang cenderung non polar sehingga puncak yang dihasilkan belum terpisah dengan baik meskipun asam kafeat sudah dapat terdeteksi. Asam kafeat sudah dapat dikatakan terdeteksi karena memiliki Rf yang berdekatan dengan baku (0,72) yaitu 0,74 - 0.76. Berdasarkan hasil elusi di atas maka fase gerak ini tidak digunakan untuk analisis kuantitatif dalam pemisahan asam kafeat. 2. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (5 : 3 : 2) Fase gerak ini berdasarkan penelitian Rastogi et al. (2008) untuk pemisahan asam fenolat di dalam tanaman Syzygium aromaticum namun dengan modifikasi pada komposisinya. Densitogram yang dihasilkan pada elusi menggunakan fase gerak ini adalah sebagai berikut:

A

B

C

Gambar 12. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (5 : 3 : 2) A. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi syphon (Rf ,48) B. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi seduh (Rf 0,47) C. Baku asam kafeat 1 mg/mL (Rf 0,48)


51

Hasil densitogram yang pada elusi menggunakan fase gerak ini menunjukkan pemisahan antara asam kafeat dengan senyawa lain di dalam matriks sampel lebih baik meskipun pemisahkan masih belum mencapai garis baseline. Pemisahan yang cukup baik antara asam kafeat dengan senyawa di sekitarnya disebabkan karena sifat toluen sebagai fase gerak yang memiliki sifat non polar yang lebih tinggi dibandingkan dengan kloroform pada komposisi fase gerak sebelumnya sehingga dapat memisahkan senyawa-senyawa non polar yang terdapat di dalam matriks sampel dari asam kafeat yang bersifat relatif polar. Penyebab tidak baselinenya pemisahan serta masih banyaknya pengotor di sekitar puncak asam kafeat (gambar 12 A dan 12 B) dapat disebabkan karena penotolan dilakukan sepanjang 4 mm dan sebanyak 2 L sehingga dengan jumlah penotolan yang terlalu banyak membuat pemisahan tidak sempurna. Selain itu, jumlah toluen yang digunakan untuk pemisahan pada komposisi fase gerak ini masih belum cukup untuk dapat memisahkan asam kafeat dari senyawa-senyawa lain pada matriks sampel karena sistem masih cenderung polar meskipun asam kafeat telah dapat terdeteksi yang dapat dilihat dari Rf yang dihasilkan yaitu 0,47 – 0,48 dengan Rf pada baku yaitu 0,48. Berdasarkan hasil elusi di atas maka fase gerak tidak digunakan untuk proses analisis selanjutnya. 3. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) Fase gerak ini merupakan modifikasi fase gerak II untuk menurunkan kepolaran dari fase gerak dengan menambahkan jumlah toluen untuk dapat memisahkan asam kafeat. Pada optimasi menggunakan fase gerak ini, dilakukan


52

pergantian pelarut menggunakan aquabidest untuk mengurangi pengotor yang disebabkan oleh pelarut. Berikut ini adalah densitogram yang dihasilkan pada elusi menggunakan fase gerak ini. B

A

C

Gambar 13. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) A. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi syphon (Rf 0,34) B. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi seduh (Rf 0,33) C. Baku asam kafeat 1 mg/mL (Rf 0,34)

Berdasarkan kromatogram pada gambar 13 yang dihasilkan dari proses elusi menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) dapat terlihat tidak ada lagi puncak lain di sekitar puncak asam kafeat serta nilai R f dari baku adalah 0,34 dan Rf dari elusi sampel dari kedua macam ekstraksi adalah 0,33 - 0,34. Hasil tersebut menandakan komposisi fase gerak ini telah dapat memisahkan asam kafeat dengan baik dari matriks sampel. Selain itu, penggunaan aquabidest sebagai pelarut juga telah mengurangi jumlah pengotor yang dapat menyebabkan munculnya puncak-puncak yang tidak diinginkan. Penambahan jumlah toluen pada


53

fase gerak telah menurunkan kepolaran dari fase gerak sehingga senyawa yang bersifat non polar akan terelusi bersama dengan fase gerak dan asam kafeat yang bersifat lebih polar akan tertahan di lempeng silika. 4. Hasil elusi asam kafeat dengan fase gerak toluene : etil asetat : asam

format (7 : 2 : 1) pada lempeng KLTKT Setelah ditemukan komposisi fase gerak yang optimal untuk memisahkan asam kafeat dari matriks sampel hasil hidrolisis ekstrak biji kopi arabika, penotolan dilakukan di lempeng KLTKT untuk memastikan bahwa fase gerak yang telah ditentukan juga dapat digunakan pada lempeng KLTKT. Berikut adalah densitogram hasil elusi menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada lempeng KLTKT

B

A

C

Gambar 14. Puncak baku asam kafeat dan sampel hasil hifrolisis ekstraksi syphon dan seduh pada  330 nm dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada plat KLTKT A. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi syphon (Rf 0,32) B. Asam kafeat yang terdeteksi pada hasil hidrolisis ekstraksi seduh (Rf 0,26) C. Baku asam kafeat 1 mg/mL (Rf 0,33)


54

Kromatogram yang dihasilkan menggunakan fase gerak fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada lempeng KLTKT (gambar 14) menunjukkan bahwa fase gerak ini dapat digunakan sebagai eluen untuk pemisahan asam kafeat dari matriks sampel dan menghasilkan pemisahan yang cukup baik ditandai dengan tidak nampaknya puncak lain di sekitar puncak asam kafeat. Rf yang dihasilkan berdasarkan elusi menggunakan fase gerak ini adalah 0,26 – 0,33 Pemisahan dapat terjadi karena interaksi yang terbentuk antara asam kafeat dengan fase diam dan fase gerak. Gugus polar dalam asam kafeat akan berinteraksi dengan sisi polar pada lempeng silika gel 60 F254 yang memiliki gugus silanol (SiOH) dan gugus siloksan (Si-O-Si) pada permukaannya. Berikut ini adalah interaksi antara asam kafeat dengan fase diam.

Gambar 15. Interaksi asam kafeat dengan fase diam ----- Interaksi hidrogen

Asam kafeat yang memiliki sifat polar membentuk ikatan hidrogen dengan fase diam seperti terlihat pada gambar 15 sehingga asam kafeat lebih cenderung tertahan lebih kuat terikat pada fase diam sehingga diperlukan fase gerak yang lebih non polar untuk menarik asam kafeat agar terpisah dari matriks sampel dan


55

membentuk pemisahan yang baik. Berikut adalah interaksi yang terjadi antara asam kafeat dengan fase gerak (toluen : etil asetat : asam format).

Gambar 16. Interaksi asam kafeat dengan fase gerak (toluen : etil asetat : asam format) ------ Interaksi hidrogen Interaksi Van Der Waals

Interaksi antara asam kafeat dengan fase gerak (gambar 16) yang terbentuk cukup kuat ditunjukkan melalui ikatan-ikatan hidrogen yang terbentuk antara fase gerak dengan gugus polar dari asam kafeat serta dibantu oleh toluen dengan jumlah yang cukup banyak serta dengan sifatnya yang paling non polar diantara ketiga jenis fase gerak yang digunakan, dapat menarik asam kafeat sehingga terpisah dari matriks sampel. 5. Ripitabilitas baku asam kafeat serta sampel pada fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) pada lempeng KLTKT Setelah didapatkan komposisi fase gerak yang optimal dilakukan pengujian ripitabilitas pemisahan baku asam kafeat dan sampel dengan menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1). Hasil pengujian ripitabilitas ini juga digunakan untuk pembuatan kurva baku yang diikuti dengan perhitungan


56

kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika. Uji ripitabilitas ini digunakan untuk melihat sudah konstan atau belumnya keterulangan pengukuran asam kafeat menggunakan fase gerak yang telah ditentukan terhadap kedua jenis ekstraksi melalui pengamatan kestabilan keterulangan nilai Rf, nilai As. Berikut adalah penjabaran hasil elusi baku asam kafeat pada panjang gelombang 325 nm, 330 nm dan 335 nm. Tabel X. Nilai Rf, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm  325 nm Konsentrasi Rf As AUC

0,08 0,28 0,64 1281,20

Konsentrasi Rf As AUC

0,08 0,25 0,70 1025,80


0,08 0,32 0,67 1081,20

Replikasi I 0,18 0,23 0,28 0,28 0,50 0,47 2854,40 3410,70 Replikasi II 0,13 0,18 0,23 0,25 0,25 0,26 0,54 0,64 0,54 1775,50 2618,70 3321,50 Replikasi III 0,13 0,18 0,23 0,32 0,32 0,32 0,45 0,5 0,5 1889,90 2646,40 3218,50 0,13 0,28 0,89 1983,30

0,28 0,29 0,54 4093,90 0,28 0,26 0,57 4085,70 0,28 0,32 0,5 4158,30

Berdasarkan data yang ditampilkan pada tabel X, XI, dan XII seluruh puncak baku asam kafeat yang dihasilkan menunjukkan peningkatan respon detektor densitometer seiring pertambahan jumlah konsentrasi yang terlihat dari peningkatan nilai AUC yang terbaca. Akan tetapi, dari nilai As yang dihasilkan, tampak bahwa puncak asam kafeat yang dihasilkan membentuk fronting. Hal ini dapat disebabkan karena pelarut yang digunakan tidak sesuai dengan fase gerak pada saat mengelusi sampel selain itu bisa juga karena pH fase gerak kurang tepat sehingga menyebabkan fronting pada puncak asam kafeat.


57

Tabel XI. Nilai Rf, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm


0,08 0,28 0,46 1206,10


0,08 0,25 0,58 961,10


0,08 0,32 0,67 1016,30

 330 nm Replikasi I 0,13 0,18 0,23 0,28 0,28 0,28 0,50 0,50 0,55 1945,10 2737,60 3380,00 Replikasi II 0,13 0,18 0,23 0,25 0,25 0,25 0,53 0,62 0,63 1721,20 2457,40 3095,60 Replikasi III 0,13 0,18 0,23 0,32 0,32 0,32 0,56 0,5 0,55 1727,20 2695,20 3287,00

0,28 0,29 0,58 4092,50 0,28 0,26 0,53 3742,20 0,28 0,32 0,5 4005,50

Akan tetapi dapat dipastikan bahwa fronting bukan disebabkan karena terdapat puncak lain yang tidak terpisah dengan puncak asam kafeat karena pembuatan larutan baku asam kafeat berasal dari serbuk asam kafeat dengan kemurnian tinggi yaitu ≥ 98%. Tabel XII. Nilai Rf, As, dan AUC dari seri larutan baku asam kafeat dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm


0,08 0,28 0,43 1118,90


0,08 0,25 0,60 867,90


0,08 0,32 0,57 987,30

 335 nm Replikasi I 0,13 0,18 0,23 0,28 0,28 0,28 0,45 0,44 0,54 1785,00 2578,70 3127,50 Replikasi II 0,13 0,18 0,23 0,25 0,25 0,26 0,55 0,62 0,55 1479,40 2271,80 2705,30 Replikasi III 0,13 0,18 0,23 0,32 0,32 0,32 0,45 0,71 0,55 1692,80 2464,70 3030,70

0,28 0,29 0,57 3789,60 0,28 0,26 0,62 3411,10 0,28 0,32 0,63 3690,90


58

Profil puncak asam kafeat yang terdeteksi pada sampel (tabel XIII) juga mengalami fronting, meskipun kadarnya relatif kecil. Berikut ini adalah tabel data hasil elusi sampel hasil kedua ekstraksi biji kopi arabika pada panjang gelombang 325 nm, 330 nm dan 335 nm. Tabel XIII. Nilai Rf, As, dan AUC dari larutan sampel hasil hidrolisis ekstraksi biji kopi arabika dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) Sampel Hasil Hidrolisis Ekstraksi Syphon  325 nm

 330 nm

 335 nm

RF

As

AUC

RF

As

AUC

RF

As

AUC

Replikasi I

0,30

0,57

1960,00

0,30

0,53

1955,20

0,30

0,57

1790,10

Replikasi II

0,29

0,53

1887,50

0,28

0,57

1887,20

0,29

0,58

1682,10

Replikasi III

0,28

0,47

1855,90

0,28

0,50

1855,40

0,28

0,57

1646,60

Replikasi IV

0,28

0,47

1809,20

0,28

0,50

1821,80

0,28

0,4

1652,60

Sampel Hasil Hidrolisis Ekstraksi Seduh  325 nm

 330 nm

 335 nm

RF

As

AUC

RF

As

AUC

RF

As

AUC

Replikasi I

0,26

0,62

1905,40

0,26

0,57

1793,10

0,26

0,62

1620,60

Replikasi II

0,25

0,64

1983,70

0,25

0,33

1837,80

0,25

0,64

1703,70

Replikasi III

0,25

0,64

1870,20

0,25

0,62

1796,60

0,25

0,54

1603,50

Replikasi IV

0,25

0,57

1844,00

0,25

0,33

1684,10

0,25

0,62

1566,90

Nilai Rf yang dihasilkan dari proses elusi baku dan sampel, menunjukkan keterulangan yang baik dengan Rf antara satu penotolan dengan penotolan lain yaitu 0,25 – 0,32 akan tetapi antar replikasi menunjukkan perbedaan Rf perbedaan ini dapat disebabkan karena perbedaan suhu ruangan saat proses elusi, kelembaban udara di sekitar chamber, serta tekanan di dalam chamber tidak dapat dikontrol selama proses elusi.


59

G. Pembuatan Kurva Baku Asam Kafeat Pembuatan kurva baku pada penelitian ini untuk memperoleh persamaan garis linier yang dapat digunakan untuk analisis kuantitaitf asam kafeat yang berada di dalam ekstrak biji kopi arabika. Kurva baku dibuat dengan 5 seri konsentrasi larutan baku, direplikasi sebanyak 3 kali dan diukur pada 3 panjang gelombang berbeda yaitu pada 325 nm, 330 nm, dan 335 nm untuk memperoleh nilai koefisien korelasi (r) yang paling baik dari masing-masing panjang gelombang. Nilai r menunjukkan korelasi antara konsentrasi dengan respon pengukuran yang dihasilkan berupa nilai Area Under Curve (AUC). Nilai r yang masih dapat diterima menurut Chan, Lam, Lee, and Zhang (2004) adalah 0,995 atau lebih. Tabel XIV. Data replikasi kurva baku asam kafeat pada  325 nm

Data Replikasi Kurva Baku Asam Kafeat

 325 nm Replikasi I konsentrasi AUC (mg/mL) 0,08 1281,20 0,13 1983,30

Replikasi II konsentrasi AUC (mg/mL) 0,08 1025,80 0,13 1775,50

Replikasi III konsentrasi AUC (mg/mL) 0,08 1016,30 0,13 1727,20

0,18 0,23 0,28

2854,40 3410,70 4093,90

0,18 0,23 0,28

2618,70 3321,50 4085,70

0,18 0,23 0,28

2695,20 3287,00 4005,50

A B R

185,69 14106 0,99787

A B r

-194,25 15332 0,99969

A B r

-94,948 14966 0,99742


60

Tabel XV. Data replikasi kurva baku asam kafeat pada  330 nm

Data Replikasi Kurva Baku Asam Kafeat  330 nm Replikasi II Replikasi III Replikasi I konsentrasi konsentrasi konsentrasi AUC AUC AUC (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) 0,08 961,10 0,08 1016,30 0,08 1206,10 0,13 1721,20 0,13 1727,20 0,13 1945,10 0,18 2457,40 0,18 2695,20 0,18 2737,60 0,23 3095,60 0,23 3287,00 0,23 3380,00 0,28 3742,20 0,28 4005,50 0,28 4092,50 A B r

77,488 14415 0,99947

A B r

-101,68 13873 0,99916

A B r

-167,51 15076 0,99742

Tabel XVI . Data replikasi kurva baku asam kafeat pada  335 nm

Data Replikasi Kurva Baku Asam Kafeat  335 nm Replikasi I Replikasi II Replikasi III konsentrasi konsentrasi konsentrasi AUC AUC AUC (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) 0,08 0,08 1118,90 867,90 0,08 987,30 0,13 1785,00 0,13 1479,40 0,13 1692,80 0,18 2578,70 0,18 2271,80 0,18 2464,70 0,23 3127,50 0,23 2705,30 0,23 3030,70 0,28 0,28 3789,60 3411,10 0,28 3690,90 A B r

73,736 13368 0,99864

A B r

-125,33 12625 0,99719

A B r

-54,956 13490 0,99879

Kurva baku yang digunakan adalah yang memiliki korelasi yang baik antara konsentrasi dengan respon pengukuran yang dihasilkan (AUC) yaitu yang koefieisn korelasinya (r) mendekati 1. Berdasarkan data pada tabel XIV, XV, XVI terlihat bahwa seluruh koefisien korelasi pada masing-masing replikasi memenuhi kriteria nilai r yang masih dapat diterima yaitu ≥ 0,995 (Chan, Lam, Lee, and Zhang,


61

2004). Kurva baku yang dipilih untuk baku asam kafeat adalah replikasi II untuk  325 nm, replikasi I 330 nm dan replikasi III untuk  335 nm. Persamaan kurva baku asam kafeat untuk  325 adalah Y = 15332 X – 194,25 dengan nilai r = 0,9997. Persamaan kurva baku asam kafeat untuk  330 adalah Y =14415 X + 77,488 dengan nilai r = 0,9995 dan persamaan kurva baku asam kafeat untuk  335 adalah Y = 13490 X – 54,956 dengan nilai r = 0,9987.

Regresi Linear  325 nm 5000.00

AUC

4000.00 Y = 15332 X - 194,25 R² = 0,9994

3000.00 2000.00 1000.00 0.00 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Konsentrasi asam kafeat (mg/mL) Gambar 17. Hubungan antara konsentrasi asam kafeat dengan AUC (replikasi II)


AUC

4000.00

Y = 14415 X + 77,488 R² = 0,9989

3000.00 2000.00 1000.00 0.00

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Konsentrasi asam kafeat (mg/mL) Gambar 18. Hubungan antara konsentrasi asam kafeat dengan AUC (replikasi I)


62


AUC

3000.00

Y = 13490 X - 54,956 R² = 0,9976

2000.00 1000.00 0.00 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Konsentrasi asam kafeat (mg/mL) Gambar 19. Hubungan antara konsentrasi asam kafeat dengan AUC (replikasi III)

H. Perhitungan Kadar Asam Kafeat Berdasarkan persamaan garis regresi linear kurva baku yang telah dihasilkan, maka dilakukanlah perhitungan kadar asam kafeat yang terdapat di dalam sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika. Berikut adalah tabel hasil perhitungan kadar asam kafeat pada panjang gelombang 325 nm, 330 nm, dan 335 nm pada kedua macam metode ekstraksi yaitu pada ekstraksi menggunakan syphon dan ekstraksi secara seduh. Tabel XVII. Data perhitungan kadar sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika pada  325 nm

 325 nm replikasi syphon

replikasi seduh

y = 15332x - 194,25 Rf

Konsentrasi asam kafeat (mg/mL)

0,30 0,29 0,28 0,28

0,1405 0,1357 0,1337 0,1306

mean SD %KV

0,1352 0,0041 3,0564

AUC 1960,00 1887,50 1855,90 1809,20

y = 15332x - 194,25 % Kadar asam kafeat (b/b) 0,00234 0,00225 0,00222 0,00217 0,00224 0,0000699 3,116

Rf


0,26 0,25 0,25 0,25

0,1369 0,1421 0,1346 0,1329

mean SD %KV

0,1366 0,0040 2,8976

AUC 1905,40 1983,70 1870,20 1844,00

% Kadar asam kafeat (b/b) 0,00228 0,00235 0,00224 0,00222 0,00227 0,0000569 2,506


63

Tabel XVIII. Data perhitungan kadar sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika pada  330 nm

 330 nm

Rf 0,29 0,28 0,28 0,28 mean SD %KV

replikasi syphon y = 14415x + 77,488 konsentrasi asam AUC kafeat (mg/mL) 0,1302 1955,20 0,1255 1887,20 0,1233 1855,40 0,1210 1821,80 0,1250 0,0039 3,1547

% Kadar asam kafeat (b/b) 0,00217 0,00208 0,00204 0,00201 0,00208

0,26 0,25 0,25 0,25 mean

0,0000669 3,223

SD %KV

Rf

replikasi seduh y = 14415x + 77,488 konsentrasi asam AUC kafeat (mg/mL) 0,1190 1793,10 0,1221 1837,80 0,1192 1796,60 0,1114 1684,10 0,1180 0,0046 3,8664


Tabel XIX. Data perhitungan kadar sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika pada  335 nm

 335 nm replikasi syphon y = 13490x - 54,956 Rf


0,30 0,29 0,28 0,28 mean SD %KV

0,1367 0,1287 0,1261 0,1265 0,1296 0,0049 3,8142

AUC 1790,10 1682,10 1646,60 1652,60

replikasi seduh y = 13490x - 54,956 % Kadar asam kafeat (b/b) 0,00227 0,00213 0,00209 0,00210 0,00215 0,0000846 3,935

Rf


0,26 0,25 0,25 0,25 mean SD %KV

0,1242 0,1303 0,1229 0,1202 0,1244 0,0043 3,4470

AUC 1620,60 1703,70 1603,50 1566,90


Berdasarkan hasil perhitungan kadar yang didapat (tabel XVII, tabel XVIII dan tabel XIX) tidak menunjukkan perbedaan kadar yang berarti. Hal tersebut ditunjukkan berdasarkan rata-rata kadar yang didapatkan pada masing-masing metode ekstraksi pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Pada pengukuran kadar menggunakan  330 nm, ekstraksi menggunakan syphon menghasilkan kadar rata-rata 0,1250 mg/mL yang setara dengan 125,0 ppm dan menggunakan metode


64

seduh biasa menghasilkan kadar rata-rata 0,1180 mg/mL yang setara dengan 118,0 ppm dengan nilai standar deviasi (SD) 0,0039 untuk metode ekstraksi menggunakan syphon dan 0,0046 untuk metode ekstraksi dengan penyeduhan biasa. Pada pengukuran menggunakan  325 nm, ekstraksi menggunakan syphon menghasilkan kadar rata-rata 0,1352 mg/mL yang setara dengan 135,2 ppm dan menggunakan metode seduh biasa menghasilkan kadar rata-rata 0,1366 mg/mL yang setara dengan 136,6 ppm dengan nilai SD 0,0041 untuk metode ekstraksi menggunakan syphon dan 0,0040 untuk metode ekstraksi dengan penyeduhan biasa dan pada pengukuran menggunakan  335 nm, ekstraksi menggunakan syphon menghasilkan kadar rata-rata 0,1296 mg/mL yang setara dengan 129,6 ppm dan ekstraksi menggunakan metode seduh biasa menghasilkan kadar rata-rata 0,1244 mg/mL yang setara dengan 124,4 ppm dengan nilai SD 0,0049 untuk metode ekstraksi menggunakan syphon dan 0,0043 untuk metode ekstraksi dengan penyeduhan biasa. Berdasarkan nilai rata-rata kadar serta nilai SD dapat ditentukan nilai % KV. Berdasarkan penjabaran sebelumnya, rata-rata konsentrasi perhitungan kadar asam kafeat adalah pada konsentrasi 1000 ppm. Menurut Horwitz, % KV yang dapat diterima pada konsentrasi tersebut adalah ≤ 5,7% (Gonzales and Herrador, 2007). Nilai KV untuk kadar asam kafeat pada  330 nm dengan ekstraksi menggunakan syphon adalah 3,15% dan untuk ekstraksi menggunakan metode seduh biasa adalah 3,87% . Nilai KV untuk kadar asam kafeat pada  325 nm


65

dengan ekstraksi menggunakan syphon adalah 3,06% dan untuk ekstraksi menggunakan metode seduh biasa adalah 2,89%. Nilai % KV untuk kadar asam kafeat pada  335 nm dengan ekstraksi menggunakan syphon adalah 3,81% dan untuk ekstraksi menggunakan metode seduh biasa 3,45%. Berdasarkan penjabaran tersebut, nilai % KV yang dihasilkan untuk masing-masing ekstraksi pada masingmasing panjang gelombang dapat dikatakan telah memenuhi persyaratan % KV yang baik menurut Horwitz (Gonzales and Herrador, 2007). Nilai perhitungan rata-rata kadar yang dihasilkan menunjukkan hasil yang kurang lebih sama antara perhitungan kadar menggunakan panjang gelombang 325 nm, 330 nm dan 335 nm, akan tetapi melalui perhitungan kadar dengan ketiga penjang gelombang tersebut, diketahui bahwa deteksi menggunakan panjang gelombang 325 nm memberikan serapan terbesar dibandingkan dengan deteksi menggunakan panjang gelombang 330 nm dan 335 nm.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Berdasarkan perhitungan kadar asam kafeat menggunakan metode ekstraksi syphon, nilai rata-rata kadar pada  330 nm sebesar 0,00201% b/b dengan %KV 3,22 dan hasil perhitungan kadar menggunakan metode ekstraksi seduh pada  330 nm sebesar 0,00196% b/b dengan %KV 3,59 sehingga dapat disimpulkan dari kedua metode tersebut memiliki rata-rata kadar yang kurang lebih sama. 2. Metode KLTKT-Densitometri yang optimum yaitu dengan instrumen Camag TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No. 160602, fase diam silika gel 60 F254, fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1), volume penotolan 1,0 L dengan mode penotolan band (pita) sepanjang 6 mm, jarak pengembangan 8 cm, hidrolisis menggunakan NaOH 1 N dan deteksi pada panjang gelombang 330 nm. B. Saran 1. Pada penelitian ini perlu dilakukan validasi metode dan efisiensi penggunaan metode yang telah tervalidasi untuk penetapan kadar hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika (Coffea arabica L.) menggunakan metode KLTKTDensitometri dengan perbandigan komposisi fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2: 1). 2. Perlu dilakukan optimasi metode hidrolisis menggunakan katalis selain NaOH dan analisis pada matriks selain ekstrak air seduhan biji kopi arabika.

66


Daftar Pustaka Antolovich, M., Prenzler, P., Robards, K., Ryan, D., 2000, Sample Preparation in The Determination of Phenolic Compounds in Fruits, The Analyst, 125, 989– 1009. Bennat, C., Engelhardt, U.H., Kiehne, A., Wirries, F., and Maier, H.G., 1994, HPLC Analysis of Chlorogenic Acid Lactones in Roasted Coffee, Z Lebensm Unters Forsch, 199, 17-21. Boer, H. 1998, Coffee Cultivation in The Watershed Of The River Aranjuez, Ministerio De Agricultura Y Ganaderia De Costa Rica, Costa Rica, pp. 6-7. Bojic, M., Haas, V.S., Saric, D., and Males, Z., 2013, Determination of Flavonoids, Phenolic Acids, and Xanthines in Mate Tea (Ilex paraguariensis St.-Hil.), Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2013, 1-6. Butt, M.S., Ahmed, A., Imran, M.T.S.A., Yasin, M., and Imran, M., 2011, Evaluating the effect of decaffeination on nutritional and antioxidant status of different coffee brands, Internet Journal of Food Safety, 13, 198-207. Bollinger, H.R., Brenner, M., Ganshirt, H., Mangold, H.K., Seiler, H., Stahl, E., Waldi, D., 1962, Thin-Layer Chromatography A Laboratory Handbook, Academic Press Inc., New York, p. 75 Cairns, D., 2008, Essentials of Pharmaceutical Chemistry, Third Edition, Pharmaceutical Press, London, pp. 234. Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X., 2004, Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification, (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, p.29. Cheynier, V., 2005, Polyphenols in Foods are more Complex than Often Thought., The American Journal of Clinical Nutrition, 81, 223S-229S. Day, R.A., dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta, p. 551. de la Rosa, L.A., Alvarez-Parrilla, E., and Gonzalez-Aguilar, G.A., 2010, Fruit and Vegetable Phytochemicals, (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., Iowa, pp.56, 88.

67


68

Eastman, M., 2010, Chromatography, http://materialsworld.utep.edu/Modules/Concrete/Chromatography/, diakses tanggal 13 April 2014. Fathi, M., Mirlohi, M., Varshoaz, J., and Madani, G., 2013, Novel Caffeic Acid Nanocarrier: Production, Characterization, and Release Modeling, Journal of Nanomaterials, 2013, 1-8. Galanakis, C.M., Goulas, V., Tsakona, S., Manganaris, G.A., and Gekas, V., 2013, A Knowledge Base for The Recovery of Natural Phenols with Different Solvents, International Journal of Food Properties, 16, 382–396. Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Puataka Pelajar, Yogyakarta, pp. 339,353,359-360, 460. Gonzales, A.G. and Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to Analytical Method Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends in Analytical Chemistry, 26(3), 227-238. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, 1 (3), 117-135. Heftmann, E., 1992, Chromatography: Fundamentals and Applications of Chromatography and Related Differential Migration Methods Part A: Fundamentals and Techniques, (Ed.), Elsevier Science, Amsterdam, pp A8A9 Hibbert, D.B., 2007, Quality Assurance in the Analytical Chemistry Laboratory, Oxford University Press, Inc., New York, pp. 67-68. Janisak, G. and Mathe, I., 1997, Parallel Determination of Rosmarinic and Caffeic Acids by TLC-Densitometry, Chromatographia, 46(5/6), 322-324. Kang, N.J., Lee, K.W., Shin, B.J., Jung, S.K., Hwang, M.K., Bode, A.M., et al., 2009, Caffeic Acid, A Phenolic Phytochemical in Coffee, Directly Inhibits Fyn Kinase Activity and UVB-Induced COX-2 Expression, Carcinogenesis, 30(2), 321-330. Kar, A., 2007, Pharmacognosy and Pharmacobiotechnology, New Age International Publisher, New Delhi, p. 342. Kreicbergs, V., Dimins, F., Mikelsone, V., and Cinkmanis, I., 2011, Logically Active Compounds in Roasted Coffee, FOODBALT 2011, Lithuanian Research Center of Agriculture and Forestry, Institute of Horticulture, 110115.


69

Lehrfeld, J., 1989, High-Performance Liquid Chromatography Analysis of Phytic Acid on a pH-Stable, Macroporous Polymer Column, Cereal Chemistry Journal, 66(6), 510-515. Lestari, E.W., Haryanto, I., dan Mawardi, S., 2009, Konsumsi Kopi Masyarakat Perkotaan dan Faktor-Faktor yang Berpengaruh: Kasus di Kabupaten Jember, Perkebunan, 25(3), 216-235. Liu, W.J.H., 2011, Traditional Herbal Medicine Research Methods (eBook): Identification, Analysis, Bioassay, and Pharmaceutical and Clinical Studies, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp.105. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., and Jimenez, L., 2004, Polyphenols: Food Sources and Bioavailability, The American Journal of Clinical Nutrition, 79, 727-747. Mattila, P., Hellstrom, J., and Torronen, R., 2006, Phenolic Acids in Berries, Fruits, and Beverages, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(19), 71937199. Mota, F.L., Queimada, A.J., Pinho, S.P. and Macedo, E.A, 2008, Aqueous Solubility of Some Natural Phenolic Compounds, Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 47, 5182–5189. Natella, F., Nardini, M., Belelli, F., and Scaccini, C., 2007, Coffee Drinking Induces Incorporation of Phenolic Acids into LDL and Increases the Resistance of LDL to Ex Vivo Oxidation In Humans, The American Journal of Clinical Nutrition, 86, 604 –609. Ohno, N., Yoshigai, E., Okuyama, T., Yamamoto, Y., Okumura, T., Sato, K., Ikeya, Y., and Nishikawa, M., 2012, Chlorogenic acid from the Japanese herbal medicine Kinginka (Flos Lonicerae japonicae) suppresses the expression of inducible nitric oxide synthase in rat hepatocytes, Herbert Open Access Journal Biology, 1(2), 1-10. Olthof, M.R., Hollman, P.C.H., and Katan, M.B., 2001, The Journal of Nutrition, 131, 66–71. Patra, A.K., 2012, Dietary Phytochemicals and Microbes, (Ed.), Springer, London, p.3 Pirera, D.M., Valentao, P., Pirera, J.A., and Andrade, P.B., 2009, Molecules, 14, 2202-2211.


70

Poole, C.F., 2003, The Essence of Chromatography, Elsevier Science, Amsterdam, pp. 504-505. Ranny, M., 1952, Thin-Layer Chromatography with Flame Ionization Detection, D. Reidel Publishing Company, Holland, p. 63. Rao, D.G., 2010, Fundamentals of Food Engineering, PHI Learning Private Limited, New Delhi, p. 364. Rastogi, S., Pandey, M.M., and Rawat, K.S., 2008, High-Performance Thin-Layer Chromatography Densitometric Method for the Simultaneous Determination of Three Phenolic Acids in Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry, Journal of AOAC International, 91(5), 1169-1173. Reich, E., and Schibli, A., 2007, High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medicinal Plant, (Eds.), Thieme Medical Publishers, Inc., New York, p. 61. Rivelli, D.P., da Silva, V.V., Ropke, C.D., Miranda, D.V., Almeida, R.L., Sawada, T.C.H., et al., 2007, Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid, Caffeic Acid and Caffeine in Hydroalcoholic and Aqueous Extracts of Ilex Paraguariensis by HPLC and Correlation with Antioxidant Capacity of The Extracts by DPPH· Reduction, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 43(2), 215-222. Shah, B.N. and Seth, A.K., 2010, Textbook of Pharmacognosy and Phytochemistry, Elsevier, New Delhi, pp. 407-409 Sherma, J. and Fried, B., 1996, Handbook of Thin-Layer Chromatography, second edition, Revised and Expanded, (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, p. 5. Sherma, J. and Fried, B., 1999, Thin-Layer Chromatography, Revised And Expanded, Fourth Edition, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 200-201. Sherma, J. and Fried, B., 2003, Handbook of Thin-Layer Chromatography, Third Edition, Revised and Expanded, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 107, 191, 194. Skoog, D.A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, CBS College Publishing, Philadelphia, pp. 800-801 Spangernberg, B., Poole, C.F., and Weins, C., 2011, Quantitative Thin-Layer Chromatography A Practical Survey, Springer, Heidelherg, pp. 22, 53-54, 59, 66, 81, 93, 231.


71

Srivastava, M.M., 2011, High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC), (Ed.), Springer, Berlin, pp. 3, 27, 45. Sun, Y., Qiao, L., Ye, X., Liu, D., Zhang, X. and Huang, H., 2013, The Sonodegradation of Caffeic Acid under Ultrasound Treatment: Relation to Stability, Molecules, 18, 561-573. Synder, L.R., and Dolan, J.W., High-Performance Gradient Elution: The practical Application of the Linear-Solvent-Strength Model, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, p. 446. Tiwari, B.K., Brunton, N.P., and Brenan, C., 2013, Handbook of Plant Food Phytochemicals: Sources, Stability and Extraction, West Sussex, pp. 400, 439. Tsao, R., 2010, Chemistry and Biochemistry of Dietary Polyphenols, Nutrients, 2, 1231-1246. Unnikrishnan, K.P., Raja, S.S. and Balachandran, I., 2008, A Reverse Phase HPLCUV and HPTLC Methods for Determination of Plumbagin in Plumbagi Indica and Plumbago Zeylanica, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 70(6), 844–847. Waksmundzka-Hajnos, M., Sherma, J., and Kowalska, T., 2008, Thin Layer Chromatography in Phytochemistry, CRC Press, Boca Raton, pp. 341, 342. Waksmundzka-Hajnos, M., and Sherma, J., 2011, High Pherformance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis, CRC Press, Boca Raton, pp. 110. Wang, J., Liu, D., Zhao, H., Ling, X., Jiang, B., and Ouyang, P., Application of Response Surface Methodology Optimization for The Production of Caffeic Acid from Tobacco Waste, African Journal of Biotechnology, 8(8), 14161424. Watson, R.R., 2014, Polyphenols in Plants: Isolation, Purification and Extract Preparation, (Ed.), Elsevier, San Diego, p. 154. Xu, Z., and Howard, L.R., 2012, Analysis of Antioxidant-Rich Phytochemicals, (Eds.), John Wiley & Sons, Ltd., West Sussex, pp. 69, 76. Zhang, L., Gong, X., Wang, Y., and Qu, H., 2012, Solubilities of Protocatechuic Aldehyde, Caffeic Acid, D-Galactose, and D-Raffinose Pentahydrate in Ethanol−Water Solutions, Journal of Chemical & Engineering Data, 57, 2018−2022.


72

LAMPIRAN


Lampiran 1. Certificate of Analysis baku asam kafeat Sigma-Aldrich

73


Lampiran 2. Certificate of Analysis plat KLT E.Merck

74


Lampiran 3. Certificate of Analysis plat KLTKT E.Merck

75


Lampiran 4. Surat determinasi biji kopi

76


77

Lampiran 5. Data penimbangan baku dan sampel serta perhitungan seri konsentrasi baku Bobot Gram

Bobot Gram

Bobot Gram

Baku asam kafeat Replikasi I Replikasi II dan III 0,0250 0,0250 Sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV 6,0142 6,0348 6,0352 6,0185

Replikasi I 6,0060

Sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh Replikasi II Replikasi III Replikasi IV 6,0001 6,0537 6,0067

b. Contoh perhitungan kadar seri konsentrasi baku asam kafeat 0,0250 𝑔 Konsentras stok = = 1,0000 mg/mL 25,0 𝑚𝐿

c. Konsentrasi seri larutan baku yang dibuat Baku 0,08 mg/mL V1 . C1 = V2 . C2 X mL . 1 mg/mL = 10 mL . 0,08 mg/mL X = 0,8 mL Baku 0.13 mg/mL V1 . C1 = V2 . C2 X mL . 1 mg/mL = 10 mL . 0,13 mg/mL X = 1,3 mL Baku 0.18 mg/mL V1 . C1 = V2 . C2 X mL . 1 mg/mL = 10 mL . 0,18 mg/mL X = 1,8 mL Baku 0.23 mg/mL V1 . C1 = V2 . C2 X mL . 1 mg/mL = 10 mL . 0,23 mg/mL 3X = 2,8 mL Baku 0.28 mg/mL V1 . C1 = V2 . C2 X mL . 1 mg/mL = 10 mL . 0,28 mg/mL X = 2,8 mL


Lampiran 6. Sistem KLTKT-Densitometri yang digunakan A. Panjang gelombang 330 nm

78


B. Panjang gelombang 325 nm

79


C. Panjang gelombang 335 nm

80


81

Lampiran 7. Densitogram hasil elusi dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak kloroform : etil asetat: asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Densitogram blangko

b. Densitogram sampel dengan ekstraksi syphon

c. Densitogram sampel dengan ekstraksi seduh


82

d. Densitogram baku 1 mg/mL

e. Densitogram baku 0,2 mg/mL

Lampiran 8. Densitogram hasil elusi dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat: asam format (5 : 3 : 2) yang dideteksi pada  330 nm a. Densitogram blangko


b. Densitogram sampel dengan ekstraksi syphon

c. Densitogram sampel dengan ekstraksi seduh

d. Densitogram baku 0,2 mg/mL

83


84

e. Densitogram baku 1 mg/mL

Lampiran 9. Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Densitogram sampel replikasi 1

b. Densitogram sampel replikasi 2


c. Densitogram sampel replikasi 3

d. Densitogram sampel replikasi 4


f. Densitogram blangko

85


86

Lampiran 10. Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Densitogram sampel replikasi 1






f. Densitogram blangko

87


88

Lampiran 11. Densitogram hasil elusi baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat: asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Densitogram sampel replikasi 1




89

d. Densitogram baku 1 mg/mL

Lampiran 12. Densitogram hasil elusi baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Densitogram sampel replikasi 1






90


91

Lampiran 13. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi I dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL

b. Baku konsentrasi 0,13 mg/mL

c. Baku konsentrasi 0,18 mg/mL


92

d. Baku konsentrasi 0,23 mg/mL

e. Baku konsentrasi 0,28 mg/mL

Lampiran 14. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi II dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL





93


94


Lampiran 15. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi III dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan fase gerak toluen : etil asetat: asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL






95


96

Lampiran 16. Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi syphon dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm a. Sampel replikasi 1

b. Sampel replikasi 2

c. Sampel replikasi 3


97

d. Sampel replikasi 4

Lampiran 17. Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  325 nm a. Sampel replikasi 1



98



Lampiran 18. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi I dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL






99


100

Lampiran 19. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi II dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL




101



Lampiran 20. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi III dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL





102


103





104



Lampiran 22. Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  330 nm a.

Sampel replikasi 1


b.

Sampel replikasi 2

c.

Sampel replikasi 3

d.

Sampel replikasi 4

105


106

Lampiran 23. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi I dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL




107



Lampiran 24. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi II dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL






108


109

Lampiran 25. Densitogram hasil elusi seri konsentrasi baku asam kafeat replikasi III dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm a. Baku konsentrasi 0,08 mg/mL




110








111


112

Lampiran 27. Densitogram hasil elusi sampel hasil hidrolisis ekstraksi seduh dengan fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1) yang dideteksi pada  335 nm a. Sampel replikasi 1




113


Lampiran 28. Perhitungan faktor asimetris (As) dan %KV pemisahan sampel asam kafeat dan baku asam kafeat fase diam silica gel 60 F254 (KLTKT) dan dengan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (7 : 2 : 1)

A

tinggi puncak = 1,7 cm 5% tinggi puncak = 0,8 cm A. Contoh perhitungan nilai Faktor Asimetris (As) Diketahui: A = 1,5 cm B = 0,8 cm As =

𝐵 𝐴

=

0,8 𝑐𝑚 1,5 𝑐𝑚

= 0,53

B

5% tinggi puncak


114

B. Contoh perhitungan nilai koefisien variansi (% KV) As dari baku asam kafeat dan sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika Diketahui : Niali As baku asam kafeat 0,08 Replikasi I = 0,46 Niali As baku asam kafeat 0,08 Replikasi II = 0,58 Niali As baku asam kafeat 0,08 Replikasi III = 0,67

% KV =

𝑆𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝐴𝑠

𝑋 100% =

0,1053 0,570

= 18,4836 %

Nilai Rf, As, dan AUC dari sampel air seduhan biji kopi arabika Sampel Hasil Hidrolisis Ekstraksi Syphon  325  330  335 RF As RF As RF As 0.30 0.57 0.30 0.53 0.30 0.57 Replikasi I 0.29 0.53 0.28 0.57 0.29 0.58 Replikasi II 0.28 0.47 0.28 0.50 0.28 0.57 Replikasi III 0.28 0.47 0.28 0.50 0.28 0.4 Replikasi IV 0.29 0.51 0.29 0.53 0.29 0.53 Mean 0.01 0.05 0.01 0.03 0.01 0.09 SD 3.33 9.61 3.51 6.32 3.33 16.38 KV Sampel Hasil Hidrolisis Ekstraksi Seduh  325  330  335 RF As RF As RF As 0.26 0.62 0.26 0.57 0.26 0.62 Replikasi I 0.25 0.64 0.25 0.33 0.25 0.64 Replikasi II 0.25 0.64 0.25 0.62 0.25 0.54 Replikasi III 0.25 0.57 0.25 0.33 0.25 0.62 Replikasi IV 0.25 0.62 0.25 0.46 0.25 0.61 Mean 0.01 0.03 0.01 0.15 0.01 0.04 SD 1.98 5.35 1.98 33.37 1.98 7.33 KV

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 115

Nilai Rf, As, dan AUC dari larutan baku asam kafeat

Konsent rasi Rf As

 330 nm

 325 nm

 335 nm

Replikasi I

Replikasi I

Replikasi I

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,28

0,28

0,28

0,28

0,29

0,28

0,28

0,28

0,28

0,29

0,28

0,28

0,28

0,28

0,29

0,46

0,50

0,50

0,55

0,58

0,64

0,89

0,50

0,47

0,54

0,43

0,45

0,44

0,54

0,57

Replikasi II Konsent rasi Rf As

Replikasi II

Replikasi II

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,25

0,25

0,25

0,25

0,26

0,25

0,25

0,25

0,26

0,26

0,25

0,25

0,25

0,26

0,26

0,58

0,53

0,62

0,63

0,53

0,70

0,54

0,64

0,54

0,57

0,60

0,55

0,62

0,55

0,62

Replikasi III

Replikasi III

Replikasi III

Konsent rasi

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

0,08

0,13

0,18

0,23

0,28

Rf

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

0,32

As

0,67

0,56

0,5

0,55

0,5

0,67

0,45

0,5

0,5

0,5

0,57

0,45

0,71

0,55

0,63

Mean

0,570 0,105 357 18,48 36

0,530 0,030 000 5,660 377

0,540 0,069 282 12,83 001

0,577 0,046 188 8,009 484

0,537 0,040 415 7,530 656

0,670 0,030 000 4,477 612

0,627 0,232 451 37,09 32

0,547 0,080 829 14,78 58

0,503 0,035 119 6,977 254

0,537 0,035 119 6,543 884

0,533 0,090 738 17,01 332

0,483 0,057 735 11,94 518

0,590 0,137 477 23,30 123

0,547 0,005 774 1,056 129

0,607 0,032 146 5,298 709

SD %KV


Lampiran 29. Data perhitungan kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika a. Data perhitungan kadar sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika pada  325 nm  325 nm replikasi syphon

Rf 0,30 0,29 0,28 0,28 mean SD %KV

y = 15332x - 194,25 Konsentr asi asam AUC kafeat (mg/mL) 0,1405 1960,00 0,1357 1887,50 0,1337 1855,90 0,1306 1809,20 0,1352 0,0041 3,0564

replikasi seduh % Kadar asam kafeat (b/b) 0,00234 0,00225 0,00222 0,00217 0,00224 0,0000699 3,116

Rf 0,26 0,25 0,25 0,25 mean SD %KV

y = 15332x - 194,25 Konsentr % Kadar asi asam asam AUC kafeat kafeat (mg/mL) (b/b) 0,1369 1905,40 0,00228 0,1421 1983,70 0,00235 0,1346 1870,20 0,00224 0,1329 1844,00 0,00222 0,00227 0,1366 0,0000569 0,0040 2,506 2,8976

b. Data perhitungan kadar sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika pada  330 nm  330 nm

Rf 0,29 0,28 0,28 0,28 mean SD %KV

replikasi syphon y = 14415x + 77,488 konsentrasi asam AUC kafeat (mg/mL) 0,1302 1955,20 0,1255 1887,20 0,1233 1855,40 0,1210 1821,80 0,1250 0,0039 3,1547


Rf 0,26 0,25 0,25 0,25 mean SD %KV

replikasi seduh y = 14415x + 77,488 konsentrasi asam AUC kafeat (mg/mL) 0,1190 1793,10 0,1221 1837,80 0,1192 1796,60 0,1114 1684,10 0,1180 0,0046 3,8664



117

c. Data perhitungan kadar sampel hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika pada  335 nm  335 nm replikasi syphon y = 13490x - 54,956 Rf


0,30 0,29 0,28 0,28 mean SD %KV

0,1367 0,1287 0,1261 0,1265 0,1296 0,0049 3,8142

AUC 1790,10 1682,10 1646,60 1652,60

replikasi seduh y = 13490x - 54,956 % Kadar asam kafeat (b/b) 0,00227 0,00213 0,00209 0,00210 0,00215 0,0000846 3,935

Rf


0,26 0,25 0,25 0,25 mean SD %KV

0,1242 0,1303 0,1229 0,1202 0,1244 0,0043 3,4470

AUC 1620,60 1703,70 1603,50 1566,90


Contoh perhitungan kadar asam kafeat hasil hidrolisis ekstrak air seduhan biji kopi arabika - Replikasi syphon  325 nm replikasi 1 AUC = 1960,00 y = 15332 x – 194,25 1960,00 = 15332 x – 194,25 x = 0,1405 - % Kadar asam kafeat 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘  𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑒𝑟𝑏𝑢𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 

0,1405 6014,2

𝑥 100

 0,00217 %


118

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi berjudul “Optimasi Metode Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi-Densitometri untuk Penetapan Kadar Asam Kafeat Hasil Hidrolisis Ekstrak Air Seduhan Biji Kopi Arabika (Coffea arabica L.)” memiliki nama lengkap Marshella. Penulis lahir di Jakarta pada tangga 1 September 1993 sebagai putri pertama dari dua bersaudara pasangan Efendi Sarifudin dan Anastasia Miranda. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Budi Mulia Jakarta (19971999), SD Budi Mulia Jakarta (1999-2005), SMP Budi Mulia Jakarta (2005-2008), SMA Katolik RICCI 1 Jakarta (2008-2011) dan kemudian melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011. Selama berkuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan seperti staff divisi penelitian dan pengembangan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi (2011-2012), staff kementrian sosial budaya dan olahraga Badan Eksekutif Mahasiswa Universitas (2012-2013), bendahara Unit Kegiatan Mahasiswa Aikido (2011-2012), sie ceramah dan diskusi Inisiasi Sanata Dharma (INSADHA 2012), Steering Committee pada kepanitiaan Hari Bumi dengan tema “Membudayakan Hidup Bersih denga Mampu Memanfaatkan Barang Bekas” (2013), ketua bidang acara Bulan Budaya dengan tema “Kampusku, Nusantaraku”(2013). Penulis juga pernah mengikuti Program Kreatifitas Mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat pada tahun 2013 dengan judul “Peningkatan 3B (Minat Baca, Belajar dan Berkreasi) Pada Anak Sejak Dini Dengan Program BIMBEL POIN”. Mengikuti Program Kreatifitas Mahasiswa bidang Penelitian pada tahun 2014 dengan judul “Analisis Tingkat Keasaman Minuman Kopi Hitam Nusantara Yang Aman Bagi Penderita Tukak Lambung”. Selain itu, penulis pernah menjadi Asisten Praktikum untuk matakuliah Kimia Organik II pada tahun 2014.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents