PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

EFEK ANTIKANKER EKSTRAK ETANOLIK DAUN LAVENDER (Lavandula officinalis Chaix) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D MELALUI PENEKANAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-α

Skripsi !Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Disusun Oleh : Winda Sekarjati NIM : 118114126

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014


EFEK ANTIKANKER EKSTRAK ETANOLIK DAUN LAVENDER (Lavandula officinalis Chaix) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D MELALUI PENEKANAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-α

Skripsi !Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Disusun Oleh : Winda Sekarjati NIM : 118114126

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014

i


Penotufua Peubinlohg

EFBK ANTII(AIIIKER EIGTNAK ETANOLn( DAT'N LAYtrNDER

(Levudtrk affihalb

,

T47D

efr)

TDRflADAP SEL KANKER PAY[ ITARA

MEI,ALII PENEKANAI{ EISPRE$I RESEPTORESTROGEN-A

--

,lttt"

'

Skipsl /ang diaj'rken oleh Winda

S*a{ati

NIM: ll8114126

Tel&dis€trqiui oleh:

Pembimbing Lltama

(Agustim Sairawati, M. Sc, Apt.) Tanggal30 Jmuari 2015

u

:


Pengesahan Skripsi Berjudul

EFEK AI\TIKAI{KER EKSTRAK ETA}IOLIK DAUN LAVEITDER (Lavandula offrcinalis Chaix) TERIIADAP SEL KAFTKER PAYUDARA T47D MELALTII PEITEKANAI\I EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN.A Oleh:

Winda Sekarjati

NIM:

118114126

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farrnasi

Universitas Sanata Dharrra Pada tanggal: 10 Maret

2015

'

''''

'. '. a.

Mengetafoui,

Fahlttas Faanasi _

:.,1

Universitas Sdata Dharma

( Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt.)

Panitia Penguji Skripsi

Tanda Tangan

1.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt.

2.

Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt.

3.

Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc.

ut


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Sebab Aku ini mengetahui rancangan – rancangan apa yang ada pada-Ku mengenai kamu demikianlah firman TUHAN, yaitu rancangan damai sejahtera dan bukan rancangan kecelakaan, untuk memberi kepdamu hari depan yang pebuh harapan.” (Yeremia 29:11)

“Diberkatilah orang yang mengandalkan TUHAN, yang menaruh harapannya pada TUHAN” (Yeremia 17:7)

! Karya!ini!kepersembahkan!kepada:! Tuhan!dan!Juru!Selamat!saya,!Tuhan!Yesus!Kristus! Bapak!saya!Sudarto!dan!! Mama!saya!Tatik!Retnowulan! Kakak!saya!Datia!Kurnia!Witri!serta! Adikku!Pandu!Yogaswara

iv


PERIYYATAAN KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang telah saya

tulis ini, tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang sudah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, seperti layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah tersebut, saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku.

Yogyakana" 30 Januari 2105 Penulis

dueA(Winda Sekarjati)


LEMBAR PER}I YATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswi Universitas Sanata Dharma.

Nama :Winda Sekarjati

NIM

.118114126

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma, Yogyakart 4 kary a ilmiah saya yang berj udul

:

EFEK ANTIKANIMR EKSTRAK ETANOLIK DAUN LAYENDER (Lavandula olftcinalis Chaix) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D MELALUI PENEKANAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-a beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

hak kepada

Perpustakaan Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta untuk

menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet dan media lain untuk kepentingan akademis tanpaperlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selamatetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan inisaya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Yada tanggal : 30

lanuai 2015

Yang menyatakan

(Winda Sekarjati)

vl


PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas kasih dan berkat-Nya yang begitu melimpah, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Efek Antikanker Ekstrak Etanolik Daun Lavender (Lavandula Officinalis Chaix) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Penekanan Ekspresi Reseptor Estrogen-α” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan campur tangan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan yang indah ini penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma 2. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing dan dosen penguji skripsi ini serta selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi, atas segala bimbingan, bantuan, dukungan, kesabaran, dan motivasi selama penyusunan skripsi tidak lupa atas segala izin yang telah diberikan untuk dapat menggunakan semua fasilitas laboratorium untuk kepentingan skripsi ini. 3. Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji skripsi dan telah memberikan saran kepada penulis.

vii


4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku Dosen penguji skripsi dan telah memberikan saran kepada penulis. 5. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu , arahan, dan bimbingan yang telah dibagikan. 6. Ibu Rumbi dan Ibu Juju selaku teknisi Laboratorium Parasitologi, Fakultas Kedokteran Umum UGM atas bimbingan dan bantuan selama melakukan berbagai perlakuan sel kanker di laboratorium tersebut. 7. Keluarga tercinta, Bapak Sudarto, Ibu Tatik Retnowulan, Pandu Yogaswara dan Datia Kurnia Witri atas segala doa yang tak henti diucapkan, dukungan, semangat, dan bantuan agar penulis dapat menyelesaikan studi dengan tepat waktu dan menjadi kebanggan keluarga. 8. Teman- teman tim skripsi “Pasti Sukses!” : Clara Dewi Anggraeni dan Andung Panjalu Vidityo yang telah memberikan bantuan, semangat dan tekad untuk dapat mengenakan toga bersama di hari wisuda nanti. 9. Sahabat-sahabat tercinta Vincentius Henry, Albertus Juannino, Theresia Dian, Skolastika Ferranda, dan Gregoria Novalia atas segala dukungan dan semangat yang telah diberikan. 10. Teman-teman FST B 2011, FSM C 2011, dan seluruh teman- teman Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta angkatan 2011 atas kebersamaannya. 11. Rekan-rekan kerja part time di PT. Aseli Dagadu Djokdja terkhusus GARDA DEPAN#49 (m49netics) atas persahabatan yang telah terjalin

viii


serta dukungan, doa dan motivasi untuk setiap anggotanya agar dapat menyelesaikan studi dengan tepat waktu. 12. Teman-teman Pemuda GKJ Brayat Kinasih Yogyakarta atas motivasi yang selalu diberikan. 13. Sahabat tercinta Thorifah Zatu Sabila dan Karisa Indraswari atas persahabatan yang telah terjalin sejak duduk di bangku Taman Kanakkanak hingga saat ini. 14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu oleh penulis yang telah membantu selama proses penyusunan skripsi ini berlangsung.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga membutuhkan saran dan kritik yang membangun untuk perubahan yang lebih baik. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca.

Yogyakarta, 23 Februari 2015 Penulis

ix


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .....................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................

iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................

v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ..........................................

vi

PRAKATA .....................................................................................................

vii

DAFTAR ISI ..................................................................................................

x

DAFTAR TABEL ..........................................................................................

xiii

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................

xiv

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................

xv

INTISARI ......................................................................................................

xvi

ABSTRACT .....................................................................................................

xvii

BAB I. PENDAHULUAN ...........................................................................

1

A. Latar Belakang ......................................................................................

1

1. Rumusan Masalah ..........................................................................

4

2. Keaslian Penelitian..........................................................................

4

3. Manfaat Penelitian ..........................................................................

4

B. Tujuan Penelitian ..................................................................................

5

1. Tujuan Umum .................................................................................

5

2. Tujuan Khusus ................................................................................

5

x


BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ..........................................................

6

A. Lavender (Lavandula officinalis Chaix) ................................................

6

1. Taksonomi .....................................................................................

6

2. Morfologi ........................................................................................

7

3. Kandungan kimia ............................................................................

8

4. Khasiat dan kegunaan......................................................................

8

B. Kanker Payudara ....................................................................................

9

C. Sel Kanker T47D ...................................................................................

12

D. Apoptosis ...............................................................................................

13

E. Uji Sitotoksik dengan Metode MTT ......................................................

14

F. Uji Apoptosis menggunakan Annexin V Fluos .....................................

15

G. Uji Ekspresi Sel dengan Metode Imunositokimia .................................

16

H. Landasan Teori ......................................................................................

17

I. Hipotesis ................................................................................................

18

BAB III. METODE PENELITIAN...............................................................

19

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................

19

B. Variabel dan Definisi Operasional ........................................................

19

1. Variabel Penelitian .........................................................................

19

2. Definisi Operasional .......................................................................

20

C. Bahan Penelitian ....................................................................................

21

D. Alat Penelitian .......................................................................................

22

E. Tata Cara Penelitian ...............................................................................

22

1. Pengumpulan Tanaman ...................................................................

22

xi


2. Determinasi Tanaman ......................................................................

22

3. Sortasi Basah ...................................................................................

22

4. Pencucian .........................................................................................

23

5. Pembuatan serbuk daun lavender kering .........................................

23

6. Pembuatan ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix ........................

23

7. Pembuatan larutan uji ......................................................................

23

8. Uji sitotoksik ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix.....................

24

9. Uji apoptosis Annexin V Fluos........................................................

26

10. Imunositokimia ................................................................................

38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................

31

A. Penyiapan ekstrak .................................................................................

31

B. Uji sitotoksik ekstrak dengan metode MTT ..........................................

32

C. Uji apoptosis ekstrak dengan metode Annexin V Fluos ........................

38

D. Uji ekspresi ERα menggunakan metode imunositokimia .....................

41

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................

47

A. Kesimpulan ............................................................................................

47

B. Saran ......................................................................................................

47

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................

48

LAMPIRAN ...................................................................................................

53

BIOGRAFI PENULIS ...................................................................................

61

xii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I

Viabilitas sel T47D dengan perlakuan ekstrak ........................

35

Tabel II

Viabilitas sel T47D dengan perlakuan tamoxifen ....................

36

Tabel III

Persentase sel T47D pada uji Annexin V Fluos ......................

39

Tabel IV

Perhitungan ekspresi ERα pada kontrol sel .............................

43

Tabel V

Perhitungan ekspresi ERα ekstrak ...........................................

44

! !

!

xiii


DAFTAR GAMBAR .

Halaman

Gambar 1.

Lavandula officinalis Chaix.....................................................

7

Gambar 2.

Struktur senyawa dalam lavender............................................

8

Gambar 3.

Anatomi kelenjar payudara manusia........................................

9

Gambar 4.

Jalur signaling ERα..................................................................

11

Gambar 5.

Sel T47D..................................................................................

12

Gambar 6.

Anatomi sel nekrosis dan apoptosis.........................................

13

Gambar 7.

Struktur MTT...........................................................................

15

Gambar 8.

Bentuk kristal formazan pada metode MTT............................

33

Gambar 9.

Morfologi sel T47D.................................................................

37

Gambar 10. Hasil pembacaan flowcytometer .............................................

39

Gambar 11. Morfologi ekspresi sel T47D pada uji imunositokimia ..........

42

! ! ! ! ! !

xiv


DAFTAR LAMPIRAN .

Halaman

Lampiran 1.

Surat keterangan hasil determinasi daun lavender ...............

54

Lampiran 2.

Perhitungan seri kadar ekstrak dan tamoxifen ......................

55

Lampiran 3.

Viabilitas sel T47D dengan pemberian ekstrak ....................

56

Lampiran 4.

Viabilitas sel T47D dengan pemberian tamoxifen ...............

57

Lampiran 5.

Analisis IC50 ekstrak menggunakan program R ..................

58

Lampiran 6.

Analisis IC50 tamoxifen menggunakan program R ..............

59

Lampiran 7.

Pengamatan tiga lapang pandang imunositokimia ...............

60

xv


INTISARI Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker dengan tingkat prevalensi yang cukup tinggi di Indonesia setelah kanker leher rahim. Selama ini penatalaksanaan kanker payudara dilakukan dengan serangkaian pengobatan meliputi pembedahan, kemoterapi, radiasi, hormonal dan terapi imunologik. Terdapat beberapa kelemahan dari pengobatan tersebut antara lain menimbulkan rasa mual dan muntah, pendarahan serta dapat meningkatkan resiko kanker endometrium (pada wanita menopause). Oleh karena itu, penting untuk dilakukan penemuan obat antikanker yang selektif. Penelitian ini mengeksplorasi efek antikanker ekstrak etanol daun lavender (Lavandula officinalis Chaix.) terhadap sel kanker payudara T47D. Model sel kanker payudara yang digunakan adalah sel T47D yang mampu mengekspresikan reseptor estrogen alfa (ERα). Uji sitotoksisitas dianalisis menggunakan metode 3[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dilanjutkan dengan uji induksi apoptosis dengan metode Annexin V Fluos. Mekanisme molekuler terhadap ERα dianalisis secara semi-kuantitatif menggunakan metode imunositokimia. Ekstrak etanol daun lavender (L. officinalis Chaix) menunjukkan efek sitotosik pada nilai IC50 232 µg/mL yang dihitung secara statistik menggunakan program R serta mampu menginduksi sel kanker payudara T47D melalui mekanisme apoptosis dengan menekan ekspresi protein ERα. Kata kunci: Ekstrak etanol, Lavandula officinalis Chaix., kanker payudara, T47D.

xvi


ABSTRACT Breast cancer is the second highest incidence after cervical cancer in Indonesia. Management of breast cancer is conducted by a series of treatment include surgery, chemotherapy, radiation, hormonal, and immunological therapy. But, there are several side effects caused by the treatment, for example, nausea and vomiting, bleeding, and may increase the risk of endometrial cancer (for menopausal woman). Furthermore, it is important to discover a selective anticancer drug. This study explored the effect of ethanol extract of Lavandula officinalis Chaix leaves against T47D breast cancer cell line. Breast cancer cell model used T47D, an overexpressing estrogen receptor alpha (ERα). Cytotoxicity assay were analyzed using 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) then induction of apoptosis using Annexin V Fluos method. Molecular mechanism on ERα was analyzed using a semi-quantitative methode, immunocytochemistry. Ethanol extract of Lavandula officinalis Chaix leaves showed cytotoxic effect with IC50 value 232 µg/mL which calculated using statistical R program and was able to induce T47D breast cancer cells through mechanism of apoptosis by inhibition the expression of ERα. Keyword: Ethanolic extract, Lavandula officinalis Chaix, breast cancer, T47D.

xvii

!


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular yang menjadi masalah kesehatan utama baik di dunia maupun di Indonesia. Menurut data WHO tahun 2013, angka kejadian kanker meningkat dari 12,7 juta kasus pada tahun 2008 menjadi 14,1 juta kasus pada tahun 2012. Di Indonesia, prevalensi penyakit kanker juga cukup tinggi, berdasarkan data Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS) tahun 2013, prevalensi kanker di Indonesia adalah 1,4 per 1000 penduduk atau sekitar 330.000 orang. Jenis kanker yang menduduki posisi dengan angka kejadian tertinggi pada wanita adalah kanker leher rahim (serviks) dan kanker payudara. Menurut estimasi Globocan, International Agency for Reasearch on Cancer (IARC) tahun 2012, angka kejadian kanker payudara sebesar 40 per 100.000 wanita, sedangkan kanker leher rahim sebesar 17 per 100.000 wanita (Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2014). Berdasarkan data di atas, maka penelitian terkait kanker payudara sangat menarik untuk dikembangkan. Kanker payudara sendiri memiliki berbagai macam sub tipe secara molekuler, Karolina dkk. (2010) menggolongkan menjadi empat macam yaitu: luminal (luminal A dan luminal B), HER2, basal-like, dan normal breast. Mengacu pada penelitian yang telah dilakukan oleh Pilar dkk. (2010), kanker payudara luminal A merupakan sub tipe yang paling umum terjadi, yaitu sekitar 50- 60% dari total kejadian kanker payudara. Salah satu karakteristik molekuler

1


2

dari kanker payudara luminal A adalah adanya ekspresi gen yang diaktifkan oleh faktor transkripsi estrogen. Over ekspresi produksi reseptor akibat stimulasi estrogen dapat mengakibatkan proliferasi sel yang tidak terkontrol. Salah satu jenis reseptor yang bertanggung jawab atas kejadian kanker payudara adalah reseptor estrogen alfa (ERα). Informasi terkait regulasi ekspresi reseptor ERα memberikan kontribusi positif terhadap penelitian mengenai kanker payudara (Hayashi, dkk., 2003). Mekanisme terjadinya kanker payudara yang cukup kompleks juga berpengaruh pada berbagai macam pengobatan yang diberikan bagi para penderita kanker payudara, beberapa diantaranya melalui operasi pengangkatan payudara, terapi radiasi, dan terapi hormonal (National Cancer Institute, 2013). Tidak sedikit pula efek samping yang ditimbulkan dari berbagai jalur pengobatan tersebut, kelemahan dari pengobatan kanker payudara adalah munculnya efek samping yang secara umum dapat berupa mual dan muntah, timbulnya rasa nyeri dan sakit, pendarahan, dan lain sebagainya. Berdasarkan keterangan diatas, maka perlu adanya penelitian untuk menemukan suatu senyawa yang memiliki target aksi lebih spesifik pada sel kanker payudara sehingga tidak menimbulkan berbagai efek samping. Daun Lavandula officinalis Chaix (Sinonim Lavandula angustifolia Mill.; Lavandula vera DC) dipilih karena mengandung berbagai komponen senyawa kimia, antara lain adalah linalil asetat, linalol, kampor, limone, dan lain sebagainya, namun yang terbesar diantara semua adalah kandungan monoterpen yaitu sebesar 60-65% (European Medicines Agency, 2011). Chu dan Kamper,

!


3

(2001) melaporkan bahwa salah satu hasil metabolit monoterpen memiliki aktivitas dalam melawan sel kanker payudara pada uji klinik fase I yang pernah dilakukan. Berdasarkan penelitian diatas, maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun

L.officinalis

Chaix

potensial

untuk

dikembangkan

sebagai

agen

kemopreventif pada kanker payudara. Penelitian ini didesain untuk eksplorasi aktivitas antikanker dan kemampuan ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix dalam menginduksi apoptosis sel kanker payudara T47D. Mekanisme molekuler antikanker dianalisis melalui ekspresi ERα dengan metode imunositokimia.

!


1.

4

Rumusan Masalah Apakah ekstrak etanol daun lavender mempunyai kemampuan sitotoksik,

induksi apoptosis, dan menekan ekspresi ERα terhadap sel kanker payudara T47D serta berapa nilai IC50 ekstrak tersebut? 2.

Keaslian Penelitian Penelitian dengan menggunakan ekstrak etanol Lavandula officinalis

Chaix yang pernah dilakukan adalah Neuroprotective effect of pretreatment with Lavandula officinalis ethanolic extract on blood-brain barrier permeability in a rat stroke model (Rabiei dan Rafieian, 2014), dalam penelitian tersebut ekstrak etanol digunakan untuk pengobatan stroke. Terdapat pula penelitian lain menggunakan ekstrak lavender sebagai anti-mikroba yang dikombinasikan dengan minyak aroma terapi lain, judul penelitian tersebut adalah The In Vitro Antimicrobial Activity of Lavandula angustifolia Essential Oil in Combination with Other Aroma Therapeutic Oils (Rapper, dkk., 2013). Sejauh studi pustaka yang dilakukan oleh peneliti, penelitian tentang uji efektifitas antikanker ekstrak etanol daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) dengan metode MTT dan imunositokimia pada sel kanker payudara T47D belum pernah dilakukan.

3. a.

Manfaat Penelitian Manfaat Teoretis. Penelitian ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan

khususnya ilmu kefarmasian mengenai informasi

!

terkait ekstrak etanol daun


5

lavender (Lavandula officinalis Chaix) sehingga dapat pula menjadi sumber acuan yang dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya. b.

Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan secara ilmiah khasiat dari

ekstrak etanol daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) yang berpengaruh pada apoptosis sel kanker payudara T47D dan mendeteksi ekspresi sel protein kanker payudara.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum Mengetahui aktivitas antikanker ekstrak etanol daun lavender terhadap sel kanker payudara T47D.

2. Tujuan Khusus Mengetahui efek ekstrak etanol daun lavender terkait kemampuan sitotoksik, induksi apoptosis pada sel kanker payudara T47D serta penekanan ekspresi

!

ERα

dengan

nilai

IC50

ekstrak

tersebut.

!


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA !

A. Lavender (Lavandula officinalis Chaix) 1.

Taksonomi Berdasarkan sistem taksonomi, tanaman lavender dikenal dengan nama

ilmiah Lavandula officinalis Chaix. Adapun klasifikasi tanaman tersebut adalah sebagai berikut : Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Superdivision

: Spermatophyta

Division

: Magnoliophyta

Class

: Magnoliopsida

Subclass

: Asteridae

Ordo

: Lamiales

Family

: Lamiaceae

Genus

: Lavandula L.

Species

: Lavandula officinalis Chaix (United States Departement of Agriculture)

Lavender merupakan tanaman yang dapat tumbuh dengan baik di tempat kering dengan sinar matahari penuh disertai perlindungan angin (Prusinowska, 2014). Tanaman ini berasal dari wilayah Mediterania Utara, kemudian dibudidayakan di daerah Eropa bagian selatan, Bulgaria, Federasi Rusia, Amerika

6


7

Serikat dan bekas Yugoslavia. Lavender berasal dari bahasa latin yang diambil dari kata “Lavo” atau “Lavare” yang berarti sarana untuk mencuci atau membersihkan (Prusinowska, 2014). Lavender merupakan nama dalam bahasa Indonesia maupun bahasa Inggris (WHO, 2007). 2. Morfologi

Gambar 1. Lavandula officinalis Chaix (United States Departement of Agriculture)

Lavandula officinalis Chaix merupakan sinonim dari Lavandula angustifolia Mill. Pada sebagian besar buku referensi lama menyebutkan bahwa Lavandula officinalis Chaix sebagai nama spesies, namun menurut peraturan internasional nomenklatur botani, Lavandula angustifolia Mill. Merupakan nama spesies yang resmi. Lavender merupakan tanaman yang termasuk dalam anggota keluarga Lamiaceae serta memiliki genus yang terdiri dari 25-35 sub-spesies dan memberikan morfologi yang beragam. Tanaman ini ditemukan dalam bentuk semak aromatik setinggi 1-2 meter, memiliki cabang berwarna abu sampai coklat tua. Bunga lavender berwarna ungu tua hingga biru tua dengan tinggi 25-35 cm. Jumlah bunga dalam satu batang mencapai 6-10 buah. Daun mengelompok pada bagian tunas daun, memiliki jarak yang cukup lebar pada tunas yang berbunga,

!


8

tangkai daun sangat pendek, bentuk tangkai daun linier-lanset higga linier dengan panjang 17 mm, lebar 2 mm (WHO, 2007).

3.

Kandungan kimia

(A)

(B)

(C)

(D)

Gambar 2. Struktur senyawa yang terkandung dalam lavender (A) Linalool; (B) Linalil asetat; (C) Kumarin; (D) Asam ursolat (PubChem, 2015).

Lavender mengandung banyak konstituen kimia, namun kandungan yang terbesar merupakan minyak esensial, beberapa diantaranya yang memiliki konsentrasi tertinggi adalah linalool yang tergolong dalam monoterpen alkohol dan linalil asetat yang tergolong monoterpen ester. Senyawa kimia lain yang terdapat di dalamnya adalah asam ursolat, monoterpen keton (kumarin), dan lain sebagainya (European Medicines Agency, 2011).

4. Khasiat dan kegunaan L. officinalis Chaix diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang baik dan komponen kimia yang berperan adalah komponen fenolik, kandungan minyak esensial didalamnya juga memiliki aktivitas antioksidan yang kuat dalam melawan lipid peroksidasi sistem model asam linoleat. Senyawa perilil alkohol (POH) golongan monoterpen didalam L. officinalis Chaix dapat digunakan sebagai agen kemopreventif dalam kanker payudara, kolon, dan pankreas

!


9

(Bardon, dkk., 2002). Pada penelitian Lim (2014), menyebutkan bahwa tikus yang diberi makan p-limonene (salah satu golongan monoterpen) sebanyak 10.000 ppm dapat mereduksi 72% tumor payudara dibandingkan dengan kontrol pada 18 minggu perlakuan. Khasiat lain yang terkandung dalam L. officinalis Chaix adalah sebagai antimikrobia, antikonvulsan dan memiliki efek sedatif, serta berperan sebagai senyawa anti-inflamasi. Pada uji klinik diketahui bahwa minyak esensial L. officinalis Chaix dapat digunakan untuk aromaterapi pada penderita insomnia (WHO, 2007). B. Kanker Payudara dan Reseptor Estrogen- α (ERα)

Gambar 3. Anatomi kelenjar payudara manusia (PubMed Health, 2014).

Kelenjar payudara manusia terdiri dari duktus dan lobus, dibentuk dari sel-sel epitel yang dikekelingi sel-sel mioepitel serta sel lain yang tergolong dalam jaringan ikat seperti fibroblast, sel endotel, serabut saraf dan adiposa. Kanker payudara adalah tumor ganas yang berasal dari kelenjar payudara, termasuk saluran kelenjar air susu dan jaringan penunjangnya. Tumor pada payudara

!


10

bermula dari sel epitelial, sehingga sebagian besar kanker payudara dikelompokan sebagai karsinoma (keganasan tumor epitelial) (Hondermarck, 2003). Terjadinya kanker payudara dibagi kedalam 4 tahapan utama didasarkan pada hasil pengujian tumor dan benjolan kelenjar getah bening selama operasi dan tes lain, tahapan tersebut adalah : a)

Tahap 0 (karsinoma in situ) : Merupakan tahapan non-invasif yaitu

dimana sel abnormal ditemukan di dalam kelenjar payudara. Sel abnormal ini cenderung tidak menyebar menuju jaringan lain didalam payudara. b)

Tahap 1 : Tahap 1 terdiri dari 1A dan 1B. Pada tahap 1A

ditemukan tumor yang berukuran 2 cm atau lebih kecil dan tidak menyebar di jaringan yang lain. Pada tahap 1B terdapat sekelompok kecil sel kanker dengan ukuran 0,2 mm namun tidak lebih dari 2 mm ditemukan di kelenjar getah bening. c)

Tahap 2 : Ukuran tumor menjadi lebih besar, yaitu sekitar 2–5 cm,

sel kanker ditemukan pada kelenjar getah bening aksilaris atau didekat tulang dada. d)

Tahap 3 : Ukuran tumor lebih besar dari 5 cm, sel kanker sudah

mulai menyebar pada kelenjar getah bening aksilaris. Sekelompok kecil sel kanker berukan lebih besar dari 0,2 mm. e)

Tahap 4 : Kanker sudah mulai menyebar pada bagian tubuh lain,

terutama pada bagian tulang, paru- paru, hati atau otak. (National Cancer Institue, 2013). Faktor yang dapat meningkatkan resiko kanker payudara pada individu tertentu, meliputi riwayat keluarga yang memiliki kanker payudara, usia, tidak

!


11

memiliki anak, kehamilan pertama pada usia di atas 30 tahun, periode menstruasi yang lebih lama (menstruasi pertama lebih awal atau menopause lebih lambat), faktor hormonal (baik estrogen maupun androgen) (Hondermarck, 2003).

Gambar 4. Jalur signaling ERα (Compston, 2001).

Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi proses metastasis kanker payudara karena adanya aktivasi atau overekspresi beberapa protein, yaitu ERα, ekspresi berlebih pada ERα sering ditemukan pada tahapan awal terjadinya kanker payudara (Hayashi, dkk., 2003).

ERα

merupakan faktor transkripsi ligand-

dependent yang memodulasi transkripsi gen melalui proses perekrutan menuju kromatin gen sasaran. Proses signaling pada reseptor ERα membantu dalam memahami terjadinya kanker payudara, tahapan signaling ERα memberikan kontribusi pada perubahan epigenik, epigenik merupakan modifikasi DNA yang tidak merubah urutan gen, namun dapat berdampak pada ekspresi gen dan dapat diwariskan. Sinyal ERα berpotensi untuk mengaktifkan sinyal ekstranuklear yang berfungsi untuk mengaktifkan beberapa kaskade kinase yang secara langsung dapat memodifikasi ekor histon atau secara tidak langsung dapat mempengaruhi

!


12

fungsi dari histon yang memodifikasi enzim. Deregulasi ERα melalui sinyal epigenik memiliki implikasi pada perkembangan kanker payudara (Mann, dkk., 2011). C. Sel Kanker T47D

Gambar 5. Sel T47D (Koleksi pribadi).

T47D merupakan sel kanker payudara yang aktivitasnya bergantung dari jumlah hormon dalam tubuh manusia, sel ini secara luas digunakan sebagai model eksperimental studi kanker payudara. T47D dapat dipakai pada uji in vitro (dalam sel kultur) maupun in vivo (tumor xenograf pada tikus), fungsi protein dan tingkat efikasi daya hambat sel. Sel ini awalnya berasal dari sisi metastasis efikasi pleura dan memberikan ekspresi pada reseptor estrogen (Adjo dan Lin, 2012). Sel kanker payudara T47D mengekpresikan reseptor estrogen nukleus, yang diperlukan bagi sel untuk mengaktifkan gen penting tertentu

dalam

pertumbuhan dan replikasi. Estrogen termasuk dalam hormon seks yang terdiri dari estradiol, estriol, dan estrone. Hormon-hormon ini mampu menembus membran sel sehingga dapat berdifusi langsung ke nukleus. Sekali estrogen dapat masuk ke dalam nukleus, maka dapat terjadi ikatan antara substrat dan reseptor estrogen membentuk reseptor dimer. Sisi aktif reseptor kemudian berikatan

!


13

dengan sisi spesifik pada DNA yang dapat menaikkan atau menurunkan ekspresi gen tergantung pada peran faktor transkripsi sisi aktif (Neumann dan Rossi, 2012).

D.

Apoptosis

Gambar 6. Anatomi (A) sel nekrosis (B) dan (C) sel apoptosis (Johnson dkk., 2002).

Apoptosis merupakan kematian sel yang terprogram dan sekaligus suatu komponen yang normal pada perkembangan dan pemeliharaan kesehatan pada organisme. Pada apoptosis, sel yang mati merupakan respon terhadap berbagai stimulus, sel ini dikontrol dan diregulasi, sel yang mati difagosit oleh makrofag (Lumongga, 2008). Kejadian apoptosis ditandai dengan adanya perubahan morfologi, termasuk penyusutan sel, membran bleebing, kondensasi kromatin, fragmentasi DNA, dan pembentukan badan apoptosis (Handayani, 2012). Apoptosis berbeda dengan nekrosis, pada nekrosis terjadi kematian sel tidak terkontrol, sel yang mati pada nekrosis dapat membesar dan kemudian hancur serta lisis pada satu daerah yang merupakan respon terhadap inflamasi. Kelainan pada kontrol kematian sel dapat memberikan kontribusi pada berbagai

!


14

penyakit, termasuk kanker, autoimun dan penyakit degeneratif. Sinyal apoptosis terjadi melalui berbagai jalur independen yang dimulai dengan memicu peristiwa dalam sel maupun dari luar sel, misalnya dengan ligasi kematian reseptor. Seluruh jalur signaling apoptosis bertemu pada suatu mesin kerusakan sel yang diaktifkan oleh famili protease sistein (caspase) yang membelah pada residu aspartat. Pembongkaran sel dicapai dengan cara proteolisis dari konstituen vital sel, degradasi DNA, dan fagositosis oleh sel tetangga (Strasser, dkk., 2000).

E. Uji Sitotoksik dengan Metode 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Uji 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) merupakan uji viabilitas sel yang dikembangkan untuk format 96 sumuran. Metode ini diawali dengan mempersiapkan substrat MTT dalam larutan fisiologis kemudian ditambahkan pada sel yang telah dikulturkan dan diinkubasi selama 14 jam. Jumlah formazan (berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup) diukur pada panjang gelombang 570 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Sel yang hidup dan memetabolisme aktif mengkonversi MTT menjadi formazan yang berwarna ungu pada absorbansi maksimum 570 nm. Ketika sel tersebut mati, maka sel itu kehilangan kemampuan dalam mengkonversi MTT menjadi sebuah formasan, sehingga adanya perubahan warna berfungsi hanya sebagai penanda jumlah sel yang masih hidup. Jumlah sinyal yang dihasilkan bergantung dari konsentrasi MTT, masa inkubasi, jumlah sel yang hidup dan aktivitas metabolisme (Terry, dkk., 2013).

!


15

Gambar 7. Struktur MTT dan formasan yang terbentuk (Terry, dkk., 2013).

F. Uji Apoptosis menggunakan Annexin V Fluos Annexin V Fluos merupakan suatu metode uji yang digunakan untuk menghitung jumlah sel yang telah mengalami apoptosis. Hal ini didasarkan pada sel-sel normal di alam bersifat hidrofobik dan memiliki membran fosfolipid yang terdistribusi di dalam dan di bagian luar lapisan membran. Pada bagian luar lipid bilayer mengandung fosfatidilkolin dan sfingomielin sedangkan pada bagian dalam terdapat fosfatidilserin, ketika terjadi apoptosis pada sel tersebut, bagian membran menjadi terganggu atau rusak, sehingga mengakibatkan fosfatidilserin keluar menuju bagian luar. Annexin V Fluos yang memiliki afinitas kuat terhadap fosfatidilserin sehingga dapat terdeteksi jumlah sel yang mengalami apoptosis. Sedangkan untuk sel- sel yang mengalami kerusakan DNA berikatan dengan reagen propidium iodin dan dapat memberikan data jumlah sel yang mengalami nekrosis (Istvan, dkk., 1995). Alat yang digunakan untuk mendeteksi hasil Annexin V Fluos adalah flow cytometer. Flow cytometer merupakan alat yang canggih untuk mendeteksi suatu fenotip dan karakteristik dari sel berdasarkan fluoresensi cahaya yang

!


16

diapancarkan oleh sel itu sendiri. Adanya fluroresensi ini kemungkinan berkaitan dengan pewarnaan atau adanya konjugasi pada antibodi spesifik pada permukaan sel atau pada komponen intraseluler. Flow cytometer dapat mengidentifikasi berbagai macam jenis sel pada populasi sel yang heterogen, hal ini dapat dicapai dengan adanya Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) didalam flow cytometer, perangkat ini mampu mengidentifikasi lebih dari dua warna floresensi (Macey, 2007). G.

Uji Ekspresi Sel dengan Imunositokimia

Metode imunositokimia memanfaatkan suatu antibodi spesifik yang dapat berikatan dengan protein atau antigen didalam sel dan membran di bawah mikroskop (Richard, 2010). Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer secara langsung, kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna (pigmen) yang mampu memberikan warna pada sel (Richard, 2011). Pada metode imunositokimia dibutuhkan suatu kontrol yang terdiri dari antibodi primer, antibodi sekunder, dan kontrol label. Antibodi primer digunakan untuk mengetahui spesifisitas ikatan antibodi primer tehadap antigen, antibodi sekunder digunakan untuk menunjukkan ikatan label yang spesifik pada antibodi

!


17

primer, sedangkan kontrol label merupakan hasil dari proses pelabelan selama proses imunositokimia dan menunjukkan bahwa label yang digunakan tidak bersifat endogen/bereaksi dengan produk (Richard, 2011).

H. Landasan Teori Kanker payudara memiliki hubungan erat dengan hormon estrogen yang terdapat pada wanita. Salah satu penyebab terjadinya kanker payudara adalah aktivasi atau overekspresi protein, yaitu reseptor estrogen alfa (ERα). ERα berikatan dengan estrogen membentuk kompleks reseptor aktif dan dapat mempengaruhi transkripsi gen yang mengatur proliferasi sel, adanya overekspresi pada ERα menimbulkan terjadinya proliferasi sel yang abnormal dan memicu terjadinya kanker. Beberapa macam jenis terapi yang pernah diberikan bagi penderita kanker payudara antara lain adalah terapi hormonal, terapi radiasi, operasi pengangkatan payudara, dan kemoterapi. Kekurangan dari berbagai terapi tersebut yaitu munculnya iritasi pada kulit payudara, lymphedema, rasa mual, muntah, diare dan sakit kepala, sehingga diperlukan adanya penelitian suatu senyawa yang mampu membunuh sel kanker payudara secara selektif dan meminimalkan munculnya efek samping. Selama ini telah dilakukan berbagai macam penelitian terkait senyawa alam yang memiliki aktivitas antikanker pada kelenjar payudara. Menurut Lim (2014), L. officinalis Chaix merupakan tanaman yang memiliki kandungan monoterpen cukup tinggi dan senyawa ini mempunyai aktivitas antikanker. Potensi ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix dalam

!


18

menghambat viabilitas sel diujikan pada sel kanker payudara T47D yang mampu mengekspresikan ERα. Kemampuan senyawa dalam menginduksi apoptosis diuji menggunakan Annexin V Fluos. Jalur kematian apoptosis dipilih karena tidak membawa pengaruh pada sel sekitarnya dan memberikan terapi yang lebih selektif. Pengamatan molekuler sel dalam menekan ekspresi ERα dilakukan dengan metode semi-kuantitatif melalui imunositokimia. Tamoxifen dapat digunakan sebagai obat pembanding dalam penelitian ini karena obat ini tergolong dalam terapi hormonal yang telah terbukti mampu menghambat ikatan antara estrogen dengan sel-sel kanker ER-positif

I. Hipotesis Adanya pengaruh ekstrak etanol daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) terhadap viabilitas sel T47D yang diuji menggunakan metode 3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium (MTT) dan mampu menginduksi apoptosis sel serta menekan ekspresi ERα melalui uji imunositokimia.

!

!


BAB III METODE PENELITIAN

A.

Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang berjudul “Efek Antikanker Ekstrak Etanolik Daun Lavender (Lavandula Officinalis Chaix) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui

Penekanan

Ekspresi

Reseptor

Estrogen-α”

termasuk

penelitian

eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian acak lengkap pola searah. Penelitian ini termasuk jenis ekperimental karena terdapat perlakuan terhadap subyek uji. Rancangan penelitian acak lengkap pola searah karena penelitian ini memiliki satu faktor dengan banyak level.

B. 1.

Variabel dan Definisi Operasional

Variabel Penelitian

a. Variabel utama 1) Variabel bebas

: tujuh peringkat konsentrasi ekstrak etanol daun

lavender yaitu (1585, 1150, 1000, 300, 178, 100, 10) µg/mL. 2) Variabel tergantung

: viabilitas sel, persentase sel apoptosis, level

ekspresi protein ERα. b. Variabel Pengacau 1) Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi sel uji, yaitu sel kanker payudara T47D. Bahan uji yang digunakan berupa daun Lavandula officinalis

19


20

Chaix yang didistribusikan oleh Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah, Indonesia) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur dipanen pada bulan Juni 2014, serta lama pengeringan daun L. Officinalis Chaix.

2) Variabel pengacau tak terkendali Usia tanaman, cuaca, kontaminasi lingkungan, kondisi lingkungan, dan waktu inkubasi.

2.

Definisi Operasional

a. Ekstrak etanol daun Lavandula officinalis Chaix adalah larutan kental hasil ekstraksi total daun lavender yang diperoleh dengan cara mengekstraksi. b.

Uji MTT adalah metode yang digunakan untuk mengetahui jumlah sel yang masih hidup setelah pemberian ekstrak etanol daun Lavandula officinalis Chaix.

c. Konsentrasi IC50 adalah konsentrasi sampel yang mampu mematikan sel sebanyak 50% dari total sel. d. Apoptosis sel yang teramati adalah sel hidup berfluoresensi hijau terang, sel yang mengalami nekrosis berwarna oranye merata seperti sel normal, sel yang mengandung ERα berwarna coklat dan sel yang tidak mengandung ERα berwarna biru. e. Imunositokimia adalah metode yang digunakan untuk mengetahui adanya ekspresi suatu protein spesifik di dalam sel. f. Level ekspresi ERα populasi atau persentase sel yang berwarna coklat baik pada sitoplasma dan atau nukleus dalam tiga lapang pandang.

!


C. 1.

21

Bahan Penelitian

Bahan utama

a. Daun lavender (Lavandula officinalis Chaix) diperoleh dari distributor Dipokusumo Farm (Rasmala A4, Semarang Kota) yang dipanen pada bulan Juni 2014 b. Breast Cancer Cell Line T47D diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. 2.

Bahan kimia Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 70% (CV. Labora), PBS

(Phospate Buffer Saline), MK (Media Kultur) yang berisi Dulbeco’s Modified Eagle Media (DMEM) dan Roswell Park Memorial Institute (RPMI), Dimethyl Sulfoxide (DMSO), Reagen MTT 5mg/mL (50 mg MTT dan 10 mL PBS), Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 10% dalam 0,1N HCl (larutan stopper), Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisilin- streptomisin 1% (v/v) (Gibco), tripsin EDTA 0,25%, fungizone 0,5% (Gibco), reagen Annexin V Fluos (Roche), Propidium Iodine (Pi), reagen Imunositokimia yang terdiri dari metanol, larutan hidrogen peroksida, Novostain universal detection kit, antibodi monoklonal primer ERα (Thermo Fisher Scientific Pierce), biotinylated universal secondary antibodi (Lab Vision), etilen, xylol, dan hematoxylin (Dako). Bahan untuk kontrol positif adalah tablet tamoxifen 10 mg (Nolvadex), akuades, Streptavidin berupa Horse Radish Peroxidase (HRP), 3, 3’ – diaminobinzidine (DAB), etanol absolut

!


D.

22

Alat Penelitian

Treated tissue culture dish diameter 10 cm, 96 well-plate, 24 well-plate, 6 well-plate, cover slip, sentrifuge tube, object-glass, conical tube, eppendorf, inkubator CO2, Laminar air flow cabinet, mikropipet, yellow-tip, blue-tip, pinset, autoklaf, hemositometer, ELISA reader, kamera digital, mikroskop cahaya, rotary evaporator, mikroskop inverter, neraca digital.

E. 1.

Tata Cara Penelitian

Pengumpulan tanaman Tanaman Lavender officinalis Chaix dibeli dari perkebunan Dipokusumo

Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah, Indonesia) dipanen pada bulan Juni 2014. Bagian tanaman yang digunakan hanya bagian daun dan dipilih daun segar dengan ciri berwarna hijau, mengeluarkan aroma lavender, bentuk masih utuh dan sedikit lengket karena kandungan minyak atsiri. 2.

Determinasi tanaman Daun lavender yang telah diperoleh dari perkebunan Dipokusumo Farm

dilakukan determinasi atau identifikasi tanaman sesuai dengan Lampiran 1. 3. Sortasi basah Daun lavender dipisahkan dari bunga, batang dan akarnya serta pengotor lain seperti tanah yang menempel pada permukaan daun.

!


23

4. Pencucian Pencucian daun lavender dilakukan dengan menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali, pencucian dilakukan dengan hati–hati supaya daun lavender tetap dalam kondisi utuh. 5. Pembuatan serbuk daun lavender kering Daun lavender yang telah dicuci bersih dilakukan pengeringan suhu rendah dengan cara dimasukkan ke dalam lemari pendingin pada suhu 5-100C selama 14 hari, daun yang telah kering tersebut kemudian dibuat dalam bentuk serbuk dengan cara diblender hingga hancur dan diperoleh serbuk halus simplisia. 6. Pembuatan ekstrak etanol daun Lavandula officinalis Chaix Sebanyak 10 gram serbuk simplisia dilarutkan dengan 50 mL etanol 70% dalam erlenmeyer, kemudian dilakukan pengadukan dan dilanjutkan dengan maserasi selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Hasil maserasi yang diperoleh selanjutnya disaring dan diambil bagian cairan, kemudian dilakukan rotary evaporator pada suhu 800C selama 5 menit dilanjutkan dengan pemekatan dengan menggunakan waterbath selama 4,5 jam pada suhu yang sama, yaitu 800C hingga diperoleh hasil ektraksi dengan konsistensi kental berwarna hijau pekat. Hasil ekstraksi yang diperoleh ditimbang, ditempatkan dalam flakon, dan disimpan pada suhu ruang (Hajhashemi, dkk., 2003). 7. Pembuatan larutan uji a. Sampel ( ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix) Ekstrak kental ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam 100 µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000

!


24

µg/ mL. Selanjutnya dibuat delapan seri kadar pengenceran yaitu 1585 µg/mL; 1150 µg/mL; 1000 µg/mL; 562 µg/mL; 300 µg/mL; 178 µg/mL; 100 µg/mL; dan 10 µg/mL. b. Kontrol positif (Tablet tamoxifen) Larutan kontrol positif menggunakan tamoxifen dari 20 tablet Nolvadex yang tiap tabletnya mengandung 20 mg tamoxifen, ditimbang kemudian digerus hingga homogen. Sebanyak 10 mg dilarutkan dalam DMSO 100 µL, didapatkan larutan stok kontrol dengan konsentrasi 100.000 µg/ mL. Selanjutnya dibuat tujuh seri kadar pengenceran yaitu 1585 µg/mL; 1150 µg/mL; 1000 µg/mL; 300 µg/mL; 178 µg/mL; 100 µg/mL; dan 10 µg/mL (Setiawati, dkk., 2009). 8. Uji Sitotoksik ekstrak etanol daun Lavender pada sel T47D a. Perlakuan sel T47D Sel T47D yang telah diinkubasi selama 24 jam dikeluarkan dari inkubator dan dipindahkan menuju LAF (Laminar Air Flow), seluruh kegiatan uji sitotoksik dilakukan didalam LAF yang sebelumnya telah diberi penyinaran UV (Ultra Violet). Selanjutnya, seluruh media didalam well-plate dibuang dan ditiriskan, lalu segera dipipet 100 µL sampel dari setiap seri kadar dan dimasukkan kedalam lubang well-plate, dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Didalam satu well-plate yang berisi 96 lubang diisi oleh sampel, kontrol sel, kontrol positif (tablet tamoxifen). Selanjutnya, sel diinkubasi selama 24 jam didalam inkubator dan setelah inkubasi dilakukan pengamatan pada sel yang telah diberi perlakuan sampel dibawah mikroskop inverter, tidak semua lubang diamati, hanya diambil beberapa lubang yaitu pada konsentrasi tertinggi, tengah dan

!


25

terendah, bentuk sel diamati dan diambil gambar dengan menggunakan kamera digital. b. Metode MTT Seluruh reagen MTT dipersiapkan dengan cara mencampur 1 mL MTT dengan 10 mL MK kedalam conical tube, digojog secara perlahan karena sangat mudah berbuih. Selanjutnya, media yang terdapat pada sel T47D perlakuan dibuang dengan membalikan plate 1800 diatas tempat pembuangan dengan jarak 10 cm kemudian tekan plate secara perlahan diatas tisu untuk meniriskan sisa cairan. Larutan PBS dimasukkan sebanyak 100 µL kedalam semua sumuran yang telah berisi sel untuk mencuci sisa media yang masih bercampur dengan sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti perlakuan diatas. Ditambahkan reagen MTT yang telah dipersiapkan sebelumnya sebanyak 100 µL ke setiap sumuran, termasuk kontrol media, dilakukan inkubasi selama empat jam didalam inkubator CO2. Setelah itu, diamti kondisi sel dan formazan yang terbentuk dibawah mikroskop inverted, jika formasan telah terbentuk, ditambahkan 100 µL SDS 10% dalam 0,1N HCl. Plate dibungkus menggunakan alumunium foil dan diinkubasi pada tempat gelap selama semalam pada suhu kamar. (American Type Culture Collection, 2011). c. ELISA Reader ELISA reader dihidupkan dan ditunggu hingga proses regressing selesai. Pembungkus plate dan tutup plate dibuka kemudian plate dimasukkan kedalam ELISA reader, absorbansi yang diperoleh dibaca pada λ= 595 nm, ditekan tombol

!


26

start. ELISA reader dimatikan, kertas hasil pembacaan menggunakan ELISA reader di fotocopy dan ditempel pada logbook. Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat grafik absorbansi versus konsentrasi menggunakan program Microsoft Excell serta dilanjutkan dengan program R. Persentase sel yang hidup dihitung dengan rumus: (!"#$%&'"#(!!"#$%&'%(!!!"#$!%&"'!!"#$%"&!!"#$%)

Persentase sel hidup = (!"#$%"&'#(!!"#$%"&!!"#!!"#$%"&'#(!!"#$%"&!!"#$%) X 100% (Doyle dan Griffiths, 2000). 9. Uji apoptosis Annexin V Fluos a. Perlakuan sel Penanaman sel T47D dilakukan pada 6 well-plate, tiap sumuran diisi dengan 2 mL. Jumlah sel sekitar lima ratus ribu hingga satu juta sel. Diinkubasi selama 24 jam didalam inkubator CO2. Selanjutnya, plate sel yang telah diinkubasi diambil dan dimasukkan dalam LAF, seluruh media dalam sumuran disedot menggunakan micropipet dan dibuang. Selanjutnya dicuci PBS sebanyak satu kali, PBS disedot kembali menggunakan micropipet. Sampel pada konsentrasi IC50 dimasukkan dalam well-plate sebanyak 2 mL. Kemudian diinkubasi selama 24 jam. b. Pra Perlakuan Annexin V Fluos Well-plate yang telah diinkubasi dengan sampel diambil dan disiapkan conical tube untuk memindahkan media yang ada pada well-plate kedalam conical tube.sesuai dengan jenis masing- masing sampel yang ada, termasuk kontrol sel. Well-plate yang telah kosong dicuci menggunakan PBS sebanyak 1 mL. Kemudian, PBS ditarik kembali menggunakan micropipet dan dimasukkan

!


27

ke dalam conical tube yang sesuai dengan tiap sampel. Selanjutnya, dimasukkan tripsin kedalam well-plate sebanyak 200 µL, diinkubasi selama 3 menit, dan diamati menggunakan mikroskop hingga terlihat bentuk bulat transparan yang menunjukkan sel T47D. Ditambahkan MK sebanyak 1 mL kedalam plate, lalu disedot kembali dan ditampung pada conical tube. Dilakukan sentrifuge pada conical tube selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan yang terbentuk dibuang kemudian ditambahkan PBS dingin sebanyak 1 mL. Dilakukan resuspensi dan 1 mL cairan di dalam conical tube dipindahkan kedalam eppendorf 1 mL. Eppendorf disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. c. Pembuatan reagen Annexin V Fluos Eppendorf dibungkus dengan alumunium foil, diambil 550 mL buffer dan dimasukkan dalam eppendorf, ditambahkan reagen Annexin V Fluos 10 µL lalu di vortex dan ditambahkan reagen Pi 10 µL, di vortex kembali. (Setiap 100 µL larutan uji digunakan 2 µL reagen Annexin V Fluos dan 2 µL reagen Pi). d. Perlakuan sampel dengan reagen Annexin V Fluos Supernatan pada sampel dibuang dan disisakan endapan yang terbentuk, ditambahkan 100 µL reagen Annexin V Fluos yang telah dibuat kedalam endapan sampel. Dilakukan inkubasi selama 10 menit dalam ruang gelap (laci). Ditambahkan buffer 300 µL didalam eppendorf kemudian dilakukan analisis. (Roche, 2008).

!


28

10. Imunositokimia a. Perhitungan sel Sel yang berada di dalam cawan petri diberi MK hingga memenuhi permukaan cawan. MK diambil dan dimasukkan dalam conical tube. Cairan sel diambil sedikit dan dituang diatas kaca preparat untuk menghitung jumlah sel. Kaca preparat diletakan diatas Haemositometer (alat penghitung sel), kemudian diamati menggunakan mikroskop inverter perbesaran 10 kali dan dilakukan penghitungan dengan bantuan counter. Sel sudah sesuai dengan kriteria apabila jumLahnya antara minimal 50.000- 100.000 sel, jika hasil perhitungan sel sudah sesuai maka dilanjutkan dengan preparasi sel tersebut. Dimasukka 5 mL MK kedalam conical tube yang baru dan ditambahkan 1,25 mL sel dari conical tube awal kedalam conical tube yang berisi 5 mL MK. b. Subkultur sel Cover slip dimasukkan ke dalam well plate sesuai dengan jumlah sampel dan kontrol yang digunakan. Campuran MK dan sel yang ada di conical tube dimasukkan pada 24 well-plate yang telah diisi coverslip sebanyak 1 mL. Inkubasi dilakukan selama 24 jam didalam inkubator CO2. c. Perlakuan MK yang ada di dalam well plate disedot kemudian diisi dengan sampel sebanyak 1 mL. Di dalam well plate juga diberi kontrol sel, kontrol positif, dan kontrol negatif.

!


29

d. Perlakuan imunositokimia Coverslip dipindahkan diatas kaca preparat dengan bantuan pinset dan jarum agar tidak merusak sel dan peletakan coverslip juga harus tepat, tidak boleh terbalik. Pada ujung kaca preparat diberi label yang dilapisi dengan selotip agar tidak lepas atau sobek saat diberi perlakuan. Kaca preparat dipindahkan pada tempat kayu untuk memudahkan memberi reagen imunositokimia. Mula–mula dilakukan pencucian dengan PBS sebanyak dua kali dengan cara menggenangi coverslip yang ada diatas kaca preparat dengan PBS yang diambil menggunakan micropipet (asal tergenang). PBS ditarik atau disedot kembali dengan menggunakan micropipet yang berbeda, hal ini dilakukan dengan hati- hati agar coverslip tidak terjatuh. Lalu dilakukan fiksasi metanol selama 10 menit, fiksasi metanol juga dilakukan dengan cara yang sama dengan pencucian PBS yaitu dengan menggenangi coverslip dengan metanol dan menarik kembali setelah 10 menit. Selanjutnya, dilakukan pencucian PBS dua kali dan akuades dua kali, lalu dibuat campuran H2O2 : H2O = 1:9, campuran diambil sebanyak 100 µL untuk diteteskan diatas coverslip, didiamkan selama 10 menit kemudian ditarik/disedot kembali menggunakan micropipet yang berbeda. Kemudian, preparat dicuci PBS sebanyak dua kali. Larutan bloking ditambahkan 100 µL, didiamkan 10 menit dan kembali disedot. Antibodi primer ditambahkan sebanyak 50 µL dan didiamkan selama satu jam, antibodi primer dan diratakan dipermukaan coverslip, seluruh coverslip diberi antibodi primer kecuali kontrol negatif. Cairan disedot kemudian dibuang. PBS ditambahkan untuk pencucian. Antibodi sekunder universal ditambahkan sebanyak 100 µL dan didiamkan selama 20 menit, cairan disedot dan

!


30

kemudian dibuang. Streptavidin (HRP) ditambahkan sebanyak 100 µL, didiamkan selama 10 menit, cairan disedot kemudian dibuang. Proses pencucian PBS dilakukan sebanyak dua kali. Sebanyak 100 µL DAB ditambahkan dan didiamkan selama 2 menit. Akuades ditambahkan untuk mencuci sebanyak dua kali, disedot kemudian dibuang. Perwarna hematoxilin ditambahkan sebanyak 100 µL dan didiamkan selama 5 menit, kembali dicuci akuades dua kali hingga bersih dan warna biru dari pewarna hilang. Etanol absolut ditambahkan dengan cara menggenangi preparat dan langsung ditarik kembali kemudian digenangi xylol dan kembali langsung ditarik. Coverslip yang ada di atas preparat dikeringkan selama beberapa menit. Setelah kering, coverslip ditempel diatas object glass dengan cara memberikan setetes etilen dan diaratakan di atas coverslip. Preparat imunositokimia dapat diamati menggunakan mikroskop cahaya. (Javois, 1999).

!

!


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix terhadap viabilitas sel kanker payudara T47D dengan melihat aktivitas ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix dalam menekan ekspresi ERα serta untuk mengetahui IC50 ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix yang berpengaruh pada apoptosis sel kanker payudara T47D. Persentase viabilitas sel diketahui dari uji in vitro menggunakan MTT assay, deteksi apoptosis dilakukan dengan metode Annexin V Fluos dan dilanjutkan dengan uji imunositokimia untuk melihat ekspresi antigen spesifik pada sel terhadap estrogen-α secara molekuler. Tamoxifen digunakan sebagai kontrol positif karena tamoxifen telah diketahui dapat dipergunakan sebagai obat dalam terapi hormonal bagi penderita kanker payudara. A. Penyiapan Ekstrak Penelitian ini menggunakan sampel berupa tanaman yaitu daun L. officinalis Chaix. Determinasi daun L. officinalis Chaix pada penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa tanaman yang diguakan dalam penelitian ini memang benar tanaman yang dimaksud, yaitu L. officinalis Chaix. Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi merupakan bagian daun, hasil determinasi dibuktikan dengan adanya surat keterangan yang dikeluarkan langsung oleh unit determinasi di Laboratorium Biologi Farmasi. Hasil

31


32

determinasi menyatakan bahwa daun yang digunakan merupakan daun L. officinalis Chaix (Lampiran 1). Tahap selanjutnya dilakukan proses ekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 70% dan diharapkan seluruh kandungan zat aktif di dalam daun L. officinalis Chaix dapat tersari. Maserasi merupakan cara ekstraksi yang sederhana, yaitu dengan merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari, pada percobaan ini dilakukan maserasi selama 48 jam agar diperoleh rendemen ekstraksi dengan kadar yang tinggi. Prinsip maserasi adalah masuknya cairan penyari kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara zat terlarut didalam sel dengan yang diluar sel maka larutan didalam sel didesak keluar dan hal ini terjadi berulang kali hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan yang ada di dalam dan di luar sel. Hasil maserasi disaring untuk memisahkan bagian padat yang mengendap dengan bagian cairan, bagian cairan dilakukan pemekatan dengan bantuan rotary evaporator untuk menguapkan larutan penyari (etanol 70%) sehingga diperoleh hasil ekstraksi yang pekat, evaporasi dilakukan selama 5 menit karena jumlah cairan hasil ekstraksi sedikit, sehingga hanya memerlukan waktu singkat untuk menguapkan. Pemekatan dilanjutkan kembali menggunakan waterbath untuk menguapkan sisa–sisa etanol 70% yang masih ada.

B.

Uji sitotoksik ekstrak daun L.officinalis Chaix pada sel kanker payudara T47D dengan metode MTT Uji sitotoksik bertujuan untuk mengetahui potensi ketoksikan suatu

senyawa dengan parameter penurunan viabilitas sel. Metode MTT merupakan

!


33

metode kolorimetrik berdasarkan pada perubahan garam tetrazolium [3-(4,5-dimet iltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromide] (MTT) menjadi formazan dalam mitokondria yang aktif pada sel hidup. MTT diabsorbsi oleh sel hidup dan dipecah oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium yang termasuk dalam respirasi mitokondria, sehingga aktif menjadi bentuk formazan (Doyle dan Griffiths, 2000). Intensitas warna ungu dan jumlah kristal formazan yang terbentuk proporsional dengan viabilitas sel. Kemudian absorbansi dapat diukur menggunakan ELISA reader, hasil pembacaan ELISA terdapat pada Lampiran 3 dan 4.

! Gambar 8. Kristal formazan (A) kontrol sel; (B) perlakuan ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix

Ilustrasi gambar di atas merupakan contoh kristal formazan yang terbentuk pada kontrol sel dan perlakuan ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix. Intensitas warna ungu dan jumlah kristal formazan yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel yang hidup, pada kontrol sel terbentuk kristal formazan lebih banyak daripada perlakuan, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix mampu menghambat sel kanker payudara T47D. Namun perlu gambaran terkait sensitivitas ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix terhadap sel kanker payudara T47D sehingga dapat diperoleh suatu evaluasi mengenai kekuatan sitotoksik ekstrak dan pengaruhnya terhadap viabilitas sel T47D.

!


34

Sensitivitas ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix terhadap sel kanker payudara T47D diukur melalui nilai IC50, nilai IC50 menunjukkan konsentrasi ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix yang mampu mematikan setengah dari populasi sel T47D yang ada. Pada penelitian ini diperoleh nilai IC50 232,86 µg/mL yang dihitung secara statistik menggunakan program R, program R merupakan software statistik seperti halnya SPSS untuk analisis regresi namun memiliki kemampuan yang lebih baik dalam mengolah dan menganalis data, hal ini seperti yang dikemukakan oleh Darinus (2002). Hasil IC50 menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix memiliki sifat sitotoksik yang cukup lemah dibandingkan dengan nilai IC50 tamoxifen yaitu 13,98 µg/mL. Menurut Kamuhabwa (2000), suatu ekstrak dikatakan memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara apabila memiliki nilai IC50 ≤ 100 µg/mL, namun ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix tetap memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai antikanker karena dalam penelitian Machana (2011) menyebutkan bahwa ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai antikanker apabila memiliki nilai IC50 > 500 µg/mL. Nilai IC50 yang kurang sensitif diduga karena kompleksitas senyawa yang terkandung didalam ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix. Pengaruh ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix terhadap viabilitas sel kanker payudara T47D dapat diketahui dari suatu kurva sigmoid yang menunjukkan hubungan persentase viabilitas sel versus log konsentrasi ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix kemudian dibandingkan dengan kurva viabilitas sel dari tamoxifen. Berikut merupakan hasil pengukuran viabilitas sel kanker payudara T47D dengan perlakuan ekstrak etanol daun lavender.

!


35

Tabel I. Viabilitas sel kanker payudara T47D dengan perlakuan ekstak etanol daun lavender.

Konsentrasi % Viabilitas Sel (µg/mL) V1 V2 V3 1585 1,428 3,973 1,089 1150 2,446 3,125 1,937 1000 -0,269 -0,608 -0,438 300 3,973 7,196 12,965 178 98,982 108,483 111,198 100 111,876 119,171 117,984 10 92,874 115,100 114,421

x,ˉ ± SD 2,163 ± 1,576 2,502 ± 0,596 -0,438 ± 0,170 8,045 ± 4,,556 106,22 ± 6,414 116,344 ± 3,914 107,465 ± 12,640

Dari hasil yang disajikan diatas, maka dapat diketahui bahwa pemberian ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix berpengaruh pada viabilitas sel kanker payudara T47D, semakin meningkat konsentrasi ekstrak maka viabilitas sel semakin menurun. Salah satu kandungan senyawa alam yang mampu mempengaruhi viabilitas sel kanker payudara T47D adalah monoterpen. Monoterpen merupakan senyawa alam yang terkandung dalam L. officinalis Chaix dengan kadar tertinggi, senyawa ini memegang peranan penting sebagai agen kemopreventif dan memiliki aktivitas terapi pada tikus yang terinduksi sel kanker payudara T47D, hal ini dipaparkan oleh Satomi dkk. (1999) pada penellitiannya. Monoterpen juga mampu menghambat pertumbuhan sel kanker serta menginduksi apoptosis. Data yang diperoleh dibandingkan dengan perlakuan tamoxifen.

!


36

Tabel II. Viabilitas sel kanker payudara T47D dengan perlakuan tamoxifen.

Konsentrasi % Viabilitas Sel (µM) V1 V2 V3 1000 4,233 5,163 4,698 100 1,910 2,375 2,530 10 107,537 106,763 102,891 1 105,834 100,568 92,514 0,1 103,210 105,524 104,440 0,01 88,952 100,258 93,908

x,ˉ ± SD 4,698 ± 0,465 2,272 ± 0,322 105,731 ± 2,489 99,639 ± 6,708 104,388 ± 1,162 94,373 ± 5,667

Data tamoxifen menunjukkan hasil yang sama, yaitu bahwa semakin tinggi konsentrasi tamoxifen, persentase viabilitas sel kanker payudara T47D mengalami penurunan. Tamoxifen tergolong dalam terapi hormonal yang digunakan pada pasien penderita kanker payudara, mekanisme aksi tamoxifen diketahui dapat melalui dua aksi, yaitu 1) melakukan kompetisi dengan 17βestradiol (E2) pada lokasi reseptor untuk memblok peran promosi E2 pada kanker payudara; dan 2) dengan mengikat DNA setelah aktivasi metabolik (Yu dan Bender, 2001). Tamoxifen merupakan senyawa yang memiliki aktivitas antiestrogen dan menjadi inhibitor kompetitif bagi estrogen yang berikatan pada reseptornya (Osborne, 1998). Apabila tamoxifen berikatan dengan ERα maka ligand-activated transcription factor yang melakukan regulasi transkripsi pada nukleus berikatan dengan Estrogen Response Element (ERE) dan mempengaruhi aktivitas protein coregulator sehingga proliferasi dari estrogen dapat dihambat (Deroo dan Korach, 2006)

!


37

Gambar 9. Morfologi sel T47D (A) kontrol sel ; (B) ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix 1585 µg/mL; (C) ekstrak lavender 300 µg/mL; (D) ekstrak lavender 10 µg/mL; (E) tamoxifen (sel hidup: ;sel mati: )

Morfologi sel kanker payudara T47D diamati dibawah mikroskop inverter dan memberikan gambaran bahwa sel yang mati memiliki warna lebih gelap dan berbentuk bulat, hal ini terjadi karena sel kehilangan sitoplasma akibat rusaknya membran sel, sehingga sel tidak dapat meneruskan cahaya dari mikroskop. Sedangkan untuk sel yang masih hidup ditunjukkan dengan bentuk yang lebih lonjong dan warna terang. Perubahan morfologi sel perlu dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui kemampuan ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix dalam menginduksi apoptosis sel kanker payudara T47D pada konsentrasi IC50.

!


C.

38

Uji Apoptosis Ekstrak Etanol Daun L. Officinalis Chaix dengan Metode Annexin V Fluos Metode Annexin V Fluos digunakan dalam penelitian ini untuk

mengetahui jalur kematian sel akibat pemberian ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix. Metode ini dipilih karena dapat memberikan hasil kuantitatif yang cepat untuk mengetahui jumlah sel yang mengalami apoptosi melalui flow cytometer dan dapat membedakan sel yang mengalami nekrosis maupun sel yang mengalami apoptosis menggunakan reagen Annexin V Fluos dan Propidium Iodin (Pi). Mekanisme kematian sel dapat dibagi menjadi dua yaitu melalui mekanisme apoptosis dan nekrosis, proses kematian sel melalui mekanisme apoptosis penting digunakan sebagai indikasi selektifitas ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix sebagai agen kemopreventif. Mekanisme kematian sel dapat dilihat dari persentase total sel di setiap kuadran dengan menggunakan metode Annexin V Fluos. Hasil Annexin V Fluos kemudian dianalisis menggunakan alat bernama FACSCalibur (Gambar 10)

!


Gambar 10. Hasil pembacaan flow cytometer: (A) Kontrol sel; (B) Ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix; (C) Tamoxifen

Tabel III. Persentase jumlah sel kanker payudara T47D pada setiap kuadran

Kuadran I (Sel hidup) Kuadran II (Early apoptosis) Kuadran III (Late apoptosis) Kuadran IV (Nekrosis)

!

Kontrol sel

Ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix

Tamoxifen

91,85%

5,51%

4,55%

6,24%

25,27%

65,61%

1,75%

52,83%

27,62%

0,21%

16,62%

2,38%

39


40

Pada kuadran satu dengan warna hijau (Gambar 10) menunjukkan jumlah sel yang hidup, kuadran dua dengan warna kuning menunjukkan jumlah sel yang mengalami apoptosis tahap awal/early apoptosis, kuadran tiga dengan warna merah muda memberikan gambaran mengenai jumlah sel yang telah mengalami apoptosis, sedangkan untuk kuadran empat menunjukkan total sel yang mengalami nekrosis. Sistem pembagian kuadran mengacu pada penelitian Nurzijah dkk. (2012). Gambaran hasil flow cytometer mengindikasikan bahwa kematian sel kanker payudara T47D yang disebabkan karena pemberian ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix mengarah pada mekanisme apoptosis, karena sebanyak 25, 27% dari total sel menempati kuadran dua yang menandakan telah terjadi tahapan apoptosis awal, sedangkan sel yang mengalami late apoptosis sebanyak 52,83% dari total sel, sehingga total sel yang mengalami apoptosis adalah sebesar 78,10% dari total sel. Jalur pemacuan apoptosis oleh ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix diprediksikan melalui jalur intrinsik karena dalam penelitian yang dilakukan oleh Liston dkk. (2013), monoterpen dapat mempengaruhi interaksi interseluler dalam menginduksi sel kanker. Pada jalur intrinsik, protein caspase 3 memiliki peran aktif dalam memecah berbagai substrat, diantaranya enzim DNA untuk mengaktifkan caspase yang lain yang memberikan amplifikasi terhadap kerusakan seluler, adanya kerusakan seluler meningkatkan ekspresi dari protein p53 yang menyebabkan terjadinya apoptosis. Kedua perlakuan baik tamoxifen maupun ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix menunjukkan bahwa pada konsentrasi IC50 yang digunakan, sel

!


41

yang mati melebihi 50%, hal ini dapat diakibatkan karena waktu inkubasi sel yang melebihi 24 jam, sehingga banyak sel yang telah mengalami kematian sebelum dilakukan uji Annexin V Fluos. Setelah dilakukan uji Annexin V Fluos terhadap ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix, analisis efek antikanker dilanjutkan menggunakan metode imunositokimia untuk mengetahui interaksi molekuler ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix terhadap ERα.

D.

Uji Ekspresi ERα menggunakan Metode Imunositokimia

Metode imunositokimia digunakan untuk mengetahui adanya ekspresi suatu protein spesifik dengan menggunakan antibodi spesifik yang berikatan dengan protein, pada penelitian ini antibodi primer yang digunakan adalah estrogen alfa. Antibodi ini berikatan dengan reseptor ERα yang ada di sel kanker payudara T47D sehingga sel tersebut dapat mengekspresikan reseptor estrogen dengan memberikan warna coklat ketika diberi pewarna DAB dari reagen imunositokimia. Pada penelitian ini digunakan metode imunositokimia indirect (tidak langsung) yang dapat memberikan hasil lebih sensitif karena antibodi primer dikenali oleh antibodi sekunder yang berikatan kovalen dengan marker (sebagai penanda) sehingga membuatnya mudah terdeteksi (Albert, dkk., 1994).

!


42

Gambar 11. Morfologi ekspresi estrogen sel T47D (A) Kontrol sel dengan pemberian antibodi; (B) Kontrol sel tanpa antibodi; (C) perlakuan ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix pada IC50; (D) perlakuan tamoxifen (mengekspresikan ERα: ; tidak mengekspresikan ERα: )

Berdasarkan pengamatan, kontrol sel dengan pemberian antibodi memiliki sel dengan warna sitoplasma coklat (bagian pinggir), warna coklat pada sel terjadi karena pewarna DAB yang bereaksi dengan H2O2 dari HRP, sehingga menimbulkan warna coklat, sedangkan HRP berikatan pada antibodi primer dan antibodi sekunder yang aktif bekerja pada ERα. Sedangkan pada pengamatan sel dengan pemberian ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix memberikan warna biru atau ungu pada sel, hal ini dikarenakan ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix menghambat ikatan antibodi primer (estrogen alfa) dengan ERα pada sel T47D, sehingga ERα tidak diekspresikan dan pewarna Mayer yang memberikan warna ungu pada sel. Selanjutnya distribusi ekspresi ERα dapat diketahui dan dihitung menggunakan metode scoring system. Metode ini memberikan gambaran terkait level ekspresi ERα dengan menghitung jumlah sel T47D yang mengekspresikan ERα dari tiga lapang pandang yang berbeda saat dilakukan pengamatan di bawah mikroskop (Vang, dkk., 2006). Mekanisme perhitungan sel

!


43

dilakukan secara blind dengan tiga orang pengamat independen untuk menghindari subyektivitas. Proses perhitungan dibandingkan dengan kontrol sel dengan antibodi dan tanpa antibodi sehingga perbedaan warna antara sel yang mengekspresikan ERα dan tidak dapat nampak dengan jelas. Tabel IV. Perhitungan ekspresi ERα pada kontrol sel dengan dan tanpa antibodi (metode scoring system) menurut Vang dkk. (2006)

Level ekspresi ERα Pengamat Kontrol sel dengan antibodi

Kontrol sel tanpa antibodi

L1

L2

L3

L1

L2

L3

1

175

101

177

0

0

0

2

175

101

177

0

0

0

3

175

101

177

0

0

0

Total sel %

175

101

177

514

365

193

100%

100%

100%

0%

0%

0%

Level

4+

4+

4+

0

0

0

!

Data perhitungan kontrol sel tanpa antibodi menunjukkan bahwa ERα tidak diekspresikan karena ERα pada sel T47D tidak berikatan dengan estrogen alfa sehingga pewarna Mayer berikatan dengan ERα dan memberikan warna biru atau ungu pada sitoplasma sel T47D. Sedangkan pada kontrol sel dengan antibodi memberikan level ekspresi ERα bernilai 4+, hal ini menunjukkan bahwa antibodi primer yang diberikan pada sel T47D dapat berikatan seluruhnya, sehingga ERα diekspresikan sepenuhnya.

!


44

Tabel V. Perhitungan ekspresi ERα pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix dan tamoxifen (metode scoring system) menurut Vang dkk. (2006).

Level ekspresi ERα Ekstrak etanol daun

Pengamat

Tamoxifen

L.officinalis Chaix L1

L2

L3

L1

L2

L3

1

0

0

0

0

0

0

2

0

0

0

0

0

0

3

0

0

0

0

0

0

Total sel %

165

115

121

56

80

63

0%

0%

0%

0%

0%

0%

Level

0

0

0

0

0

0

metode

scoring

Hasil

tabel

perhitungan

menggunakan

system

menunjukkan bahwa level ekspresi ERα pada sel T47D dengan pemberian ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix adalah 0 (nol), hal ini mengindikasikan bahwa seluruh ERα telah diduduki oleh senyawa yang terkandung pada ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix dan menandakan bahwa kematian sel tergolong dalam ER-dependent dimana kematian sel dikendalikan oleh ERα. Hal yang sama juga terjadi pada pemberian tamoxifen terhadap sel kanker payudara T47D, skala level ekspresi yang ditimbulkan akibat pemberian tamoxifen adalah 0 (nol), karena tamoxifen berperan sebagai inhibitor kompetitif bagi estrogen alfa yang berikatan dengan ERα, sehingga tamoxifen dapat menghambat ekspresi ERα termasuk faktor pertumbuhan dan faktor angiogenik yang disekresikan oleh sel kanker dan mempengaruhi proses pertumbuhan sel kanker, hal ini dinyatakan dalam penelitian yang dilakukan oleh Osborne (1998).

!


45

Pengujian ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix pada sel kanker payudara T47D memberikan hasil bahwa ekstrak tersebut telah mampu menekan ekspresi ERα dengan mekanisme kematian sel apoptosis. Senyawa yang berperan langsung dalam mekanisme tersebut dapat diketahui dengan melakukan sebuah pengujian lebih lanjut untuk mengkonfirmasi kandungan-kandungan yang terdapat dalam ekstrak etanol daun L.Officinalis Chaix. Salah satu penelitian yang pernah dilakukan oleh Nevein dkk. (2014) menunjukkan bahwa kandungan tertinggi dalam L. Officinalis Chaix adalah monoterpen dan penelitian lain yang serupa pernah dilakukan oleh Saadatian dkk. (2013) yang menganalisis kandungan senyawa dalam ekstrak etanol 70% L. Officinalis Chaix menggunakan Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC-MS), namun senyawa yang teridentifikasi senyawa volatil, sehingga perlu adanya metode analisis lain seperti menggunakan

High

Performance

Liquid

Chromatography

(HPLC)

dan

kromatografi lapis tipis (KLT). Menurut penelitian yang dilakukan oleh Crowell (1997), monoterpen memiliki aktivitas kemopreventif pada kanker payudara dengan menghambat proses karsinogenesis pada fase inisiasi maupun promosi atau progesi. Fase inisiasi merupakan tahapan awal dalam proses karsinogenesis, senyawa inisiator tidak reaktif terhadap DNA, namun diubah melalui enzim pemetabolime obat didalam tubuh yang dapat menyebabkan mutasi DNA (Devi, 1989). Apabila proses karsinogenesis pada proses inisiasi dapat dihambat, maka perubahan genetik DNA yang permanen akibat ikatan irreversible senyawa inisiator dapat dicegah dan DNA dapat menghasilkan kode genetik yang sesuai.

!


46

Selain itu, monoterpen juga memiliki aktivitas molekuler yang berpotensi untuk mendasari index terapetik yang positif, pada penelitian Gould (1997) dikatakan bahwa monoterpen mampu menghambat isoprenilasi small G protein, isoprenilasi protein memegang peranan penting dalam fungsionalisasi protein yang mampu memacu terjadinya kanker (McTaggart, 2006). Penghambatan ini dapat mengubah sinyal transduksi dan mengakibatkan ekspresi gen yang berubah, hasil dari ekspresi gen yang baru telah diidentifikasi mampu menurunkan regresi dari karsinoma kelenjar payudara.

!

!


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A.

Kesimpulan

Ekstrak etanol daun lavender mempunyai efek sitotoksik pada sel kanker payudara T47D serta menginduksi apoptosis dengan nilai IC50 sebesar 232,86 µg/mL dan mampu menekan ekspresi protein ERα.

B. Saran 1.

Perlu dilakukan proses pengujian lebih lanjut untuk mengetahui senyawasenyawa yang terkandung di dalam ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix.

2.

Potensi ketoksikan dari ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix perlu ditingkatkan dengan mengujikannya pada model sel kanker payudara lain.

3.

Penelitian

dilanjutkan

dengan

membuat

suatu

formulasi

sediaan

menggunakan ekstrak etanol daun Lavandula officinalis Chaix sebagai obat kemopreventif.

47


48

DAFTAR PUSTAKA

A

Adjo, J., dan Lin, S., 2012, Comparison of Functional Proteomic Analyses of Human Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF7, Plos One, 7(2), 1-4. Alberts, B. dkk.. 1994. Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, New York, 186-188. American Type Culture Collection, 2011, MTT Cell Proliferation Assay, University Boulevard, www.atcc.org, diakses tanggal 20 Februari 2015. Bardon, S., Picard, K., dan Martel, P., 2002, Monoterpene Inhibit Cell Growth, Cell Cycle Progession, and Cyclin D1 Gene Expression in Human Breast Cancer Cell Lines, Nutrition and Cancer, 32(1), 1-7. Chu, C., dan Kemper, K., 2001, Lavender Longwood Herbal Task Force, http://www.mcp.edu/herbal/, diakses tanggal 12 Desember 2014. Compston, J., 2001, Sex Steroids and Bone, APS, 81(1), 429. Crowell, P., 1997, Monoterpenes in Breast Cancer Chemopreventive, Breast Cancer Research anf Treatment, 46, 191- 197. Deroo, B., dan Korach, K., 2006, Estrogen Receptors and Human Disease, JCI, 116 (3). Darinus, O., 2002, Aplikasi software R dalam analisis regressi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara. Devi, U., 1989, Basics of Carcinogenesis, Health Administrator, 17 (1), 16- 24. Doyle, A., dan Griffiths J.B., 2000, Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology, John Willey & Sons LTD, New York, 62- 64. European Medicines Agency, 2011, Assessment report on Lavandula angustifolia Mill., aetheroleum and Lavandula angustifolia Mill., flos, HMPC,16d(1). Gould, M., 1997, Cancer Chemoprevention and Therapy by Monoterpenes, Enviromental Health Perspectives, 105 (4), 977- 979. Hajhashemi, V., Ghannadi, A., dan Sharif, B., 2003, Anti-inflammatory and analgesic properties of the leaf extracts and essential oil of Lavandula angustifolia Mill., Journal of Ethnopharmacology, 89(2003), pp. 67- 71. Handayani, S., 2012, Selaginella Active Fractions Induce Apoptosis On T47d Breast Cancer Cell, Indonesian J. Pharm., 23(1), 48-50.

!


49

Hayashi dkk., 2003, The Expression and Function of Estrogen Receptor α and β in Human Breast Cancer and its Clinical Application, Endocrine- Realted Cancer, 10, 193- 202. Hondermarck, H., 2003, Breast Cancer : When Proteomics Challenges Biological Complexity, Molecular and Proteomics, 2, 281- 291. Istvan, V., Haanen, C., Nakken, H., dan Reutelingsperger, C., 1995, A novel assay for apoptosis Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V, Journal of Immunological Methods, 1, 184. !

Javois, L., 1999, Immunocytochemical Methods and Protocol 2nd Ed., Humana Press, USA, 3-10. Johnson, A., dkk., 2002, Molecular Biology of the Cell. 4th edition, Garland Science, New York, 335. Kamuhabwa, A., Nshimo, C., dan de Witte P., 2000, Cytotoxicity of some medicinal plant extracts used in Tanzanian traditional medicine, J. Ethnopharmacol, 70(2), 143- 149. !

Karolina, H., dkk., 2010,! RMolecular subtypes of breast cancer are associated with characteristic DNA methylation patterns, CBR, 12, 1- 16. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2014, Hilangkan Mitos tentang Kanker, http://www.depkes.go.id/article/print/201407070001/hilangkanmitos-tentang-kanker.html, diakses tanggal 10 Mei 2014. Lim, T., 2014, Lavandula angustifolia, Edible Medicinal and Non Medicinal Plant, 8, 165-167. Liston, B., dkk., 2003, Perillyl Alcohol as Chemopreventive Agent in NNitrosomethylbenzylamine-induced Rat Esophageal Tumorigenesis, American Association for Cancer Research, 2399-2403. Lumongga, F., 2008, Apoptosis, Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan, 2-4. Macey, M., 2007, Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science & Business Media, Totowa, pp. 1-2.

!


50

Machana, S., Weerapreeyakul, N., Barusrux, S., Nonpunya, A., Sripanidkulchai, B., Thitimetharoch, T., 2011, Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line, Chin Med.,6(1), 1-8. McTaggart, S., 2006, Isoprenylated Protein, Cell. Mol. Life. Sci, 63, 255- 267. Mann, M., Cortez, V., and Vadlamudi, K., 2011, Epigenetics of Estrogen Receptor Signaling: Role in Hormonal Cancer Progression and Therapy, Cancers, 3, 1691- 1699. National Cancer Institue, 2013, Breast Cancer Treatment, http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/breast/Patient/page1. Diakses tanggal 1 juli 2014. Neumann, B., dan Rossi, M., 2012, Effects of Exemestane on Two-Dimensional and Three-Dimensional T47D Breast Cancer Cell Cultures, University of New Haven Summer Undergraduate Research Fellowship 2012, 1-4. Nevein, M., Gamil, M., dan Nagi, F., 2014, Phytochemical Studies and In Vivo Antioxidant Activity of Two Lavandula Species (Lamiaceae) Against Streptozotocin Induced Oxidative Stress in Albino Rats, JBPR, 4(3), 30-40. Hurzijah, I., Putri, D., Rivanti, E., dan Meiyanto, E., 2012, Secang (Caesalpinia sappan L.) Heartwood Ethanolic Extract Shows Activity as Doxorubicin Co-chemotherapeutic Agent by Apoptosis Induction on T47D Breast Cancer Cells, ISCC, 3(2), 377-384. Osborne, K., 1998, Tamoxifen in the Treatment of Breast Cancer, The New England Journal of Medicine, 339(22), 1609-1912. Pilar,E., Bosch, A., Perez-Fidalgo, J., dan Lluch, A., 2012, Molecular biology in breast cancer: Intrinsic subtypes and signaling pathways, J.CTRV, 38(2012), 698- 707.

Prusinowska, R., 2014, Composition, biological properties and therapeutic effects of lavender (Lavandula angustifolia L.). A review, Hepo., 60 (2), 5662. Pubchem, 2015, Open Chemistry Database, NIH, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Linalool#section=Top, diakses tanggal 19 Februari 2015. Pubchem, 2015, Open Chemistry http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/8294, Februari 2015.

!

Database, NIH, diakses tanggal 19


Pubchem, 2015, Open Chemistry Database, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/323#section=Top, tanggal 19 Februari 2015. Pubchem, 2015, Open Chemistry http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/64945, Februari 2015.

51

NIH, diakses

Database, NIH, diakses tanggal 19

PubMed Health, 2014, Breast Cancer Treatment, PDQ, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0032825/, diakses tanggal 19 Februari 2015.

Rabiei, Z., dan Rafieian, M., 2014, Neuroprotective effect of pretreatment with Lavandula officinalis ethanolic extract on blood- brain barrier permeability in a rat stroke model, Asian Pac. J. Trop. Med,7 (1), 421- 426. Rapper, S., Kamatou, G., Viljoen, A., dan Vuuren S., 2013, The In Vitro Antimicrobial Activity of Lavandula angustifolia Essential Oil in Combination with Other Aroma Therapeutic Oils, Evidence-Baed Complementary and Alternative Medicine, 2013, 1- 10. Richard, W., 2010, Immunocytochemistry: A Pratical Guide for Biomedical Research, Springer, 1-2. Richard, W., 2011, Control for Immunocytochemistry: An Update, JHC, 59(1), 612. Roche, 2008, Apoptosis, Cytotoxicity, and Cell Proliferation, 4th edition, Roche Diagnostic GmbH, German, pp. 38- 41. Saadatian, M., Aghaei M., Farahpour, M., dan Balouchi, Z., 2013, Chemical composition of Lavender (Lavandula Officinalis L.) Extraction Extracted by Two Solvent Concentration, Glob. J. Med. Plant Res., 1(2), 214- 217. Satomi, Y., Miyamoto,S., dan Gould, M., 1999, Induction of AP-1 activity by Perillyl Alcohol in Breast Cancer Cells, Carcinogenesis, 20(10). Setiawati, A., Riswanto, F., Yuliani, S., dan Istyastono, E., 2014, Anticancer Activity of Mangosteen Pericarp Dry Extract Against MCF-7 Breast Cancer Cell Line through Estrogen Receptor –α, Indonesian J. Pharm., 25 (3), 119124. Strasser, A., O’ Connor, L., and Dixit, V., 2000, Apoptosis Signaling, Annurev. Biochem., 69 (1), 217- 245.

!


52

Terry, L., dkk., 2013, Cell Viability Assays, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, San Fransisco. Unites States Department of Agriculture, 2012, Lavandula officinalis Chaix, Natural Resources Conservation Service, http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=LAAN81. Diakses tanggal 10 Mei 2014. Vang, R., dkk., 2006, Immunohistochemistry for estrogen and progesterone receptors in the distinction of primary and metastatic mucinous tumors in the ovary: an analysis of 124 cases, MPG, 19, 99-102. World Health Organization, 2007, WHO Monograph on Selected Medicinal Plants, volume 3, WHO Press, Geneva, 219- 225. Yu, F., dan Bender W., 2001, The Mechanism of Tamoxifen in Breast Cancer Prevention, Breast Cancer Reasearch, 3(1), 22.

!


LAMPIRAN

!

53


54

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi sampel daun L. officinalis Chaix

!


55

Lampiran 2. Perhitungan seri kadar ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix dan tamoxifen

a. Ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix 10 mg + 100 µL DMSO = 100.000 µg/mL Intermediet (int): 2000 µg/mL= 30 µL bulk + 1470 µL MK C1 (1585 µg/mL)

= 396 µL (int) + 104 µL MK

C2 (1150 µg/mL)

= 288 µL (int) + 212 µL MK

C3 (1000 µg/mL)

= 250 µL (int) + 250 µL MK

C4 (300 µg/mL)

= 75 µL (int) + 425 µL MK

C5 (178 µg/mL)

= 45 µL (int) + 455 µL MK

C6 (100 µg/mL)

= 50 µL C3

+ 450 µL MK

C7 (10 µg/mL)

= 50 µL C7

+ 450 µL MK

b. Tamoxifen (2000 µM) C1 (315 µg/mL)

= 79 µL bulk + 421 µL MK

C2 (175 µg/mL)


C3 (100 µg/mL)


C4 (60 µg/mL)


C5 (35 µg/mL)


C6 (20 µg/mL)


C7 (10 µg/mL)

= 50 µL C7

+ 450 µL MK

C8 (1 µg/mL)

= 50 µL C7

+ 450 µL MK

!


56

Lampiran 3. Tabel viabilitas sel T47D dengan pemberian ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix.

NO KONSENTRASI LOG+KONSENTRASI 1 2 3 5 6 7 8

1585 1150 1000 300 178 100 10

A1 0,105 0,111 0,095 0,12 0,68 0,756 0,644

V1 1,428 2,446 ,0,269 3,973 98,982 111,876 92,874

!

3,200 3,061 3 2,477 2,250 2 1

ABSORBANSI A2 A3 rata(rata 0,12 0,103 0,109 0,115 0,108 0,111 0,093 0,094 0,094 0,139 0,173 0,144 0,736 0,752 0,723 0,799 0,792 0,782 0,775 0,771 0,730

%)VIABILITAS)SEL V2 V3 RATA(RATA) 3,973 1,089 2,163 3,125 1,937 2,502 ,0,608 ,0,438 ,0,438 7,196 12,965 8,045 108,483 111,198 106,221 119,171 117,984 116,344 115,100 114,421 107,465

SD 1,576 0,596 0,170 4,556 6,414 3,914 12,640


Lampiran 4. Tabel viabilitas sel T47D dengan pemberian tamoxifen.

NO KONSENTRASI LOG*KONSENTRASI 1 2 3 4 5 6

1000 100 10 1 0,1 0,01

A1 0,122 0,107 0,789 0,778 0,761 0,669

V1 4,233 1,910 107,537 105,834 103,201 88,952

!

3 2 1 0 &1 &2

ABSORBANSI A2 A3 rata(rata 0,128 0,125 0,125 0,11 0,111 0,109 0,784 0,759 0,777 0,744 0,692 0,738 0,776 0,769 0,769 0,742 0,701 0,704

%)VIABILITAS)SEL V2 V3 RATA(RATA) 5,163 4,698 4,698 2,375 2,530 2,272 106,763 102,891 105,731 100,568 92,514 99,639 105,524 104,440 104,388 100,258 93,908 94,373

SD 0,465 0,322 2,489 6,708 1,162 5,667

57


Lampiran 5. Hasil analisis IC50 ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix menggunakan program R.

!

58


Lampiran 6. Hasil analisis IC50 tamoxifen menggunakan program R.

!

59


60

Lampiran 7. Pengamatan tiga lapang pandang sel T47D dalam perhitungan imunositokimia

A. Perlakuan esktrak etanol daun L. officinalis Chaix.

B. Perlakuan tamoxifen

C. Kontrol sel dengan pemberian antibodi

D. Kontrol sel tanpa antibodi

!


61

BIOGRAFI PENULIS

Winda Sekarjati. Penulis lahir pada tanggal 28 Agustus 1992 di Yogyakarta dan merupakan anak kedua dari tiga bersaudara, memiliki kakak bernama Datia Kurniawitri dan adik bernama Pandu Yogaswara. Penulis lahir dari pasangan suami- istri Sudarto dan Tatik Retno Wulan dan telah menempuh pendidikan di SD Lempuyang Wangi pada tahun 1999 sampai tahun 2005, SMP Negeri 5 Yogyakarta pada tahun 2005 sampai dengan tahun 2008, SMA Negeri 8 Yogyakarta pada tahun 2008 sampai dengan tahun 2011, dan melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma pada tahun 2011 sampai dengan tahun 2015. Selama menjadi mahasiswa, penulis mengikuti beberapa kegiatan dan kepanitiaan, yaitu Program Kreativitas Mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat lolos didanai DIKTI (2013), Inisiasi Fakultas Farmasi yaitu TITRASI (Tiga Hari Temu Akrab Farmasi ) selama tiga tahun berturut- turut (2012-2014) menjabat sebagai anggota seksi acara, koordinator seksi acara dan steering committee (SC), Pelatihan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa (PPKM I) sebgai Co- Facilitator (2013), serta pernah mengambil pekerjaan part time (paruh waktu) di PT. DAGADU ASELI DJOKDJA sebagai Gardep (2014).

!

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents