PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI

PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA COKLAT Sargassum polyceratium Montagne DENGAN METODE FOLIN-CIOCALTEAU

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Angela Woro Dwi Priharina NIM : 048114052

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008



SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

ii

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Skripsi



Telah disetujui oleh :

Ign. Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si. Tanggal 16 April 2008

iii


iv


HALAMAN PERSEMBAHAN It’s a long and heavy journey untill I know where I’m supposed to be Sometimes it’s too hard to get enough strength But by passing all success and failure I learn to smile although I face many difficulties I learn to share in the ups and downs of my life, to share anything sincerely to offer help or some loving care, and to lean when I can’t stand up, making sure that I’m not alone and learn not to quit when I am down or troubled, or nothing is going right, I learn to differentiate the right and wrong Although the journey is so long But only by getting through the life with all blessings the Lord grants I can grow and learn, and appreciate His very best creation

Kupersembahkan karya ini untuk : Tuhan Yesus, Sahabat yang selalu memeliharaku dengan berkat Ibu – Bapakku, ungkapan rasa hormat dan baktiku Saudara Kembar dan Adikku Para Sahabat dan Keluarga dan Almamaterku tercinta

v


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama

: Angela Woro Dwi Priharina

Nomor Mahasiswa

: 048114052

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA COKLAT Sargassum polyceratium Montagne DENGAN METODE FOLIN-CIOCALTEAU” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 7 Juli 2008

Yang menyatakan

Angela Woro Dwi Priharina


PRAKATA

Puji syukur Penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kasih atas segala berkat yang dianugerahkan oleh-Nya, sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “Penetapan Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan Metode Folin-Ciocalteau”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat yang diwajibkan untuk memperoleh gelar sarjana farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam membuat skripsi ini, Penulis menyadari telah mendapat banyak bantuan, bimbingan, dukungan, dan semangat dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Pada kesempatan ini, dengan segala kerendahan hati Penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada : 1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Bapak Ignatius Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan kepada Penulis mulai dari saat penyusunan proposal penelitian hingga penyelesaian skripsi ini. 3. Ibu Nora Iska Harnita, M.Si., Apt., yang telah memberikan kesempatan kepada Penulis untuk ambil bagian dalam penelitian ini serta berkenan meluangkan waktu untuk membimbing Penulis selama penelitian di laboratorium, memberikan solusi atas permasalahan yang dihadapi

vi


Penulis, serta mendukung dan memberikan semangat saat Penulis mengalami kebingungan dan kegagalan. 4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan skripsi ini. 5. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini. 6. Bapak Abdul Razaq Chasani, M.Si., dan Ibu Dr. Rina Sri Kasiamdari dari Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang telah membantu mengidentifikasi alga. 7. Bapak Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt., yang telah berkenan meluangkan waktu untuk berdiskusi dan memberikan masukan kepada Penulis. 8. Segenap staf pengajar, laboran dan karyawan Fakultas Farmasi, terima kasih atas bantuan, dukungan, dan motivasi yang diberikan kepada Penulis serta atas kebersamaan dan kerja sama yang telah terjalin. 9. Ibu Fransisca Christina Sri Suharni dan Bapak Matheus Poniman tercinta serta Rini dan Esti yang selalu memberikan doa, cinta, semangat, pengorbanan, serta dukungan yang sangat tulus. 10. Rekan seperjuangan, “Tim Alga”, Andri, Hendry, Dipta, Dewi, Fanny, Elsa, yang telah bekerja sama dengan Penulis selama melakukan penelitian di laboratorium dan menyusun skripsi ini, serta teman-teman “Tim Teh”, “Tim Wortel”, “Tim Pulveres”, dan “Tim Jagung” yang

vii


telah berjuang bersama dan saling mendukung selama bekerja di laboratorium. 11. Rekan-rekan mahasiswa Fakultas Farmasi angkatan 2004, terutama para sahabat tercinta, Keke, Nana, Dika, yang telah bersedia berbagi, memberikan semangat, dukungan, dan juga penghiburan yang membuat Penulis tidak mudah menyerah, tegar dan kuat. 12. Para sahabat Mudika St. Vinsensius a Paulo dan St. Bonaventura, atas kebersamaan dan keceriaan yang menjadi penyemangat dan menjadi bagian untuk menghilangkan penat. Terima kasih untuk hal-hal yang luar biasa yang telah kita buat. 13. Semua pihak yang telah berpartisipasi memberikan dukungan dan bantuan kepada Penulis sehingga skripsi ini dapat terselesaikan. Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih banyak terdapat kekurangan dan ketidaksempurnaan. Oleh karena itu, dengan segenap kerendahan hati Penulis memohon maaf apabila terdapat hal-hal yang kurang berkenan serta dengan besar hati Penulis menerima segala kritik serta saran yang bermanfaat. Akhir kata, Penulis berharap semoga skripsi ini berguna bagi pihak-pihak yang membutuhkan dan dapat memberikan sumbangan bagi ilmu pengetahuan, khususnya mengenai alga coklat.

Yogyakarta, Juni 2008 Penulis

viii


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, Juni 2008 Penulis

Angela Woro Dwi Priharina

ix


INTISARI

Eksplorasi senyawa fenolik alam untuk mendapatkan agen fotoprotektif baru terus dilakukan. Tumbuhan alga merupakan salah satu kekayaan laut Indonesia yang sangat potensial, namun belum dimanfaatkan secara maksimal baik sebagai makanan maupun agen biomedis. Alga mengandung phlorotannin yang bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan. Phlorotannin merupakan senyawa polifenol yang hanya ditemukan pada tumbuhan alga khususnya spesies alga coklat. Salah satu spesies alga coklat yang dapat dikembangkan adalah Sargassum polyceratium Montagne. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne serta menetapkan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga tersebut. Isolasi dilakukan dengan metode sokhletasi dengan pelarut metanol p.a. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian difraksinasi dengan kloroform, akuades, dan etil asetat. Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga ditetapkan secara kolorimetri dengan metode Folin-Ciocalteau. Larutan standar yang digunakan adalah phloroglucinol yang dibuat seri konsentrasi 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm dengan pelarut aseton 75%. Penetapan kadar phlorotannin dilakukan pada panjang gelombang 750,1 nm dengan menggunakan persamaan kurva baku y = 1,2274 x + 0,0175. Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne diperoleh sebesar 10,81 ± 0,28 mg PE (phloroglucinol equivalent)/g fraksi. Kata kunci : phlorotannin, alga coklat, Folin-Ciocalteau

x


ABSTRACT

Exploration of natural phenolic compounds for obtaining the new photoprotective agents has been doing. Algae is one of Indonesian potential marine resources, but it is never used maximally either as food or biomedical agent. Algae contains phlorotannins which is responsible for antioxidant effect. Phlorotannin is a polyphenol substance which is only found in algae especially brown algae. One of the brown algae can be developed is Sargassum polyceratium Montagne. The aims of the research are to obtain ethyl acetate fraction of brown algae Sargassum polyceratium Montagne and to determine concentration of phlorotannin in ethyl acetate fraction of the algae. Isolation is done with soxhletation method with methanol p.a. The extract obtained is fractioned using chloroform, aquadestilata, and ethyl acetate. Phlorotannin concentration in ethyl acetate fraction is determined with colorimetric using Folin-Ciocalteau method. Standard solution used in the research is phloroglucinol, made in 7 serial dilutions that is 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm with 75 % aceton. Phlorotannin concentration is measured in 750,1 nm wavelength using phloroglucinol’s linear regression equation y = 1,2274 x + 0,0175. Phlorotannin concentration in ethyl acetate fraction of brown algae Sargassum polyceratium Montagne is 10,81 ± 0,28 mg PE (phloroglucinol equivalent)/g fraction. Keywords : phlorotannin, brown algae, Folin-Ciocalteau

xi


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL……………………………………………………….......... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………............... iii HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………….......…. iv HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………………...........v PRAKATA............................................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ ix INTISARI................................................................................................................ x ABSTRACT............................................................................................................. xi DAFTAR ISI......................................................................................................... xii DAFTAR TABEL................................................................................................ xvi DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... xviii BAB I. PENGANTAR ............................................................................................ 1 A. Latar Belakang ................................................................................................ 1 B. Perumusan Masalah......................................................................................... 4 C. Keaslian Penelitian .......................................................................................... 4 D. Manfaat Penelitian .......................................................................................... 4 1. Manfaat teoritis ........................................................................................... 4 2. Manfaat praktis............................................................................................ 4 E. Tujuan Penelitian............................................................................................. 5 1. Tujuan umum .............................................................................................. 5 2. Tujuan khusus ............................................................................................. 5

xii


BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA..................................................................... 6 A. Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne ........................................... 6 B. Polifenol Alga (Phlorotannin) ........................................................................ 7 C. Isolasi .............................................................................................................. 9 D. Spektrofotometri Visibel............................................................................... 10 E. Kolorimetri .................................................................................................... 12 F. Metode Folin-Ciocalteau ............................................................................... 13 G. Kesalahan dalam Metode Analisis ................................................................ 16 1. Kesalahan sistematik................................................................................. 16 a. Kesalahan personil dan operasi ............................................................. 16 b. Kesalahan alat dan pereaksi .................................................................. 17 c. Kesalahan metode ................................................................................. 17 2. Kesalahan tidak sistematik........................................................................ 17 H. Keterangan Empiris....................................................................................... 18 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 20 A. Jenis Rancangan Penelitian ........................................................................... 20 B. Variabel dan Definisi Operasional ................................................................ 20 1. Variabel penelitian .................................................................................... 20 2. Definisi operasional .................................................................................. 20 C. Bahan dan Alat Penelitian ............................................................................. 21 1. Bahan ........................................................................................................ 21 2. Alat............................................................................................................ 22 E. Tata Cara Penelitian ...................................................................................... 22

xiii


1. Pengambilan dan Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne .................................................................................................. 22 2. Penetapan Kadar Air Serbuk Alga ............................................................ 23 3. Skrining Fitokimia Alga............................................................................ 23 a. Preparasi ekstrak untuk skrining fitokimia.............................................23 b. Skrining tanin dan polifenol...................................................................... 24 4. Isolasi Phlorotannin dari Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne .................................................................................................. 24 5. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau........................... 25 a. Pembuatan Larutan Standar................................................................... 25 b. Penentuan Operating Time (OT)........................................................... 25 c. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λ maks) ............................. 26 d. Pembuatan Kurva Baku Phloroglucinol ............................................... 26 6. Estimasi Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne ......................................................... 27 F. Analisis Hasil................................................................................................. 28 1. Analisis Hasil Skrining Tanin dan Polifenol............................................. 28 2. Analisis Hasil Penetapan Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan metode FolinCiocalteau ................................................................................................. 28 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 29 A. Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne................ 29 B. Skrining Fitokimia Alga ................................................................................... 33

xiv


C. Isolasi Phlorotannin dari Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne.... 35 D. Optimasi Metode Folin-Ciocalteau .................................................................. 37 1. Pembuatan Larutan Standar ...................................................................... 37 2. Penentuan Operating Time (OT)............................................................... 38 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks) .................................. 40 4. Pembuatan Kurva Baku Phloroglucinol ................................................... 42 E. Estimasi Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne................................................................ 44 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN............................................................... 47 A. Kesimpulan ................................................................................................... 47 B. Saran.............................................................................................................. 47 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 48 LAMPIRAN.......................................................................................................... 52 BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 68

xv


DAFTAR TABEL Halaman

Tabel I.

Data replikasi seri baku phloroglucinol .............................................. 42

Tabel II. Hasil pembacaan absorbansi fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne...................................................................... 45 Tabel III. Hasil penetapan kadar ......................................................................... 45

xvi


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur kimia beberapa polifenol alga .............................................. 8

Gambar 2.

Rangkaian alat sokhletasi................................................................... 9

Gambar 3.

Instrumentasi spektrofotometer........................................................ 10

Gambar 4.

Reaksi fenol dengan reagen Folin-Ciocalteau.................................. 15

Gambar 5.

Ionisasi senyawa fenol ..................................................................... 16

Gambar 6.

Proses oksidasi fenol oleh enzim polifenol oksidase (PPO) ............ 31

Gambar 7.

Reaksi saat penetapan kadar air dengan Karl Fischer...................... 33

Gambar 8.

Reaksi phloroglucinol dengan FeCl3 ............................................... 34

Gambar 9.

Spektra OT phloroglucinol kadar 3,0 ppm dengan pereaksi Folin Ciocalteau......................................................................................... 38

Gambar 10. Reaksi oksidasi phloroglucinol ........................................................ 39 Gambar 11. Reaksi phloroglucinol dengan reagen Folin-Ciocalteau .................. 40 Gambar 12. Spektra scanning λmaks phloroglucinol 3 macam konsentrasi phloroglucinol: 1,0; 3,0; dan 6,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau ............................................................................... 41 Gambar 13. Kurva baku hubungan kadar dan absorbansi phloroglucinol........... 43

xvii


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Hasil determinasi alga dari Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta............... 52

Lampiran 2.

Foto autoklaf Sanshenyiliaogixie YX-400Z ................................. 54

Lampiran 3.

Foto tirator Karl Fischer Mettler DL-18 ....................................... 54

Lampiran 4.

Hasil perhitungan kadar air serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan metode Karl Fischer .................. 55

Lampiran 5.

Hasil skrining fitokimia alga coklat Sargassum polyceratium Montagne ...................................................................................... 57

Lampiran 6.

Foto uji kualitatif........................................................................... 58

Lampiran 7.

Foto fraksinasi ekstrak alga coklat Sargassum polyceratium Montagne ...................................................................................... 59

Lampiran 8.

Foto vacum rotary evaporator ...................................................... 60

Lampiran 9.

Foto spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lambda 20 ............ 60

Lampiran 10. Data penimbangan seri baku phloroglucinol ................................ 61 Lampiran 11. Contoh perhitungan seri konsentrasi baku phloroglucinol ........... 62 Lampiran 12. Hasil scanning λmaks kadar phloroglucinol 1,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin-Ciocalteau............................................ 63 Lampiran 13. Hasil scanning λmaks kadar phloroglucinol 3,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin-Ciocalteau............................................ 63 Lampiran 14. Hasil scanning λmaks kadar phloroglucinol 6,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin-Ciocalteau............................................ 64 Lampiran 15. Hasil pembacaan seri baku phloroglucinol replikasi I.................. 64

xviii


Lampiran 16. Hasil pembacaan seri baku phloroglucinol replikasi II................. 65 Lampiran 17. Hasil pembacaan seri baku phloroglucinol replikasi III ............... 65 Lampiran 18. Data penimbangan sampel.............................................................. 66 Lampiran 19. Data absorbansi sampel fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne ................................................................ 66 Lampiran 20. Contoh perhitungan kadar sampel .................................................. 67

xix


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Eksplorasi senyawa fenolik alam yang memiliki cincin aromatik yang berikatan sedikitnya dengan 1 gugus hidroksil untuk mendapatkan agen fotoprotektif baru terus dilakukan. Beberapa contoh senyawa fenolik adalah caffeic acid, ferulic acid, kuersetin, apigenin, genistein, resveratrol, nordihydroguaiaretic acid, carnosic acid, silimarin, polifenol teh, dan tanin. Senyawa-senyawa tersebut terbukti mempunyai efek fotoprotektif terhadap kerusakan kulit yang diinduksi radiasi UV. Sayangnya eksplorasi senyawa fenolik tersebut masih mengandalkan tumbuhantumbuhan terestrial yang lingkungannya sangat terbatas (Svobodova, Psotova, dan Walterova, 2003; Dahuri, 2003). Sebagai negara yang dikelilingi oleh lautan, Indonesia mempunyai potensi yang baik untuk memanfaatkan dan mengembangkan kekayaan lautnya terutama alga atau rumput laut (Sulistiyowati, 1992). Tumbuhan alga merupakan salah satu kekayaan laut Indonesia yang sangat potensial, namun belum dimanfaatkan secara maksimal baik sebagai makanan maupun agen biomedis. Alga mengandung makronutrien dan mikronutrien yang memiliki efek protektif terhadap kesehatan yang menarik untuk diteliti lebih lanjut. Alga merupakan sumber polisakarida (alginat, fucoidan, dan karagenan). Selain itu, alga juga mengandung makronutrien seperti mineral (iodium dan kalsium), protein dan

1


2

asam amino, lemak dan asam lemak, serta mikronutrien seperti vitamin C, vitamin E, polifenol dan karotenoid (Burtin, 2003). Pada umumnya alga memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi karena berbagai kandungan komponen antioksidan yang sangat tinggi, seperti asam askorbat, flavonoid, hidrokuinon, fikosianin, manitol, mioinositol, senyawa fenolik serta poliamina. Dalam beberapa penelitian dinyatakan bahwa phlorotannin bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan alga (Wu dan Pan, 2004). Phlorotannin merupakan senyawa polifenol yang tidak ditemukan pada tumbuhan terestrial, tetapi hanya pada tumbuhan alga khususnya jenis alga coklat (Burtin, 2003). Phlorotannin terdiri dari molekul dengan struktur dan tingkat polimerisasi yang heterogen yaitu phloroglucinol dan oligomernya seperti eckol, phlorofucofuroeckol A, dieckol, 8,8’bieckol dan lainnya (Nagayama, Iwamura, Shibata, Hirayama, dan Nakamura, 2002). Phloroglucinol yang merupakan monomer phlorotannin menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi. Phloroglucinol memiliki struktur yang paling sederhana dan mudah teroksidasi. Polifenol dengan polimer sedang memiliki panjang gugus kromofor yang dapat memberikan absorbansi pada daerah panjang gelombang UVA (320-400 nm) dan UVB (280-320 nm) sehingga dapat dikembangkan sebagai produk antioksidan. Beberapa aktivitas biologik phlorotannin yang telah diteliti adalah antiproliferasi dan antioksidan (Athukorala, Kim, dan Jeon, 2006; Yuan dan Walsh, 2006), efek protektif terhadap ionizing radiation (Kang, et al., 2006), kemampuan untuk mengabsorbsi sinar UV (Roleda, Wiencke, dan Luder, 2006; Swanson dan


3

Druehl, 2002), sitoprotektif terhadap stress oksidatif (Kang, et al., 2005), dan inhibitor HIV-1 reverse transcriptase dan protease (Ahn, et al., 2004). Salah satu alga yang berpotensi untuk dikembangkan yaitu Sargassum polyceratium Montagne. Jenis Sargassum ini banyak tersebar di pantai selatan termasuk pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta. Oleh karena itu, agar dapat lebih dimanfaatkan secara optimal perlu dilakukan penetapan kadar phlorotannin dalam alga coklat Sargassum polyceratium Montagne sebagai langkah awal pengembangan kandungan polifenol dalam alga tersebut terutama sebagai produk kosmetik antioksidan seperti sunscreen. Zhang, Zhang, Shen, Silva, Dennis, dan Barrow (2006) melakukan penelitian tentang metode sederhana untuk estimasi kandungan polifenol total pada rumput laut dan ekstraknya berdasarkan reaksi kolorimetri Folin-Ciocalteau. Metode tersebut memiliki keunggulan dalam hal sensitivitasnya mengukur senyawa-senyawa yang memiliki gugus fenolik hingga tingkat part per million (ppm) serta prosedurnya yang sederhana karena hanya memerlukan satu jenis pereaksi yaitu reagen FolinCiocalteau. Sementara itu, Pavia, Toth, Lindgren, dan Aberg (2003) melaporkan variasi intraspesifik kandungan phlorotannin dalam alga coklat Ascophyllum nodosum. Dilaporkan pula bahwa khasiat sebagai antiproliferasi ekstrak alga berkorelasi positif dengan kandungan total polifenol yang diduga berhubungan dengan kandungan phlorotannin (Yuan dan Walsh, 2006).


4

B. Perumusan masalah Permasalahan penelitian ini difokuskan pada fraksi phlorotannin yang diisolasi dari alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. Rumusan permasalahan adalah sebagai berikut : a. Apakah phlorotannin dapat diisolasi dari alga coklat Sargassum polyceratium Montagne? b. Berapakah kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne yang ditetapkan dengan metode Folin-Ciocalteau?

C. Keaslian penelitian Sepengetahuan peneliti, penelitian tentang penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan metode Folin-Ciocalteau belum pernah dilakukan.

D. Manfaat 1. Manfaat teoritis Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan mengenai kadar phlorotannin pada alga coklat Sargassum polyceratium Montagne sehingga dapat dikembangkan sebagai senyawa bioaktif. 2. Manfaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi ilmu pengetahuan mengenai pengembangan produk alam dari biota laut, khususnya


5

tentang pemanfaatan alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dalam industri makanan, farmasi, dan kosmetik.

E. Tujuan 1. Tujuan umum Tujuan umum penelitian ini adalah mengetahui kadar phlorotannin dalam alga coklat. 2. Tujuan khusus Tujuan khusus penelitian ini adalah sebagai berikut : a. Mengisolasi phlorotannin dari alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. b. Mengetahui kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne yang ditetapkan dengan metode Folin-Ciocalteau.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne Alga coklat Sargassum polyceratium Montagne termasuk dalam kelas Phaeophyceae, ordo Fucales, dan famili Sargassaceae, serta merupakan salah satu alga coklat marga Sargassum dengan spesies Sargassum polyceratium Montagne (Anonim, 2008). Lingkungan tempat tumbuh alga Sargassum terutama di daerah perairan yang jernih yang memiliki substrat dasar batu karang, karang mati, batuan vulkanik, dan benda-benda yang bersifat massive yang berada di dasar perairan. Habitat alga Sargassum di perairan dengan kedalaman 0,5–10 m. Marga ini tumbuh subur pada daerah tropis dengan suhu perairan 27,25–29,30°C dan salinitas 32–33,5‰. Kebutuhan intensitas cahaya matahari alga Sargassum berkisar 6500–7500 lux. Alga Sargassum tumbuh berumpun dengan untaian cabang-cabang. Panjang thalli utama mencapai 1–3 m dan tiap-tiap percabangan terdapat gelembung udara berbentuk bulat yang disebut bladder yang berguna untuk menopang cabang-cabang thalli terapung ke arah permukaan air untuk mendapatkan intensitas cahaya matahari (Kadi, 2007). Kandungan bahan kimia utama alga coklat Sargassum yaitu alginat. Dalam industri kosmetik alginat digunakan sebagai bahan pembuat sabun, cream body lotion, sampo, dan cat rambut. Selain alginat, alga coklat Sargassum juga

6


7

mengandung protein, vitamin C, tanin, iodin sebagai obat pencegah gondok, dan fenol (Kadi, 2007).

B. Polifenol Alga (Phlorotannin) Polifenol alga atau lebih dikenal sebagai phlorotannin banyak terdapat pada alga coklat, namun polifenol alga ini mempunyai perbedaan dengan polifenol dari tumbuhan terestrial. Polifenol dari tumbuhan terestrial berasal dari asam galat dan asam elagat, sedangkan polifenol alga berasal dari unit phloroglucinol (1,3,5trihydroxybenzine) (Burtin, 2003). Phlorotannin terdiri dari molekul dengan struktur dan tingkat polimerisasi yang heterogen yaitu phloroglucinol (2%) dan oligomernya seperti eckol (trimer, 3%), phlorofucofuroeckol A (pentamer, 28%), dieckol (hexamer, 7%), 8,8’-bieckol (hexamer, 7%) dan lainnya (30%). Contoh struktur kimia senyawa-senyawa polifenol alga seperti pada gambar 1. Kandungan phlorotannin paling tinggi ditemukan pada alga coklat antara 5-15% berat kering (Nagayama, et. al, 2002). Phlorotannin dengan struktur dan tingkat polimerisasi yang heterogen memungkinkan senyawa ini mempunyai aktivitas biologik yang luas. Phloroglucinol yang merupakan monomer phlorotannin menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi. Beberapa aktivitas biologik phlorotannin yang telah diteliti adalah antiproliferasi dan antioksidan (Athukorala, Kim, dan Jeon, 2006; Yuan dan Walsh, 2006), efek protektif terhadap ionizing radiation (Kang, et al., 2006), kemampuan untuk mengabsorbsi sinar UV (Roleda, Wiencke, dan Luder, 2006; Swanson dan


8

Druehl, 2002), sitoprotektif terhadap stress oksidatif (Kang, et al., 2005), dan inhibitor HIV-1 reverse transcriptase dan protease (Ahn, et al., 2004).

OH

HO

OH

(1)

(2)

(4)

(3)

(5)

Gambar 1. Struktur kimia beberapa polifenol alga : (1) Phloroglucinol, (2) eckol, (3) phlorofucofuroeckol A, (4) dieckol, (5) 8,8’-bieckol

Glombitza dan Keusgen (1995) menemukan phloroglucinol bebas dalam Fucus vesiculosus dan mendeskripsikan isolasi beberapa polyphloroglucinol dan dinamakan difucol, trifucol, serta campuran dua isomerik tetrafucol. Dari ganggang coklat yang lain, Bifurcaria bifurcate, diisolasi sebuah difenil eter dan


9

dikarakterisasikan sebagai paracetate. Data spektrum menunjukkan senyawa ini, bernama bifuhalol yang lebih lanjut diduga sebagai prekusor tanin phaeophyta.

C. Isolasi Kandungan senyawa organik dari jaringan tumbuhan kering dapat diperoleh dengan cara mengekstraksi berkesinambungan serbuk bahan dengan alat sokhlet (rangkaian alat sokhlet seperti pada gambar 2) dengan menggunakan pelarut secara berganti-ganti mulai dengan eter lalu eter minyak bumi dan kloroform (untuk memisahkan lipid dan terpenoid) sedangkan untuk senyawa yang lebih polar digunakan alkohol atau etil asetat (Harborne, 1987). Sokhletasi mempunyai keuntungan antara lain memerlukan cairan penyari lebih sedikit dan secara langsung hasil yang diperoleh lebih pekat, serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni maka dapat menyari zat aktif lebih banyak dan penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan tanpa menambah volume cairan penyari (Anonim, 1986).

Gambar 2. Rangkaian alat sokhletasi : A) tempat ekstraksi sampel, B) tempat solven Pemisahan ekstrak menjadi kelompok senyawa yang memiliki sifat fisikokimia yang sama disebut fraksinasi. Fraksinasi dapat dilakukan dengan


presipitasi,

ekstraksi

pelarut-pelarut,

destilasi,

dialisis,

kromatografi,

10

dan

elektroforesis. Pada ekstraksi pelarut-pelarut, akan terbentuk dua lapisan pada saat suatu cairan ditambahkan pada ekstrak yang berada pada cairan lain yang tidak saling campur. Komponen dalam campuran mempunyai kelarutan pada tiap lapisan dan setelah beberapa saat konsentrasi ekuilibrium pada kedua lapisan tercapai (Houghton, 1998).

D. Spektrofotometri Visibel Spektrofotometri visibel merupakan salah satu teknik analisis spektroskopik yang menggunakan sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak pada panjang gelombang 380 – 780 nm dengan memakai instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Spektrofotometer adalah suatu instrumen yang akan memecah radiasi polikromatis menjadi panjang gelombang berbeda. Instrumentasi seluruh spektrofotometer yang ada : 1) sumber radiasi kontinyu pada λ tertentu, 2) monokromator untuk memilih berkas sempit dari sumber spektrum, 3) sel sampel, 4) detektor, dan 5) pembaca respon detektor atau recorder (Christian, 2004), seperti terlihat pada gambar 3.

Gambar 3. Instrumentasi spektrofotometer (Cairns, 2005)


11

Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi berupa atom, ion, atau molekul. Radiasi elektromagnetik merupakan salah satu jenis energi yang ditransmisikan dalam ruang dengan kecepatan tinggi. Interaksi antar molekul yang memiliki gugus kromofor dan radiasi elektromagnetik pada daerah sinar ultraviolet dan sinar tampak akan menghasilkan spektra absorbansi elektronik. Spektra absorbansi tersebut dapat digunakan untuk analisis kuantitatif karena jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap memiliki hubungan dengan jumlah molekul penyerap (Khopkar, 1990; Skoog, 1985). Aspek kuantitatif spektrofotometer didasarkan pada hukum Lambert-Beer. Hukum ini menyatakan hubungan antara transmitan (T) dengan tebalnya cuplikan dan konsentrasi bahan penyerap. Hubungan tersebut dinyatakan sebagai berikut : A = log

1 Io = log =εbc T I

Keterangan : A

= serapan

T

= persen transmitan

Io

= intensitas radiasi yang datang

I

= intensitas radiasi yang diteruskan

ε

= absorbtivitas molar (L mol-1 cm-1)

b

= panjang sel (cm)

c

= konsentrasi larutan (mol L-1) (Cairns, 2005; Silverstein, Bassler, dan Morrill, 1986)


12

E. Kolorimetri

Kolorimetri merupakan suatu teknik pengukuran cahaya yang diabsorbsi oleh zat berwarna, baik warna yang terbentuk dari asalnya maupun akibat reaksi dengan zat lain (Khopkar, 1990). Metode kolorimetri merupakan metode analisis yang didasarkan pada gugus yang dapat bereaksi membentuk warna menggunakan instrumen spektrofotometer visibel dengan spektrum elektromagnetik pada daerah tampak mata manusia yaitu sekitar 400-700 nm atau 4000-7000 Å (1 nm = 10 Å) (Butz dan Nobel, 1961). Pada kolorimetri, pengukuran dilakukan terhadap serapan cahaya oleh larutan yang berwarna. Kadar larutan dibuat dengan konsentrasi menaik. Warna larutan tersebut dibandingkan dengan senyawa yang hendak dianalisis. Penentuan fotometri senyawa tidak berwarna yang diubah menjadi zat yang berwarna juga dapat dilakukan dalam daerah sinar tampak/visibel (400 – 800 nm) (Khopkar, 1990; Roth dan Baschke, 1994). Pemilihan prosedur kolorimetri untuk menentukan substansi tergantung pada pertimbangan sebagai berikut : 1. metode kolorimetri akan memberikan hasil yang lebih akurat pada konsentrasi rendah daripada titrimetri atau gravimetri. 2. metode kolorimetri sering digunakan pada kondisi di mana tidak ada titrimetri atau gravimetri. 3. metode kolorimetri memiliki beberapa keuntungan dalam hal spesifisitas (Vogel, 1978).


13

Kriteria untuk analisis kolorimetri yang baik adalah : 1. Menghasilkan reaksi warna yang khusus Reaksi-reaksi yang ada sangat sedikit sekali untuk beberapa substansi tertentu, tetapi justru memberikan warna-warna yang banyak membentuk kelompok warna tersendiri yang hanya berhubungan dengan substansi khusus. 2. Adanya proporsi yang sesuai antara warna dan konsentrasi Untuk kolorimeter visual sangat penting bahwa intensitas warna harus meningkat secara linier dengan konsentrasi substansi yang ditentukan. 3. Stabilitas warna Warna yang dihasilkan harus sama untuk mendapatkan hasil yang akurat. Hal ini menerapkan reaksi-reaksi warna yang akan dicapai secara maksimal. Waktu untuk mencapai warna yang maksimal harus cukup lama untuk mendapatkan pengukuran yang akurat. 4. Reprodusibel Prosedur kolorimetri harus memberikan hasil yang reprodusibel dalam kondisi yang spesifik. 5. Kejernihan larutan Larutan harus bebas dari pengotor jika pembanding yang dipakai dibuat dengan standar. Kekeruhan akan menyerap cahaya dengan baik (Vogel, 1978).

F. Metode Folin-Ciocalteau

Reagen Folin-Ciocateau tersusun atas 100 g natrium tungstat, 25 g natrium molibdat P, 50 mL asam fosfat P, 100 mL HCl P, 150 g litium sulfat P, dan beberapa


14

tetes brom P (Anonim, 1995a). Reagen aktif Folin-Ciocalteau, suatu agen pengoksidasi, tersusun atas larutan asam berwarna kuning yang mengandung kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam heteropoli asam tungstat dan asam molibdat. Pada kenyataannya reagen ini mengandung rangkaian polimerik yang memiliki bentukan

umum dengan pusat

unit tetrahedral fosfat (PO43-) yang

dikelilingi oleh beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum (Singleton dan Rossi, 1965). Bagian yang paling aktif dari reagen Folin-Ciocalteau adalah molibdat. Dalam bentuk tunggal, molibdat sukar larut dan membentuk koloid. Oleh karena itu, molibdat ditambah asam sehingga berwujud cair non-koloid. Asam yang ditambahkan pada reagen ini umumnya asam fosfat, tungstat, atau wolframat (Auterhoff dan Knabe, 1978). Reagen ini mengoksidasi fenolat (garam alkali), sehingga mereduksi asam heteropoli menjadi kompleks Mo-W. Fenolat hanya ada pada larutan basa tetapi reagen dan produknya tidak stabil pada kondisi basa. Reaksi tersebut menghasilkan warna biru ungu yang dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (Jansoon, 2005). Metode Folin-Ciocalteau telah digunakan untuk mendeterminasikan fenol total (Singleton dan Rossi, 1965). Metode Folin-Ciocalteau digunakan untuk menetapkan konsentrasi gugus-gugus hidroksil fenolik dalam sampel. Metode ini tidak memberikan data senyawa fenolik tertentu dalam ekstrak. Metode FolinCiocalteau berdasar atas kemampuan mereduksi gugus hidroksil fenolik dan sangat tidak spesifik, namun dapat mendeteksi semua fenol tanpa ada diferensiasi antara asam galat, monomer, dimer, dan senyawa fenolik yang lebih besar dengan


15

sensitivitas berbeda. Reaksi redoks fenolat dapat terjadi di bawah kondisi basa mereduksi kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat dalam reagen menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten warna biru (gambar 4). Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk, artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi asam heteropoli sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Box, 1983; Singleton dan Rossi, 1965). OH

O

H5(PMo12O40)

+

H3PO4(MoO3)12

+

+ H 2O

atau H7(PMo12O40)

O

gugus fenol

reagen Folin-Ciocalteau

kuinon

kompleks oktahedral molybdenum-blue

Gambar 4.Reaksi fenol dengan reagen Folin-Ciocalteau

Saat analisis, terjadi kesetimbangan reaksi redoks. Oleh karena porsi yang terionisasi bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteau maka kesetimbangan bergeser dan akan lebih banyak ion fenolat yang dihasilkan. Untuk itu diperlukan waktu agar reaksi mendekati sempurna. Di samping itu, gugus fenol teroksidasi dengan cepat hanya pada suasana yang cukup basa untuk menghasilkan ion-ion fenolat dalam konsentrasi yang cukup. Sekitar 50% fenol terionisasi pada pH 9 hingga 10 (ionisasi senyawa fenol menjadi ion fenolat ditunjukkan pada gambar 5). Namun sayangnya, reagen Folin-Ciocalteau dan kompleks berwarna biru yang terbentuk tidak stabil dalam larutan basa. Untuk pertimbangan tersebut maka diperlukan kondisi optimum untuk produksi reaksi yang cepat dan retensi waktu yang panjang untuk memaksimalkan warna. Kondisi tersebut mencakup kadar reagen fosfo-molibdo-


16

tungstat yang tinggi serta alkalinitas yang sedang agar reagen Folin-Ciocalteau tetap bertahan dalam kondisi basa sehingga dapat bereaksi dengan semua ion fenolat (Singleton dan Rossi, 1965).

Gambar 5. Ionisasi senyawa fenol

G. Kesalahan dalam Metode Analisis

Mulja dan Suharman (1995) mengkategorikan kesalahan dalam analisis kimia menjadi 2 kelas utama, yaitu : 1. Kesalahan sistematik (determinate errors)

Kesalahan sistematik merupakan hasil analisis yang menyimpang secara tetap dari nilai kadar yang sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis, sehingga kesalahan ini juga disebut kesalahan prosedur (Mulja dan Suharman, 1995). Beberapa faktor penyebab kesalahan ini antara lain: a. kesalahan personil dan operasi Kesalahan ini disebabkan oleh cara pelaksanaan analisis dan bukan karena metode. Kesalahan operasi umumnya bersifat fisis, bukan khemis, misalnya kesalahan pengamatan visual pada titik akhir titrasi, kesalahan cara pencucian endapan, dan sebagainya. Kesalahan ini bersifat individual dan sangat dipengaruhi oleh keterampilan analis dalam melakukan pekerjaan analisis.


17

b. kesalahan alat dan pereaksi Kesalahan ini disebabkan oleh pereaksi yang kurang murni, alat yang kurang valid, atau pemakaian alat yang kurang tepat walaupun alat tersebut dalam kondisi baik, misalnya pengambilan volume dengan menggunakan pipet ukur atau gelas ukur, penggunaan buret 50 mL (buret makro) untuk analisis mikro, dan sebagainya. c. kesalahan metode Kesalahan ini disebabkan oleh kesalahan pengambilan sampel, kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna, atau ikut mengendapnya zat-zat yang tidak diinginkan (Day dan Underwood, 1986). Kesalahan sistematik dapat dihindari atau diperkecil dengan beberapa cara seperti berikut: 1) mengkalibrasi instrumen dan melakukan koreksi secara berkala (biasanya setiap 3 bulan atau disesuaikan dengan frekuensi pemakaian alat) 2) memilih metode dan prosedur standar dari badan resmi 3) memakai bahan kimia dengan derajat untuk analisis 4) meningkatkan pengetahuan dan keterampilan para analis 5) melakukan penetapan blanko atau kontrol dengan zat baku 6) melakukan penetapan paralel (in duplo atau in triplo)

2. Kesalahan tidak sistematik (indeterminate errors)

Kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan yang tidak tetap dari hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan fluktuasi dari instrumen yang


18

dipakai. Penyebab kesalahan ini tidak dapat ditentukan dan tidak dapat dikontrol, sehingga kesalahan ini disebut juga kesalahan acak (random error) (Mulja dan Suharman, 1995).

H. Keterangan Empiris

Penelitian

ini

bertujuan

untuk

mengetahui

besarnya

kandungan

phlorotannin dalam alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. Alga coklat Sargassum polyceratium Montagne mengandung senyawa polifenol yang lebih dikenal sebagai phlorotannin. Adanya kandungan polifenol dibuktikan dengan analisis kuantitatif menggunakan reagen FeCl3. Filtrat ekstrak alga bereaksi positif dengan reagen menghasilkan warna coklat tua kehijauan. Polifenol alga (phlorotannin) dapat diekstraksi dengan metode maserasi maupun sokhletasi dengan pelarut metanol. Metode maserasi menghasilkan ekstrak yang lebih sedikit dibanding metode sokhletasi. Metode sokhletasi menggunakan panas dan ekstraksi secara berkesinambungan sehingga lebih efisien. Pemilihan sokhletasi sebagai teknik penyarian didasarkan atas pertimbangan bahwa kandungan phlorotannin dalam alga coklat ini tahan terhadap pemanasan. Ekstrak metanol yang diperoleh difraksinasi dengan etil asetat untuk mendapatkan phlorotannin dengan polimer sedang. Polifenol berpolimer sedang memiliki panjang gugus kromofor yang dapat memberikan absorbansi pada daerah panjang gelombang UVA (320-400 nm) dan UVB (280-320 nm). Polifenol rantai pendek memiliki gugus kromofor sedikit dan serapan pada daerah UV tidak maksimal, sedangkan jika polimer polifenol terlalu panjang maka akan memberikan


19

absorbansi pada panjang gelombang visibel (400-800 nm). Polifenol dengan rantai yang terlalu panjang tidak dapat dikembangkan sebagai bahan aktif pembuatan produk sunscreen karena tidak dapat memberikan absorbansi pada panjang gelombang UV. Analisis kuantitatif untuk menetapkan kadar phlorotannin dalam alga coklat dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteau. Reagen Folin-Ciocalteau spesifik terhadap gugus fenol, sehingga dapat bereaksi dengan polifenol alga, mengoksidasi gugus fenolik-hidroksil, membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru, dan dapat dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel. Standar yang digunakan dalam penetapan kadar polifenol alga ini adalah phloroglucinol yang merupakan monomer phlorotannin alga. Zhang, et al. (2006) mendapatkan hasil pembacaan panjang gelombang maksimum produk berwarna biru yang dihasilkan dari metode Folin-Ciocalteau pada sampel alga A. nodosum dan standar phloroglucinol sama-sama berada pada panjang gelombang 750 nm atau dengan kata lain terdapat kesamaan karakteristik antara phlorotannin dengan standar phloroglucinol saat direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau. Perhitungan kadar phlorotannin dinyatakan ekuivalen dengan phloroglucinol (mg PE/g fraksi).


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam penelitian non eksperimental karena tidak ada intervensi atau perlakuan terhadap parameter yang diamati.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian

a. Variabel utama penelitian ini adalah kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. b. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini meliputi volume cairan penyari untuk mengisolasi phlorotannin dalam alga coklat Sargassum polyceratium Montagne, tempat panen alga di Pantai Drini, waktu panen pada bulan Mei 2007, serta komposisi reagen saat analisis. c. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah umur alga yang dipanen (bukan tanaman budidaya), pH, suhu dan kelembaban ruang saat analisis.

2. Definisi operasional

a. Simplisia alga coklat merupakan alga coklat Sargassum polyceratium Montagne yang diambil dari Pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta dengan thallus alga pendek dan bergerigi.

20


21

b. Ekstrak kental adalah ekstrak metanol hasil sokhletasi serbuk alga coklat pada suhu antara 100°C hingga 120°C kemudian dipekatkan pelarutnya dengan vacum rotary evaporator sampai volume yang kecil (volume ekstrak ∼1/10 volume awal).

c. Fraksi etil asetat alga coklat adalah fraksi yang diperoleh dari fraksinasi ekstrak kental metanol simplisia alga coklat menggunakan etil asetat dan diuapkan pelarutnya dengan vacum rotary evaporator sampai pekat kemudian dikeringkan di atas waterbath. d. Kadar phlorotannin adalah kadar polifenol total dalam fraksi etil asetat alga coklat yang ditetapkan dengan metode Folin-Ciocalteau dan dihitung ekuivalen dengan phloroglucinol (mg PE/g fraksi).

C. Bahan dan Alat 1. Bahan

Bahan yang digunakan adalah simplisia alga coklat Sargassum polyceratium Montagne yang diambil dari pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta, kertas filter Schleicher & Schuell, metanol pro analysis (p.a.), kloroform p.a., etil asetat p.a., aseton p.a., natrium bikarbonat p.a., phloroglucinol yang kesemuanya berasal dari Merck, Germany, pereaksi Folin-Ciocalteau dari Sigma Chem, Co., USA, larutan gelatin 1%, larutan NaCl 10%, dan akuades.


22

2. Alat

Alat-alat yang digunakan meliputi autoklaf Sanshenyiliaogixie YX-400Z, oven Memmert ULM 500, UM 400, dan U 50, oven Termaks seri 88725, blender Retsch bv, seperangkat alat titrasi Karl Fischer Mettler DL-18, seperangkat spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lambda 20, timbangan elektrik BP 160 dan Scaltec SBC 22 readability 0, 01 mg, vacum rotary evaporator (Buchi), waterbath (Abo-Tech), corong Buchner, mikropipet 0, 5 - 10 μL dan 100 – 1000 μL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup (Scott-Germany), sokhlet, labu alas bulat, heating mantle, corong pisah 500 mL, alat sentrifus, homogenizer (Vortex Genie), dan alat-alat gelas.

D. Tata Cara Penelitian 1. Pengambilan dan preparasi sampel alga coklat Sargassum polyceratium Montagne

Sampel alga coklat Sargassum polyceratium Montagne diperoleh dari hasil panen petani dari Pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta dalam bentuk simplisia kering. Alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel, kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf selama 30 menit pada suhu 100°C. Selanjutnya dikeringkan dengan oven dengan suhu 80-100°C selama 6 hari sampai dapat dihancurkan dengan tangan, diserbuk dengan blender, kemudian diayak.


23

2. Penetapan kadar air serbuk alga

Penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan menggunakan metode Karl Fischer. Serbuk alga ditimbang 2,0 gram, kemudian ditambahkan 10 mL metanol, lalu didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan pretitrasi pada alat, lalu dilakukan uji kebocoran alat, hingga didapat angka drift 10-50 pada alat. Standardisasi dilakukan dengan cara spuit berisi air ditimbang, kemudian 1 tetes air dimasukkan ke dalam alat. Kemudian spuit ditimbang kembali untuk menentukan berat air yang dimasukkan. Selanjutnya dihitung kesetaraan air. Sebanyak 1 mL metanol (blanko) dimasukkan dan dititrasi dengan alat. Lalu dihitung kadar airnya. Sebanyak 1 mL sampel ekstrak metanol serbuk alga dimasukkan, dititrasi dengan alat, dan dihitung kadar air dalam sampel. Kadar air dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus: Kadar air =

x − blanko (10) × 100 % berat yang ditimbang

x = angka yang muncul pada alat (%) dikali 10000 mg atau berat yang dimaksudkan untuk konversi

3. Skrining Fitokimia Alga

a. Preparasi ekstrak untuk skrining fitokimia Sebanyak 10 g serbuk kering alga ditimbang dan ditempatkan dalam botol bertutup kemudian ditambahkan 30 mL metanol 80%. Selanjutnya dipanaskan di atas waterbath selama ± 1 jam. Setelah itu campuran didinginkan pada suhu ruang dan disaring dengan bantuan corong Buchner yang dilapisi kertas saring. Untuk membilas botol maka ditambahkan kurang lebih 5 mL


24

metanol 80% dan disaring menggunakan corong dan kertas saring (Farnsworth, Fong, dan Tinwu, 1992). b. Skrining tanin dan polifenol Sejumlah volume yang setara dengan 10 g ekstrak metanol 80% yang telah disiapkan pada langkah preparasi (hasil saringan) dikeringkan dengan cara diuapkan menggunakan waterbath untuk mendapatkan ekstrak kering. Ekstrak kering alga tersebut ditambah dengan 25 mL akuades panas dan diaduk kemudian didiamkan sampai dingin pada temperatur ruangan. Setelah itu ke dalam ekstrak ditambahkan 3 – 4 tetes larutan NaCl 10%. Suspensi yang terjadi disaring dengan corong Buchner lalu larutan hasil saringan dibagi menjadi 4 bagian masingmasing sebanyak kurang lebih 3 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Pada tabung 1 ditambahkan 4–5 tetes larutan gelatin 1% dan diamati terjadinya endapan. Pada tabung 2 ditambahkan 4–5 tetes garam gelatin (campuran larutan gelatin 1% dan larutan NaCl 10%) dan diamati terjadinya endapan. Pada tabung 3 ditambahkan 3–4 tetes larutan FeCl3 dan diamati terjadinya perubahan warna dan atau endapan. Tabung 4 digunakan sebagai kontrol dan tidak ditambah reagen (Farnsworth, et al., 1992).

4. Isolasi phlorotannin dari alga coklat Sargassum polyceratium Montagne

Serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne (kadar air kurang dari 10%) ditimbang sebanyak 80,0 g, atau sesuai dengan kapasitas sokhlet, kemudian dimasukkan ke dalam kertas filter Schleicher & Schuell dan dimasukkan ke labu sokhlet. Selanjutnya pelarut metanol diberikan sebanyak dua kali sirkulasi. Sokhletasi dilakukan dengan suhu 120 ± 20°C sampai tetesan pelarut jernih.


25

Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian dipekatkan menggunakan vacum rotary evaporator sampai volume yang kecil (~1/10 dari volume mula-mula) yaitu sekitar 60 mL. Selanjutnya secara berturut-turut ditambahkan metanol hingga 120 mL, ditambahkan 120 mL kloroform , dan 45 mL air dalam corong pisah 500 mL, lalu digojog dan didiamkan hingga membentuk dua lapisan. Lapisan atas dan lapisan bawah dipisahkan, selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat dua kali masing-masing 75 mL. Fraksi etil asetat (bagian atas) dikumpulkan, selanjutnya diuapkan hingga kering dan diperoleh ekstrak yang merupakan fraksi etil asetat alga coklat (Nagayama, et al., 2002).

5. Optimasi metode kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau

a. Pembuatan larutan standar Standar phloroglucinol ditimbang dengan seksama sebanyak 0,05 g, kemudian dilarutkan dalam aseton 75% sampai volume 50,0 mL. Seri konsentrasi larutan intermediet diambil dari larutan induk sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL, dan ditambahkan pelarut aseton 75% sampai volume 10,0 mL sehingga konsentrasinya menjadi 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm. b. Penentuan Operating Time (OT) Larutan intermediet 4,0 ppm diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteau yang diencerkan dengan akuades (1:1), dan didiamkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dicampur dengan akuades


26

sampai 50,0 mL. Operating time diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis phloroglucinol (750 nm). c. Penentuan panjang gelombang maksimum (λmaks) Larutan intermediet phloroglucinol dengan konsentrasi 1,0; 3,0; dan 6,0 ppm diambil sebanyak 0,5 mL dan masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades (1:1). Campuran didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dicampur dengan akuades sampai 50,0 mL. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua campuran tersebut divortex selama 30 detik). Kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Ketiga larutan tersebut discanning pada rentang panjang gelombang 400900 nm dengan spektrofotometer visibel untuk menentukan panjang gelombang maksimumnya. d. Pembuatan kurva baku phloroglucinol Masing-masing larutan intermediet diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteau yang diencerkan dengan akuades (1:1), dibiarkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dicampur dengan akuades sampai 50,0 mL. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru. Pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua campuran tersebut divortex selama 30 detik. Kemudian campuran disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm.


27

Absorbansi masing-masing campuran tersebut diukur pada panjang gelombang maksimum (λmaks) hasil scanning menggunakan spektrofotometer visibel. Persamaan kurva baku dihitung dengan menggunakan regresi linier konsentrasi terhadap absorbansi.

6. Estimasi kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne secara kolorimetri (metode Folin-Ciocalteau)

Fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne ditimbang lebih kurang 0,05 g dengan seksama, kemudian dilarutkan dalam aseton 75% sampai volumenya 50,0 mL. Sebanyak 10,0 mL larutan sampel alga coklat diambil dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL reagen FolinCiocalteau yang diencerkan dengan akuades (1:1), biarkan selama 2 menit. Lalu ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dicampur dengan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut diinkubasi pada temperatur ruang selama operating time (OT) sambil divortex pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, masingmasing selama 30 detik. Campuran disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil scanning dengan menggunakan spektrofotometer visibel. Prosedur ini dilakukan sebanyak 3 kali replikasi dengan masing-masing replikasi ditetapkan sebanyak 2 kali dengan cara 2 kali pemipetan (duplo). Kadar phlorotannin diestimasi sebagai kadar polifenol total dan dihitung ekuivalen dengan phloroglucinol (mg PE/g fraksi).

28


E. Analisis Hasil 1. Analisis hasil skrining tanin dan polifenol

Hasil uji kualitatif dianalisis dengan cara membandingkan warna hasil reaksi pada uji tabung dengan warna zat yang tidak diberi tambahan reagen. Perubahan warna menjadi hijau kebiruan atau hitam kehijauan setelah penambahan larutan FeCl3 menunjukkan adanya konstituen fenolik dan sebaliknya, jika tidak ada reaksi dengan larutan FeCl3 maka tidak ada senyawa senyawa fenolik. Apabila terbentuk endapan setelah penambahan garam gelatin maka terdapat senyawa tanin. Apabila tidak ada endapan tetapi terjadi perubahan warna menjadi kehijauan atau hitam kebiruan maka tidak terdapat senyawa tanin (Farnsworth et al., 1992).

2. Analisis hasil penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan metode Folin-Ciocalteau

Hasil uji kuantitatif berupa kadar dihitung dengan memasukkan absorbansi sampel ke dalam persamaan kurva baku phloroglucinol. Kadar phlorotannin diestimasi

sebagai

kadar

polifenol total

phloroglucinol (mg PE/g fraksi).

dan

dihitung

ekuivalen

dengan


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengambilan dan Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne

Sampel alga coklat Sargassum polyceratium Montagne diperoleh dari hasil panen petani dari Pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta pada tanggal 21 Mei 2007. Sampel alga tersebut dalam bentuk simplisia kering. Secara geografis, Pantai Drini berada di wilayah Samudera Indonesia, pantai selatan Pulau Jawa. Suhu perairan habitat alga yaitu sekitar 27°C. Umur alga coklat tersebut tidak diketahui secara pasti, karena bukan merupakan hasil budidaya. Padahal informasi mengenai umur, masa panen, kondisi geografis habitat alga dan spesies alga cukup penting untuk diperhatikan karena dapat memberikan variasi kandungan polifenol alga. Alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel seperti debu, pasir (silikat), atau material laut lain yang terbawa dan menempel pada alga coklat. Pencucian alga harus dilakukan dengan cermat agar tidak mengganggu sampel yang akan diteliti. Beberapa senyawa dapat mereduksi kompleks dalam pereaksi FolinCiocalteau sehingga berpengaruh terhadap warna larutan sampel yang dihasilkan. Sebagai

contoh,

senyawa

silikat

dapat

membentuk

kompleks

molibdat

H6[SiMo12O40].n H2O dengan pereaksi Folin-Ciocalteau dalam suasana asam (Auterhoff dan Knabe, 1978).

29


30

Selain dilakukan pencucian juga dilakukan sortasi basah untuk menghilangkan epifit yang menempel. Pada saat melakukan sortasi pada thallus alga terdapat butiran kapur berwarna putih yang merupakan kalsium. Kalsium tersebut merupakan produk alamiah hasil kalsifikasi dan tidak akan mengganggu analisis karena kalsium bukan merupakan reduktor sehingga tidak dapat mereduksi kompleks asam molibdat-fosfat pada reagen Folin-Ciocalteau yang digunakan. Alga yang telah dipilih kemudian diidentifikasi. Identifikasi spesies alga dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Hasil identifikasi menunjukkan alga coklat yang dimaksud termasuk ordo Fucales, familia Sargassaceae, genus Sargassum dan spesies Sargassum polyceratium Montagne (lihat lampiran 1). Sebelum dikeringkan dengan oven alga coklat dimasukkan dalam autoklaf selama 30 menit pada suhu 100°C. Tujuan proses tersebut adalah untuk menginaktivasi enzim polifenol oksidase (PPO). Menurut penelitian Mustapha dan Ghalem (2007) mengenai efek perlakuan panas terhadap aktivitas PPO, perlakuan pada 55°C membuat enzim inaktif secara parsial dan dilaporkan PPO menjadi inaktif dengan direbus dalam air panas pada 100°C selama 1,5 menit. Enzim PPO mengkatalisis hidroksilasi monofenol menjadi o-difenol, yang selanjutnya dapat mengkatalisis oksidasi o-difenol menjadi o-kuinon (gambar 6) (Yagar dan Sagiroglu, 2000). Polimerisasi o-kuinon menghasilkan pigmen berupa senyawa polifenol. Inaktivasi enzim tersebut dimaksudkan untuk mencegah polimerisasi rantai polifenol pada alga agar tidak bertambah panjang.


O

HO

HO

O

O HO

Enzim PPO

31

Enzim PPO

O

o-quinone

.

Gambar 6. Proses oksidasi fenol oleh enzim polifenol oksidase (PPO) (Sullivan et al., 2003)

Polifenol alga yang akan ditetapkan kadarnya adalah polifenol yang memiliki polimer sedang. Polifenol berpolimer sedang memiliki panjang gugus kromofor yang dapat memberikan absorbansi pada daerah panjang gelombang UVA (320-400 nm) dan UVB (280-320 nm). Polifenol rantai pendek memiliki gugus kromofor sedikit dan serapan pada daerah UV tidak maksimal, sedangkan jika polimer polifenol terlalu panjang maka akan memberikan absorbansi pada panjang gelombang visibel (400-800 nm). Polifenol dengan rantai yang terlalu panjang tidak dapat dikembangkan sebagai bahan aktif pembuatan produk sunscreen karena tidak dapat memberikan absorbansi pada panjang gelombang UV. Alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dikeringkan menggunakan oven pada suhu 90°C selama beberapa hari sehingga menjadi simplisia alga coklat kering yang mudah dihancurkan dengan tangan kemudian diserbuk dengan blender. Setelah diblender serbuk diayak dengan derajat kehalusan serbuk 20/30 untuk mendapatkan serbuk yang lebih homogen dan ukuran partikel tidak terlalu besar atau kecil. Partikel serbuk tidak terlalu besar dapat meningkatkan efisiensi ekstraksi serbuk simplisia karena semakin luas permukaan serbuk yang kontak dengan cairan penyari. Sementara itu, partikel serbuk yang terlalu kecil dapat menyumbat pori-pori


32

kertas filter yang digunakan dalam sokhletasi sehingga menghambat proses ekstraksi. Serbuk yang sangat halus juga menyebabkan cairan pengekstraksi akan sulit dipisahkan dari sisa yang tertinggal setelah proses ekstraksi selesai. Serbuk alga harus cukup kering. Kandungan air alga tidak boleh lebih dari 10% seperti yang dipersyaratkan untuk simplisia tanaman umumnya (Anonim, 1995b). Apabila kandungan air dalam serbuk alga melebihi batasan tersebut maka dapat memudahkan pertumbuhan mikroba yang dapat merusak kandungan dalam alga. Oleh karena itu, dilakukan penetapan kadar air terhadap serbuk kering alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. Penetapan kadar air serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dilakukan menggunakan metode Karl Fischer yang relatif spesifik untuk air. Serbuk alga mengandung berbagai macam senyawa alam dan juga ada kemungkinan alga mengandung senyawa yang dapat menguap. Oleh karena itu, kadar air dalam alga tidak ditetapkan dengan metode gravimetri untuk mencegah pengaruh senyawa volatile dalam penetapan kadar air. Prinsip penetapan kadar air dengan metode Karl Fischer ini berdasar pada reaksi reduksi iodin oleh sulfur dioksida dengan adanya air. Reaksi berakhir dengan terjadinya perubahan sulfur trioksida menjadi piridin sulfur trioksida yang akan bereaksi dengan metanol membentuk garam metil sulfat, seperti pada gambar 7 (Evans, 2002). H2O +

I2 +

SO2

2HI

+

SO3

(1)


SO2 + I2 + H2O + 3

+

2 N HI

N

+

N O 2S

O

CH3OH N

N O 2S

33

H

O

SO4CH3

Gambar 7. Reaksi redoks pada saat penetapan kadar air dengan metode Karl Fischer

Kadar air serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan metode Karl Fischer adalah sebagai berikut : Replikasi I

: 3,52%

Replikasi II

: 3,07%

Replikasi III

: 4,04%

Hasil penetapan kadar air serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne masih memenuhi persyaratan karena kadar airnya berada di bawah 10% yaitu sebesar 3,54 ± 0,48%.

B. Skrining Fitokimia Alga

Uji kualitatif dilakukan untuk mengetahui keberadaan kandungan polifenol dalam alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. Polifenol merupakan salah satu metabolit sekunder yang dihasilkan oleh alga. Polifenol alga terdiri atas berbagai macam senyawa fenolik seperti flavonoid dan tanin dengan phloroglucinol sebagai monomer. Skrining polifenol dilakukan dengan menggunakan pereaksi FeCl3.


34

Phloroglucinol akan bereaksi dengan FeCl3 membentuk kompleks berwarna hijau, biru, atau ungu (gambar 8). HO

H O

O

OH

OH

3

HO

+

FeCl3

Fe3+

HO

O

+ 3HCl

OH O

OH

OH

phloroglucinol

kompleks berwarna biru-ungu

Gambar 8. Reaksi antara phloroglucinol dengan FeCl3

Perubahan warna menjadi hijau kebiruan atau hitam kehijauan menunjukkan adanya konstituen fenolik. Sebaliknya jika tidak ada reaksi dengan larutan FeCl3 maka tidak ada polifenol. Hasil uji kualitatif alga coklat Sargassum polyceratium Montagne menunjukkan hasil positif adanya kandungan senyawa fenolik, ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi coklat tua kehijauan. Warna coklat yang terbentuk disebabkan karena kandungan pigmen fucoxanthin dalam alga coklat. Selain skrining polifenol, juga dilakukan skrining tanin karena secara kimia ada kemiripan antara tanin dan phlorotannin. Uji kualitatif tanin menggunakan garam gelatin yang merupakan campuran larutan gelatin 1% dan larutan NaCl 10%. Penambahan NaCl 10% dimaksudkan untuk menghilangkan protein sehingga mencegah terjadinya reaksi positif palsu. Kandungan protein dalam sampel juga dapat menyebabkan terbentuknya endapan maka campuran disaring dan filtrat yang diperoleh ditambah gelatin.


35

Hasil uji kualitatif dengan gelatin ini menunjukkan hasil positif mengandung tanin, dilihat dari terbentuknya sedikit endapan putih di dasar tabung. Terbentuknya endapan disebabkan karena kemampuan tanin menyamak kulit. Selain itu, endapan menunjukkan adanya tanin yang tidak larut dengan gelatin dalam HCl atau NaCl. Tanin memiliki afinitas yang kuat terhadap gelatin sehingga mengalami presipitasi (Thomas dan Frieden, 1923).

C. Isolasi Phlorotannin dari Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne

Serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne ditimbang sebanyak 80,07 g

dan dimasukkan ke dalam kertas filter Schleicher & Schuell untuk

selanjutnya diekstraksi dengan cara sokhletasi dengan pelarut metanol. Prinsip ekstraksi dengan metode sokhletasi yaitu pemisahan senyawa berdasarkan polaritas. Phlorotannin merupakan senyawa yang relatif polar sehingga dapat larut dalam pelarut yang relatif polar seperti metanol. Metanol memiliki gugus hidroksil sehingga mampu membentuk ikatan hidrogen intramolekular dengan gugus hidroksil pada senyawa fenolik sehingga polifenol dapat larut dalam metanol. Proses ekstraksi dengan metode sokhletasi dilakukan hingga pelarut pengekstraksi jernih untuk memastikan semua senyawa yang relatif polar ditarik ke dalam ekstrak metanol. Metode sokhletasi dipilih untuk mengekstraksi serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne karena prosesnya cepat dan jumlah hasil ekstrak lebih banyak dibandingkan metode maserasi. Selain itu, pemilihan metode ini juga didasarkan atas pertimbangan bahwa polifenol alga tahan terhadap pemanasan


36

hingga 170°C. Sokhletasi dilakukan pada suhu antara 100°C hingga 120°C selama 30 jam 55 menit. Ekstrak hasil sokhletasi diuapkan pelarutnya dengan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga volume kecil (~1/10 dari volume mula-mula) hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak tersebut difraksinasi menggunakan pelarut yang tidak saling campur, yaitu metanol-air dan kloroform. Berdasarkan berat jenisnya maka metanol-air akan berada pada lapisan atas sedangkan kloroform berada pada lapisan bawah. Seperti telah disebutkan di atas, phlorotannin merupakan senyawa yang relatif polar sehingga akan lebih tertarik ke dalam fraksi metanol-air. Metanol memiliki gugus hidroksil sehingga memungkinkan terbentuknya ikatan hidrogen intramolekuler dengan gugus hidroksil pada senyawa fenolik dan meningkatkan kelarutan polifenol dalam metanol. Sementara itu, senyawa-senyawa non polar seperti lipid dan senyawa polifenol rantai panjang akan tertarik ke dalam fraksi kloroform dan dibuang. Phlorotannin dalam fraksi metanol-air kemudian diekstraksi dengan etil asetat. Phlorotannin dengan polimer intermediet akan lebih tertarik ke dalam fraksi etil asetat dan akan ditetapkan kadarnya. Ekstraksi dengan etil asetat dilakukan sebanyak dua kali agar semua fraksi phlorotannin dapat ditarik dengan lebih sempurna karena proses ekstraksi berulang lebih efektif dibanding sekali ekstraksi. Fraksi etil asetat yang diperoleh dikumpulkan dan kemudian diuapkan pelarutnya di atas waterbath. Fraksi disimpan dalam oven dengan suhu 50°C agar tidak menjadi lembab dan rusak karena terpapar udara bebas yang mengandung uap


37

air. Fraksi tersebut akan menjadi analit untuk ditetapkan kadar polifenol totalnya menggunakan metode Folin-Ciocalteau. . D. Optimasi Metode Folin-Ciocalteau 1. Pembuatan Larutan Standar

Standar yang digunakan dalam penelitian ini adalah phloroglucinol. Alasan pemilihan phloroglucinol sebagai standar karena phloroglucinol merupakan monomer phlorotannin alga. Selain itu, Zhang, et al. (2006) mendapatkan hasil pembacaan panjang gelombang maksimum produk berwarna biru yang dihasilkan dari metode Folin-Ciocalteau pada sampel alga A. nodosum dan standar phloroglucinol sama-sama berada pada panjang gelombang 750 nm atau dengan kata lain

terdapat

kesamaan

karakteristik

antara

phlorotannin

dengan

standar

phloroglucinol saat direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau. Standar phloroglucinol yang telah dilarutkan dalam aseton 75% kemudian direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau, dibiarkan selama 2 menit, lalu ditambahkan Na2CO3 1,9 M untuk memberikan suasana basa sehingga fenol lebih mudah bereaksi. Setelah penambahan basa larutan menjadi berwarna biru. Agar homogen maka campuran divortex. Sebelum dibaca absorbansinya campuran disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan senyawa-senyawa yang tidak diketahui yang tidak larut dalam aseton maupun air. Supernatan hasil sentrifugasi berwarna biru sedangkan endapan berwarna putih. Supernatan tersebut kemudian dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer visibel.


38

2. Penentuan Operating Time (OT)

Penentuan operating time (OT) perlu dilakukan dalam analisis dengan metode kolorimetri karena warna hasil reaksi tidak selalu stabil. Waktu reaksi dan pembentukan warna kompleks molybdenum-blue merupakan salah satu variasi dalam metode Folin-Ciocalteau. Oleh karena itu perlu ditentukan rentang waktu setelah sampel direaksikan dengan reagen sehingga hasil yang diperoleh dapat memberikan absorbansi yang stabil pada saat dibaca dengan spektrofotometer. Operating time diukur dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis phloroglucinol, yaitu 750 nm. Hasil pengukuran operating time seperti pada gambar 9.

0,600

absorbansi

0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

Waktu (menit)

Gambar 9. Spektra operating time phloroglucinol konsentrasi 4,0 ppm

Dari hasil spektra pada gambar 9 maka dapat disimpulkan bahwa hasil reaksi memberikan nilai absorbansi yang stabil pada menit ke-50 hingga menit ke-90, dihitung sejak sampel direaksikan dengan reagen. Pada rentang waktu tersebut


39

senyawa polifenol yang terkandung dalam alga telah bereaksi sempurna dengan reagen Folin-Ciocalteau. Pada saat reaksi terjadi, reagen Folin-Ciocalteau mendapatkan proton (H+) dari

phloroglucinol

dan

air

(tereduksi)

membentuk

kompleks

oktahedral

molybdenum blue. Sementara itu, phloroglucinol akan mendapatkan tambahan oksigen dari air dan reagen (teroksidasi) sehingga membentuk kuinon (gambar 10). Kompleks oktahedral yang terbentuk merupakan kompleks MoO3-fosfat dengan fosfor (P) sebagai pusatnya. Molibdat pada kompleks tersebut dapat disubstitusi oleh tungsten. Reaksi reduksi reagen Folin-Ciocalteau :

H3PO4(MoO3)12 + 2e

+ 2H

H5(PMo12O40)

(2)

H3PO4(MoO3)12 + 4e

+ 4H

H7(PMo12O40)

(3)

O

OH

oksidator + H2O HO

OH

+

4H+

+

4e

OH

HO O

Gambar 10. Reaksi oksidasi phloroglucinol

Reaksi sempurna berarti semua phloroglucinol dalam fraksi etil asetat alga coklat telah bereaksi dengan reagen dan menghasilkan molybdenum blue (gambar 11).


O

OH

+

HO

40

OH

H3PO4(MoO3)12

+

H2O

+

HO

H7(PMo12O40)

OH O

Gambar 11. Reaksi phloroglucinol dengan reagen Folin-Ciocalteau

3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks)

Panjang gelombang maksimum (λmaks) merupakan panjang gelombang suatu senyawa memberikan absorbansi maksimum. Panjang gelombang maksimum ditentukan dan digunakan untuk membaca absorbansi sampel. Mulja dan Suharman (1995) menyatakan pembacaan absorbansi pada panjang gelombang maksimum akan memberikan sensitivitas dan presisi analisis yang maksimal. Zhang, et al. (2006) telah melakukan penelitian mengenai estimasi kandungan polifenol total pada sampel rumput laut dan ekstraknya berdasarkan reaksi Folin-Ciocalteau. Pada penelitian tersebut diperoleh panjang gelombang maksimum standar phloroglucinol adalah 750 nm. Untuk melihat puncak spektrum yang lebih jelas di sekitar panjang gelombang 750 nm maka scanning dilakukan pada rentang 400-900 nm. Scanning panjang gelombang dilakukan menggunakan

tiga konsentrasi

baku phloroglucinol yang berbeda yaitu 1,0; 3,0; dan 6,0 ppm yang direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau. Pemilihan ketiga konsentrasi tersebut didasarkan atas pertimbangan bahwa ketiganya dianggap mewakili konsentrasi rendah, menengah, dan tinggi. Hasil yang diperoleh menunjukkan tiga puncak absorbansi


41

maksimum pada panjang gelombang yang berbeda, yaitu 758,7 nm; 750,1 nm; dan 743,4 nm (gambar 12).

0,800 0,700 0,600 0,500

absor bance uni t ( au)

C

0,400 0,300

B

0,200 0,100

A

λ (wavelength)

Gambar 12. Spektra scanning panjang gelombang maksimum phloroglucinol pada tiga konsentrasi (A = 1,0 ppm; B = 3,0 ppm; C = 6,0 ppm) setelah direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau

Dari hasil scanning panjang gelombang maksimum, ditemukan bahwa semakin besar konsentrasi standar phloroglucinol yang direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau maka panjang gelombang maksimum cenderung bergeser ke panjang gelombang yang lebih kecil. Hal ini disebabkan oleh reduksi reagen FolinCiocalteau yang tidak terkontrol. Auterhoff dan Knabe (1978) menyebutkan dua bentuk reduksi reagen Folin-Ciocalteau, seperti tertulis pada persamaan (2) dan (3). Reaksi reduksi tersebut ditentukan oleh keasaman (pH). Keterbatasan penelitian ini adalah tidak terkontrolnya keasaman larutan pada saat dianalisis. Dengan demikian


42

reaksi reduksi reagen dapat terjadi dalam dua bentuk, sehingga berpengaruh pada hasil reaksi redoks yang menyebabkan terjadinya pergeseran panjang gelombang. Oleh karena diperoleh tiga panjang gelombang yang berbeda, maka absorbansi standar phloroglucinol dibaca pada ketiga panjang gelombang tersebut. Hasil pembacaan absorbansi menunjukkan perbedaan yang tidak berbeda jauh. Oleh karena itu, untuk pembacaan absorbansi seri baku dan sampel dipilih panjang gelombang 750,1 nm karena merupakan panjang gelombang yang mendekati panjang gelombang maksimum teoritis phloroglucinol yaitu 750 nm (Zhang, et al., 2006).

4. Pembuatan Kurva Baku Phloroglucinol

Kurva baku phloroglucinol dibuat sebanyak tiga replikasi agar hasil yang diperoleh dapat menggambarkan kondisi yang sebenarnya. Absorbansi larutan kurva baku dibaca pada panjang gelombang 750,1 nm. Dengan demikian diperoleh tiga persamaan kurva baku yang berbeda (tabel I). Tabel I. Data replikasi seri baku phloroglucinol Seri Baku 1 2 3 4 5 6

Replikasi I Kadar absorbansi (mg/100mL) 0,1024 0,2048 0,3071 0,4095 0,5119 0,6143 A B r

0,138 0,269 0,405 0,516 0,648 0,768 0,0175 1,2274 0,9997

y = 1,2274 x + 0,0175

Replikasi II Kadar absorbansi (mg/100mL) 0,1046 0,2091 0,3137 0,4182 0,5228 0,6274 A B r

0,132 0,257 0,407 0,514 0,643 0,712 0,0277 1,1381 0,9956

y = 1,1381 x + 0,0277

Replikasi III Kadar absorbansi (mg/100mL) 0,1016 0,2032 0,3048 0,4064 0,5080 0,6096 A B r

0,121 0,238 0,379 0,542 0,602 0,720 0,0087 1,1952 0,9941

y = 1,1952 x + 0,0087

Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel I dapat dilihat hubungan yang linier antara konsentrasi phloroglucinol dan absorbansi yang dihasilkan, yaitu dengan


43

melihat koefisien korelasi (r) masing-masing replikasi. Koefisien korelasi (r) replikasi I (0,9997), replikasi II (0,9956), dan replikasi III (0,9941). Dari ketiga replikasi tersebut dipilih satu persamaan kurva baku yang memiliki parameter linearitas yang paling baik, yaitu persamaan kurva baku replikasi I. Persamaan kurva baku replikasi I dipilih untuk menghitung kadar sampel karena memiliki nilai r paling mendekati 1. Nilai r yang mendekati 1 menunjukkan adanya korelasi antara peningkatan konsentrasi dengan kenaikan nilai respon absorbansi. Persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 1,2274 x + 0,0175 (gambar 13).

Kurva Baku

0.9

0.8

0.7

Absorbansi

0.6

0.5

0.4 y = 1.2274 x + 0.0175

0.3

0.2

0.1

0 0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

Konsentrasi (ppm )

Gambar 13. Kurva baku phloroglucinol

0.7000


44

E. Estimasi Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan metode Folin-Ciocalteau

Estimasi kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteau. Metode ini merupakan metode yang paling umum untuk menetapkan kadar polifenol. Untuk mengestimasi kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne terlebih dahulu dilakukan penimbangan seksama terhadap fraksi sebanyak 0,05 g. Penimbangan dilakukan sebanyak tiga replikasi. Fraksi yang sudah ditimbang kemudian dilarutkan dalam aseton 75% secara bertahap. Untuk membantu kelarutan fraksi diperlukan pemanasan 50°C

dan pengadukan dalam

waktu yang cukup lama karena fraksi sukar larut sempurna. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan fraksi adalah aseton 75%, bukan metanol. Pemilihan ini didasarkan atas pertimbangan bahwa campuran aseton dan air yang relatif polar ini juga efektif untuk menarik senyawa polifenol (Padda, 2006). Selain itu, gugus hidroksil (OH) dalam metanol dapat memberikan intervensi absorbansi karena dapat mereduksi kompleks asam dalam reagen Folin-Ciocalteau sehingga blanko juga dapat berwarna kebiruan. Hal ini tentu akan meningkatkan resiko kesalahan pembacaan absorbansi analit. Fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne yang telah larut sempurna dalam aseton 75% berwarna coklat jernih. Larutan ini kemudian direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteau seperti pada standar phloroglucinol. Absorbansi sampel dibaca pada panjang gelombang 750,1 nm dan panjang


45

gelombang hasil scanning dengan spektrofotometer. Hasil pembacaan absorbansi sampel disajikan pada tabel II. Tabel II. Hasil pembacaan absorbansi fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne Panjang Gelombang 750,1 nm Absorbansi Replikasi I 1 0,281 2 0,292 Replikasi II 1 0,277 2 0,270 Replikasi III 1 0,278 2 0,300

Perhitungan kadar sampel dilakukan menggunakan data absorbansi sampel yang dibaca pada panjang gelombang 750,1 nm sesuai dengan persamaan kurva baku yang dipilih. Dengan menggunakan persamaan kurva baku y = 1,2274 x + 0,0175 maka diperoleh hasil perhitungan kadar fraksi dengan tiga kali replikasi dan masingmasing replikasi dianalisis duplo untuk mengurangi nilai kesalahan sistematik, seperti pada tabel III. Tabel III. Hasil penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne Replikasi (duplo) Kadar Rata-rata kadar (mg PE/g fraksi) (mg PE/g fraksi) 10,8618 I.1 10,6414 I.2 11,0825 10,5052 II.1 10,6488 II.2 10,3617 11,0688 III.1 10,6185 III.2 11,5192

Kadar phlorotannin diestimasi sebagai kadar polifenol total dan dihitung ekuivalen dengan standar phloroglucinol. Hal tersebut disebabkan karena metode Folin-Ciocalteau ini tidak spesifik mengukur jenis polimer polifenol tertentu namun sangat sensitif terhadap seluruh senyawa yang memiliki gugus fenolik (Waterman


46

dan Mole, 1994), termasuk phlorotannin. Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne yang diukur dengan metode FolinCiocalteau ini sebesar 10,81 ± 0,28 mg PE/g fraksi. Metode kolorimetri dengan reagen Folin Ciocalteau memiliki kelebihan antara lain sensitivitas dalam mengukur senyawa dengan gugus fenolik sampai tingkat part per million (ppm), reprodusibilitas tinggi, linearitas baik, serta menghasilkan reaksi warna yang cukup stabil dalam rentang waktu yang relatif panjang. Sementara itu, kelemahan metode ini adalah memerlukan kondisi optimum mencakup kadar reagen yang tinggi serta alkalinitas sedang (pH 9-10) untuk produksi reaksi yang cepat dan retensi waktu yang panjang untuk memaksimalkan warna. Selain itu, metode ini tidak spesifik mengukur jenis polimer polifenol tertentu namun sangat sensitif terhadap seluruh senyawa yang memiliki gugus fenolik.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Phlorotannin dapat diisolasi dari alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. 2. Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne yang ditetapkan menggunakan metode Folin-Ciocalteau adalah 10,81 ± 0,28 mg PE/g fraksi.

B. Saran

1. Perlu dilakukan analisis struktur kimia phlorotannin yang terkandung dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne. 2. Perlu penelitian lebih lanjut mengenai optimasi metode Folin-Ciocalteau terkait pengaruh pH pada saat reaksi. 3. Perlu dilakukan validasi metode Folin-Ciocalteau untuk menetapkan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polyceratium Montagne.

47


DAFTAR PUSTAKA

Ahn, M.J., Yoon, K.D., Min, S.Y., Lee, J.K., Kim, J.H., Kim, T.G., et al., 2004, Inhibition of HIV-1 Reverse Transcriptase and Protease by Phlorotannin From The Brown Alga Ecklonia cava, Biol. Pharm. Bull, 27(4), 544-547 Anonim , 1978, Marine Natural Products : Chemical and Biological Perspectives, Volume I, diedit oleh Paul J. Scheuer, 118-119, Academic Press, New York Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 25-26, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995a, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 1157, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995b, Materia Medika Indonesia, Jilid VI, xiv, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim,

2008, Sargassum polyceratium, Taxonomy, http://zipcodezoo.com/Chromista/S/Sargassum_polyceratium.asp, diakses tanggal 12 Februari 2008

Athukorala, Y., Kim, K.N., and Jeon,Y.J., 2006, Antiproliferative and antioxidant properties of an enzymatic hydrolysate from brown alga, Ecklonia cava, Food Chem.Toxicol., 44(7), 1065-1074 Auterhoff, H. and Knabe, J., 1978, Lehrbuch der Pharmazeutischen Chemie, 103, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Mbh., Stuttgart Blunt, J.W., Copp, B.R., Munro, M.H.G., Northcotec, P.T. and Prinsep, M.R., 2005, Marine natural products, Nat. Prod. Rep., 22, 15 Box, J.D., 1983, Investigation of the Folin-Ciocalteu phenol reagent for the determination of polyphenolic substances in natural waters, Water Res, 17, 511–525 Burtin, P., 2003, Nutrional Value of Algas , Electron. J. Environ. Agric. Food Chem., France, 2 (4) , 498-500 Butz, H.W. and Nobel, H.J., 1961, Instrumental Methods for The Analysis of Food Additives, 109-123, Interscience Publisher, New York

48


49

Cairns, D., 2005, Essentials of Pharmaceutical Chemistry, Second Edition, 151-159, Pharmaceutical Press, London Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, Sixth Edition, 65, 66, 483, 484, John Wiley & Sons, Inc., United States of America Dahuri, R., 2003, The Role of Marine Biotechnology in The Development of Marine Biomedical Product, Proceedings of International Symposium on Biomedicine, 18-19 September, 2003, 1-5, IPB, Bogor Day, R. A. dan Underwood, A. L., 1986, Analisis Kuantitatif, Edisi V, 389-392, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, Penerbit Erlangga, Jakarta Evans, W.C., 2002, Trease and Evans: Pharmacognosy, 15th Ed., 98, W.B. Saunders, London Farnsworth, N.R., Fong, H.S., Tin-Wu, M., 1990, Phytochemical Screening, 30-31, 62, Department of Pharmacognosy and Pharmacology, College of Pharmacy, University of Illinois of The Medical Center, Illinois Glombitza, K. W. and Keusgen , M., 1995, Fuhalols and deshydroxyfuhalols from the brown alga Sargassum spinuligerum, Phytochemistry, 38, 987-990 Harborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods, Edisi II, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, Penerbit ITB, Bandung Houghton, P.J., 1998, Laboratory Handbook for The Fractionation of Natural Extract, 7-8, 54, 57, Thomson Science, London Jansoon, N., 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green Tea, 209.85.165.104/search?q=cache:Nj311vjKCdcJ:chemw.sc.mahidol.ac.th/sc ess/scch108/2005_06_SCCH108Lab02.pdf+Folin-Ciocalteau+ method +colori metric&hl=en&ct=clnk&cd=9&gl=id, diakses tanggal 24 Oktober 2007 Kadi, A., 2007, Beberapa Catatan Kehadiran Marga Sargassum di Perairan Indonesia, www.oseanografi.lipi.go.id/volxxxno.42.pdf, diakses tanggal 20 Februari 2007 Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Zhang, R., Jung, M.S., Ham, Y.M., et al., 2005, Cytoprotective Effect of Phloroglucinol on Oxidative Stress Induced Cell Damaged via Catalase Activation, J.Cell Biochem., 97(3), 609-620


50

Kang, K.A., Zhang, R., Lee, K.H., Chae, S., Kim, B.J., Kwak, Y.S., et al., 2006, Protective Effect of Triphlorethol-A from Ecklonia cava Against Ionizing Radiation in Vitro, J.Radial.Res., 47(1), 61-68 Khopkar, S.M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, alih bahasa oleh Saptoraharjo, A., 193, 204, Universitas Indonesia Press, Jakarta Krumholz, L.R. And Bryant, M.P., 1988, Characterization of the PyrogallolPhloroglucinol Isomerase of Eubacterium oxidoreducens, Journal of Bacteriology, Illinois, 170(6), 2478 Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 26-28, Airlangga University Press, Surabaya Mustapha, K. and Ghalem, S., 2007, Effect of Heat Treatment on Polyphenol Oxidase and Peroxidase Activities in Algerian Stored Dates, AJB, 6(6), 790-794 Nagayama, K.,Iwamura, Y., Shibata, I., Hirayama, I., and Nakamura, T., 2002, Bactericidal Activity of Phlorotannins from The Brown Alga Ecklonia kurome, JAC, 50, 889-893 Padda, M.S., 2006, Phenolic Composition And Antioxidant Activity of Sweetpotatoes [Ipomoea batatas (L.) Lam], Disertasi, Punjab Agricultural University ,15 Pavia, H., Toth, G.B., Lindgren, A., and Aberg, P., 2003, Intraspesific Variation in The Phlorotannin Content of Brown Alga Ascophyllum nodosum, Phycologia, 42(4), 378-383 Roleda, M.Y., Wiencke, C., and Luder, U.H., 2006, Impact of Ultraviolet Radiation on Cell Structure, UV-absorbing Compounds, Photosynthesis, DNA Damage, and Germination in Zoospore of Arctic Saccorhiza dermatodea, J.Exp.Marine.Biol.Ecol., 57(14), 3847-3856 Roth, H.J., and Blaschke, G., 1994, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh Sarjoko Kisman dan Slamet Ibrahim, 359-361, 373, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta Silverstein, R.M., Bassler, G.C., and Morrill, T.C., 1986, Spectrometric Identification of Organic Compounds, edisi kelima, alih bahasa oleh Hartomo, A.J., dan Purba, A.V., 307-308, Erlangga, Jakarta Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147


51

Skoog, D.A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3rd Edition, 22, 164-165, 329-351, Saunders College Publishing, Philadelphia Sulistiyowati, H., 1992, Komposisi dan Distribusi Alga di Pantai Pasir Putih, Kabupaten Situbondo (Laporan Penelitian), FKIP-UNEJ, Jember Sullivan, M., Thoma, S., Samac, D. and Hatfield, R., 2003, Cloning of Red Clover and Alfafa Polyphenol Oxydase Genes and Expression of Active Enzymes in Transgenic Alfafa, Molecular Breeding of Forage and Turf, 190 Svobodova, A., Psotova, J., and Walterova, D., 2003, Natural phenolics in prevention of UV-Induced Skin Damage (A Review), Biomed. Papers, 147(2), 137-145 Swanson, A.K., and Druehl, L.D., 2002, Induction, Exudation and The UV Protective Role of Kelp Phlorotannins, Aquatic Bot., 73, 241-253 Thomas, A.W. and Frieden, A., 1923, The Gelatin-Tannin Reaction, 839, Industrial & Engineering Chemistry, Columbia University, New York Vogel, A.I., 1978, A Text Book of Quantitative Inorganic Analysis, Fourth edition, 728, The English Languange Book Society, Richard Clay Ltd., Bungay Waterman, P.G. and Mole, S., 1994, Analysis of Phenolic Plant Metabolites : Extraction and Chemical Quantification, Blackwell Scientific Pub., 66-69 Wu, S. and Pan, C., 2004, Preparation of Algal-oligosaccharide Mixtures by Bacterial Agarases and Their Antioxidative Properties, Fisheries Science, 70, 1164-1173 Yagar, H. and Sagiroglu, A., 2000, Partially Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase of Quince, Turk J.Chem., 26(2002), 97-103 Yuan, Y.V., and Walsh, N.A., 2006, Antioxidant and Antiproliferative Activities of Extract from a Variety of Edible Seaweeds, J.Fd.Chem.Toxicol., 44, 11441150 Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., Dennis, D.A., and Barrow, C.J., 2006, A Simple 96-well Microplate Method for Estimation of Total Polyphenol Content in Seaweeds, Journal of Applied Phycology, 445-450


LAMPIRAN

Lampiran 1.

Hasil determinasi alga dari Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

52


53


Lampiran 2.

Foto autoklaf Sanshenyiliaogixie YX-400Z

Lampiran 3.

Foto titrator Karl Fischer Mettler DL-18

54


Lampiran 4.

55

Hasil perhitungan kadar air serbuk alga coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan metode Karl Fischer

Replikasi

Bobot yang

Angka di alat

Kadar air

Rata-rata

ditimbang

(%)

(%)

kadar air

(mg) I

2000,5

0,1054

3,5241

II

2000,6

0,0963

3,0691

3,5437 ±

III

2001,0

0,1157

4,0380

0,4848

Drift = 19 Blangko : Berat air + spuit

= 8,6898 g

Berat spuit + sisa air

= 8,6694 g

Berat air yang dimasukkan

= 0,0204 g

Konsentrasi

= 25,253 mg/5 mL titran

Angka di alat = 0,0349 % Kadar air

=

0,0349 x 10000 x 1 mg 100

= 3,49 mg Keterangan : 10000 merupakan angka untuk konversi perhitungan blangko dan sampel agar diperoleh angka yang mempermudah perhitungan.


Replikasi I Penimbangan = 2000,5 mg Kadar air

=

0,1054 x 10000 x 1 mg = 10,54 mg 100

Persentase kadar air

=

(10,54 − 3,49) x10 x 100 % = 3,5241 % 2000,5

Replikasi II Penimbangan = 2000,6 mg Kadar air

=

0,0963 x 10000 x 1 mg = 9,63 mg 100

Persentase kadar air

=

(9,63 − 3,49) x10 x 100 % = 3,0691 % 2000,6

Replikasi III Penimbangan = 2001,0 mg 0,1157 x 10000 x 1 mg = 11,57 mg 100

Kadar air

=

Persentase kadar air =

(11,57 − 3,49) x10 x 100 % = 4,0380 % 2001,0

56


Lampiran 5.

Hasil

skrining

fitokimia

alga

coklat

Sargassum

polyceratium Montagne Ekstrak alga + gelatin 1% Æ positif jika memberikan endapan Ekstrak alga + gelatin 1% + NaCl 10% Æ positif jika memberikan endapan Ekstrak alga + FeCl3 Æ positif jika berwarna kebiruan atau hitam kehijauan Ekstrak +

Ekstrak +

gelatin 1%

gelatin 1% +

perlakuan

NaCl 10%

(kontrol)

Ekstrak + FeCl3

Ekstrak tanpa

Coklat muda

Coklat muda

Coklat tua,

Coklat muda

jernih dengan

jernih dengan

kehijauan

jernih

sedikit endapan

sedikit endapan

(+)

(+)

(+)

57


Lampiran 6.

Foto uji kualitatif

1

2

3

4

Keterangan : 1. Ekstrak alga Sargassum polyceratium Montagne + gelatin 1% 2. Ekstrak alga Sargassum polyceratium Montagne + gelatin 1% + NaCl 10% 3. Ekstrak alga Sargassum polyceratium Montagne + FeCl3 4. Ekstrak alga Sargassum polyceratium Montagne tanpa perlakuan (kontrol)

58


Lampiran 7.

Foto fraksinasi ekstrak alga coklat Sargassum polyceratium Montagne

Keterangan : Fraksi metanol-air (lapisan atas) dan kloroform (lapisan bawah)

Keterangan : Fraksi etil asetat (lapisan atas) dan metanol-air (lapisan bawah)

59


Lampiran 8.

Lampiran 9.

Foto Vaccum Rotary Evaporator

Foto spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lambda 20

60


Lampiran 10.

Data penimbangan seri baku phloroglucinol

Replikasi I: Berat kertas + zat

= 0,45148 g

Berat kertas + sisa

= 0,40029 g

Berat zat

= 0,05119 g

Replikasi II: Berat kertas + zat

= 0,44832 g

Berat kertas + sisa

= 0,39604 g

Berat zat

= 0,05228 g

Replikasi III: Berat kertas + zat

= 0,44613 g

Berat kertas + sisa

= 0,39533 g

Berat zat

= 0,05080 g

61


Lampiran 11.

Contoh perhitungan seri konsentrasi baku phloroglucinol

Replikasi I Konsentrasi stok baku

= 0,05119 g/50 mL = 51,19 mg/50 mL = 1,0238 mg/mL

Konsentrasi 1 = 1,0 mL x 1,0238 mg/mL x

1 0,5 x x 102 mg/100mL 10 50

= 0,10238 mg/100mL = 1,0238 ppm Konsentrasi 2 = 2,0 mL x 1,0238 mg/mL x

1 0,5 x x 102 mg/100mL 10 50


1 0,5 x x 102 mg/100mL 10 50


1 0,5 x x 102 mg/100mL 10 50


1 0,5 x x 102 mg/100mL 10 50


1 0,5 x x 102 mg/100mL 10 50

= 0,61428 mg/100mL = 6,1428 ppm

62


Lampiran 12.

Hasil scanning λmaks konsentrasi phloroglucinol 1,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin-Ciocalteau

Lampiran 13.


63


Lampiran 14.


Lampiran 15.

Hasil pembacaan absorbansi seri baku phloroglucinol replikasi I

Konsentrasi (ppm) 1.0238 2.0476 3.0714 4.0952 5.1190 6.1428 A B r

λ (nm) 765,8 0.139 0.267 0.401 0.512 0.641 0.755 0.02120 0.12036 0.99966

746,5 0.137 0.269 0.403 0.518 0.649 0.767 0.01667 0.12293 0.99974

729,1 0.135 0.266 0.401 0.516 0.650 0.774 0.01080 0.12452 0.99983

750,1 0.138 0.269 0.405 0.516 0.648 0.768 0.01753 0.12274 0.99969

64


Lampiran 16.

Hasil pembacaan absorbansi seri baku phloroglucinol replikasi II


Lampiran 17.

λ (nm) 755,5 0.132 0.261 0.401 0.517 0.639 0.722 0.02533 0.11477 0.99741

750,1 0.132 0.257 0.407 0.514 0.643 0.712 0.02767 0.11381 0.99561

739,6 0.130 0.257 0.402 0.518 0.647 0.717 0.02307 0.11534 0.99608

725,7 0.131 0.257 0.404 0.519 0.649 0.714 0.02507 0.11493 0.99538

Hasil pembacaan absorbansi seri baku phloroglucinol replikasi III λ (nm)


750,1 0.121 0.238 0.379 0.542 0.602 0.720 0.00867 0.11952 0.99413

747,5 0.121 0.256 0.379 0.561 0.620 0.721 0.01560 0.12019 0.99181

745,1 0.123 0.239 0.381 0.544 0.603 0.725 0.00933 0.11994 0.99425

726,4 0.121 0.240 0.378 0.549 0.610 0.727 0.00640 0.12123 0.99399

65


Lampiran 18.

Data penimbangan sampel

Berat kaca arloji + fraksi Berat kaca arloji + sisa Berat fraksi

Lampiran 19.

Replikasi I 15,44613 g 15,39569 g 0,05044 g

Replikasi II 15,45166 g 15,40203 g 0,04963 g

Replikasi III 15,45148 g 15,40152 g 0,04996 g

Data absorbansi fraksi etil asetat alga coklat Sargassum

polyceratium Montagne

Replikasi (duplo) I.1 I.2 II.1 II.2 III.1 III.2

759,6 nm 0,281 0,290 0,275 0,267 0,275 0,299

Absorbansi pada λ 750,1 nm 745,9 nm 0,281 0,279 0,292 0,291 0,277 0,278 0,270 0,270 0,278 0,279 0,300 0,301

730,9 nm 0,278 0,290 0,278 0,270 0,278 0,300

66


Lampiran 20.

67

Contoh perhitungan kadar sampel

Keterangan : absorbansi sampel dibaca pada panjang gelombang 750,1 nm dan dihitung menggunakan persamaan kurva baku replikasi I yaitu y = 1,2274 x + 0,0175 Replikasi I duplo 1 y

= 0,281

y

= 1,2274 x + 0,0175

0,281 = 1,2274 x + 0,0175 x

=

0,281 − 0,0175 1,2274

= 0,2147 mg/100 mL = 2,147 x 10-3 mg/mL Kadar =

2,147 x10 −3 mg / mL 50 x x 50 mL 0,05044 g 10

= 10,6414 mg/g fraksi


BIOGRAFI PENULIS

Angela Woro Dwi Priharina, penulis skripsi berjudul “Penetapan Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum polyceratium Montagne dengan Metode Folin-Ciocalteau”, lahir di Klaten pada

tanggal 21 Januari 1987. Penulis adalah putri kedua pasangan Bapak Matheus Poniman dan Ibu Fransisca Christina Sri Suharni. Penulis menyelesaikan pendidikan di TK Pertiwi Granting, Jogonalan, Klaten pada tahun 1992, SD Negeri Granting 1, Jogonalan, Klaten pada tahun 1998, SLTP Pangudi Luhur 1 Klaten pada tahun 2001, dan SMA Negeri 1 Klaten pada tahun 2004. Penulis melanjutkan studi di Program S1 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2004 hingga 2008. Selama menjadi mahasiswi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Penulis pernah menjadi asisten Praktikum Kimia Dasar pada semester gasal 2007-2008 dan asisten Praktikum Farmakologi Dasar pada semester genap 2007-2008. Selain itu, Penulis juga pernah menjadi asisten fasilitator Pelatihan dan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa (PPKM) pada bulan Januari 2006 dan 2007. Penulis juga aktif dalam Unit Kegiatan Fakultas (UKF) Paduan Suara Fakultas Farmasi Veronika dan Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) Kerohanian.

68

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents