PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

OPTIMASI KOMPOSISI DAN KECEPATAN ALIR FASE GERAK METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK UNTUK PENETAPAN KADAR ASAM ASKORBAT DALAM SEDIAAN LARUTAN INJEKSI OBAT PEMUTIH KULIT MERK “X”

Skripsi

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Diajukan oleh: Eunike Lystia Florentien Kelana Jeversoon NIM : 12814025

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

i


ii


HALAMAN PENGESAHAN

iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Sometimes I just look up, smile and say, I know that was You, God! For You be glorified” I am able to do all things through the one who strengthens me - Philippians 4 : 13

Kupersembahkan karya tulisku ini untuk Tuhan Yesus Kristus yang aku tahu bahwa Ia yang selalu turut bekerja bersamaku hingga akhirnya, Papa Mama Cece dan Adik-adikku tercinta yang selalu menyemangati dan mendoakanku, sahabat-sahabatku yang selalu disampingku memberi penghiburan, dan almamaterku tercinta

iv


v


vi


PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas rahmat-Nya yang telah diberikan sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi berjudul “Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merk “X” dengan baik. Dalam penyelesaian skripsi ini, tentu penulis memperoleh campur tangan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. dan Dr. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. selaku Dekan dan Ketua Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2.

Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku Dosen Pembimbing Utama yang telah membimbing dan memberikan saran serta motivasi selama penyusunan skripsi.

3.

Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing Pendamping yang telah membimbing, dan memberikan saran serta motivasi selama penyusunan skripsi.

4.

Agustina

Setiawati,

M.Sc.,

Apt.,

selaku

Kepala

Penanggungjawab

Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam penggunaan fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian ini.

vii


5.

Mas Bimo dan Mas Kethul selaku laboran dan karyawan laboratorium Fakultas Farmasi yang telah membantu penulis dalam proses pelaksanaan penelitian di laboratorium.

6.

Keluargaku tercinta papa, mama, cece Regi, Sammy, dan Ezra yang selalu setia memberi semangat, perhatian, doa demi kelancaran studi dan penyusunan naskah skripsi.

7.

Teman-teman seperjuangan skripsi Petra Annie Anjani dan Rosalia Lestari atas segala kerjasama, bantuan dan semangat dalam penyusunan skripsi ini dari awal hingga akhir.

8.

Jonathan Wijaya Setiawan, Sina Susanti, Ludwina Dearesthea Onevita, Januaritha Dara Nastiandari, dan Prisca Nadya Verina Djala untuk kesetiaannya menemani, menghibur, membantu penyelesaian skripsi ini dari awal hingga akhir.

9.

Teman-teman FSM-A 2012, FST-A 2012 dan seluruh angkatan 2012.

10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan baik. Penulis berharap semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu Farmasi.

Penulis

viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ..........................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN.........................................................................

iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................

v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA . ...........

vi

PRAKATA ......................................................................................................... vii DAFTAR ISI ......................................................................................................

ix

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xviii INTISARI ........................................................................................................... xix ABSTRACT .........................................................................................................

xx

BAB I PENDAHULUAN ..................................................................................

1

A. Latar Belakang .......................................................................................

1

1. Rumusan Masalah ...........................................................................

3

2. Keaslian Penelitian ..........................................................................

4

3. Manfaat Penelitian...........................................................................

5

B. Tujuan Penelitian ....................................................................................

6

1. Tujuan Umum ..................................................................................

6

2. Tujuan Khusus .................................................................................

6

ix


BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................

7

A. Asam Askorbat .......................................................................................

7

B. Spektrofotometer UV .............................................................................

9

C. Larutan bufer ..........................................................................................

13

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ..........................................................

15

E. Landasan Teori .......................................................................................

25

F. Hipotesis .................................................................................................

26

BAB III METODE PENELITIAN.....................................................................

27

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................

27

B. Variabel Penelitian .................................................................................

27

1. Variabel bebas .................................................................................

27

2. Variabel tergantung .........................................................................

27

3. Variabel pengacau terkendali ..........................................................

27

C. Definisi Operasional ...............................................................................

28

D. Bahan Penelitian ...................................................................................

28

E. Alat Penelitian ........................................................................................

29

F. Tata Cara Penelitian ...............................................................................

29

1. Pembuatan asam fosfat 0,1 M ..........................................................

29

2. Pembuatan bufer fosfat 0,01 M ........................................................

29

3. Pembuatan fase gerak .......................................................................

30

4. Pembuatan larutan stok asam askorbat. ...........................................

30

5. Pembuatan larutan baku asam askorbat yang digunakan untuk penentuan panjang gelombang maksimum ......................................

x

30


6. Pembuatan larutan kerja asam askorbat yang digunakan untuk optimasi komposisi dan kecepatan alir fase gerak ...........................

30

7. Penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dengan spektrofotometer UV-Vis .................................................................

31

8. Preparasi larutan sampel ..................................................................

31

9. Optimasi pemisahan asam askorbat dari matriks sampel dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik ....................................

31

G. Analisis Hasil .........................................................................................

33

1.

Bentuk puncak pemisahan asam askorbat .......................................

34

2.

Waktu retensi ..................................................................................

34

3.

Nilai resolusi ...................................................................................

34

4.

Nilai HETP ......................................................................................

35

5.

Nilai koefisien variansi ...................................................................

35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................................

36

A. Pemilihan Pelarut ...................................................................................

36

B. Penentuan Fase Gerak ............................................................................

37

C. Larutan Baku ..........................................................................................

42

D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Askorbat Menggunakan Spektrofotometri UV-Vis .............................................

43

E. Optimasi Komposisi Fase Gerak ............................................................

45

F. Optimasi Kecepatan Alir Fase Gerak .....................................................

53

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................

64

A. Kesimpulan .............................................................................................

64

xi


B. Saran .......................................................................................................

64

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................

65

LAMPIRAN .......................................................................................................

67

xii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I.

Jenis bufer yang digunakan pada sistem KCKT fase terbalik .........

15

Tabel II. Indeks polaritas fase gerak campuran metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 .................................................................................................

41

Tabel III. Waktu retensi, nilai tailing factor dan nilai resolusi baku asam askorbat 100 µg/mL pada beberapa komposisi fase gerak pada kecepatan alir 1 mL/menit ...............................................................

46

Tabel IV. Waktu retensi, nilai tailing factor dan nilai resolusi baku asam askorbat 100 µg/mL pada komposisi metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 pada beberapa kecepatan alir...

54

Tabel V. Uji kesesuaian sistem asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL dengan fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dan kecepatan alir 0,9 mL/menit ............................................................

62

Tabel VI. Uji kesesuaian sistem asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL dengan fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dan kecepatan alir 0,9 mL/menit ............................................................

xiii

62


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur asam askorbat. .............................................................

7

Gambar 2.

Reaksi degradasi asam askorbat................................................

9

Gambar 3.

Skema eksitasi elektron.............................................................

11

Gambar 4.

Skema sistem KCKT.................................................................

15

Gambar 5.

Struktur kolom C18 ....................................................................

17

Gambar 6.

Perhitungan nilai As dan nilai Tf ...............................................

20

Gambar 7.

Kromatogram asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL tanpa menggunakan fase gerak mengandung bufer fosfat dengan kecepatan alir 1 mL/menit ........................................................

Gambar 8.

Kromatogram

asam

askorbat

konsentrasi

100

39

µg/mL

menggunakan fase gerak metanol : bufer fosfat pH 5,6 dengan kecepatan alir 1 mL/menit ........................................................ Gambar 9.

Kromatogram

asam

askorbat

konsentrasi

100

40

µg/mL

menggunakan fase gerak metanol : bufer fosfat pH 3 dengan kecepatan alir 1 mL/menit ........................................................

40

Gambar 10. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat .......................

44

Gambar 11. Spektra asam askorbat pada 3 seri konsentrasi .........................

44

Gambar 12. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan ..........

47

Gambar 13. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat .........................................................................................

xiv

47


Gambar 14. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL menggunakan komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 10 : 90 pada kecepatan alir 0,9 mL/menit ...................................................................................

49


50


51


52

Gambar 18. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL menggunakan komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 50 : 50 pada kecepatan alir 0,9 mL/menit ................................................................................... Gambar 19. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL menggunakan komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat

xv

53


pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 pada kecepatan alir 0,7 mL/menit ...................................................................................

55


56


57


58


59


xvi

60


Gambar 25. Kromatogram sampel larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” konsentrasi 100 µg/mL menggunakan komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 pada kecepatan alir 0,9 mL/menit ........................................

xvii

61


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Certificate of Analysis (CoA) baku asam askorbat. ..................

68

Lampiran 2. Penimbangan asam askorbat .....................................................

69

Lampiran 3. Perhitungan indeks polaritas fase gerak yang dioptimasi .........

69

Lampiran 4. Kromatogram asam askorbat pada Uji Kesesuaian Sistem (UKS) KCKT fase terbalik .......................................................

xviii

71


INTISARI Asam askorbat merupakan salah satu agen pemutih kulit yang paling sering digunakan di masyarakat Indonesia. Kemampuannya melindungi kulit dari radiasi UV mampu mencegah pembentukan melanin pada kulit. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kondisi optimal Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik sebagai metode yang digunakan dalam penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X”. Sistem KCKT fase terbalik menggunakan kolom Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm ukuran partikel 5µm dengan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak yaitu 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60; 50 : 50 dan kecepatan alir fase gerak yaitu 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1 dan 1,2 mL/menit menggunakan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 244 nm. Analisis hasil dilakukan dengan melakukan pengamatan terhadap nilai tailing factor, nilai resolusi, nilai koefisien variansi, HETP, area under curve (AUC), tinggi puncak dan waktu retensi asam askorbat hasil pemisahan. Kondisi optimum sistem KCKT fase terbalik yang diperoleh adalah fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40:60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit. Kondisi ini telah memenuhi parameter pemisahan yang baik yaitu nilai tailing factor 1,42 dan waktu retensi 3,03. Nilai koefisien variansi (% CV) yang diperoleh dari Uji Kesesuaian Sistem (UKS) untuk parameter tailing factor, HETP, AUC, tinggi puncak, dan waktu retensi secara berturut-turut adalah 0,36%, 0,47%, 0,05%, 0,23%, dan 0,04%. Kata kunci: Asam askorbat, obat pemutih kulit, optimasi metode, KCKT fase terbalik

xix


ABSTRACT Ascorbic acid is one of skin whitening agents which are most frequently used in Indonesia societies. Its ability to protect skin from UV radiation capables to inhibit the formation of melanin in human skin. This study aims to determine the optimum conditions of Reversed-Phase High Perfomance Liquid Chromatography which is used as a method to analyze the ascorbic acid in injection solution of skin whitening product with brand “X”. The RP-HPLC system uses Phenomenex® C18 column and the dimension is 250 x 4.6 mm. The size of the particle is 5 µm with methanol : 0.01 M phosphate buffer pH 3 as mobile phase. Optimization was done by varying the composition of mobile phase 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60; 50 : 50 and varying the flow rate of mobile phase 0.7; 0.8; 0.9; 1.0; 1.1 dan 1.2 mL/min using UV detector at 244 nm. The analysis of the result was carried out by observing the tailing factor value, resolution value, coefficient of variation value, HETP, area under curve (AUC), peak height, and retention time of ascorbic acid. The optimum condition of RP-HPLC which has been obtained is methanol : 0.01 M phosphate buffer pH 3 (40 : 60) as a mobile phase with flow rate 0.9 mL/min. These conditions have fulfilled the requirements of a good separation parameters which are 1.42 for tailing factor value and 3.03 for the retention time. Coefficient of variation (%CV) values which have been obtained from System Suitability Test (SST) for parameter of tailing factor, HETP, AUC, peak height, and retention time respectively were 0.36%, 0.47%, 0.05%, 0.23%, and 0.04%. Keyword: Ascorbic acid, whitening-skin product, optimization method, Reversed-Phase HPLC.

xx


BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Produk pemutih kulit sudah menjadi salah satu produk yang paling banyak dicari oleh masyarakat saat ini. Beberapa penelitian menunjukkan 55% dari 85% wanita Indonesia yang memiliki kulit gelap ingin memutihkan kulitnya (Saputri, 2011). Tujuan utama penggunaan produk pemutih kulit ini tidak lain adalah untuk mencerahkan kulit, baik dengan meratakan warna kulit maupun merawat kulit sehingga terhindar dari masalah pigmentasi seperti bintik-bintik hitam, melasma, tanda bekas hamil dan keriput. Beberapa agen pemutih kulit yang saat ini sering digunakan adalah arbutin, vitamin C (asam askorbat), kojic acid, licorice extract, burner root extract, scutellaria extract, dan mulberry (Thongchai dkk., 2007). Peranan asam askorbat sebagai agen pemutih kulit adalah dengan menghambat pembentukan melanin dengan meminimalkan kemampuan radiasi UV menginduksi sintesis melanin. Asam askorbat bertindak sebagai antioksidan dengan cara menetralkan radikal bebas yang terbentuk pada kompartemen air dalam sel (Hwang dkk., 2009). Asam askorbat bersifat tidak stabil terutama dalam bentuk larutan (Sihite, 2010). Asam askorbat mudah mengalami oksidasi menjadi bentuk asam dehidro

1


2

askorbat yang bereaksi secara reversibel dan asam dehidro askorbat dapat mengalami oksidasi lanjutan yang bereaksi secara ireversibel menjadi bentuk yang tidak aktif, yaitu asam diketoglukonat. Reaksi oksidasi dapat diinduksi oleh paparan cahaya, peningkatan suhu, peningkatan pH, oksigen dan katalis logam (Novakova dkk., 2008). Sifat asam askorbat tersebut dapat mempengaruhi jumlah asam askorbat dalam produk pemutih kulit. Menurut Undang-Undang RI No. 8 tahun 1999 tentang Perlindungan Konsumen, konsumen memiliki hak untuk memperoleh barang sesuai dengan yang kondisi atau jaminan yang telah dijanjikan dan pelaku usaha memiliki kewajiban untuk memberikan informasi terkait produk secara benar mengenai kondisi barang dan menjamin mutu barang yang diproduksi atau diperdagangkan sehingga konsumen menerima barang yang sesuai dengan kondisi sebenarnya. Jumlah asam askorbat yang tidak sesuai dengan yang tertera pada label dapat menurunkan efikasi produk pemutih kulit sehingga konsumen akan dirugikan. Menurut Farmakope Indonesia (1995), larutan injeksi asam askorbat yang dibuat mengandung asam askorbat tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada label. Oleh karena itu, perlu dilakukan penetapan kadar asam askorbat dalam produk pemutih kulit dengan bentuk sediaan larutan injeksi yang mengandung asam askorbat untuk menjamin efikasi produk. Pengembangan metode dilakukan melalui tiga tahapan, yaitu : optimasi metode, validasi metode dan aplikasi metode penetapan kadar (Suprianto, 2014). Sebelum melakukan penetapan kadar, perlu dilakukan tahapan optimasi pada metode analisis yang digunakan. Penelitian yang akan dilakukan peneliti adalah


3

optimasi pada sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik untuk mendapatkan kondisi yang optimal sehingga diperoleh hasil yang optimal yaitu pemisahan yang baik pada senyawa asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” yang akan ditetapkan kadarnya. Penggunaan metode KCKT fase terbalik menjadi pilihan utama dalam analisis asam askorbat dikarenakan metode ini memiliki selektivitas yang lebih baik dibandingkan metode lainnya seperti titrasi dan spektrofotometri (Solichova dkk., 2008) sehingga metode analisis yang dihasilkan dapat memberikan hasil pemisahan antara senyawa asam askorbat dengan produk degradasinya, yaitu asam dehidroaskorbat. Penelitian mengenai asam askorbat dengan metode KCKT fase terbalik sudah pernah dilakukan oleh Ullah, A., Hussain, A., Ali, J., Khaliqurrehman and Ullah, A. (2012) menggunakan panjang gelombang 300 nm, fase gerak campuran metanol dan bufer fosfat dengan perbandingan 20 : 80, pengaturan pH dilakukan dengan penambahan meta phosporic acid mencapai pH 3 ± 0,1 dan kecepatan alir fase gerak 1,0 mL/menit. Adanya perbedaan sistem KCKT melatarbelakangi perlunya dilakukan optimasi kondisi optimal suatu metode analisis agar diperoleh pemisahan optimal asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” sehingga dapat dilakukan analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. 1.

Rumusan masalah Bagaimana komposisi dan kecepatan alir fase gerak yang dapat

memberikan pemisahan dengan bentuk puncak simetris, waktu retensi (tR), nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, dan


4

nilai koefisien variansi yang optimal untuk pemisahan asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik ? 2.

Keaslian penelitian Pengembangan dan validasi metode kuantifikasi asam askorbat dengan

menggunakan metode KCKT fase terbalik pernah dilakukan oleh Ullah, A., Hussain, A., Ali, J., Khaliqurrehman and Ullah, A. (2012) dengan judul “A Simple and Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin-C in Local Packed Juices of Pakistan”. Penelitian tersebut menggunakan kolom Inertsil ODS-3 C18 (250 mm x 4,6 mm), fase gerak campuran metanol : bufer fosfat dengan perbandingan (20 : 80, v/v) pH 3 ± 0,1, dan kecepatan alir fase gerak 1,0 mL/menit untuk menganalisis asam askorbat dalam kemasan jus. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 300 nm. Penelitian lain mengenai asam askorbat dilakukan oleh Wang, A., Cheng, S., Sheu, C. And Kwan, C. (2011) dengan judul “Simultaneous Determination of Five Whitening Agents by Ion-Pair Reversed-Phase High Perfomance Liquid Chromatography”. Penelitian tersebut menggunakan kolom Inertsil ODS-3V (4,6 x 250 mm, 5µm), fase gerak campuran asetonitril : larutan bufer campuran (50 mM natrium dihidrogen fosfat dan 2 mM n-heksadesiltrimetil amonium bromida) dengan elusi gradien komposisi asetoniril : larutan bufer campuran (1 : 99, v/v) dari menit ke-0 sampai ke-20, (70 : 30, v/v) dari menit ke-21 sampai ke-40 dan (1 : 99, v/v) dari menit ke-41, pH 4,5, dan kecepatan alir fase gerak


5

1,0 mL/menit untuk menganalisis sediaan kosmetik lotion dan krim pemutih kulit. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 270 nm. Penelitian mengenai agen pemutih kulit juga dilakukan oleh Thongchai, W., Liawruangrath, B. and Saisunee L. (2007) dengan judul “High-Perfomance Liquid Chromatograpic Determination of Arbutin in Skin-Whitening Creams and Medicinal Plant Extracts” menggunakan kolom ODS Hypersil® C18 (125 mm x 4 mm, 5 µm), fase gerak campuran air : metanol : 0,1 M hydrochloric acid (89 : 10 : 1, v/v), dan kecepatan alir fase gerak 1,0 mL/menit. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 222 nm. Sejauh penelitian penulis, analisis asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik belum pernah dilakukan, sehingga dapat dilakukan optimasi sistem KCKT fase terbalik untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X”. 3.

Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis. Memberikan sumbangan bagi ilmu pengetahuan tentang pengembangan metode yang optimal dalam pemisahan dan penetapan kadar asam askorbat. b. Manfaat praktis. Memberikan informasi kondisi pemisahan asam askorbat yang optimal untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sampel produk pemutih kulit.


6

B. Tujuan 1.

Tujuan umum Mengetahui metode yang optimal dalam pemisahan dan penetapan kadar

asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” dengan metode KCKT fase terbalik. 2.

Tujuan khusus Mengetahui komposisi dan kecepatan alir fase gerak yang dapat

memberikan pemisahan dengan bentuk puncak, waktu retensi (tR), nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, dan nilai koefisien variansi optimal pada hasil pemisahan asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” dengan metode KCKT fase terbalik.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Asam Askorbat Asam askorbat (Gambar 1), secara kimia dikenal sebagai (2R)-2-[(1S)1,2-dihidroksietil]-4,5-dihidroksifuran-3-on merupakan senyawa berbentuk kristal tidak berwarna atau berbentuk serbuk kristal berwarna putih atau kuning pudar. Asam askorbat dengan rumus kimia C6H8O6 memiliki berat molekul

176,1

g/mol, nilai pKa = 4,2; 11,6 (pada suhu 25°C), dan nilai log P (oktanol : air) 1,8. Kelarutan dalam air 1 : 3, dalam etanol 1 : 30, dalam metanol 1 : 10 dan dalam propilen glikol 1 : 20. Asam askorbat dapat larut dalam aseton, tidak larut dalam benzena, kloroform, eter, petroleum eter, minyak, lemak, dan pelarut lemak (Moffat dkk., 2011). Asam askorbat bersifat fotosensitif dan mudah teroksidasi (Ahuja dan Dong, 2005). Nilai E1% asam askorbat adalah 556a pada pelarut asam, 1cm λ 243 nm (Moffat dkk., 2011).

Gambar 1. Struktur Asam askorbat (Moffat dkk., 2011)

Asam askorbat merupakan salah satu agen pemutih kulit yang paling sering digunakan (Thongchai dkk., 2007). Radiasi UV akan menstimulasi melanogenesis dengan mengaktivasi enzim tirosinase yang berperan sebagai oksidator dalam reaksi pembentukan melanin. Radiasi UV juga menginduksi 7


8

pembentukan reactive oxygen species (ROS). ROS berperan untuk memulai reaksi oksidasi selama proses pembentukan melanin. Asam askorbat menghambat pembentukan melanin dengan meminimalkan kemampuan sinar UV menginduksi sintesis melanin. Asam askorbat bertindak sebagai antioksidan dengan cara menetralkan radikal bebas yang terbentuk pada kompartemen air dalam sel (Hwang dkk., 2009). Dosis asam askorbat adalah 0,2-3 g per hari (Moffat dkk., 2011). Larutan injeksi asam askorbat adalah larutan steril asam askorbat dalam air untuk injeksi yang dibuat dengan penambahan natrium hidroksida/natrium karbonat/natrium bikarbonat. Sediaan larutan injeksi asam askorbat mengandung tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari 110% dari jumlah yang tertera pada label (Dirjen POM, 1995). Asam askorbat bersifat mudah teroksidasi terutama dalam bentuk larutan. Degradasi asam askorbat dipengaruhi oleh beberapa faktor luar seperti paparan cahaya, oksigen, peningkatan suhu, peningkatan pH, dan katalis logam. Asam askorbat mudah mengalami oksidasi menjadi bentuk asam dehidro askorbat yang bereaksi secara reversibel dan asam dehidro askorbat dapat mengalami oksidasi lanjutan yang bereaksi secara ireversibel menjadi bentuk yang tidak aktif, yaitu asam diketoglukonat. Reaksi degradasi asam askorbat dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini:


9

Gambar 2. Reaksi degradasi asam askorbat (Sihite, 2010).

B. Spektrofotometer UV 1.

Radiasi elektromagnetik dan penyerapan radiasi oleh molekul Sinar ultraviolet merupakan salah satu jenis radiasi elektromagnetik yang

memiliki suatu energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Panjang gelombang adalah jarak linier antara suatu titik pada satu gelombang dengan titik yang bersebelahan pada gelombang terdekatnya. Hubungan antara energi yang dimiliki suatu radiasi elektromagnetik, frekuensi, dan panjang gelombang suatu senyawa dapat dilihat dari persamaan berikut: E= Keterangan : E = Energi radiasi cahaya h = Tetapan planck (6,626 x 10-34 Joule) c = Kecepatan cahaya (2,998 x 1010 cm. s-1) λ = panjang gelombang

hc λ

(1)

(Rohman dan Gandjar, 2007).

Suatu molekul bergerak dari tingkat energi yang lebih tinggi menuju tingkat energi yang lebih rendah dengan melepaskan suatu energi yang sering dianggap sebagai radiasi. Dalam kata lain, kehilangan radiasi ini dapat disebut dengan emisi radiasi. Apabila suatu molekul dikenai oleh suatu radiasi


10

elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga menyebabkan energi molekul ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi absorpsi energi oleh molekul. Peristiwa absorpsi ini hanya dapat terjadi apabila terjadi kesetaraan antara perbedaan energi pada dua tingkat energi dengan jumlah energi foton yang diserap suatu molekul. Secara matematis, pernyataan tersebut dapat dinyatakan dengan persamaan di bawah ini:

(2)

E 2 − E1 = hυ Keterangan : E1 = Energi pada tingkat yang lebih rendah E2 = Energi pada tingkat yang lebih tinggi ʋ = frekuensi foton yang diabsorpsi


Energi yang melompat dari suatu tingkat ke tingkat lain disebut transisi. Transisi yang dimiliki oleh suatu molekul dengan struktur yang berbeda tidak sama sehingga spektra absorpsi dapat digunakan untuk analisis kualitatif. Absrobansi suatu senyawa pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan

untuk

analisis

kuantitatif.

Senyawa

analit

menjerap

radiasi

elektromagnetik di daerah panjang gelombang UV-Vis yang mengakibatkan tereksitasinya elektron ketingkat energi yang lebih tinggi (Gambar 3). Elektron akan tereksitasi dari ground state menuju excited state (Snyder dkk., 2010).


11

Gambar 3. Skema eksitasi elekron (Rohman dan Gandjar, 2007)

Molekul-molekul yang memerlukan energi yang lebih banyak untuk mengeksitasikan elektron maka akan menyerap panjang gelombang yang lebih pendek, sedangkan untuk molekul-molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit untuk mengeksitasikan elektron maka akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang (Fessenden and Fessenden, 1997). Jumlah energi yang diserap oleh molekul-molekul disebut absorban. Hukum Lambert-Beer menunjukkan bahwa absorbansi suatu senyawa dipengaruhi oleh absorptivitas molar, tebal kuvet dan konsentrasi molekul dalam senyawa analit (Rohman dan Gandjar, 2007). Hukum Lambert-Beer dapat dilihat melalui persamaan di bawah ini: A=ɛbc Keterangan : A = absorban ɛ = absorptivitas molar (M-1. cm-1) b = tebal kuvet (cm) c = konsentrasi molekul dalam senyawa analit

(3)


Absorptivitas molar merupakan suatu konstante yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan


12

sampel, tetapi tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi. Dikatakan sebagai absorptivitas molar apabila konsentrasi molekul zat analit dalam satuan Molar (M). Jika konsentrasi molekul zat analit berada dalam satuan persen berat/volume (g/100 mL), maka absorptivitas dapat ditulis dengan E1% (Rohman dan Gandjar, 2007). Hubungan antara E1% dengan 1cm 1cm absorptivitas molar (ɛ) dapat dilihat pada persamaan di bawah ini:

ε = E1% 1cm x

BM 10

(4)

Keterangan : ɛ = absorptivitas molar (M-1. cm-1)

E1% 1cm

BM

= absorptivitas molekul dalam satuan konsentrasi (g/100 mL) = bobot molekul (g/mol)


Nilai E1% memberikan manfaat untuk mengetahui berapa besar 1cm konsentrasi senyawa asam askorbat yang harus dipersiapkan sehingga diperoleh absorbansi pada kisaran 0,2-0,8. Selain itu, manfaat dari informasi nilai E1% 1cm adalah terkait dengan sensitivitas senyawa untuk diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Semakin besar nilai E1% suatu senyawa maka semakin sensitif senyawa 1cm 1% tersebut untuk dideteksi dan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Nilai E1cm

asam askorbat adalah 556a pada pelarut asam, λ 243 nm (Moffat dkk., 2011). Nilai tersebut dapat menunjukkan bahwa senyawa asam askorbat cukup sensitif dan dapat dideteksi dengan spektrofotometer UV-Vis. Nilai absorbtivitas molar asam askorbat adalah 9791,15 M-1. cm-1. Nilai tersebut menunjukkan bahwa asam askorbat akan mengalami transisi dan dapat diaplikasikan pada spektrofotometer


13

yang memiliki rentang panjang gelombang antara 200-700 nm (Rohman dan Gandjar, 2007). 2.

Gugus yang mempengaruhi penyerapan radiasi elektromagnetik Gugus kromofor merupakan suatu gugus atau atom dalam suatu senyawa

organik yang mampu menyerap radiasi sinar UV. Disamping itu, dalam suatu molekul organik terdapat suatu gugus auksokrom yang merupakan suatu gugus fungsional yang memiliki elektron bebas, seperti: -OH, -NH2, dan -OCH3. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor mampu menggeser pita absorpsi sehingga panjang gelombang yang dihasilkan akan lebih besar. Ikatan terkonjugasi adalah ikatan rangkap yang berselang-seling dengan ikatan tunggal dalam suatu struktur molekul senyawa. Adanya ikatan terkonjugasi dalam senyawa akan mempengaruhi panjang gelombang maksimalnya. Semakin panjang ikatan terkonjugasinya, maka akan semakin besar panjang gelombang maksimalnya (Rohman dan Gandjar, 2007).

C. Larutan Bufer Larutan bufer sering dipakai dalam analisis seperti penggunaanya sebagai fase gerak dalam sistem KCKT. Jenis bufer paling sederhana terdiri atas suatu asam atau basa lemah yang dikombinasikan dengan suatu asam atau basa konjugatnya (Rohman dan Gandjar, 2007). Larutan bufer (bufer) memiliki peranan penting dalam pemisahan senyawa asam ataupun basa dalam sistem KCKT. Penggunaan bufer dalam fase gerak sistem KCKT akan memberikan suatu nilai pH yang relatif konstan sehingga


14

waktu retensi senyawa selama proses pemisahan menjadi lebih reprodusibel. Faktor-faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan larutan bufer pada fase gerak sistem KCKT fase terbalik adalah nilai pKa asam lemah atau basa lemah, kapasitas bufer, kelarutan komponen bufer, absorbansi pada daerah UV, dan stabilitas bufer (Snyder dkk., 2010). Kapasitas bufer adalah kemampuan bufer untuk mempertahankan pH dan tergantung pada nilai pKa asam lemah atau basa lemah, konsentrasi bufer, dan pH fase gerak. Asam lemah atau basa lemah yang menyusun bufer hendaknya memiliki nilai pKa dalam rentang ±1,0 unit dari pH fase gerak yang diinginkan (Snyder dkk., 2010). Dalam sistem KCKT dengan detektor UV, penggunaan bufer dapat dikatakan ideal apabila memiliki absorban pada panjang gelombang di bawah 220 nm. Beberapa jenis bufer yang sering digunakan dalam sistem KCKT fase terbalik dapat dilihat pada tabel di bawah ini:


15

Tabel I. Jenis bufer yang digunakan pada sistem KCKT fase terbalik (Kazakevich and Lobrutto, 2007)

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 1.

Definisi dan instrumen KCKT Kromatografi cair kinerja tinggi adalah salah satu metode analisis untuk

pemisahan suatu campuran senyawa kimia. Penggunaan pompa bertekanan tinggi akan mengalirkan fase gerak ke dalam kolom sehingga akan terjadi pemisahan dengan cepat, terkontrol dan efektif. Baik buruknya pemisahan dipengaruhi oleh kondisi eksperimental seperti kondisi kolom, kemurnian pelarut, suhu, kecepatan alir fase gerak, komposisi fase gerak, dan sebagainya (Snyder dkk., 2010). Pemisahan pada sistem kromatografi terjadi akibat adanya interaksi antara zat


16

analit dengan fase diam dan fase gerak yang kemudian akan menghasilkan perbedaan waktu migrasi dari zat analit (Kazakevich and Lobrutto, 2007). Ada dua macam jenis kromatografi cair kinerja tinggi dalam analisis, yaitu KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik. KCKT fase normal adalah KCKT yang menggunakan fase diam bersifat lebih polar dibandingkan dengan fase geraknya, sedangkan KCKT fase terbalik adalah KCKT yang menggunakan fase diam bersifat lebih non-polar dibandingkan dengan fase geraknya (Snyder dkk., 2010). Sistem KCKT dapat diilustrasikan secara sistematik seperti pada Gambar 4 di bawah ini:

Gambar 4. Skema sistem KCKT (Snyder dkk., 2010)

Bagian-bagian dalam sistem KCKT fase terbalik, antara lain: a) Kolom Salah satu jenis kolom KCKT fase terbalik yang paling sering digunakan adalah kolom tipe C18. Kolom C18 (Gambar 5) tersusun oleh suatu penyangga silika gel (SiO2) dimana silika gel tersusun atas rantai -O-Si-O- dan pada bagian permukaan silika terdapat gugus-gugus hidroksil (-OH), oleh karena itu silika gel


17

relatif bersifat polar. Pada KCKT fase terbalik, modifikasi silika gel dilakukan dengan menutup gugus silanol (-SiOH) dengan suatu bagian organik yang umumnya adalah suatu hidrokarbon rantai panjang untuk menghilangkan gugus hidroksil melalui reaksi silanisasi. Semakin panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika maka akan semakin hidrofobik. Kebanyakan fase diam dengan penyusun silika memiliki rentang pH yang dapat ditoleransi, yaitu pH 2-7. Apabila di bawah pH 2, maka akan terjadi hidrolisis yang menyebabkan terjadinya pemutusan ikatan fase terikat dengan substrat silika. Apabila di atas pH 7, maka substrat silika akan terdisolusi sebagian dalam fase gerak yang polar. Salah satu dampak yang terlihat adalah terbentuknya puncak yang asimetris pada pH di atas 3 akibat adanya interaksi antara bentuk ion zat analit dengan residu silanol (Kazakevich and Lobrutto, 2007).

Gambar 5. Struktur kolom C18 (Snyder dkk., 2010))

b) Fase gerak Fase gerak atau eluen tersusun atas campuran pelarut yang saling bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam elusi zat analit dan resolusi dalam sistem KCKT. Daya elusi dan resolusi dipengaruhi oleh polaritas fase gerak, polaritas fase diam, dan sifat komponen analit. Pada sistem KCKT fase terbalik, kemampuan elusi akan menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut yang digunakan dalam fase gerak (Rohman dan Gandjar, 2007).


18

Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan fase gerak adalah kompatibilitas pelarut yang digunakan, kelarutan analit dalam fase gerak, polaritas fase gerak, transmisi cahaya, viskositas, stabilitas dan pH fase gerak (Kazakevich and Lobrutto, 2007). Kompatibilitas antar komponen fase gerak perlu diperhatikan supaya penyusun fase gerak dapat bercampur dengan baik. Campuran fase gerak harus dapat digunakan untuk melarutkan analit dengan baik. Apabila analit tidak terlarut sempurna pada fase gerak yang digunakan, maka analit akan mengendap ketika proses penginjekan dilakukan. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah transmisi cahaya dari fase gerak. Transmisi cahaya akan berkaitan erat dengan detektor UV yang digunakan. Setiap fase gerak memiliki UV-cutoff yang berbeda satu sama lain sehingga perlu diperhatikan ketika memilih komponen fase gerak. Perlu dipastikan bahwa UV-cutoff pelarut fase gerak yang digunakan tidak mengganggu deteksi analit pada detektor UV. Viskositas fase gerak perlu diperhatikan pula karena semakin besar viskosias fase gerak makan akan semakin besar tekanan dalam kolom sistem KCKT (Kazakevich and Lobrutto, 2007). Tingkat kepolaran fase gerak yang digunakan akan mempengaruhi elusi analit dalam sistem KCKT. Kepolaran campuran komponen penyusun fase gerak dapat dilihat dari nilai indeks polaritasnya. Indeks polaritas fase gerak dapat dihitung dengan menggunakan persamaan di bawah ini:

P' camp = φ1P'1 + φ2P'2 + ... + φnP' n Keterangan: P’camp = indeks polaritas campuran P’n = indeks polaritas pelarut ke-n ɸ = fraksi volume pelarut

(5)

(Gritter dkk., 1991).


19

Indeks polaritas menunjukkan korelasinya dengan kepolaran suatu pelarut fase gerak. Semakin besar nilai indeks polaritasnya maka semakin polar pelarut fase gerak yang digunakan (Snyder dkk., 2010). Sebagian besar senyawa obat yang berada di pasaran dapat terionisasi pada pH tertentu, sehingga diperlukan pengaturan pH pada fase gerak untuk mempertahankan kondisi pH fase gerak yang membawa analit agar analit tetap dalam bentuk molekulnya sampai detektor. Pengaturan pH dapat dilakukan dengan penggunaan larutan bufer dalam komponen penyusun fase gerak. Hal yang perlu diperhatikan ketika menggunakan bufer adalah tingkat kelarutan bufer dalam pelarut yang digunakan karena pemilihan jenis bufer yang salah akan mengakibatkan mengendap atau terpisahnya komponen bufer dalam fase gerak (Kazakevich and Lobrutto, 2007). c) Detektor Detektor yang digunakan untuk KCKT dapat digolongkan menjadi dua golongan, yaitu golongan detektor universal dan golongan detektor spesifik mendeteksi analit secara spesifik dan selektif. Detektor UV merupakan salah satu jenis detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif sesuai panjang gelombang yang digunakan. Dasar detektor UV adalah penyerapan radiasi UV pada kisaran panjang gelombang 200-400 nm oleh analit yang memiliki gugus kromofor pada strukturnya. Beberapa karakteristik detektor adalah memiliki respon yang cepat dan reprodusibel terhadap analit, memiliki sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasiannya dan signal yang dihasilkan


20

berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam sampel (Rohman dan Gandjar, 2007). 2.

Pemisahan yang optimal pada sistem KCKT a.

Bentuk puncak pemisahan asam askorbat. Bentuk puncak yang diharapkan adalah simetris. Parameter bentuk puncak adalah asymmetry factor (As) dan tailing factor (Tf). Nilai asymmetry factior (As) dihitung pada 10% tinggi puncak. Perhitungan As dapat dilakukan dengan persamaan yang tercantum pada Gambar 5. Apabila nilai As = 1, maka dapat dikatakan puncak yang dihasilkan simetri. Akan tetapi, pada nilai As < 2 puncak juga masih dikatakan baik (Snyder dkk., 2010). Tailing factor (Tf) merupakan rasio antara lebar setengah tinggi puncak. Nilai Tf = 1 menunjukkan bahwa puncak simetris, sedangkan nilai Tf ˃ 1 menunjukkan bahwa puncak mengalami tailing. Semakin besar nilai Tf maka efisiensi kolom semakin menurun. Tailing factor (Tf) dapat dihitung melalui persamaan yang tercantum pada Gambar 6 berikut:

Gambar 6. Perhitungan nilai As dan nilai Tf (Snyder dkk., 2010)

Pada saat migrasi, analit mengalami transfer antara fase diam atau fase gerak berkali-kali. Analit hanya dapat bergerak bila berada dalam fase gerak,


21

maka migrasi dalam kolom menjadi tidak teratur. Akibatnya, laju rata-rata analit relatif terhadap fase gerak sangat bervariasi dan menyebabkan pelebaran puncak analit. Berdasarkan teori laju, pelebaran puncak analit disebabkan oleh 3 faktor yang dapat diuraikan sebagai berikut: 1) Difusi Eddy Difusi Eddy merupakan aliran tidak teratur yang menyebabkan terjadinya pencampuran konvektif. Hal ini disebabkan oleh perbedaan jarak yang harus dilalui molekul yang satu dengan yang lain. Perbedaan jarak yang dilalui oleh molekul yang satu dengan yang lain disebabkan oleh perbedaan bentuk, ukuran partikel pengisi kolom, cara pengisian kolom, dan diameter kolom. Perbedaan tersebut mengakibatkan perbedaan waktu elusi molekul-molekul dari kolom. Suatu molekul solut dapat bergerak melalui kolom dekat dinding kolom yang memiliki kerapatan kemas partikel fase diam yang rendah, sehingga molekul tersebut dengan cepat akan terelusi. Berbeda dengan molekul solut yang melalui bagian tengah kolom yang memiliki kerapatan kemas partikel fase diam yang tinggi, solut akan terelusi dengan kecepatan yang lebih rendah. Hal inilah yang menyebabkan pelebaran puncak untuk tiap analit. Cara memperkecil efek ini adalah menggunakan fase diam yang memiliki partikel berdiameter kecil, diameter kolom kecil, pengemasan kolom yang rapat dan homogen (Rohman dan Gandjar, 2007).


22

2) Difusi longitudinal Analit ketika berada dalam fase gerak melewati fase diam menyebar ke segala arah secara difusi, baik dengan arah yang sama maupun berlawanan dengan aliran fase gerak sehingga akan menghasilkan bentuk puncak yang melebar simetris. Difusi longitudinal merupakan efek dari gerakan random molekul analit dalam fase gerak karena adanya perbedaan konsentrasi. Ketika melintasi kolom, molekul-molekul akan berdifusi menyebar ke segala arah. Difusi ini dapat terjadi di sepanjang kolom, baik pada fase gerak maupun fase diam. Akibatnya bentuk puncak analit yang semula sempit, dengan adanya difusi ke dalam fase gerak di sekelilingnya, akan melebarkan profil puncak. Efek ini dapat diperkecil dengan menggunakan fase gerak yang bobot jenisnya lebih tinggi dengan kecepatan linier aliran ditingkatkan (Rohman dan Gandjar, 2007). 3) Transfer massa Pengaruh transfer massa ini terjadi antara fase diam dengan fase gerak. Proses transfer massa tidak terjadi secara instan melainkan terjadi secara lambat dalam hal kinetikanya. Fase gerak mengalir secara terus menerus mengakibatkan distribusi kesetimbangan analit dalam fase diam dan fase gerak tidak pernah ada. Konsentrasi analit pada fase diam yang tertinggal sebenarnya lebih sedikit dibandingkan dengan konsentrasi analit pada fase gerak sehingga akan terbentuknya pelebaran puncak (Rohman dan Gandjar, 2007).


23

Beberapa penyebab terjadinya puncak asimetris antara lain: 1) Konsentrasi analit terlalu besar yang membuat fase gerak tidak mampu membawa analit dengan sempurna sehingga akan terbentuk tailing pada puncak yang dihasilkan. 2) Adanya interaksi yang kuat antara analit dengan fase diam sehingga analit sulit terelusi dari kolom dan membuat terbentuknya tailing pada puncak. 3) Terdapat kontaminan dalam sampel sehingga akan muncul suatu puncak didepan puncak analit yang membuat terbentuknya fronting pada puncak (Rohman dan Gandjar, 2007). b.

Waktu retensi (tR). Waktu retensi merupakan waktu yang dibutuhkan suatu analit untuk melewati kolom. Waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k’) dihubungkan dengan persamaan: tR = tM (l + k’)

(6)

tM merupakan waktu yang dibutuhkan analit yang tidak tertahan untuk melewati kolom. Analit yang tidak tertahan akan bermigrasi melewati kolom dengan kecepatan yang sama dengan kecepatan fase gerak, sehingga nilai faktor retensinya adalah nol (tR = tM). Analit yang mempunyai nilai k’ > 0 akan tertahan secara proporsional dan menghasilkan waktu retensi yang lebih besar daripada tM (Gandjar dan Rohman, 2007). c.

Resolusi (Rs). Resolusi adalah indikator pemisahan dua puncak yang berdekatan. Pemisahan yang baik adalah pemisahan yang menghasilkan nilai Rs ≥ 1,5. Hubungan antara waktu retensi analit (tR) dengan lebar puncak (W) dinyatakan dalam persamaan berikut:


24

Rs =

t R2 − t R1 0,5(W2 + W1 )

Dimana : tR1 dan tR2 = waktu retensi komponen W1 dan W2 = lebar alas puncak komponen

d.

(7) (Snyder dkk., 2010).

Efisiensi kolom. Salah satu yang menjadi tolok ukur efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis. Efisiensi kolom akan berpengaruh pada waktu retensi analit. Semakin tinggi jumlah lempeng teoritis maka semakin baik pula efisiensi kolom (Snyder dkk., 2010). Nilai Height Equivalent Theoritical Plate (HETP) merupakan tolok ukur efisiensi kolom, dimana HETP dapat dihitung melalui persamaan berikut:

HETP =

L N

(8)

Dimana : L = panjang kolom N = jumlah lempeng

dimana nilai N merupakan bilangan lempeng teoritik dan dapat dihitung dengan persamaan berikut:

⎛ ⎞ tR ⎟ ⎜ N = 5,54 x ⎜ ⎜ W1 h ⎟⎟ ⎝ 2 ⎠

2

(9)

Dimana : tR = waktu retensi analit W 1 = lebar puncak pada posisi setengah tinggi puncak 2

h

Nilai HETP berbanding terbalik dengan jumlah lempeng teoritis (N). Dengan begitu, semakin tinggi nilai N makan semakin kecil nilai HETP dan semakin efisien kolom yang digunakan (Snyder dkk., 2010).


25

E. Landasan Teori Asam askorbat merupakan salah satu senyawa yang digunakan sebagai agen pemutih kulit. Jumlah asam askorbat dalam produk pemutih kulit perlu untuk dipastikan kebenarannya dengan klaim label agar konsumen tidak dirugikan. Sifat asam askorbat yang mudah terdegradasi oleh paparan cahaya, peningkatan suhu, peningkatan pH, oksigen dan katalis logam merupakan salah satu penyebab ketidaksesuaian jumlah asam askorbat dalam produk dengan klaim label. Dalam penelitian ini, asam askorbat yang akan diteliti berada dalam sampel larutan injeksi obat pemutih kulit. KCKT dapat digunakan untuk melakukan pemisahan asam askorbat dari sampel larutan injeksi obat pemutih kulit. Pemisahan yang dilakukan dengan KCKT merupakan pemisahan yang berdasarkan tingkat kepolaran dan interaksi analit dengan fase gerak dan fase diam pada metode KCKT ini. Analit yang sudah dipisahkan dengan KCKT akan dideteksi oleh detektor UV karena asam askorbat memberikan absorban pada panjang gelombang UV. Asam askorbat memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada struktur sebagai syarat senyawa yang dapat dideteksi dengan detektor UV. Nilai E1% asam askorbat adalah 556a pada pelarut 1cm asam, λ 243 nm. Nilai tersebut menunjukkan bahwa senyawa asam askorbat cukup sensitif dan dapat dideteksi dengan detektor UV. Nilai absorbtivitas molar asam askorbat adalah 9791,15 M-1. cm-1. Nilai tersebut menunjukkan bahwa asam askorbat akan mengalami transisi π → π * . Jenis transisi ini merupakan transisi yang cocok untuk analisis pada rentang panjang gelombang antara 200-400 nm dan dapat diaplikasikan pada spektrofotometer.


26

Sistem KCKT fase terbalik yang optimal diperlukan untuk melakukan penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit, sehingga di penelitian ini dilakukan optimasi sistem KCKT fase terbalik untuk mendapatkan metode KCKT fase terbalik yang mampu memisahkan asam askorbat dari matriks sampel secara optimal. Variabel yang akan dioptimasi dalam penelitian ini adalah komposisi dan kecepatan alir fase gerak. Variasi perbandingan fase gerak dan kecepatan alir fase gerak dilakukan untuk melihat perbandingan berapa yang akan memberikan pemisahan optimal. Parameter optimasi yang harus dipenuhi adalah bentuk puncak, nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, nilai koefisien variansi dari nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, tailing factor, HETP, area under curve (AUC) dan waktu retensi asam askorbat.

F. Hipotesis Metode KCKT fase terbalik detektor UV dengan komposisi dan kecepatan alir fase gerak yang optimal dapat memberikan pemisahan dengan bentuk puncak simetris yaitu nilai tailing factor < 2, waktu retensi (tR) kurang dari 10 menit, nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain > 1,5, dan nilai koefisien variansi ≤ 2% sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X”.


BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian yang dilakukan ini merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental analitik karena pada subjek uji diberikan perlakuan yaitu komposisi dan kecepatan alir fase gerak.

B. Variabel Penelitian 1.

Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah perbandingan komposisi fase

gerak yaitu metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 dan kecepatan alir fase gerak yang digunakan. 2.

Variabel tergantung Variabel tergantung pada penelitian ini adalah pemisahan puncak dari

asam askorbat dari matriks sampel yang terlihat dari asymmetry factor, tailing factor, nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, nilai koefisien variansi, HETP, area under curve (AUC) dan waktu retensi asam askorbat hasil pemisahan. 3.

Variabel pengacau terkendali a. Kemurnian pelarut yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan pelarut yang memiliki kemurnian tinggi yaitu pelarut pro analysis.

27


28

b. Kemurnian bahan baku yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan bahan baku yang telah terjamin kualitasnya dengan adanya Certificate of Analysis (CoA).

C. Definisi Operasional 1.

Asam askorbat merupakan salah satu agen pemutih kulit yang terdapat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X”.

2.

Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT menggunakan jenis kolom C18 merek Phenomenex® (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm), dengan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3

3.

Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak dan kecepatan alir fase gerak.

4.

Parameter optimasi dengan menggunakan metode KCKT adalah bentuk puncak, waktu retensi, nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lainnya dan reprodusibilitas luas area dan waktu retensi.

D. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah reference standard asam askorbat (Supelco), metanol grade HPLC, asam fosfat 85% dan kalium fosfat monohidrat (p.a E.Merck), akua demineralisata (PT.Bratacho), penyaring


29

Whatman 0,45µm, dan produk pemutih kulit merk “X” yang diperoleh dari online shop “Y”. E. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat KCKT dengan

detektor

ultraviolet,

Shimadzu

LC-2010C,

kolom

C18

merek

Phenomenex® (dimensi 250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm), seperangkat komputer (merek Dell B6RDZ1S Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625730), UV-Vis Spechtrophotometer SP-3000plus merek OPTIMA dengan detektor silicon photo diode, milipore, ultrasonikator Refsch, Tipe : T460 (Schwing 1 PXE, FTZ-Nr. C066/83, HF-Frequ:35 kHz), timbangan analitik SCALTEC (max 60/210 g, min 0,001 g), alat vakum GAST, dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.

F. Tata Cara Penelitian 1.

Pembuatan asam fosfat 0,1 M Larutan pekat H3PO4 dengan konsentrasi 85% diambil sejumlah 0,3 mL,

kemudian diencerkan dalam akua demineralisata 25,0 mL sehingga konsentrasi H3PO4 menjadi 0,1 M. 2.

Pembuatan bufer fosfat 0,01 M Sejumlah 0,68 g KH2PO4 ditimbang seksama dan dilarutkan dalam akua

demineralisata hingga 500,0 mL sehingga konsentrasi menjadi 0,1 M, kemudian pH diatur dengan penambahan asam fosfat 0,1 M hingga mencapai pH 3.


30

3.

Pembuatan fase gerak Fase gerak dibuat dengan mencampur antara metanol dan 0,01 M bufer

fosfat pH 3 dengan perbandingan 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60; dan 50 : 50 oleh sistem KCKT. Sebelumnya masing-masing fase gerak tersebut disaring dengan penyaring Whatman 0,45 µm yang dibantu dengan pompa vakum kemudian didegassing selama 15 menit menggunakan ultrasonicator. 4.

Pembuatan larutan stok asam askorbat Sejumlah 4,0 mg asam askorbat ditimbang seksama dan dilarutkan dalam

fase gerak hingga 10,0 mL sehingga konsentrasi menjadi 400 µg/mL. 5.

Pembuatan larutan baku asam askorbat yang digunakan untuk penentuan panjang gelombang maksimum Dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 40; 50; dan 60

µg/mL dengan mengencerkan 1,0; 1,25; dan 1,5 mL larutan stok menggunakan fase gerak hingga 10,0 mL. 6.

Pembuatan larutan kerja asam askorbat yang digunakan untuk optimasi komposisi dan kecepatan alir fase gerak Sejumlah 2,5 mL larutan stok asam askorbat dengan konsentrasi

400 µg/mL diambil dan diencerkan dalam fase gerak 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan 100 µg/mL. Larutan disaring dengan menggunakan milipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit.


31

7.

Penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dengan spektrofotometer UV-Vis Masing-masing konsentrasi larutan seri baku asam askorbat 40; 50; dan

60 µg/mL dengan pelarut fase gerak, discan antara panjang gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Spektrum yang dihasilkan akan menunjukkan panjang gelombang maksimum yang akan digunakan untuk deteksi pada sistem KCKT yaitu panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi maksimum dari ketiga konsentrasi tersebut. 8.

Preparasi larutan sampel Sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” yang mengandung

200 mg/mL asam askorbat (klaim label), diambil sejumlah 50 µL dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan fase gerak sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan stok sampel yang memiliki konsentrasi asam askorbat 1000 µg/mL. Kemudian diambil sejumlah 2,0 mL larutan stok sampel dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan fase gerak sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan sampel yang memiliki konsentrasi asam askorbat 100 µg/mL. Larutan sampel disaring dengan menggunakan milipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit. 9.

Optimasi pemisahan asam askorbat dari matriks sampel dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik a.

Optimasi komposisi fase gerak. Larutan kerja asam askorbat dengan konsentrasi 100 µg/mL diinjeksikan sejumlah 20 µL ke sistem KCKT. Optimasi dilakukan pada panjang gelombang maksimum dengan


32

menggunakan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60; dan 50 : 50 pada kecepatan alir fase gerak 1,0 mL/menit. Dilakukan analisis hasil terhadap parameter nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, waktu retensi dan nilai tailing factor dari berbagai perbandingan fase gerak. b.

Optimasi kecepatan alir fase gerak. Larutan kerja asam askorbat dengan konsentrasi 100 µg/mL diinjeksikan sejumlah 20 µL ke sistem KCKT. Optimasi dilakukan pada panjang gelombang maksimum dengan menggunakan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan hasil optimasi pada kecepatan alir fase gerak 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; dan 1,2 mL/menit. Dilakukan analisis hasil terhadap parameter nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, waktu retensi dan nilai tailing factor dari berbagai kecepatan alir fase gerak.

c.

Pemisahan asam askorbat dari matriks larutan sampel dengan fase gerak hasil optimasi. Larutan sampel dengan konsentrasi 100 µg/mL diinjeksikan sejumlah 20 µL ke sistem KCKT. Pengamatan dilakukan menggunakan komposisi dan kecepatan alir fase gerak hasil optimasi serta pada panjang gelombang maksimum yang telah ditentukan. Kromatogram yang dihasilkan diamati dan dihitung parameter uji kesesuaian sistem yang meliputi nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak senyawa lain, luas puncak asam askorbat, nilai


33

N dan HETP dari pemisahan asam askorbat dari matriks pada larutan sampel. d. Uji kesesuaian sistem KCKT. Larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 100 µg/mL diinjeksikan sebanyak 20 µL ke sistem KCKT menggunakan fase gerak dan kecepatan alir fase gerak hasil optimasi. Penginjekan larutan ini dilakukan sebanyak 6 kali. Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang maksimum dan kemudian diamati kromatogram asam askorbat hasil pemisahan dan dihitung nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, waktu retensi, nilai k’, nilai tailing factor, area under curve (AUC), tinggi puncak, nilai N dan HETP, serta % koefisien variansi pada masing-masing parameter tersebut.

G. Analisis Hasil Hasil optimasi komposisi fase gerak dan kecepatan alir fase gerak tertentu menghasilkan data kromatogram. Pemisahan asam askorbat dari matriks sampel paling baik dapat diketahui dengan melihat baik data kromatogram baku maupun kromatogram sampel dan melakukan pengamatan terhadap nilai resolusi antara puncak asam askorbat dengan puncak terdekat senyawa lain, waktu retensi, nilai k’, nilai tailing factor, AUC, tinggi puncak, nilai N dan HETP, serta perhitungan % koefisien variansi pada masing-masing parameter tersebut.


34

Pemisahan yang baik adalah pemisahan yang menghasilkan bentuk puncak simetris, waktu retensi < 10 menit, memiliki nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap puncak terdekat, dan nilai koefisien variansi (% CV) ≤ 2% (Snyder dkk., 2010). 1.

Bentuk puncak pemisahan asam askorbat Bentuk puncak yang diharapkan adalah simetris. Parameternya adalah

asymmetry factor (As) dan tailing factor (Tf). Nilai asymmetry factior (As) dihitung pada 10% tinggi puncak dan nilai tailing factor (Tf) dihitung pada 5% tinggi puncak. Perhitungan As dan Tf dapat dilakukan dengan persamaan yang tercantum pada Gambar 6. Apabila nilai As dan Tf = 1, maka dapat dikatakan puncak yang dihasilkan simetris. Akan tetapi, pada nilai As dan Tf < 2 puncak juga masih dikatakan baik (Snyder dkk., 2010). 2.

Waktu retensi (tR) Pengamatan waktu retensi dilakukan untuk melihat waktu yang

dibutuhkan suatu senyawa berpisah dengan optimal dalam suatu campuran. Apabila waktu yang didapatkan kurang dari 10 menit, maka dapat dikatakan waktu pemisahan efektif (Snyder dkk., 2010). 3.

Nilai resolusi (Rs) Nilai resolusi pemisahan puncak dapat dihitung dengan persamaan

berikut: Rs = Dimana : tR1 dan tR2 W1 dan W2

t R2 − t R1 0,5(W2 + W1 )

= waktu retensi komponen = lebar alas puncak komponen


35

Pemisahan yang baik adalah pemisahan yang menghasilkan nilai resolusi sebesar ≥1,5 (Rohman dan Gandjar, 2007). 4.

Nilai HETP Nilai HETP dapat dihitung melalui persamaan berikut:

HETP = Dimana : L N

L N

= panjang kolom = jumlah lempeng

dimana nilai N merupakan bilangan lempeng teoritik dan dapat dihitung dengan persamaan berikut:

⎛ ⎞ tR ⎟ ⎜ N = 5,54 x ⎜ ⎜ W1 h ⎟⎟ ⎝ 2 ⎠ Dimana : tR

W1

2

h

2

= waktu retensi analit = lebar puncak pada posisi setengah tinggi puncak

Apabila nilai HETP semakin kecil, maka efisiensi kolom akan semakin baik dan pemisahan juga semakin baik. 5.

Nilai koefisien variansi Nilai koefisien variansi resolusi, tailing factor, HETP, AUC dan waktu

retensi asam askorbat hasil pemisahan diketahui dengan menghitung nilai % CV dengan menggunakan persamaan berikut:

%CV = Dimana : SD

x

= standar deviasi data = rata-rata jumlah data

SD x


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pemilihan Pelarut Pemilihan pelarut dalam analisis menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) menjadi penting karena analit harus terlarut dalam pelarut sebelum masuk ke sistem KCKT. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam askorbat adalah campuran fase gerak metanol dan bufer fosfat 0,01 M yang dominan mengandung akua demineralisata. Asam askorbat dapat terlarut dalam akua demineralisata dan metanol. Kelarutan asam askorbat dalam air pada suhu 20°C adalah 290 g/L dan kelarutan dalam metanol adalah 125 g/L (International Œnological Codex, 2007). Syarat pemilihan pelarut adalah dapat melarutkan analit dengan baik, tidak berinteraksi dengan analit dan tidak toksik. Akua demineralisata merupakan jenis pelarut air yang bebas mineral. Proses mendapatkan akua demineralisata adalah dengan melewatkan air mineral yang mengandung ion melalui suatu kolom resin sehingga mineral yang ada akan tertahan pada kolom resin (Falah dkk., 2009). Degradasi asam askorbat akan meningkat dengan adanya ion logam transisi seperti Cu2+ dan Fe3+. Menurut Khan dan Sarwar (1999), ion Cu2+, Fe3+, Cr6+, Mn2+ dan V5+ mampu meningkatkan kecepatan reaksi degradasi asam askorbat pada suhu ruang 25°C. Kandungan trace metal dalam akua demineralisata sangat kecil (Soen dkk., 1966) sehingga penggunaan akua demineralisata diharapkan dapat meminimalkan risiko degradasi asam askorbat oleh trace metal.

36


37

B. Penentuan Fase Gerak Berdasarkan polaritas fase diam dan fase gerak, metode KCKT yang digunakan merupakan metode KCKT fase terbalik karena fase diam yang digunakan yaitu oktadesilsilan (C18) yang bersifat non polar sedangkan fase gerak bersifat lebih polar dibanding fase diam. Fase gerak yang paling sering digunakan dalam penelitian menggunakan sistem KCKT fase terbalik adalah campuran air dengan pelarut organik seperti asetonitril dan metanol. Fase gerak yang dipakai untuk sistem KCKT fase terbalik adalah pelarut organik yang bersifat mudah bercampur dengan air, viskositas relatif rendah, stabil di bawah kondisi yang digunakan. Jenis pelarut organik yang paling sering dan disarankan berturut-turut adalah asetonitril, metanol, dan paling jarang digunakan adalah tetrahidrofuran (Snyder dkk., 2010). Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dengan bufer fosfat 0,01 M pada pH 3. Sistem elusi fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah isokratik karena menggunakan campuran fase gerak dengan perbandingan tetap sehingga polaritas fase gerak tetap selama proses elusi berlangsung. Eluent strength (ε°) merupakan salah satu hal yang perlu diperhatikan ketika memilih suatu pelarut dalam fase gerak. Eluent strength adalah kemampuan pelarut organik untuk mengelusi suatu analit. Semakin besar nilai eluent strength maka semakin besar kemampuan elusinya. Semakin besar nilai ε° maka semakin besar risiko terjadinya tumpang tindih antara puncak dua analit yang memiliki waktu retensi yang berdekatan. Akan tetapi, semakin kecil nilai ε°


38

maka fase gerak akan lebih sulit untuk mengelusi analit. Metanol memiliki nilai ε° = 1,0 sedangkan asetonitril memiliki nilai ε° = 3,1 pada kolom C18. Apabila dilihat dari nilai ε° menunjukkan kemampuan elusi asetonitril untuk mengelusi analit lebih besar dari pada metanol. Namun, asetonitril tidak digunakan sebagai komposisi fase gerak dikarenakan biaya yang dibutuhkan terlalu mahal. Selain itu, dengan menggunakan pelarut metanol, asam askorbat sudah dapat terelusi dengan baik dalam sistem KCKT yang digunakan. Oleh karena itu, untuk meningkatkan efisiensi biaya dalam penelitian ini dipilih pelarut metanol sebagai komponen fase gerak. Bufer fosfat merupakan salah satu komponen fase gerak yang digunakan. Bufer fosfat mempunyai nilai pKa 2,1; 7,2 dan 12,3 dengan rentang pH berturutturut adalah 1,1-3,1; 6,2-8,2; dan 11,3-13,3 (Supelco, 2001). Rentang pH tersebut menunjukkan kapasitas bufer fosfat, yaitu kemampuan untuk mempertahankan pH secara efektif. Suatu larutan asam askorbat 5% dalam air memiliki pH 2,1 - 2,6, pH 10% larutan kalsium askorbat dalam air adalah antara 6,8 dan 7,4 dan pH larutan natrium askorbat dalam air antara 7,0 dan 8,0. Stabilitas maksimum terjadi dekat pH 3 dan pH 6 (Sihite, 2010). Asam askorbat cukup stabil dalam larutan dengan pH rendah seperti 2 atau 3 dengan anggapan bahwa tidak ada ion logam transisi dalam larutan. Peningkatan pH fase gerak menjadi > nilai pKa asam askorbat yaitu 4,2 akan meningkatkan terbentuknya ion asam askorbat (AscH-) yang berakibat pada stabilitas asam askorbat dalam larutan menurun (Buettner and Jurkiewics, 1996). Pada penelitian ini digunakan pH 3 dengan pertimbangan stabilitas larutan asam askorbat dalam sistem KCKT yang digunakan. Pada saat


39

orientasi, dilakukan pengukuran dengan menggunakan fase gerak tanpa mengandung bufer, mengandung bufer fosfat pH 3 dan bufer fosfat pada pH 5,6. Akan tetapi, hasil puncak kromatogram yang diperoleh dari penggunaan fase gerak tanpa bufer dan bufer pH 5,6 terpecah menjadi beberapa bagian dan bentuk puncak yang tidak baik (Gambar 7 dan 8). Berbeda dengan puncak kromatogram yang dihasilkan dengan menggunakan bufer fosfat pH 3 (Gambar 9). Oleh sebab itu, perlu digunakan bufer untuk mempertahankan pH selama berada dalam sistem KCKT tetap pada rentang pH stabil larutan asam askorbat sehingga menghasilkan waktu retensi asam askorbat yang tetap dan meminimalkan terjadinya kerusakan asam askorbat akibat perubahan pH.

Gambar 7. Kromatogram asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut: Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : air (40 : 60) Kecepatan alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm


40

Gambar 8. Kromatogram asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut: Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat pH 5,6 (40 : 60) Kecepatan alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm

Gambar 9. Kromatogram asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut: Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm

Selain kapasitas bufer, UV-cutoff merupakan hal lain yang perlu diperhatikan dalam pemilihan bufer. UV-cutoff adalah panjang gelombang suatu pelarut yang dapat memberikan absorbansi lebih dari 1,0 satuan absorbansi pada


41

kuvet yang memiliki tebal 1 cm (Rohman dan Gandjar, 2007). Bufer fosfat memiliki nilai UV-cutoff di bawah 200 nm (Supelco, 2001), sedangkan metanol memiliki UV-cutoff 205 nm (Rohman dan Gandjar, 2007). Apabila pengukuran analit dilakukan pada panjang gelombang UV-cutoff pelarut yang digunakan maka akan terjadi kekacauan hasil sehingga hasil data menjadi bias. Panjang gelombang yang digunakan dalam penelitian ini adalah 244 nm sehingga tidak terjadi bias data akibat UV-cutoff. Evaluasi polaritas fase gerak yang digunakan dapat dilihat dengan menggunakan parameter indeks polaritas (P’). Komposisi fase gerak yang digunakan pada penelitian ini adalah metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 dengan perbandingan 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; dan 50:50. Menurut Mulja dan Suharman (1995), semakin besar nilai indeks polaritas campuran fase gerak, maka semakin polar fase gerak yang digunakan. Indeks polaritas fase gerak yang digunakan untuk masing-masing komposisi dapat dilihat pada tabel II di bawah ini: Tabel II. Indeks polaritas fase gerak campuran metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 (Snyder dkk., 2010)

No. 1. 2. 3. 4. 5.

10 20 30 40 50

Komposisi Fase Gerak Metanol Bufer fosfat 0,01 M pH 3 90 80 70 60 50

Indeks Polaritas 9,69 9,18 8,67 8,16 7,65

Menurut hasil indeks polaritas di atas dapat dikatakan bahwa dengan bertambahnya metanol dalam campuran fase gerak maka semakin non polar fase gerak yang digunakan. Hal ini menjadi dasar pemilihan variasi komposisi fase


42

gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 yang akan di optimasi yaitu 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60 dan 50 : 50. Asam askorbat merupakan senyawa yang bersifat polar sehingga cenderung akan lebih optimal terelusi dengan menggunakan fase gerak yang bersifat polar dalam sistem KCKT fase terbalik. Fase gerak yang telah dipersiapkan, disaring dengan menggunakan kertas Whatman 0,45 µm dengan maksud untuk menghilangkan partikel-partikel yang dapat mengotori kolom dan mengganggu pengukuran. Selanjutnya, fase gerak harus didegassing selama kurang lebih 15 menit untuk menghilangkan gelembung gas yang dapat mengganggu detektor.

C. Larutan Baku Baku asam askorbat yang digunakan adalah reference standard dengan kemurnian 98,7 % yang didapatkan dari PT. Supelco dan memiliki Certificate of Analysis (CoA) yang dapat dilihat pada lampiran 1 sehingga terjamin kemurniannya. Tujuan pembuatan larutan baku adalah memastikan di dalam sampel terdapat zat asam askorbat yang hendak dianalisis. Tujuan tersebut dilihat dari kesamaan waktu retensi antara waktu retensi larutan baku dengan senyawa analit dalam sampel. Pada penentuan panjang gelombang maksimum dibuat larutan baku dengan tiga level konsentrasi berbeda, yaitu 40, 50, dan 60 µg/mL pada pelarut campuran fase gerak. Larutan baku tersebut diukur absorbansi pada panjang gelombang UV antara 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis.


43

Optimasi sistem KCKT dilakukan dengan menggunakan larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 100 µg/mL. Tujuan dibuat larutan baku asam askorbat adalah untuk mengetahui waktu retensi asam askorbat. Larutan baku ini akan digunakan dalam optimasi komposisi fase gerak dan kecepatan alir sistem KCKT. Uji kesesuaian sistem KCKT menggunakan larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 100 µg/mL juga. Uji kesesuaian sistem dilakukan pada kondisi sistem KCKT dengan komposisi dan kecepatan alir fase gerak yang optimal. Larutan baku yang sudah dibuat perlu disaring terlebih dahulu dengan milipore dengan tujuan untuk menghilangkan partikel yang dapat menyumbat kolom dan mengkontaminasi fase diam. Setelah dilakukan penyaringan, larutan baku juga perlu didegassing sebelum diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan tujuan untuk menghilangkan gelembung gas yang bisa mengganggu respon detektor.

D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Askorbat Menggunakan Spektrofotometri UV-Vis Panjang gelombang yang digunakan untuk pengamatan pada instrumen KCKT fase terbalik ditentukan dengan mengukur panjang gelombang analit tunggal terlebih dahulu menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Secara teori, asam askorbat memiliki rentang panjang gelombang di daerah UV yaitu antara 200-400 nm. Asam askorbat diukur pada tiga seri konsentrasi yaitu 40, 50, dan


44

60 µg/mL. Pembuatan tiga seri konsentrasi dilakukan dengan maksud untuk melihat kenaikan respon absorbansi terhadap kenaikan konsentrasi sehingga kita dapat memastikan bahwa bentuk spektra serta panjang gelombang maksimum yang diperoleh adalah benar-benar milik asam askorbat. Gugus kromofor dan auksokrom pada asam askorbat dapat dilihat pada Gambar 10 di bawah ini:

Gambar 10. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat

Pola spektrum asam askorbat pada konsentrasi 40, 50, dan 60 µg/mL menunjukkan bahwa kenaikan respon absorbansi sebanding dengan kenaikan konsentrasi dan dapat dilihat pada Gambar 11 di bawah ini:

Gambar 11. Spektra asam askorbat pada seri konsentrasi 40, 50 dan 60 µg/mL dengan pelarut campuran fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3


45

Hasil spektra asam askorbat pada tiga seri konsentrasi menunjukkan bahwa panjang gelombang maksimum asam askorbat adalah 244 nm. Menurut Moffat dkk. (2011), panjang gelombang maksimum asam askorbat adalah 243 nm. Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), pergeseran panjang gelombang yang diijinkan adalah sebanyak 1 nm. Hasil pengukuran yang dilakukan menunjukkan panjang gelombang maksimum yang bergeser 1 nm dari teoritis, sehingga panjang gelombang maksimum yang diperoleh dari hasil pengamatan dapat diterima dan digunakan untuk pengukuran dengan sistem KCKT fase terbalik.

E. Optimasi Komposisi Fase Gerak Pada sistem KCKT fase terbalik, fase diam yang bersifat non polar akan menahan senyawa yang lebih non polar sehingga senyawa yang bersifat lebih polar akan terelusi terlebih dahulu daripada senyawa yang bersifat non polar. Asam askorbat merupakan suatu senyawa yang bersifat polar sehingga secara teori asam askorbat akan terelusi dengan cepat yang dapat ditunjukkan dengan waktu retensi yang pendek. Tabel III menunjukkan waktu retensi, nilai tailing factor dan nilai resolusi yang diperoleh dari pengukuran asam askorbat 100 µg/mL pada komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 dengan perbandingan 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60 dan 50 : 50 pada kecepatan alir 1,0 mL/menit.


46

Tabel III. Waktu retensi, nilai tailing factor dan nilai resolusi baku asam askorbat 100 µg/mL pada beberapa komposisi fase gerak pada kecepatan alir 1,0 mL/menit

No.

1. 2. 3. 4. 5.

Komposisi fase gerak Metanol Bufer fosfat (%) 0,01 M pH 3 (%) 10 90 20 80 30 70 40 60 50 50

Waktu retensi pada kecepatan alir 1,0 mL/menit 3,37 2,86 2,78 2,73 2,70

Nilai tailing factor pada kecepatan alir 1,0 mL/menit 0 2,99 1,98 1,41 1,27

Nilai resolusi pada kecepatan alir 1,0 mL/menit 0,60 0 0 0 0

Data pada tabel III menunjukkan bahwa semakin besar jumlah metanol dalam fase gerak maka semakin pendek waktu retensi asam askorbat yang dihasilkan. Hal ini disebabkan karena kemampuan elusi fase gerak akan meningkat dengan menambahkan jumlah pelarut organik dalam fase gerak (Snyder dkk., 2010). Asam askorbat dapat berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak. Interaksi asam askorbat dengan fase diam adalah interaksi gaya London. Menurut Levita dan Mustarichie (2012), gaya London merupakan gaya tarikan lemah yang disebabkan oleh dipol induksi sesaat pada suatu atom yang terjadi karena adanya pergerakan elektron dalam suatu orbital. Pergerakan ini dapat mengakibatkan tidak meratanya kepadatan elektron atom sehingga atom memiliki satu sisi dipol dengan muatan lebih negatif dibandingkan sisi lainnya. Dipol sesaat pada suatu atom dapat menginduksi atom yang berada disekitarnya sehingga terjadi dipol terinduksi. Hal ini menyebabkan terjadinya gaya tarik menarik antara dipol sesaat suatu atom dengan dipol terinduksi atom lainnya. Gambar 12 di bawah ini


47

menunjukkan interaksi gaya London antara asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan:

Gambar 12. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan

Interaksi yang terjadi pada asam askorbat dengan fase gerak adalah interaksi hidrogen. Menurut Levita dan Mustarichie (2012), interaksi hidrogen merupakan interaksi dipol-dipol yang terbentuk antara suatu proton yang terikat pada gugus yang memiliki atom elektronegatif dengan suatu atom elektronegatif lin yang memiliki pasangan elektron bebas. Gambar 13 di bawah ini menunjukkan interaksi hidrogen antara asam askorbat dengan fase gerak:

Gambar 13. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat

Berdasarkan penjelasan interaksi yang terjadi antara asam askorbat dengan fase diam dan fase gerak, dapat dikatakan bahwa interaksi asam askorbat


48

dengan fase diam merupakan interaksi yang bersifat lemah sehingga asam askorbat cenderung berinteraksi lebih kuat dengan fase gerak. Pada optimasi komposisi fase gerak didapatkan bahwa semakin besar jumlah metanol dalam fase gerak maka semakin pendek waktu retensi asam askorbat yang dihasilkan. Pada pengamatan waktu retensi, didapatkan hasil asam askorbat terelusi kurang dari 10 menit pada seluruh variasi perbandingan komposisi fase gerak (tabel III). Pada analisis dengan KCKT secara umum, waktu retensi yang diharapkan adalah kurang dari 10 menit (Snyder dkk., 2010). Parameter optimasi lainnya adalah nilai tailing factor. Parameter ini menunjukkan bentuk puncak kromatogram yang simetris atau asimetris (mengalami tailing). Bentuk puncak dikatakan simetris apabila memiliki nilai tailing factor mendekati 1, sedangkan bentuk puncak dikatakan asimetris atau mengalami tailing apabila nilai tailing factor lebih besar dari 1. Semakin besar nilai tailing factor maka semakin menurun efisiensi kolom. Menurut Snyder dkk. (2010), nilai tailing factor yang masih dapat diterima adalah kurang dari 2. Jika nilai tailing factor lebih dari 2, maka puncak kromatogram dikatakan mengalami tailing, penurunan resolusi, batas deteksi dan presisi (Rohman dan Gandjar, 2007). Beberapa penyebab nilai tailing factor yang besar adalah jumlah analit yang masuk dalam kolom terlalu besar, fase gerak yang tidak sesuai dan interaksi analit dengan residu silanol pada fase diam. Dalam penelitian ini, jumlah asam askorbat yang masuk ke kolom adalah 2 µg dalam 20 µL volume injeksi. Parameter optimasi komposisi fase gerak adalah nilai resolusi. Pengamatan nilai resolusi dilakukan untuk menjamin puncak asam askorbat tidak


49

tumpang tindih dengan noise pengotor lain yang mungkin ada dalam kolom dan terdeteksi pada panjang gelombang yang sama dengan panjang gelombang asam askorbat. Pemisahan yang baik dilihat dengan nilai resolusi yang harus lebih besari dari 1,5 (Rohman dan Gandjar, 2007). 1.

Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 10 : 90 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit Pada komposisi fase gerak 10 : 90 (Gambar 14), didapatkan puncak baku

asam askorbat yang pecah dan tidak terpisah secara sempurna. Nilai resolusi yang diperoleh adalah 0,60 antara puncak dengan waktu retensi 3,09 menit dan puncak dengan waktu retensi 3,37 menit. Nilai tailing factor sama dengan nol yang disebabkan karna puncak tidak terpisah secara sempurna. Parameter tersebut tidak memenuhi kriteria penerimaan yang ada sehingga dianggap bukan komposisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini.

Gambar 14. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut: Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat 0,01M pH 3 10 : 90 Kecepatan alir : 1,0 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm


50

2. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 20 : 80 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit Pada komposisi fase gerak 20 : 80 (Gambar 15), didapatkan puncak baku asam askorbat yang melebar dengan nilai tailing factor lebih dari 2, yaitu 2,99. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 2,86 menit. Pada komposisi ini, parameter tailing factor tidak memenuhi kriteria penerimaan sehingga dianggap bukan komposisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini.


3. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 30 : 70 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit Pada komposisi fase gerak 30 : 70 (Gambar 16), didapatkan puncak baku asam askorbat yang runcing dan sedikit melebar dengan nilai tailing factor


51

mendekati 2, yaitu 1,98. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 2,78 menit. Pada komposisi ini, meskipun nilai tailing factor yang dihasilkan masih di bawah 2, tetapi nilai tersebut tergolong kurang baik sehingga dianggap bukan komposisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini.


4. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit Pada komposisi fase gerak 40 : 60 (Gambar 17), didapatkan puncak baku asam askorbat yang runcing dan ramping dengan nilai tailing factor kurang dari 2, yaitu 1,41. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 2,73 menit. Pada komposisi ini, seluruh parameter telah memenuhi kriteria penerimaan.


52


5. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 50 : 50 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit Pada komposisi fase gerak 50 : 50 (Gambar 18), didapatkan puncak baku asam askorbat yang runcing dan ramping dengan nilai tailing factor kurang dari 2, yaitu 1,27. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 2,70 menit. Pada komposisi ini, seluruh parameter telah memenuhi kriteria penerimaan.


53


Berdasarkan uraian di atas, kompisisi fase gerak yang optimal untuk penelitian ini adalah komposisi 40 : 60. Hal ini ditunjukkan dengan bentuk puncak baku asam askorbat yang runcing dan ramping, nilai tailing factor kurang dari 2, nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi kurang dari 10 menit. Pada komposisi ini, seluruh parameter telah memenuhi kriteria penerimaan.

F. Optimasi Kecepatan Alir Fase Gerak Pada sistem KCKT secara umum kecepatan alir fase gerak juga akan mempengaruhi puncak analit. Nilai HETP merupakan salah satu parameter pendukung yang perlu diperhatikan dalam sistem KCKT. Nilai HETP menunjukkan efisiensi kolom. Semakin kecil nilai HETP maka akan semakin tingi efisiensi kolom. Nilai HETP akan menurun salah satuya dengan penggunaan laju


54

alir fase gerak yang rendah (Bella, 2009). Tabel IV menunjukkan waktu retensi, nilai tailing factor dan nilai resolusi yang diperoleh dari pengukuran asam askorbat 100 µg/mL pada komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 pada kecepatan alir 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1 dan 1,2 mL/menit. Tabel IV. Waktu retensi, nilai tailing factor, dan nilai resolusi baku asam askorbat 100 µg/mL pada komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 pada beberapa kecepatan alir

No.

Kecepatan alir fase gerak (mL/menit)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2

Waktu retensi asam askorbat (menit) 3,89 3,41 3,03 2,73 2,48 2,28

Nilai tailing factor

Nilai resolusi

1,46 1,46 1,41 1,41 1,40 1,43

0 0 0 0 0 0

Berdasarkan hasil yang tercantum dalam tabel IV di atas, dapat disimpulkan bahwa peningkatan kecepatan alir fase gerak akan menghasilkan waktu retensi yang semakin pendek. 1. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dengan kecepatan alir 0,7 mL/menit Pada kecepatan alir fase gerak 0,7 mL/menit (Gambar 19), didapatkan puncak baku asam askorbat yang runcing dan ramping dengan nilai tailing factor kurang dari 2, yaitu 1,46. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 3,89 menit. Parameter tersebut telah memenuhi kriteria penerimaan.


55


2. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit Pada kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/menit (Gambar 20), didapatkan puncak baku asam askorbat yang runcing dan ramping dengan nilai tailing factor kurang dari 2, yaitu 1,46. Nilai resolusi sama dengan nol dikarenakan tidak ada puncak lain yang terdeteksi dan waktu retensi yang diperoleh kurang dari 10 menit, yaitu 3,41 menit. Parameter tersebut telah memenuhi kriteria penerimaan.


56




57




58




59




60


Berdasarkan uraian di atas, dapat dikatakan bahwa penggunaan semua variasi kecepatan alir fase gerak dapat memberikan hasil yang baik karena semua parameter sudah memenuhi persyaratan yang ada. Penulis memilih kecepatan alir 0,9 mL/menit sebagai kecepatan alir fase gerak yang optimal dalam penelitian ini. Komposisi (40 : 60) dan kecepatan alir (0,9 mL/menit) hasil optimasi diaplikasikan pada sampel larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” untuk melihat apakah sistem tersebut mampu memisahkan analit dengan baik dalam matriks sampel atau tidak. Hasil kromatogram sampel (Gambar 25) yang diperoleh menunjukkan bahwa komposisi fase gerak 40 : 60 dengan kecepatan alir fase gerak 0,9 mL/menit pada panjang gelombang 244 nm mampu menghasilkan puncak asam askorbat yang terpisah dengan baik dari interfensi lain dalam matriks sampel.


61

Gambar 25. Kromatogram sampel larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” konsentrasi 100 µg/mL, dengan parameter sebagai berikut: Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : bufer fosfat 0,01M pH 3 40 : 60 Kecepatan alir : 0.9 mL/menit Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm

Komposisi dan kecepatan alir yang telah optimal dilakukan uji kesesuaian sistem (UKS). Uji ini bertujuan untuk membuktikan bahwa sistem yang telah optimal dapat memberikan data yang memenuhi persyaratan dan dapat diterima. Presisi dapat dilihat dari nilai % CV yang tidak lebih besar dari 2 %. Nilai % CV yang ≤ 2 menunjukkan bahwa sistem yang digunakan telah memberikan hasil yang konsisten. Hal ini dilihat dari penginjekan sebanyak 6 kali dan memperoleh hasil yang tetap baik. Parameter uji kesesuaian sistem antara lain waktu retensi, nilai resolusi, nilai Area Under Curve (AUC), nilai resolusi, nilai tailing factor, nilai HETP, nilai therotical plate (N), dan tinggi puncak. Tabel V dan VI di bawah ini menunjukkan data hasil uji kesesuaian sistem.


62

Tabel V. Uji kesesuaian sistem asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL dengan fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dan kecepatan alir 0,9 mL /menit

Replikasi 1 2 3 4 5 6 Rata-rata SD % CV

Waktu retensi (menit) 3,028 3,030 3,030 3,030 3,027 3,029 3,029 0,0013 0,04

Nilai resolusi

Nilai AUC 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7081382 7070856 7073387 7074634 7072272 7074222 7074458,833 3658,65 0,05

Nilai tailing factor 1,408 1,416 1,414 1,420 1,418 1,423 1,4165 0,00521 0,36

Nilai HETP 42,529 42,709 42,638 42,897 42,679 43,085 42,756 0,2008 0,47

Tabel VI. Uji kesesuaian sistem asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL dengan fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dan kecepatan alir 0,9 mL /menit

Replikasi 1 2 3 4 5 6 Rata-rata SD % CV

Nilai theroritical plate (N) 23513,263 23414,166 23453,199 23311,708 23430,950 23209,987 23388,879 109,52 0,47

Tinggi puncak 943436 940512 941726 938807 938938 937661 940180 2138,9 0,23

k’ 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Pada uji kesesuaian sistem, parameter waktu retensi, nilai Area Under Curve (AUC), nilai tailing factor, nilai HETP, nilai therotical plate (N), dan tinggi puncak memberikan nilai % CV kurang dari 2 % sehingga dapat disimpulkan bahwa sistem yang digunakan pada optimasi metode KCKT fase terbalik untuk menganalisis senyawa asam askorbat dapat memberikan hasil yang konsisten. Berdasarkan hasil optimasi dan uji kesesuaian sistem yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa metode KCKT fase terbalik dengan komposisi fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 dan kecepatan alir fase gerak


63

0,9 mL/menit adalah yang paling optimal untuk menganalisis senyawa asam askorbat sehingga sistem ini bisa digunakan untuk tahapan selanjutnya yaitu validasi metode analisis dan penetapan kadar asam askorbat dalam sampel larutan injeksi pemutih kulit merk “X”.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Kondisi optimum yang didapatkan pada penelitian asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X” dengan metode KCKT fase terbalik adalah sebagai berikut: Fase diam

: Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm

Fase gerak

: metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60

Kecepatan alir

: 0,9 mL/menit

Volume injeksi

: 20 µL

Detektor

: UV-244 nm

B. Saran 1. Perlu dilakukan optimasi lanjut dengan melakukan forced degradation study untuk melihat pemisahan asam askorbat dari hasil degradasinya, terutama asam dehidroaskorbat 2. Perlu dilakukan validasi metode KCKT fase terbalik pada penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X”. 2. Perlu dilakukan penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk “X”.

64


DAFTAR PUSTAKA Arbab, A. H. H., and Eltahir, M. M., 2010, Review on Skin Whitening Agents, Khartoum Pharmacy Journal, 13 (1), 5-7. Bella, Lissa, 2009, Optimasi Fase Gerak dan Laju Alir Pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin dan Dekstrometorfan HBr dalam Sirup Dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Tesis, 30, Universitas Sumatera Utara, Sumatera Utara. Buettner, Garry R., and Jurkiewicz, Beth Anne, 1996, Catalytic Metals, Ascorbate and Free Radicals: Combinations to Avoid, Radiation Research Society, 145, 532-541. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.39-40. Fallah, Laila Mustahiqul, Gunawan dan Haris, Abdul, 2009, Pembuatan Aqua DM (Aqua Demineralized) dari Air AC (Air Conditioner) Menggunakan Resin Kation dan Anion, Universitas Diponegoro, http://core.ac.uk/download/pdf/11704040.pdf, diakses tanggal 18 November 2015. Fessenden, R.J. and Fessenden, J.S., 1997, Kimia Organik, edisi III, jilid 1, diterjemahkan oleh Aloysius Handayana Pudjaatmaka, Penerbit Erlangga, Jakarta, pp.436. Gritter, R.J., Bobbit, J.M., and Schwarting, A.E., 1991, Introduction to Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Edisi III, Institut Teknologi Bandung, Bandung, hal.197. Hwang, S.W., Oh, D.J., Lee, D., Kim, J.W., and Park, S.W., 2009, Clinical Efficacy of 25% L-ascorbic acid (C’ensil) in the treatment of melasma, Journal of Cutaneous-Medicine and Surgery, 13 (2), 74-81 International Œnological Codex, 2007, Ascorbic acid, International Œnological Codex, www.oiv.int/oiv/files/.../E-COEI-1-ASCACI.pdf, diakses tanggal 20 Januari 2016. Khan, M. Nasiruddin dan Anila Sarwar, 1999, The Influence of Transition Metal Ions on the Kinetics of Ascorbic Acid Oxidation by Methylene Blue in Strongly Acidic Media, TUBITAK, 25 (2001), 433-440. Levita, J., dan Mustarichie, R., 2012, Pemodelan Molekul dalam Kimia Medisinal, Graha Ilmu, Yogyakarta, pp. 22-25. Moffat, A.C., David, M.O. and Widdop, B., (Ed.), 2011, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, 4th edition, Pharmaceutical press, London, pp. 923. Novakova, L., Solich, P., and Solichova, D., 2008, HPLC Method for Simultaneous Determination of Ascorbic and Dehydroascorbic Acids, Trends in Analytical Chemistry, 27 (10), 942-958. Rohman, A. dan Gandjar, I.G., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 231-232, 244-246, 381, 388. Saputri, Dara, 2011, Berbagai Faktor yang Mempengaruhi Penggunaan Pemutih Kulit Wajah (Skin Beaching) pada Pengunjung Salon Kecantikan di kota Medan, Tesis, 1, Universitas Sumatera Utara, Sumatera Utara.

65


66

Sihite, Christina M., 2010, Pembuatan Sediaan Vitamin C Megadosis dengan Sistem Gastric Delivery Memakai Kapsul Alginat dan Pengujian Keamannya pada Lambung Kelinci, Tesis, 8, Universitas Sumatera Utara, Sumatera Utara. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Dolan, J.W., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, A John Willey & Sons, Inc. Publication, New York, pp.208-209. Soen, Tan Biauw, Bouw, Poey Seng, dan Djali Ahimsa, 1966, Pemeriksaan Air Suling, Dwisuling dan Aqua Demineralisata terhadap Cu, Mn dan Na dengan Menggunakan Analisa Pengaktipan Netron, http://digilib.batan.go.id/eprosiding/File%2520Prosiding/Energi/Simpos iumI_Radioisotop_1-2_08_1966/Data_artikel/Tan_Biauw_Soen-47.pdf, diakses tanggal 7 Januari 2016. Supelco, 2001, Buffered Mobile Phases in Reversed-Phase Liquid Chromatography, Sigma-Aldrich Co., http://www.lcresources.com/discus/messages/5133/buffer.pdf, diakses tanggal 20 Januari 2016. Suprianto, 2014, Pengembangan Metode Penetapan Kadar Campuran Pemanis, Pengawet, dan Pewarna Secara Simultan dalam Sirup Esens dengan Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Tesis, 4, Universitas Sumatera Utara, Sumatera Utara. Thongchai, W., Liawruangrath, B. and Saisunee L., 2007, High Perfomance Liquid Chromatograpic Determination of Arbutin in Skin-Whitening Creams and Medicinal Plant Extracts, J.Cosmet. Sci., (58), 35-44. Ullah, A., Hussain, A., Ali, J., Khaliqurrehman and Ullah, A., 2012, A Simple and Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin-C in Local Packed Juices of Pakistan, Middle-East Journal of Scientific Research, 12 (8), 10851091. United States Pharmacopeial Convention, 1995, United States Pharmacopeia, Edisi 30, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, p. 130. Wang, A., Cheng, S., Sheu, C. And Kwan, C., 2011, Simultaneous Determination of Five Whitening Agents by Ion-Pair Reversed-Phase High Perfomance Liquid Chromatography, Int. Journal of Applied Science and Engineering, 9 (4), 287-299.


LAMPIRAN

67


68

Lampiran 1. Certificate of Analysis (CoA) baku asam askorbat


Lampiran 2. Penimbangan asam askorbat Alat timbang : timbangan analitik SCALTEC (max 60/210 g, min 0,001 g) Wadah timbang

= 0, 21355 gram

Wadah + asam askorbat

= 0, 25360 gram

Wadah + sisa

= 0, 21359 gram

Asam askorbat

= 0, 00401 gram

Lampiran 3. Perhitungan indeks polaritas fase gerak yang dioptimasi Diketahui data indeks polaritas di bawah ini: Pelarut

Indeks Polaritas

Metanol

5,1

Air

10,2

Perhitungan indeks polaritas campuran fase gerak: 1. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 (10 : 90)

⎛ 10 ⎞ ⎛ 90 ⎞ Indeks polaritas = ⎜ x 5,1⎟ + ⎜ x 10,2 ⎟ = 0,51 + 9,18 = 9,69 ⎝ 100 ⎠ ⎝ 100 ⎠ 2. Fase gerak metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 (20 : 80)



69



⎛ 50 ⎞ ⎛ 50 ⎞ Indeks polaritas = ⎜ x 5,1⎟ + ⎜ x 10,2 ⎟ = 2,55 + 5,1 = 7,65 ⎝ 100 ⎠ ⎝ 100 ⎠

70


71

Lampiran 4. Kromatogram asam askorbat Uji Kesesuaian Sistem (UKS) KCKT fase terbalik

Nama sampel Fase diam Fase gerak Kecepatan alir Volume injeksi Detektor

: baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL replikasi 1 : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm : metanol : bufer fosfat 0,01 M pH 3 40 : 60 : 0,9 mL/menit : 20 µL : UV-244 nm


72




73




74




75




76




77

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merk “X” ini memiliki nama lengkap Eunike Lystia Florentien Kelana Jeversoon. Penulis lahir di Metro, 26 Oktober 1994. Penulis adalah anak kedua dari empat bersaudara dari pasangan Bambang Kelana dan Rumicha Panjaitan. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di TK Xaverius Metro pada 1998-2000, SD Xaverius I Bandar Lampung pada 2000-2006, SMP Xaverius II Bandar Lampung 2006-2009, dan SMA BOPKRI I Yogyakarta 2009-2012. Penulis melanjutkan studi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2012. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Sanata Dharma, penulis pernah menjadi asisten praktikum Analisis Farmasi dan Validasi Metode dan asisten praktikum pharmaceutical analysis. Penulis pernah meraih juara II lomba Pharmaceutical Industry Case Study (PICS) yang diselenggarakan oleh Institut Teknologi Bandung (ITB) tahun 2015. Selain itu, penulis pernah mewakili Universitas Sanata Dharma dalam kegiatan 61st IPSF World Congress 2015 di Hyderabad, India dan berkontribusi dalam kegiatan Public Health Campaign on Tuberculosis yang diselenggarakan di Auxilium High School, Secunderabad, India.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents