PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

PERBANDINGAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.) DALAM MULTIEMULSI A/M/A DAN SUSPENSI LIPOSOM

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Eva Mayangsari NIM : 118114163

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015


PERBANDINGAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.) DALAM MULTIEMULSI A/M/A DAN SUSPENSI LIPOSOM

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Eva Mayangsari NIM : 118114163

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


PERSETUJUAN PEMBIMBING

ii


Pengesahan Skripsi Berjudul

HALAMAN PERSEMBAHAN

If someone wants something, and if they’re willing to work for it, they can achieve great things – Chris Colfer ( Land of Stories, The Wishing Spell)

The will to win, the desire to succeed, the urge to reach your full potential are the keys that will unclock the door to personal excellence - Confucius

Kupersembahkan skripsi ini untuk... Tuhan yang selalu memberkati, memberiku kekuatan, dan menuntunku pada jalan yang benar, Papa, Mama, saudaraku, dan teman-temanku tercinta atas doa, dukungan, dan kasih sayang, Dosen Fakultas Farmasi atas pengalaman dan pengetahuan yang berikan, Serta almamaterku.

iii


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

iv


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

v


PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala perlindungan dan berkat yang telah diberikan sehingga skripsi berjudul “Perbandingan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.)

dalam Multiemulsi A/M/A dan Suspensi Liposom” yang disusun untuk memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S. Farm.) dapat dikerjakan dengan baik dan lancar. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan dan campur tangan berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan rasa terimakasih kepada : 1.

Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah mengijinkan penulis menjalankan pembelajaran selama masa studi.

2.

Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt., selaku Dosen Pembimbing Skripsi yang telah membimbing, mendampingi, dan memberikan saran serta pengetahuan baru selama penelitian dan penyusunan skripsi.

3.

Beti Pudyastuti, M.Sc., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan kritik dan saran selama penyusunan skripsi.

4.

Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah mendampingi perkembangan perkuliahan dan memberikan saran serta motivasi.

vi


5.

Agustina

Setiawati,

M.Sc.,

Apt.

selaku

Kepala

Penanggungjawab

Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam penggunaan fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian ini. 6.

Drs. Sanjayadi, MSc., selaku dosen pembimbing pendamping yang telah membimbing, memberi banyak pengetahuan dan membuka wawasan serta motivasi selama penelitian dan penyusunan skripsi.

7.

Pak Bima, Pak Musrifin, Pak Kayat, Pak Wagiran, Pak Heru, Pak Parlan, Pak Kunto, dan Pak Bimo, Pak Iswandi, selaku laboran Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah membantu penulis dalam proses pelaksanaan penelitian di laboratorium.

8.

Papa dan Mama tercinta yang selalu memberi motivasi, perhatian, dukungan dan doa demi kelancaran studi dan keseluruhan proses pelaksanaan skripsi.

9.

Saudara-saudara tersayang, cece Evi, Evan, Megu, dan Awin yang selalu memberi saran akademis, selalu mengingatkan untuk tidak menyia-nyiakan waktu, membantu penyediaan alat, dan memberikan motivasi yang bermanfaat saat sedang down.

10. Teman-teman tim skripsi rosella, Yolana dan Meli atas segala bantuan, kerjasama dan semangat dalam penelitian ini dari awal hingga akhir dan kesabaran, dan atas kesabaran menghadapi emosiku yang labil. Selama penelitian ini kita semakin banyak mengenal lebih dalam sifat satu sama lain dan saya belajar banyak hal dari kalian. Maaf atas kesalahan perbuatan maupun perkataan, sengaja maupun tidak disengaja.

vii


11. Sahabat – sahabat dari bangku SMA, Victor, Alvin, Domi, Steven, dan Eric atas persahabatan, motivasi, doa, dukungan, nasihat yang diberikan serta kesediaan mendengar cerita kegalauanku dan cerita-cerita tentang penelitian ini walaupun kalian tidak begitu mengerti apa maksud cerita itu. 12. Tim skripsi analisis melon (Kiki, Devi, Lika, Miko), PPD (Verni, Canly, Shiro, Erita), dan udang (Yolanda dan Adit) di bawah bimbingan Ibu Sri Noegrohati dan Bapak Sanjayadi atas segala dukungan, bantuan serta sharing informasi terkait penelitian dan administratif. 13. Seluruh dosen, teman-teman FSM D, teman-teman FST-B 2011, serta seluruh angkatan 2011 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 14. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan baik. Penulis menyadari bahwa manusia tidak ada yang sempurna sehingga penulis berharap kritik dan saran dari semua pihak demi kemajuan di masa yang akan datang. Akhir kata, semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu Farmasi.

Penulis

viii


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................................... iii LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................. iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................. v PRAKATA

..................................................................................................... vi

DAFTAR ISI ..................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiii DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv INTISARI

................................................................................................... xvi

ABSTRACT .................................................................................................. xvii BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1 A. Latar Belakang .............................................................................................. 1 1. Perumusan masalah ................................................................................ 3 2. Manfaat penelitian .................................................................................. 4 3. Keaslian penelitian ................................................................................. 4 B. Tujuan penelitian .......................................................................................... 5 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................... 6 A. Antioksidan................................................................................................... 6 B. Radikal Bebas ............................................................................................... 7 C. Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) .................................................................... 8

ix


D. Multiemulsi A/M/A..................................................................................... 14 E. Komponen Pembentuk Multiemulsi ............................................................ 16 F. Stabilitas Multiemulsi ................................................................................. 21 G. Liposom...................................................................................................... 23 H. Kulit dan Fungsi Kulit ................................................................................. 26 I.

Metode DPPH ............................................................................................. 29

J.

Spektrofotometri Visibel ............................................................................. 30

K. Landasan Teori ........................................................................................... 32 L. Hipotesis ..................................................................................................... 34 BAB III METODOLOGI PENELITIAN............................................................ 35 A. Jenis Rancangan Penelitian ......................................................................... 35 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional .............................................. 35 1. Variabel penelitian ............................................................................... 35 2. Definisi operasional.............................................................................. 36 C. Bahan Penelitian ......................................................................................... 37 D. Alat Penelitian ............................................................................................ 38 E. Tata Cara Penelitian .................................................................................... 38 1. Ekstraksi kelopak bunga rosella ............................................................ 38 2. Penetapan bobot tetap ekstrak............................................................... 39 3. Formulasi dan optimasi multiemulsi A/M/A ......................................... 39 4. Evaluasi multiemulsi A/M/A ................................................................ 42 5. Penentuan aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A ekstrak rosella ..... 44 6. Evaluasi suspensi liposom .................................................................... 45 7. Penentuan aktivitas antioksidan suspensi liposom ekstrak rosella ......... 46 F. Analisis Hasil .............................................................................................. 47

x


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 49 A. Ekstraksi Kelopak Bunga Rosella ................................................................ 50 B. Penetapan Bobot Tetap Ekstrak Rosella ...................................................... 50 C. Pembuatan Multiemulsi A/M/A Ekstrak Rosella ......................................... 51 D. Hasil Evaluasi Multiemulsi A/M/A Ekstrak Rosella .................................... 55 1. Pengamatan organoleptis dan pH .......................................................... 55 2. Pengukuran diameter partikel rata-rata ................................................. 56 3. Uji tipe fase emulsi ............................................................................... 59 4. Uji mekanik (sentrifugasi) .................................................................... 59 5. Volume pemisahan ............................................................................... 59 E. Evaluasi Suspensi Liposom Ekstrak Rosella ................................................ 60 1. Pengamatan organoleptis dan pH .......................................................... 60 2. Pengukuran diameter partikel rata-rata ................................................. 61 F. Penentuan Aktivitas Antioksidan Multiemulsi A/M/A Ekstrak Rosella dan Liposom dengan Metode DPPH .................................................................. 62 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ............................... 63 2. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A dan liposom dengan metode DPPH ............................................................. 65 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.............................................................. 72 A. Kesimpulan ................................................................................................. 72 B. Saran........................................................................................................... 72 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 73 BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 104

xi


DAFTAR TABEL

Tabel I.

Konstituen fitokimia bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L.) ........ 10

Tabel II.

Rentang HLB dan aplikasinya ..................................................... 17

Tabel III.

Formula emulsi primer tipe air dalam minyak (A/M) ................... 55

Tabel IV.

Formula emulsi ganda tipe air dalam minyak dalam air (A/M/A). 55

xii


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

Tanaman rosella (Hibiscus sabdariffa L.) ...................................... 9

Gambar 2.

Sturuktur dasar antosianin ........................................................... 11

Gambar 3.

Jalur degradasi termal antosianin pada berbagai pH ..................... 12

Gambar 4.

Jenis-jenis droplet multiemulsi A/M/A ........................................ 15

Gambar 5.

Struktur Span 80 ......................................................................... 17

Gambar 6.

Struktur Tween 80 ....................................................................... 18

Gambar 7.

Struktur dimethicone ................................................................... 19

Gambar 8.

Struktur setil alkohol ................................................................... 19

Gambar 9.

Struktur xanthan gum .................................................................. 20

Gambar 10.

Proses ketidakstabilan emulsi sederhana ...................................... 22

Gambar 11.

Fusi pada liposom ....................................................................... 24

Gambar 12.

Reaksi reduksi DPPH oleh antioksidan ........................................ 30

Gambar 13.

Multiemulsi A/M/A ekstrak rosella ............................................. 55

Gambar 14.

Foto mikroskopik multiemulsi A/M/A ekstrak rosella hari ke–1 .. 58

Gambar 15.

Foto mikroskopik multiemulsi A/M/A ekstrak rosella hari ke–28 58

Gambar 16.

Suspensi liposom ekstrak rosella pada hari ke-1 .......................... 61

Gambar 17.

Foto mikroskopik suspensi liposom ekstrak rosella ..................... 62

Gambar 18.

Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh antosianin ........... 63

Gambar 19.

Pembentukan radikal bebas yang lebih stabil oleh resonansi ........ 63

Gambar 20.

Spektrum serapan larutan DPPH 0,0776 mM dalam metanol ....... 64

Gambar 21.

Reaksi peredaman radikal bebas oleh BHT .................................. 66

Gambar 22.

Kurva aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A .......................... 66

Gambar 23.

Perbandingan aktivitas antioksidan dan entrapment efficiency multiemulsi A/M/A ektrak rosella ............................................... 67 xiii


Gambar 24.

Kurva aktivitas antioksidan suspensi liposom .............................. 68

Gambar 25.

Laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom pada hari ke- 1 ........... 69

xiv


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.

Skema pembuatan emulsi ganda .................................................. 79

Lampiran 2.

Foto multiemulsi A/M/A selama rentang waktu pengujian .......... 80

Lampiran 3.

Foto hasil uji tipe fase emulsi ...................................................... 81

Lampiran 4.

Foto hasil uji mekanik (sentrifugasi) multiemulsi A/M/A ............ 82

Lampiran 5.

Foto hasil uji volume pemisahan multiemulsi A/M/A .................. 83

Lampiran 6.

Penetapan bobot tetap ekstrak rosella .......................................... 84

Lampiran 7.

Optimasi formula dan pencampuran multiemulsi A/M/A ekstrak rosella ......................................................................................... 85

Lampiran 8.

Perhitungan jumlah emulsifier campuran emulsi primer .............. 87

Lampiran 9.

Perhitungan diameter globul rata-rata .......................................... 88

Lampiran 10. Konsentrasi larutan uji ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A ........................................................................................ 90 Lampiran 11. Konsentrasi larutan uji ekstrak rosella dalam suspensi liposom.... 90 Lampiran 12. Penimbangan DPPH dan BHT untuk penentuan aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A .................................................. 91 Lampiran 13. Aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A ................................... 92 Lampiran 14. Penimbangan DPPH dan BHT untuk penentuan aktivitas antioksidan suspensi liposom ...................................................... 98 Lampiran 15. Aktivitas antioksidan suspensi liposom ekstrak rosella ................ 99 Lampiran 16. Uji signifikansi (t-test) IC50 multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ekstrak rosella setelah penyimpanan hari ke-1 .............. 102 Lampiran 17. Uji signifikansi (t-test) laju penurunan IC50 multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ekstrak rosella pada hari ke-1 hingga ke14 .............................................................................................. 103

xv


INTISARI Kelopak bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L.) memiliki aktivitas antioksidan dan berpotensi digunakan sebagai zat aktif dalam produk kosmetik. Penggunaan ekstrak kelopak bunga rosella secara topikal menyebabkan iritasi kulit dan mudah teroksidasi sehingga perlu diformulasikan dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sifat dan stabilitas fisis formula optimum multiemulsi A/M/A ekstrak rosella, serta mengevaluasi perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak kelopak bunga rosella dalam multiemulsi A/M/A dan dalam suspensi liposom. Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dianalisis menggunakan metode DPPH dengan spektrofotometer visibel selama 28 hari. Aktvitas antioksidan dinyatakan dalam Inhibition Concetration 50% (IC50). Perbedaan nilai IC50 ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan liposom diuji statistik t–test dengan taraf kepercayaan 95%. Hasil penelitian menunjukkan multiemulsi A/M/A dapat menjerap emulsi primer yang mengandung ekstrak rosella dan stabil sifat fisis dalam penyimpanan pada suhu 4oC selama 28 hari. Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam suspensi liposom lebih tinggi dibandingkan dalam multiemulsi A/M/A dengan signifikansi yang berbeda bermakna. Kata kunci: rosella, antioksidan, multiemulsi A/M/A, liposom, DPPH

xvi


ABSTRACT Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) has an antioxidant activity and potential to be used as an active ingredients in cosmetic products. The use of roselle extract topically causes dermal irritation and oxidation of active substance, therefor it needs to be formulated in W/O/W multiple emulsion and liposom suspension. The aim of this study was to find out the physical characteristic and stability of optimum formula of W/O/W multiple emulsion, and to evaluate the antioxidant activity of roselle extract in W/O/W multiple emulsion and liposome suspension. Antioxidant activity was assessed by DPPH method using visible spectrophotometer for 28 days. Antioxidant activity was expressed in inhibition concentration (IC50). The different of roselle extract IC50 value in W/O/W multiple emulsion and liposome suspension were analysed statistically using t-test with confidence level of 95%. The result showed that the W/O/W multiple emulsion could entrapped primary emulsion containing roselle extract and was stable for 28 days under storage of 4oC. Antioxidant activity of roselle extract was higher in liposome suspension compared in W/O/W multiple emulsion with high significant differences. Keywords : roselle, antioxidant, W/O/W multiple emulsion, liposome, DPPH

xvii


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Lingkungan memberikan dampak buruk bagi kulit manusia melalui radiasi ultraviolet (UV). Paparan cahaya matahari yang berlebihan dapat menimbulkan Reactive Oxygen Species (ROS) yang menyebabkan oksidasi terhadap molekul-molekul yang membentuk sel kulit. Peroksidasi lipid, kerusakan pada protein membran, dan mutasi DNA menyebabkan perubahan struktural dan fungsional kulit, serta dapat menginisiasi terjadinya berbagai penyakit (Stojiljković, Pavlović, dan Arsić, 2014). Tanda-tanda klinis tejadinya kerusakan kulit yaitu keriput, pigmentasi kulit, kulit kasar, kulit kering, memudarnya warna kulit, kemerahan, kanker dan melanoma (Pandel, Poljšak, Godic, dan Dahmane, 2013). Industri kosmetik berfokus pada pengembangan produk perawatan kulit untuk mengatasi permasalahan terhadap kulit, salah satunya adalah produk kosmetik yang mengandung antioksidan yang dapat membentuk sistem pertahanan terhadap faktor biologis (misalnya fitopatogen) maupun fisik (misalnya radiasi UV) yang menyebabkan pembentukan radikal bebas. Ketertarikan antioksidan alami terutama yang berasal dari tanaman semakin meningkat. Antioksidan alami digabungkan dalam produk kosmetik dan digunakan untuk perawatan rutin terhadap kulit (Gokturk, Ozkan, dan Yasar, 2007). Potensi antioksidan dari tanaman berhubungan dengan senyawa fenolik

1


2

yang terkandung, misalnya asam fenolat, flavonoid, antosianin, dan tanin (Djeridane, Yousfi, Nadjemi, Boutassouna, Stocker, dan Vidal, 2006). Hibiscus sabdariffa .L atau rosella merupakan tanaman dari famili Malvaceae dan digunakan oleh beberapa negara di dunia sebagai bahan makanan serta diaplikasikan dalam pengobatan seperti mengatasi hipertensi, gangguan hati, leukimia dan penyakit lainnya yang disebabkan oleh rusaknya material biologis dalam tubuh (Mohd-Esa, Hern, Ismail, dan Yee, 2010). Komponen aktif dalam ekstrak rosella yang memiliki efek antioksidan adalah senyawa

antosianin.

Penggunaan ekstrak rosella

secara topikal

menyebabkan iritasi pada kulit dan menurunnya aktivitas antioksidan senyawa antosianin akibat degradasi oleh faktor lingkungan antara lain suhu, cahaya, dan pH. Kenaikan suhu pada rentang pH 1-7 menyebabkan terbentuknya senyawa intermediet kalkon yang menimbulkan warna coklat pada ekstrak (Wallace dan Giusti, 2014). Selain itu, banyaknya gugus hidrofilik pada senyawa antosianin menyebabkan sulitnya penetrasi ekstrak rosella ke dalam struktur lipofilik dari stratum korneum (Pinsuwan, Amnuaikit, Ungphaiboon, dan Itharat, 2010). Antosianin dalam zat aktif ekstrak rosella dapat stabil dalam kondisi asam sehingga perlu diformulasikan dalam pembawa yang juga bersifat asam yang sesuai untuk menjaga dan meningkatkan aktivitas antioksidan serta membawa zat aktif ke tempat aksi yang dituju yaitu bagian epidermis kulit. Ekstrak rosella diformulasikan dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom yang memiliki kemampuan untuk melindungi zat aktif di dalam sistemnya terhadap lingkungan eksternal. Ekstrak rosella dalam fase air internal multiemulsi


3

A/M/A akan terlindungi oleh membran minyak yang membatasi fase air internal dan eksternal (Epstein dan Simion, 2001), sedangkan ekstrak rosella dalam inti polar vesikel liposom akan terlindung oleh membran fosfolipid lapis ganda (Shasi, Satinder, dan Bharat, 2012). Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ditetapkan menggunakan metode DPPH (2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl) dengan melihat nilai IC50 ekstrak rosella dalam kedua jenis formulasi tersebut. Metode DPPH merupakan metode yang banyak digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dalam waktu yang relatif singkat, mudah dan sederhana serta memberikan hasil yang memiliki reprodusibilitas yang tinggi. Senyawa DPPH sebagai radikal bebas akan mengalami reduksi dengan menerima atom hidrogen dari senyawa antosianin sehingga menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Molyneux, 2004). Aktivitas antioksidan ektrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom dibandingkan dan dievaluasi untuk mengetahui kemampuan masing-masing jenis formulasi tersebut dalam mengurangi kerusakan senyawa antosianin dalam ekstrak rosella.

1.

Perumusan masalah a.

Bagaimana sifat dan stabilitas fisis formula optimum multiemulsi A/M/A ekstrak rosella?

b.

Bagaimana perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom yang diuji dengan metode DPPH dan ditunjukkan dengan nilai IC50?


2.

4

Manfaat penelitian a.

Manfaat teoritis Penelitian ini menambah informasi dan ilmu pengetahuan mengenai metode yang digunakan untuk pengujian kadar antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom menggunakan metode DPPH.

b.

Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom.

3.

Keaslian penelitian Penelitian terkait ekstrak rosella yang pernah dilakukan yaitu: Liposom-Containing Hibiscus sabdariffa Calyx Extract Formulation with Increased Antioxidant Activity, Improved Dermal Penetration dan Reduce Dermal Toxicity Testing oleh Pinsuwan, Amnuaikit, Ungphaiboon, dan Itharat (2010). Penelitian tersebut belum melakukan penentuan aktivitas antioksidan ekstrak rosella setelah diformulasikan dalam liposom. Sejauh penelusuran pustaka oleh peneliti, penelitian mengenai perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom belum pernah dilakukan.


5

B. Tujuan 1.

Mengetahui sifat dan stabilitas fisis formula optimum multiemulsi A/MA .

2.

Mengetahui dan mengevaluasi perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan dalam suspensi liposom yang diuji dengan metode DPPH dan ditunjukkan dengan nilai IC50.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Antioksidan Antioksidan merupakan substansi yang secara langsung maupun tidak langsung menjaga sel dari efek samping yang ditimbulkan oleh xenobiotika, obat, karsinogen dan reaksi radikal toksik dengan mendonorkan elektron pada ROS. Beberapa senyawa penting yang memiliki efek antioksidan antara lain vitamin C (asam askorbat), vitamin E (α-tocopherol), vitamin A, β-karoten, polifenol, flavonoid, taurin, fitoeserogen, dan lain-lain. Antioksidan dari senyawa fenolik misalnya

3-(2)-tert-butyl-4–hydroxyanisole

(BHA),

3,5-di-tert-butyl-4-

hydroxytoluene (BHT), and t-butyl hydroquinone (t-BHQ) juga memiliki fungsi untuk mencegah oxidative stress (Mates, 2000). Antioksidan memiliki kemampuan untuk menetralisasi radikal bebas atau reaksinya pada berbagai kondisi. Antioksidan dibagi berdasarkan fungsinya, yaitu 1.

pencegahan pembentukan ROS misalnya superoksida dismutase (SOD) yang mengkatalisis dismutasi superperoksidan menjadi H2O2 dan katalase

2.

melakukan pencegatan terhadap reaksi radikal bebas dengan peredaman radikal misalnya pada antioksidan vitamin C dan E, flavonoid, dan kartenoid

3.

memperbaiki enzim yang terlibat dalam reaksi oksidasi untuk mengurangi tingkat kerusakan misalnya glutation (Devasagayam, Tilak, Baloor, Sane, Ghaskadbi, dan Lele, 2004). Walaupun sel biologis memiliki berbagi enzim antioksidan dan molekul

antioksidan, senyawa-senyawa tersebut mungkin belum cukup untuk menetralisasi

6


7

reaksi reduksi-oksidasi selama oxidative stress, sehingga diperlukan antioksidan eksogen untuk mencapai kondisi homeostatis reduksi-oksidasi dalam sel. Beberapa tanaman kaya akan antioksidan dan mikronutrien sehingga banyak dikembangkan sebagai antioksidan alami salah satunya adalah senyawa polifenol. Polifenol merupakan peredam ROS yang efektif karena adanya beberapa gugus hidroksil. Contoh antioksidan alami polifenol yang berasal dari tanaman yaitu lain vitamin E, flavonoid, derivat asam sinamat, kurkumin, kafein, katekin, derivat asam galat, antosianin, dan tanin (Kunwar dan Priyadarsini, 2011).

B. Radikal Bebas Radikal bebas merupakan molekul yang memiliki satu atau lebih elektron tak berpasangan. Radikal bebas yang paling sederhana adalah atom hidrogen dengan satu proton dan elektron. Contoh radikal bebas yaitu radikal dengan elektron tak berpasangan pada atom O (Reactive Oxygen Species / ROS) seperti superperoksida (O2•-) dan hidroksil (OH•), peroksil (ROO•), dan hidrogen peroksida (H2O2) (Halliwell, 2001). Pembentukan

ROS

intraseluler

umumnya

meliputi

radikal

superperoksida (O2•-) dan nitrit oksida (NO•). Pada keadaan fisiologi normal, sekitar 2% oksigen yang dikonsumsi oleh tubuh mengalami perubahan menjadi O2•- melalui proses respirasi mitokondria, fagositosis, dan lain-lain. Presentase ROS meningkat oleh infeksi, polutan, sinar UV, radiasi, dan lain-lain. Reactive Oxygen Species berpartisipasi dalam berbagai reksi kimia dengan molekul biologis yang menyebabkan kondisi patofisiologis yang dikenal sebagai oxidative stress. (Kunwar dan Priyadarsini, 2011). Radikal O2•- dan NO• dapat bereaksi


8

langsung pada beberapa molekul dalam tubuh namun jika diubah menjadi radikal pengoksidasi kuat seperti hidroksil (OH•), alkoksi (RO•), peroksil (ROO•) melalui reaksi transformasi kompleks maka dapat bereksi dengan molekul apapun (Halliwell, 2001). Kerusakan molekular yang disebabkan oleh radikal bebas dapat merusak fungsi sel dan bahkan menyebabkan kematian sel yang pada akhirnya menimbulkan berbagai penyakit. Reaksi antara radikal bebas dengan lipid menimbulkan peroksidasi lipid. Selama peroksidasi lipid, produk antara akan terbentuk dan memberikan efek merugikan jauh dari tempat pembentukannya, maka dari itu produk antara ini disebut juga sebagai second messenger. Radikal bebas seperti OH• bereksi dengan karbohidrat menyebabkan putusnya ikatan molekul penting seperti asam hialuronat. Interaksi ROS dengan DNA terutama terhadap basa purin dan pirimidin menghasilkan produk oksidatif dari purin dan pirimidin yang berimplikasi pada karsinogenesis, penuaan dan kerusakan DNA (Devasagayam dkk., 2004).

C. Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) 1.

Taksonomi Kerajaan

: Plantae

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Bangsa

: Malvales

Famili

: Malvaceae

Marga

: Hibiscus

Spesies

: Hibiscus sabdariffa L. (Backer dan Bakhuizen van den Brink, 1965).


2.

9

Deskripsi tanaman rosella (Hibiscus sabdariffa L.) Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) merupakan anggota famili Malvaceae. Rosella dapat tumbuh dengan baik di daerah beriklim tropis dan subtropis. Tanaman ini mempunyai habitat asli di daerah yang terbentang dari India sampai Malaysia. Rosella merupakan herba tahunan yang bisa mencapai ketinggian 0,5-3 meter. Batangnya bulat, tegak, berkayu, dan berwarna merah. Daunnya tunggal, berbentuk bulat telur, pertulangan menjari, ujung tumpul, tepi bergerigi, dan pangkal berlekuk. Panjang daun 6-15 cm dan lebarnya 5-8 cm.

Kelopak bunga rosella

(a)

(b)

Gambar 1. (a) Tanaman rosella (Hibiscus sabdariffa L.) dan (b) bagian kelopak bunga rosella (foto koleksi pribadi)

Bunga rosella yang keluar dari ketiak daun merupakan bunga tunggal. Bunga ini mempunyai 8-11 helai kelopak yang berbulu, panjangnya 1 cm, pangkalnya saling berlekatan, dan berwarna merah seperti terlihat dalam gambar 1. Mahkota bunga berbentuk corong, terdiri dari 5 helai, panjangnya 3-5 cm. Buahnya berbentuk kotak kerucut, berambut, berwarna


10

merah. Bentuk biji menyerupai ginjal, berbulu, dengan panjang 5 mm dan lebar 4 mm. Saat masih muda, biji berwarna putih dan setelah tua berubah menjadi abu-abu (Maryani dan Kristiana, 2005).

3.

Fitokimia bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L.) Bunga rosella kaya akan asam dan pektin. Analisis bunga rosella menunjukkan adanya protein sederhana dan mineral seperti besi, fosfor, kalsium, mangan, aluminium, magnesium, potasium, dan sodium. Kalsium sitrat, asam askorbat, gossypetin, dan hibiscin chlorideare juga terdapat pada bunga rosella seperti tercantum dalam tabel I (Mahadevan, Shivali, dan Kamboj, 2009). Tabel I. Konstituen fitokimia bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L.) Konstituen Protein Lemak Serat Kalsium Fosfor Besi Karoten Thiamin Riboflavin Niacin Asam askorbat

Jumlah (gram dan mg / 100g) 1,145 g 2,61 g 12,0 g 12,63 mg 273,2 mg 8,98 mg 0,029 mg 0,117 mg 0,277 mg 3,765 mg 6,7 mg (Mahadevan dkk., 2009)

Sebuah studi oleh Yang dkk., (2012) menunjukan bahwa ekstrak etanolik Hibiscus sabdariffa L. kaya akan senyawa polifenol dan antosianin. Senyawa tersebut dapat digunakan sebagai sumber antioksidan alami. Antosianin merupakan senyawa pigmen warna pada tanaman yang larut


11

dalam air dan termasuk dalam kelas senyawa flavonoid. Senyawa antosianin memiliki struktur dasar yang terdiri dari dua cincin aromatis (cincing A dan B) yang terikat bersama oleh tiga atom karbon membentuk cincin heterosiklik (cincin C) dengan gugus gula yang terikat pada atom karbon pada posisi C-3 atau A-5 (gambar 2). Berdasarkan nilai pH medium, antosianin dapat mengalami perubahan warna yaitu warna merah hingga jingga pada pH asam (pH 1-4) karena adanya ikatan rangkap terkonjugasi yang membawa muatan positif, tidak berwarna pada pH 5 dan 6 karena terbentuk senyawa karbinol dan kalkon, dan akan terdegradasi pada pH 7 (Miguel, 2011).

Gambar 2. Sturuktur dasar antosianin (Miguel, 2011)

Aktivitas antioksidan antosianin sangat bergantung pada struktur kimianya dan tidak semua menghasikan aktivitas yang sama dalam meredam ROS dan RNS. Kemampuan antioksidan antosianin bergantung pada orientasi struktural dari senyawa tersebut karena orientasi pada cincin aromatis akan menentukan atom hidrogen dari gugus hidroksil yang dapat berperan sebagai donor hidrogen dan menentukan pula kapasitas antosianin dalam membawa elektron yang tidak berpasangan (Kay, 2004). Efek peredaman radikal bebas oleh rosella bergantung pada donor hidrogen oleh senyawa antosianin yang


12

Menghasilkan radikal bebas baru yang distabilkan oleh resonansi (Farombi dan Fakoya, 2005).

Gambar 3. Jalur degradasi termal antosianin pada berbagai pH (Wallace dan Giusti, 2014)

Penurunan aktivitas antioksidan senyawa antosianin disebabkan oleh faktor lingkungan antara lain suhu, cahaya, dan pH selama penyimpanan yang menyebabkan perubahan warna dari merah menjadi kecoklatan. Perubahan ini memberikan dampak negatif terhadap penampilan produk dan aktivitas antioksdannya (Laleh, Frydoonfar, Heidary, Jameei, dan Zare, 2006). Kenaikan suhu pada pH 1-7 menyebabkan putusnya ikatan kovalen pada cincin pirilium dan membentuk senyawa kalkon yang berwarna coklat hingga akhirnya akan menghasilkan produk degradasi berupa molekul-molekul yang lebih kecil seperti kumarin glikosida pada pH 1 (gambar 3a) serta derivat


13

aldehid dan asam benzoat pada pH 3,5 dan 7 (gambar 3b dan 3c) (Wallace dan Giusti, 2014).

4.

Manfaat farmakologis bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L.) Rosella terkenal dan banyak digunakan sebagai tanaman obat yang memiliki beberapa khasiat. Bagian bunga tanaman rosella dapat berkhasiat sebagai antihipertensi dan kardioprotektif yang ditunjukkan dengan efektivitasnya terhadap penurunan tekanan darah pada pasien hipertensi. Bunga rosella menunjukkan efek proteksi terhadap sitotoksisitas dan genotoksisitas pada hepar. Mekanisme yang berkaitan dengan manfaat sebagai hepatoprotektif tersebut adalah peredaman radikal bebas oleh senyawa protochatecuic acid. Aktivitas anti oksidatif antosianin dalam rosell memiliki efek mencegah oksidasi LDL dan menyebabkan apoptosis sel kanker sehingga berkhasiat sebagai agen kemopreventif (Mahadevan dkk.,2009). Khasiat rosella sebagai antioksidan dan peredam radikal bebas ditunjukkan oleh ekstrak bunga rosella dalam etanol dapat meredam hidrogen peroksida dan radikal anion superperoksida. Penelitian oleh Tee, Yusof, dan Mohamed (2002) menentukan sifat antioksidatif ekstrak bunga rosella dan membandingkannya dengan tocopherol dan BHA. Hasil penelitian tersebut menyatakan bahwa ekstrak rosella memiliki efek antioksidan yang lebih kuat dibandingkan dengan tocopherol dan BHA. Efek penghambatan peroksidasi lipid yang dihasilkan diduga berasal dari antosianin, yang termasuk dalam kelompok senyawa fenolik dalam rosella (Mahadevan dkk.,2009).


14

D. Multiemulsi A/M/A Multiemulsi air dalam minyak dalam air (A/M/A) merupakan sistem emulsi di mana droplet air terjebak dalam droplet minyak yang berukuran lebih besar yang kemudian didispersikan kembali dalam fase air. Multiemulsi seperti ini sering diaplikasikan dalam produk kefarmasian dan kosmetik. Multiemulsi A/M/A mengandung dua jenis emulsi yaitu emulsi primer M/A dan emulsi sekunder A/M dalam air yang membutuhkan sedikitnya dua jenis emulsifier (zat pengemulsi) dalam formulasi yaitu emulsifier bernilai Hydrophile-Lipophile Balance (HLB) rendah untuk menstabilkan emulsi tipe A/M dan emulsifier bernilai HLB tinggi untuk menstabilkan emulsi tipe M/A (Jiao dan Burgess, 2008). Multiemulsi memiliki keuntungan yaitu dapat memberikan efek lepas lambat dari zat aktif yang terjebak dalam fase internal dan dapat membawa zat aktif yang tidak kompatibel satu sama lain dalam satu formula yang sama. Aplikasi multiemulsi berbasis air dalam industri kosmetik memberikan sensasi nyaman dengan pelepasan zat aktif yang lebih lambat. Selain itu juga akan memberikan sifat mudah tercuci dengan air (Epstein dan Simion, 2001). Multiemulsi

biasanya terbentuk dengan dua tahap emulsifikasi

menggunakan rotor konvensional atau homogenizer bertekanan tinggi. Emulsi primer dibuat dengan kondisi pencampuran kecepatan tinggi, sedangkan emulsi sekunder dibuat dengan kondisi pencampuran kecepatan rendah. Masalah utama dalam membuat multiemulsi A/M/A adalah stabilitas yang disebabkan oleh koalesen fase air, koalesen fase minyak, pecahnya lapisan minyak yang menyebabkan keluarnya droplet air internal, serta keluar masuknya air dan zat


15

aktif larut air melalui lapisan minyak antara kedua fase air. Beberapa cara yang dapat digunakan untuk mengatasi tidak stabilnya multiemulsi adalah dengan mengecilkan ukuran partikel droplet internal melalui pemilihan surfaktan yang sesuai dan meningkatkan stabilitas fase internal dan eksternal multiemulsi dengan menggunakan surfaktan polimerik untuk membentuk lapisan yang lebih kuat dan kaku pada permukaan antar fase (Kumar, Kumar, dan Mahadevan, 2012). Multiemulsi memiliki ukuran droplet yang lebih besar daripada emulsi biasa sehingga bersifat kurang stabil secara termodinamika. Pelepasan zat aktif dari fase dalam ke fase luar dan sebaliknya sering tidak terkendali. Stabilitas dan mekanisme pelepasan multiemulsi saling berhubungan dan memiliki keterkaitan (Lutz dan Aserin, 2008). Tipe A

Tipe B

Tipe C

Fase terdispersi primer Fase terdispersi sekunder Fase kontinue Gambar 4. Jenis-jenis droplet multiemulsi A/M/A (Myers, 2006)

Multiemulsi A/M/A terbagi menjadi tiga jenis berdasarkan sifat dasar droplet minyak (gambar 4) yaitu tipe A berisikan satu droplet internal berukuran besar dan terenkapsulasi oleh fase minyak; tipe B berisikan beberapa droplet internal yang berukuran kecil dan terpisah satu sama lain; dan tipe C berisikan


16

banyak droplet internal berukuran kecil dengan jarak yang dekat satu sama lain (Myers, 2006).

E. Komponen Pembentuk Multiemulsi 1.

Surfaktan (emulsifier agent) Surfaktan adalah molekul amfifilik yang terdiri dari bagian hidrofobik non polar yang berupa rantai hidrokarbon atau florokarbon lurus atau bercabang yang terdiri dari 8-18 atom karbon, yang terikat pada bagian polar atau ionik (hidrofilik). Bagian hidrofilik dapat berupa non ionik, ionik atau zwitterionik. Rantai hidrokarbon berinteraksi lemah dengan molekul air, sedangkan gugus polar atau ionik berinteraksi kuat dengan molekul air melalui ikatan dipol atau ion-dipol. Ikatan yang kuat dengan molekul air ini menyebabkan surfaktan larut di air. Keseimbangan antara bagian hidrofobik dan hidrofilik akan membentuk lapisan antar muka pada sistem serta suatu perkumpulan dalam larutan (membentuk misel) (Tadros, 2005). Surfaktan menurunkan energi bebas pada batas antar fase. Energi bebas pada antar muka disebut juga dengan tekanan antar muka atau tegangan permukaan. Semakin tinggi adsorpsi surfaktan maka semakin tinggi penurunan terhadap tekanan antar muka. Tingkat adsorpsi surfaktan pada antar muka bergantung pada struktur surfaktan dan sifat dari kedua fase yang bertemu pada antar muka (Tadros, 2005). Surfaktan juga membentuk misel. Pembentukan misel disebabkan oleh menurunnya kontak antara rantai hidrokarbon dengan air, dengan demikian akan menurunkan energi bebas sistem. Misel dalam solven polar


17

terbentuk karena gugus hidrofobik surfaktan menghadap bagian dalam agregat dan gugus polar menghadap bagian solven. Misel memiliki keseimbangan yang dinamis dan kecepatan perpindahan antara molekul surfaktan dan misel bergantung pada struktur dari molekul surfaktan (Tadros, 2005). Tabel II. Rentang HLB dan aplikasinya Rentang HLB Aplikasi 3–6 Emulsi A/M 7–9 Agent pembasah 8 – 18 Emulsi M/A 13 – 15 Detergen 15 – 18 Pelarut (Tadros, 2005) Pemilihan berbagai jenis surfaktan dalam membuat emulsi minyak dalam air (M/A) maupun air dalam minyak (A/M) seringkali berdasarkan pada dasar empiris. Berdasarkan dasar semi empiris dalam pemilihan surfaktan adalah dengan mengetahui nilai HLB (Hydrophilic–Lipophilic Balance) (tabel II). Nilai HLB ini didasarkan pada persentase relatif gugus hidrofil terhadap lipofil dalam molekul surfaktan (Tadros, 2005). a.

Span 80 O H 2C

O

HC

OH O OH

OH

Gambar 5. Struktur Span 80 (Rowe, Sheskey, dan Quinn, 2009)

Span 80 (gambar 5) mempunyai nama lain sorbitan monooleat sering digunakan dalam kosmetik sebagai surfaktan nonionik lipofilik. Umumnya Span 80 digunakan dalam formulasi farmasetik sebagai


18

emulsifiying agent untuk preparasi sediaan krim, emulsi, dan salep untuk aplikasi secara topikal. Kombinasi Span 80 dengan surfaktan polisorbat dengan kombinasi tertentu akan menghasilkan krim atau emulsi air dalam minyak atau minyak dalam air dengan konsistensi yang beragam. Span 80 berupa cairan kental berwarna kuning dengan nilai HLB sebesar 4,3. Penggunaan Span 80 sebagai emulsifying agent bersamaan dengan emulsifier hidrofilik adalah sebesar 1–10% (Rowe dkk., 2009). b.

Tween 80 H2 C H3 C

C H2

H2 C H 3C

H2 C

H C

x H2 C

H 3C

H2 C

H2 C C H2

H2 C C H2

z

CH

H2 C C H2

H yC

CH3 C CH2

CH 2

HC

CH 2

CH 2 C H2

w

w + x + y + z = 20

Gambar 6. Struktur Tween 80 (Rowe dkk., 2009)

Tween 80 (gambar 6) mempunyai nama lain polisorbat 80 merupakan surfaktan nonionik yang secara luas digunakan sebagai emulsifying agent dalam membuat emulsi minyak dalam air yang stabil. Tween 80 berupa cairan kental yang berminyak berwarna kuning dengan nilai HLB sebesar 15. Penggunaan Tween 80 sebagai emulsifying agent tunggal untuk menghasilkan emulsi minyak dalam air adalah sebesar 1– 15%, sedangkan penggunaan bersamaan dengan emulsifier hidrofilik adalah sebesar 1-10% (Rowe dkk., 2009).


2.

19

Dimethicone CH 3 H3 C

H3C

Si

CH3 Si

O

CH3 Si

CH3

O

n

H 3C

CH3

Gambar 7. Struktur dimethicone (Rowe dkk., 2009)

Dimethicone (gambar 7) memiliki nama lain dimethylpolysiloxane. Dimethicone digunakan dalam kosmetik. Dimethicone ditambahkan ke fase minyak sebagai antifoaming agent (penghilang busa) dalam air dalam minyak. Dimethicone berupa cairan bening tidak berwarna dengan kekentalan yang beragam. Penggunaan dimethicone dalam formulasi krim adalah sebesar 1030% (Rowe dkk., 2009).

3.

Stiffening agent (setil alkohol)

H

H

H

C

(CH 2) 14C

H

H

OH

Gambar 8. Struktur setil alkohol (Rowe dkk., 2009)

Setil alkohol (gambar 8) menghasilkan barrier mono-molekular dan padat pada lapisan antar muka suatu emulsi sehingga dapat mengurangi koalesen droplet, maka dari itu setil alkohol disebut juga sebagai peningkat konsistensi atau agen pembentuk. Setil alkohol berupa granul, lilin, kubus atau kepingan berwarna putih, berbau khas minyak, dan tidak memiliki rasa. Setil alkohol memiliki titik leleh yaitu 46-52°C. Penggunaan setil akohol sebgai stiffening agent adalah sebesar 2-10% (Rowe dkk., 2009).


4.

20

Biopolimer (xanthan gum) CH 2OH

CH2OH O

O

OH O

O

n OH

OH

CH2OR1

M+ = Na, K, 1/2 Ca

O

R1 = H /

OH

CCH 3

O

OH

R2, R3 = CH 2M

+

O

- +

CO2 M C

CH3

O

atau

OH

R2, R3 = H

CH 2OR 3 O

O

OH

atau R2 = H

OH

O

R3 =

O

OH CCH 3

R2O

Gambar 9. Struktur xanthan gum (Rowe dkk., 2009)

Xanthan gum (gambar 9) merupakan polisakarida dengan berat molekul yang besar. Tiap unit xanthan gum terdiri lima residu glukosa yaitu dua unit glukosa, dua unit manosa, dan satu unit asam glukoronat. Ikatan polimer terdiri dari tiga unit β-D-glukosa yang berikatan pada posisi satu dan empat, yang strukturnya menyerupai struktur selulosa. Xanthan gum berupa serbuk berwarna coklat muda atau putih dan tidak berbau.Xanthan gum sering digunakan dalam formulasi farmasetik, kosmetik dan makanan sebagai stabilizing agent dan thickening agent dalam emulsi karena bersifat non toksik, kompatibel dengan hampir semua bahan farmasetik, dan memiliki stabilitas dan viskositas yang baik pada kisaran pH 3-12 dan suhu 10-60 °C (Rowe dkk., 2009). Penggunaan xanthan gum sebagai thickening agent adalah sebesar lebih dari 2% dan stabil pada berbagai rentang pH (Billany, 2001).


21

F. Stabilitas Multiemulsi Proses pecahnya atau ketidakstabilan emulsi dapat terjadi akibat beberapa mekanisme. Faktor yang paling berpengaruh terhadap hal tersebut adalah menurunnya energi bebas sistem yang disebabkan berkurangnya area antarmuka. Mekanisme sederhana ketidakstabilan emulsi antara lain (gambar 10): 1.

Koalesensi Koalesensi mengacu pada bergabungnya dua atau lebih doplet membentuk suatu droplet tunggal akibat hilangnya lapisan tipis antar droplet dengan volume yang lebih besar namun dengan area antar muka yang lebih kecil. Perubahan ini akan menunjukkan perubahan signifikan secara mikroskopik dari fase terdispersi, seperti perubahan ukuran partikel rata-rata dan distribusi, namun tidak berpengaruh langsung terhadap perubahan penampilan sistem secara makroskopik.

2.

Breaking Breaking mengacu pada proses pemisahan signifikan antara dua fase. Proses ini merupakan konsekuensi dari koalesensi droplet secara mikroskopik yang terlihat signifikan pula secara makroskopik. Identitas droplet telah hilang, bersamaan dengan sifat fisik dan kimia dari emulsi. Hal ini menunjukkan kehilangan stabilitas dari emulsi.

3.

Flokulasi Flokulasi mengacu pada bergabungnya beberapa droplet emulsi tunggal membentuk gumpalan atau gabungan partikel yang longgar dengan lapisan tipis sebagai pembatas antar droplet. Flokulasi pada kebanyakan kasus


22

merupakan proses yang reversibel, diatasi dengan memberikan energi yang lebih sedikit dibandingkan dengan yang dibutuhkan untuk proses emulsifikasi. 4.

Creaming Creaming berhubungan dengan flokulasi yang dipengaruhi oleh perbedaan densitas antar dua fase. Kecepatan creaming bergantung pada karakteristik fisik sistem terutama viskositas fase kontinu dan perbedaan densitas antar dua fase. Creaming dapat diatasi dengan memberikan energi yang kecil. Flokulasi dan creaming menunjukkan kondisi di mana droplet saling bersentuhan, namun tidak bersatu untuk membentuk suatu unit tunggal. (Myers, 2006).

Emulsi primer

Gambar 10. Proses ketidakstabilan emulsi sederhana (a) koalesens; (b) breaking; (c) flokulasi; (d) creaming (Myers, 2006)

Mekanisme

utama

penyebab

ketidakstabilan

multiemulsi

adalah

koalesensi emulsi primer. Pemilihan emulsifier primer berupa surfaktan tunggal atau campuran surfaktan untuk membentuk emulsi primer yang stabil menjadi hal yang penting untuk dipertimbangkan. Mekanisme kedua adalah hilangnya droplet emulsi yang terjerap akibat pecahnya lapisan minyak yang memisahkan droplet internal dengan fase kontinu. Mekanisme tersebut dapat disebabkan oleh


23

perbedaan tekanan osmotik antara fase internal dan fase kontinu dalam sistem yang menyebabkan transfer material (Myers, 2006). Mekanisme ketidakstabilan sangat merugikan bagi aplikasi obat terkontrol yang mekanisme pelepasannya adalah difusi terkontrol karena dapat menghasilkan efek pelepasan yang cepat dari zat aktif dan memungkinkan terjadinya efek berbahaya. Stabilitas akhir sistem sangat bergantung pada sifat fase minyak, karakteristik emulsifier primer dan sekunder, dan hubungan antara fase internal dan kontinu (Myers, 2006).

G. Liposom Liposom merupakan suatu vesikel koloid yang tersusun dari membran lipid lapis ganda unilamelar atau multilamelar yang mengelilingi suatu kompartemen cairan. Zat aktif yang terenkapsulasi pada kompartemen air didalam vesikel liposom dapat mencapai efek terapetik dengan durasi yang lama karena zat aktif harus dilepaskan terlebih dahulu dari vesikel liposom (Shasi dkk., 2012). Liposom dapat digunakan untuk menghantarkan zat aktif yang bersifat hidrofobik, amfifatik, dan hidrofilik. Liposom memiliki kelebihan antara lain biokompatibel, tidak toksi, tidak menyebabkan reaksi imunologi, serta dapat mengenkapulasi zat aktif dari pengaruh lingkungan sehingga meningkatkan stabilitas zat aktif dalam sediaan (Shasi dkk., 2012). Liposom dapat digunakan sebagai sistem pembawa obat untuk pengobatan secara lokal terhadap penyakit kulit. Penggunaan zat aktif obat dalam bentuk liposom dibandingkan dengan formulasi lain dapat meningkatkan konsentrasi obat dalam kulit dan jaringan subkutan dan mengurangi disposisi


24

biologis dalam plasma (Davis, Gyurik, Hadgraft, Pellett, dan Walters, 2002). Mekanisme peningkatan absorbsi obat ke dalam kulit belum jelas, namun ada kemungkinan bahwa liposom berpenetrasi ke stratum korneum dan berinteraksi dengan lapisan lipid pada kulit untuk melepaskan obat ke stratum korneum. Umumnya, liposom yang efektif adalah liposom yang memiliki komposisi yang mirip dengan komposisi lipid pada stratum korneum (Benson, 2005). Berbagai jenis fosfolipid dapat digunakan untuk membuat liposom. Fosfolipid yang paling sering digunakan adalah fosfatidilkolin, dapat digunakan secara individu atau kombinasi dengan kolesterol. Kolesterol dapat digunakan untuk memadatkan bilayer fosfatidilkolin, sehingga dapat meningkatkan rigiditas (Ranade dan Hollinger, 2004).

Gambar 11. Fusi pada liposom (Meier dan Schreiber, 2005)

Potensi liposom sebagai sistem penghantar obat sangatlah menjanjikan, namun terdapat beberapa masalah terkait stabilitas liposom. Liposom sangat mudah rusak oleh perubahan pH, temperatur, dan radiasi cahaya serta kehadiran


25

enzim. Liposom yang sensitif terhadap suhu dapat mengalami kebocoran lebih cepat di atas suhu transisi fase dari membran lipidnya. Liposom dapat stabil hingga suhu 37oC, namun akan rusak ketika melewati area tubuh dengan temperatur lebih dari 40 oC (Kulkami, 2005). Masalah stabilitas liposom diketahui berasal dari vesikel unilamelar karena dapat berfusi dengan vesikel lain membentuk vesikel unilamelar dengan ukuran besar atau Large Unilamelar Vesicle (LUV) (Gambar 11) (Meier dan Schreiber, 2005). Parameter yang harus dipertimbangkan untuk menstabilkan sistem liposom dalam suatu formulasi antara lain: 1.

Membuat liposom dengan lipid murni karena lipid yang tidak murni (teroksidasi/terhidrolisis atau lipid yang tersuspensi pada minyak/trigliserida) akan mendestabilisasi liposom.

2.

Hindari penggunaan surfaktan ionik dalam fase di mana liposom akan ditambahkan.

3.

Hindari pemanasan tinggi (> 40oC) ketika membuat produk akhir yang mengandung liposom. Liposom dapat ditambahkan pada fase pembawa pada akhir proses ketika temperatur fase tersebut telah di bawah 40oC.

4.

pH produk dipertahankan mendekati pH netral karena kecepatan hidrolisis teredah pada pH 6,5.

5.

Produk yang mengandung liposom idealnya disimpan dalam suhu lemari pendingin. Namun, jika produk akhir dibuat dengan viskositas tertentu menggunakan gum atau pengental yang netral maka produk tersebut dapat disimpan pada suhu ruangan.


6.

26

Wadah produk yang mengandung liposom berupa wadah dengan bahan opaque untuk menghindari/mengurangi kerusakan oleh cahaya pada liposom. (Kulkami, 2005). H. Kulit dan Fungsi Kulit Kulit merupakan organ terbesar dan penting dalam menjaga homeostatis

tubuh. Kulit terdiri dari tiga lapisan antara lain: 1.

Epidermis Epidermis tersusun dari epitel skuamosa yang berlapis dan tidak ada pembuluh darah ataupun ujung saraf. Lapisan paling dalam dari sel epidermal disebut stratum basal atau stratum germinativum. Sel dalam lapisan ini dapat membelah dan tumbuh, sehingga sel epidermal yang telah tua (keranosit) akan disisihkan dari dermis menuju permukaan kulit. Semakin jauh sel berpindah, maka suplai nutrisi dari pembuluh darah semakin berkurang dan hingga pada waktunya sel tersebut akan mati. Peristiwa tersebut disebut keranitisasi. Sel mati yang terakumulasi pada lapisan terluar epidermis membentuk lapisan yang disebut stratum korneum (Shier, Butler, dan Lewis, 2006). Epidermis menjalankan beberapa fungsi salah satu yang paling penting adalah untuk generasi stratum korneum. Absorbsi suatu solute melalui bagian kulit ini lebih sulit dibandingkan melalui bagian kulit lain dari tubuh. Hal ini dikarenakan stratum korneum memiliki barrier dengan densitas yang tinggi (1,4 g/cm3 pada kondisi kering), hidrasi yang rendah (1520%), dan kecilnya luas area untuk transport solut. Barrier ini berperan


27

dalam fungsi protektif dari kehilangan air dari jaringan, tekanan mekanis, perlindungan dari senyawa berbahaya, dan menjaga dari serangan mikroorganisme patogen (Walters dan Roberts, 2002). Bagian dasar epidermis terdiri dari memiliki peran penting dalam sistem imun kulit yaitu sel Langerhans. Sel Langerhans merupakan sel dendritik yang berperan dalam mengatur proliferasi dari keratinosit dan juga sebagai antigen-presenting cell. Sel lain yang terdapat dalam epidermis adalah melanosit yang memproduksi melanin, yaitu pigmen gelap yang memberikan warna pada kulit. melanin mengabsorbsi radiasi ultraviolet dari sinar matahari, mencegah mutasi DNA pada sel kulit dan efek merusak lainnya. Melanosit terdapat pada bagian terdalam epidermis (Walters dan Roberts, 2002). 2.

Dermis Dermis mengikat epidermis pada jaringan di dalam kulit. Bagian kulit ini terdiri dari jaringan ikat yang mengandung serat-serat kolagen dan elastin. Jaringan-jaringan yang terbentuk dari serat ini memberikan struktur yang kuat dan elastis pada kulit (Shier dkk., 2006). Dermis memiliki fungsi nutrisi, imunitas dan sistem pendukung bagi epidermis melalui lapisan papilari tipis yang berdekatan dengan epidermis, juga berperan dalam pengaturan suhu, tekanan, dan rasa sakit. Sel-sel yang ada pada lapisan ini adalah fibroblas yang menghasilkan komponen jaringan ikat seperti kolagen, laminin, fibronektin dan vitronektin; sel mast yang terlibat dalam respon


28

imun dan inflamasi; dan melanosit yang terlibat dalam memproduksi pigmen melanin (Walters dan Roberts, 2002). Pembuluh darah pada lapisan dermis memberikan suplai nutrisi pada semua sel kulit, juga membantu dalam regulasi suhu tubuh. Sel saraf tersebar pada lapisan dermis. Proses motorik membawa rangsangan keluar dari otak atau tulang belakang menuju otot atau kelenjar kulit. Proses sensorik membawa ransangan pergi dari reseptor sensorik menuju otak atau tulang belakang (Shier dkk., 2006). Sistem limfatik merupakan komponen penting dalam regulasi tekanan, mobilisasi mekanisme pertahanan dan penghilangan material limbah. Sistem limfatik berupa jaringan yang padat dan rata pada lapisan papiler dermis dan menyebar hingga bagian yang lebih dalam dari dermis. Aliran limfatik mengeleminasi solute yang berukuran besar seperti interferon (Walters dan Roberts, 2002). 3.

Subkutan Lapisan terdalam kulit adalah jaringan subkutan atau hipodermis. Hipodermis berperan sebagai isolator panas, penyerap getaran, dan tempat penyimpanan energi. Lapisan ini merupakan jaringan sel lemak yang berikatan dengan dermis pada kolagen dan serabut elastin. Sel yang terdapat dalam lapisan subkutan adalah sel lemak, fibroblas dan makrofag. Peran utama dari lapisan subkutan adalah tempat sistem vaskular dan saraf pada kulit, juga untuk mengikat kulit pada lapisan otot di bawahnya (Walters dan Roberts, 2002).


4.

29

Komponen kulit lainnya Komponen kulit ini terdiri dari folikel rambut, kelenjar sebasea, dan kelenjar keringat. Masing-masing komponen ini memiliki fungsi yang berbeda-beda. Folikel rambut terdistribusi pada seluruh permukaan kulit kecuali pada telapak kaki, telapak tangan, dan bibir. Otot halus yaitu erector pilorum mengikat folikel pada jaringan dermis sehingga memungkinkan rambut untuk tegak sebagai respon terhadap rasa takut. Kelenjar sebaseus mensekresikan sebum yang mengandung trigliserida, asam lemak bebas, dan lilin, yang berfungsi menjaga dan melubrikasi kulit serta menjaga pH kulit. Kelenjar keringat terdiri dari kelenjar ekrin dan apokrin. Kelenjar ekrin terletak pada bagian terbawah dermis, mensekresikan larutan garam dengan pH 5 yang distimulasi oleh temperatur serta stress emosional oleh sistem saraf otonom. Kelenjar apokrin mensekresi protein, lipoprotein dan lipid yang juga distimulasi oleh temperatur (Walters dan Roberts, 2002).

I. Metode DPPH Senyawa DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) merupakan radikal bebas yang stabil dan mengalami delokalisasi elektron pada keseluruhan molekul, sehingga molekul tidak membentuk dimer seperti yang terjadi pada radikal bebas lainnya. Delokalisasi ini juga membentuk warna ungu pada larutan sehingga dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm (Molyneux, 2004). Metode DPPH secara luas digunakan untuk menguji kemampuan dari suatu senyawa untuk berperan sebagai peredam radikal bebas DPPH atau sebagai pendonor hidrogen dan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan suatu senyawa


30

yang terkandung dalam makanan, kosmetik ataupun dalam sistem biologis. Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel padat ataupun cair dan tidak spesifik untuk senyawa antioksidan tertentu, melainkan untuk hampir keseluruhan senyawa antioksidan (Prakash, 2001). Metode ini berdasarkan pada pengukuran kemampuan antioksidan menghambat radikal bebas DPPH. Elektron pada DPPH akan tereduksi dengan menerima atom hidrogen dari antioksidan menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning (gambar 12) (Kedare dan Singh, 2011).

Gambar 12. Reaksi reduksi DPPH oleh antioksidan yang mendonorkan atom hidrogen. (a) radikal bebas 2,2-diphenylpicryl-1-hydrazyl (ungu) ; (b) non-radikal 2,2-diphenylpicryl-1-hydrazine (kuning)

J.

Spektrofotometri Visibel

Prinsip dari spektrofotometri adalah radiasi pada panjang gelombang 400-800 nm melalui larutan yang mengandung molekul tertentu akan menyebabkan

elektron

pada

ikatan

antar

molekul

tereksitasi.

Eksitasi

menyebabkan molekul memiliki bilangan kuantum yang lebih tinggi dan mengabsorbsi energi yang melewati larutan. Instrumentasi dalam spektrofotometer visibel antara lain: 1. Sumber cahaya berupa lampu halogen atau tungsten untuk daerah visibel pada panjang geombang 350-900 nm.


31

2. Monokromator yang digunakan untuk mendispersikan cahaya sesuai panjang gelombang penyusunnya yang selanjutnya akan dipilih oleh suatu celah. Monokromator berotasi sehingga cahaya pada panjang gelombang pada kisaran yang ditentukan melewati sampel ketika instrumen melakukan pengukuran. 3. Optik yang didesain untuk memisahkan cahaya sehingga cahaya melewati dua kompartemen yaitu kompartemen larutan sampel dan kompartemen larutan blanko (pada instrumen spektrofotometri double beam). (Watson, 1999). Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan sebagai berikut: ................................................(1) Keterangan: A

= absorban,

ε

= absortivitas

b

= tebal kuvet (cm)

c

= konsentrasi Jika absorbansi suatu seri konsentrasi larutan diukur pada panjang

gelombang, suhu, kondisi pelarut yang sama, dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan terhadap konsentrasinya maka suatu garis lurus akan teramati sesuai persamaan Lambert-Beer. Grafik ini disebut dengan plot hukum LambertBeer dan jika garis yang dihasilkan merupakan suatu garis lurus maka dapat dikatakan bahwa hukum Lambert-Beer dipenuhi pada kisaran konsentrasi yang diamati (Gandjar dan Rohman, 2008).


32

Kadar sampel dapat ditetapkan dengan menggunakan perbandingan absorbansi sampel dengan absorbansi baku, atau dengan menggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi baku dengan absorbansinya. Persamaan kurva baku selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2008).

K. Landasan Teori Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) memiliki khasiat sebagai antioksidan dan efektif dalam menghambat dan menangkal radikal bebas. Salah satu senyawa dalam rosella yang berkhasiat sebagai antioksidan adalah antosianin. Penggunaan secara langsung ekstrak rosella secara topikal pada kulit dapat menyebabkan penurunan aktivitas antioksidan senyawa antosianin oleh faktor lingkungan antara lain suhu, pH dan cahaya. Degradasi termal dapat menyebabkan antosianin mengalami perubahan menjadi senyawa kalkon yang berwarna coklat, sehingga ekstrak rosella perlu diformulasikan dalam suatu sistem pembawa yang dapat melindungi senyawa antosianin dalam ekstrak rosella dari degradasi dan mempertahankan aktivitas antioksidannya. Sistem pembawa yang dapat melindungi antosianin dalam ekstrak rosella adalah multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom. Multiemulsi A/M/A merupakan emulsi yang terdiri dari 2 jenis emulsi yaitu emulsi tipe A/M sebagai emulsi primer yang kemudian didispersikan kembali dalam fase air untuk membentuk emulsi sekunder dengan bantuan emulsifier. Multiemulsi memiliki kemampuan untuk membawa zat aktif yang tidak kompatibel satu sama lain dalam suatu formulasi yang sama dan melindungi zat aktif dalam droplet-droplet internal.


33

Liposom merupakan suatu sistem berbentuk vesikular yang terdiri dari satu atau lebih fosfolipid bilayer yang sering digunakan dalam sediaan farmasetik untuk menghantarkan obat ke tempat aksi baik obat yang bersifat lipofilik maupun hidrofilik. Liposom dan multiemulsi A/M/A memiliki kelebihan dalam hal kenyamanan penggunaan secara topikal dan dapat membawa antosianin dalam ekstrak rosella ke dalam kulit sehingga dapat memberikan efek antioksidan. Penelitian oleh Sonakpuriya, Bhowmick, Pandey, Joshi, dan Dubey (2013) menghasilkan multiemulsi A/M/A dengan emulsifier Span 80 dan Tween 80 yang mengandung zat aktif Valsartan dengan entrapment efficiency sebesar 95,75%. Penelitian oleh Pinsuwan dkk. (2010) menghasilkan liposom yang mengandung ekstrak rosella dengan entrapment efficiency sebesar 65%. Multiemulsi A/M/A umumnya memiliki ukuran yang lebih besar dibandingkan liposom yaitu sebesar 10-50 μm (Benichou dan Aserin, 2008), sehingga memungkinkan penjerapan zat aktif yang lebih banyak, dan akan memberikan efek antioksidan yang lebih tinggi. Formula optimal multiemulsi A/M/A diperlukan agar multiemulsi dapat stabil dalam penyimpanan jangka panjang dan penjerapan zat aktif ekstrak rosella maksimal. Formula optimum dipilih berdasarkan sifat fisis meliputi organoleptis, pH, tipe fase emulsi, dan pengamatan mikroskopis, serta stabilitas fisis meliputi organoleptis, pengamatan mikroskopis dan persen volume pemisahan selama 28 hari. Penelitian oleh Li (2015) menunjukkan bahwa kondisi penyimpanan optimum untuk multiemulsi A/M/A adalah pada suhu -4oC, terlindung dari cahaya, dan diberi gas nitrogen. Multiemulsi A/M/A optimum memiliki pH yang sesuai


34

dengan pH kulit, memiliki tipe A/M/A, homogen, menjerap zat aktif dalam droplet internal, serta dapat stabil selama 28 hari yang ditunjukkan dengan tidak adanya pemisahan fase. Uji aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A yang telah optimum sifat dan stabilitas fisisnya dan dalam liposom dilakukan untuk mengetahui efektivitas kedua formulasi tersebut dalam melindungi dan membawa antosianin dalam ekstrak rosella ke bagian epidermis kulit. Aktivitas antioksidan ditunjukkan dengan nilai IC50 secara metode DPPH dan dianalisis dengan metode spektrofotometri visibel.

L. Hipotesis 1.

Formula optimum multiemulsi A/M/A ekstrak rosella memiliki sifat dan stabilitas fisis sesuai dengan kriteria penerimaan yang ditetapkan yaitu memiliki pH yang sesuai dengan pH kulit, memiliki tipe emulsi A/M/A, homogen, menjerap zat aktif dalam droplet internal dan stabil selama penyimpanan selama 28 hari pada suhu -4oC, terlindung dari cahaya, dan diberi gas nitrogen yang ditandai dengan tidak adanya pemisahan fase.

2.

Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A formula optimum lebih baik dibandingkan dalam suspensi liposom yang ditunjukkan dengan nilai IC50 ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A yang lebih tinggi dibandingkan dalam suspensi liposom.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian Jenis rancangan penelitian ini adalah rancangan eksperimental murni untuk mencari formula multiemulsi A/M/A ekstrak rosella yang optimal sifat dan stabilitas fisisnya untuk kemudian dilakukan uji aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan dalam suspensi liposom dengan menggunakan metode DPPH.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1.

Variabel penelitian a.

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi eksipien dan HLB multiemulsi A/M/A, lama penyimpanan, dan jenis formulasi

b.

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat dan stabilitas fisis multiemulsi A/M/A, serta aktivitas antioksidan (IC50) ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan dalam suspensi liposom.

c.

Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah cahaya selama pembuatan dan penyimpanan multiemulsi A/M/A, udara dan suhu saat pembuatan dan penyimpanan multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom, dan homogenitas sediaan.

d.

Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kelembaban ruangan saat pembuatan multiemulsi A/M/A, ukuran partikel, serta matriks

sediaan

multiemulsi

35

A/M/A

dan

suspensi

liposom.


2.

36

Definisi operasional a.

Ekstrak rosella adalah sediaan cair dan kental hasil ekstraksi simplisia bunga rosella menggunakan pelarut metanol.

b.

Antioksidan adalah zat yang dalam konsentrasi rendah dibandingkan zat yang mudah teroksidasi, secara signifikan dapat menunda atau mencegah oksidasi zat yang terdapat pada jaringan termasuk protein, lipid, karbohidrat, dan DNA. Zat yang berperan sebagai antioksidan dalam penelitian ini adalah ekstrak rosella.

c.

Multiemulsi A/M/A ekstrak rosella adalah sistem emulsi A/M yang mengandung ekstrak rosella dan didispersikan dalam fase air dengan menggunakan bantuan emulsifier.

d.

Formula optimum multiemulsi A/M/A ekstrak rosella adalah formula yang telah stabil sifat dan stabilitas fisisnya setelah penyimpanan selama 28 hari.

e.

Sifat fisis multiemulsi A/M/A meliputi uji organoleptis sediaan, uji pH, uji tipe fase emulsi, dan pengamatan mikroskopik multiemulsi A/M/A yang dilakukan setelah proses pembuatan.

f.

Stabilitas fisis multiemulsi A/M/A meliputi uji volume pemisahan multiemulsi A/M/A yang dilakukan selama 28 hari penyimpanan pada suhu -4oC, terlindung dari cahaya, dan disertai penjenuhan dengan gas nitroge, serta pengamatan mikroskopik pada hari ke 1 dan ke-28.


g.

37

Liposom ekstrak rosella adalah suatu sistem yang terdiri dari satu atau lebih lipid bilayer dengan struktur vesikular dan mengelilingi sejumlah ekstrak rosella dalam medium air.

h.

Suspensi liposom adalah sediaan cair yang mengandung liposom ekstrak rosella yang dibuat menggunakan metode pertukaran pelarut organik, yang kemudian didispersikan dalam medium dispersi yang sesuai dengan bantuan suspending agent.

i.

Metode DPPH adalah metode uji aktivitas antioksidan yang didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk menghambat radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen yang ditunjukkan dengan perubahan warna ungu dari DPPH menjadi kuning. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan selama 28 hari untuk mengetahui laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella.

j.

Inhibition Concentration 50% (IC50) adalah konsentrasi ekstrak rosella yang dibutuhkan untuk menghambat atau meredam radikal DPPH sebesar 50% .

C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak rosella yang diperoleh dari Sanjayadi, aquadest (Laboratorium Kimia Organik), parafin cair (kualitas farmasetik, PT. Brataco Yogyakarta), Span 80® (kualitas farmasetik, PT. Brataco Yogyakarta), dimethicone (kualitas farmasetik, PT. Brataco Yogyakarta), Tween 80® (kualitas pro analysis, Merck), setil alkohol, magnesium sulfat, xanthan gum,

metanol (kualitas pro

analysis,

Merck),

2,2-diphenyl-1-


38

picrylhydrazyl (kualitas pro analysis, Sigma Aldrich), BHT (kualitas pro analysis, Sigma Aldrich), Triton X-100® (kualitas pro analysis, Sigma Aldrich), dan gas nitrogen teknis yang diperoleh dari CV. Perkasa Yogakarta.

D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, flakon, parafilm, mixer (Miyako), waterbath (Elbanton), alat ultrasonifikasi (Retsch), alat sentrifugasi

(PLC–03),

vortex

(Scientific

Industries),

seperangkat

spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1800), kuvet disposable 2,5 mL, mikropipet (Socorex), mikroskop (Olympus CX31), timbangan analitik (Mettler Tolledo), stopwatch, dan alumunium foil.

E. Tata Cara Penelitian 1.

Ekstraksi kelopak bunga rosella Sebanyak 5 kg kelopak bunga rosella segar yang didapatkan dari Pontianak, Kalimantan Barat dicuci dengan air mengalir sebanyak tiga kali dan kemudian dicuci kembali menggunakan aquadest. Kelopak bunga rosella dimaserasi dengan 5 mL metanol menggunakan ultraturrax pada suhu ruangan selama dua hari. Supernatan disaring menggunakan corong Buchner dengan kertas saring Whatman nomor satu. Filtrat yang didapatkan kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 40oC. Ekstrak disimpan pada suhu -4oC dalam wadah polietilen yang dibungkus dengan alumium foil serta dijenuhkan dengan gas nitrogen hingga waktu analisis. Ekstraksi ekstrak rosella dilakukan oleh Sanjayadi.


2.

39

Penetapan bobot tetap ekstrak Sebanyak 500 μL ekstrak kental metanolik rosella dipanaskan menggunakan waterbath pada suhu 40°C - 50°C di atas cawan porselen hingga memperoleh bobot tetap. Bobot tetap adalah berat pada penimbangan 2 kali berturut-turut setelah zat dikeringkan selama 1 jam hingga tidak berbeda lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang. Penetapan bobot tetap ekstrak dilakukan sebanyak 3 kali replikasi (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1975).

3.

Formulasi dan optimasi multiemulsi A/M/A Fase air yang mengandung zat aktif ekstrak rosella, emulsifier Tween 80, dan elektrolit MgSO4 serta fase minyak parafin cair yang mengandung emulsifier Span 80, setil alkohol, dan dimethicone dipanaskan pada suhu 50±3oC di atas waterbath. Fase air diemulsifikasikan ke dalam fase miyak menggunakan mixer dengan skala kecepatan 5 selama 10 menit untuk mendapatkan droplet

emulsi primer

A/M.

Emulsi

A/M kemudian

diemulsifikasikan dalam larutan air eksternal yang mengandung emulsifier Tween 80 dan xanthan gum menggunakan mixer dengan skala kecepatan 1 selama 10 menit. Keseluruhan proses pencampuran disertai dengan penjenuhan menggunakan gas nitrogen. Multiemulsi dimasukkan dalam flakon yang dibungkus dengan alumunium foil agar terlindung dari cahaya dijenuhkan dengan gas nitrogen sebelum ditutup rapat dengan parafilm, dan disimpan dalam lemari es dengan suhu -4oC selama pengujian 28 hari.


40

Optimasi formula dan proses pembuatan multiemulsi A/M/A yang dilakukan meliputi: a.

Optimasi emulsifier emulsi primer berdasarkan nilai HLB Emulsi primer dibuat dengan kombinasi emulsifier primer yaitu Span 80 dan Tween 80 dengan konsentrasi sebesar 10% untuk mendapatkan HLB sebesar 5; 5,3; 5,5; dan 5,8. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah.

b.

Optimasi kecepatan pencampuran emulsi primer Emulsi primer dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi emulsifier primer menggunakan mixer pada skala kecepatan 4 dan 5. Berdasarkan hasil optimasi tersebut tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah.

c.

Optimasi lama pencampuran emulsi primer Emulsi primer skala kecepatan yang telah teroptimasi dengan lama pencampuran 10; 15; dan 20 menit. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah.

d.

Optimasi eksipien setil alkohol sebagai stiffening agent Emulsi primer dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi lama pencampuran emulsi primer dan ditambahkan setil alkohol sebesar 4%; 4,5%; 5%; 5,5%; 6%; 8%; dan 10%. Berdasarkan


41

hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah. e.

Optimasi eksipien dimethicone sebagai antifoaming agent Emulsi primer dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi eksipien setil alkohol dan ditambahkan dengan dimethicone sebesar 2%; 4%; 6%; dan 8%. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula emulsi primer dengan persen pemisahan fase terendah.

f.

Optimasi rasio fase emulsi primer dan fase air eksternal Multiemulsi A/M/A dibuat dengan memasukkan emulsi primer hasil optimasi ke dalam fase air dengan perbandingan 3:6; 4:6; dan 5:6. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula multiemulsi dengan persen pemisahan fase terendah.

g.

Optimasi emulsifier sekunder Multiemulsi A/M/A dibuat dengan ratio emulsi primer dan air eksternal hasil optimasi dengan jumlah emulsifier tunggal Tween 80 dengan konsentrasi 2%; 4%; dan 6%. Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula multiemulsi dengan persen pemisahan fase terendah.

h.

Optimasi lama pencampuran multiemulsi A/M/A Multiemulsi A/M/A dibuat dengan formula terbaik yang didapatkan pada optimasi jumlah emulsifier sekunder pada skala kecepatan 1 dengan lama pencampuran 10; 12; dan 15 menit.


42

Berdasarkan hasil optimasi tersebut dipilih formula multiemulsi dengan persen pemisahan fase terendah.

4.

Evaluasi multiemulsi A/M/A Evaluasi terhadap formula optimum multiemulsi A/M/A ekstrak rosella antara lain: a.

Pengamatan organoleptis dan pH Multiemulsi A/M/A diamati aspek penampilan, rasa, dan bau pada hari pertama dan hari ke-28 sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan indikator pH universal dengan cara memasukkan pH strips ke dalam multiemulsi A/M/A dan dibandingkan warnanya dengan standar (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1975).

b.

Ukuran diameter partikel rata-rata Diameter partikel rata-rata multiemulsi A/M/A diukur dengan menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan lensa okuler, mikrometer yang telah dikalibrasi dan seperangkat kamera pada hari pertama dan hari ke-28 sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan. Multiemulsi A/M/A diletakan pada kaca objek dan ditutup dengan gelas penutup. Kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 40 kali. Multiemulsi A/M/A yang diamati, difoto, dan diukur diameter partikelnya menggunakan aplikasi ImageJ (Martin, Swarbrick, dan Cammarata, 1993).


c.

43

Uji tipe fase emulsi Uji tipe fase emulsi dilakukan setelah dilakukan pembuatan emulsi primer dan multiemulsi A/M/A dengan formula optimum. Emulsi primer dan multiemulsi A/M/A dilarutkan dalam aquadest dan parafin cair, kemudian diamati kelarutan masing-masing emulsi dalam kedua fase tersebut (Billany, 2001).

d.

Uji mekanik Uji

mekanik

dilakukan

setelah

dilakukan

pembuatan

multiemulsi A/M/A dengan formula optimum. Multiemulsi A/M/A dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Hasil sentrifugasi diamati dengan melihat ada atau tidaknya pemisahan fase (Mahmood, Akhtar, dan Manickam, 2014). e.

Uji volume pemisahan Uji volume pemisahan dilakukan setelah dilakukan pembuatan multiemulsi A/M/A dengan formula optimum. Multiemulsi A/M/A dimasukkan dalam tabung reaksi berskala dan diamati secara berkala selama rentang waktu pengujian apabila terjadi perubahan tinggi akibat pemisahan (creaming atau pengendapan). Tabung reaksi berskala ditempatkan pada suhu dingin yaitu -4oC, terlindung dari cahaya, dan disertai penjenuhan dengan gas nitrogen (Billany, 2001).


5.

44

Penentuan aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A ekstrak rosella a.

Pembuatan pereaksi DPPH Sebanyak 50 mg serbuk DPPH (BM = 394,32 g/mol) dimasukkan dalam labu takar 100 mL dan dilarutkan dalam metanol p.a hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi pereaksi DPPH 1,27 mM.

b.

Penentuan panjang gelombang maksimum Sebanyak 180 μL larutan DPPH 1,27 mM dimasukkan dalam kuvet dan ditambahkan metanol hingga 3 mL. Kemudian dilakukan scanning panjang gelombang dengan kisaran 450-550 nm. Panjang gelombang maksimum adalah absorbansi paling tinggi (peak) dari larutan DPPH pada rentang panjang gelombang tersebut. Metanol digunakan sebagai blanko.

c.

Preparasi sampel ekstrak rosella total dalam multiemulsi A/M/A Aktivitas antioksidan total dalam multiemulsi A/M/A diukur dengan melakukan uji secara metode DPPH terhadap ekstrak rosella yang terjerap maupun tidak terjerap dalam droplet emulsi. Sebanyak 8,5 gram multiemulsi A/M/A diultrasonifikasi selama 30 menit, kemudian disentrifugasi selama 40 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Sebanyak 2,5 mL supernatan dari hasil sentrifugasi 5000 rpm ditambahkan metanol sebanyak 5 mL dan disentrifugasi selama 20 menit. Sebanyak 4 mL supernatan dari hasil sentrifugasi dimasukkan dalam labu takar 10 mL,


45

ditambahkan dengan metanol hingga batas tanda dan dianalisis kandungan antioksidannya dengan metode DPPH. d.

Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A ditentukan dengan metode DPPH. Pengukuran terhadap larutan DPPH dengan konsentrasi tertentu dilakukan untuk mendapatkan absorbansi larutan DPPH dengan nilai lebih dari 0,8, yang selanjutnya konsentrasi larutan DPPH tersebut digunakan sebagai konsentrasi yang ditambahkan dalam seri konsentrasi sampel ekstrak. Seri konsentrasi sampel ekstrak dimasukkan dalam kuvet dan ditambahkan larutan DPPH. Selanjutnya ditambah metanol p.a hingga 3 mL dan didiamkan selama 15 menit (Sanjayadi, 2014). Metanol p.a digunakan sebagai blanko. Penentuan aktivitas antioksidan dari BHT dilakukan pula sebagai kontrol positif dengan metode dan prosedur yang sama. Setiap sampel dianalisis dengan replikasi sebanyak 3 kali.

6.

Evaluasi suspensi liposom Suspensi liposom yang diperoleh dari Sanjayadi disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu 4oC menurut penelitian oleh Pinsuwan dkk. (2010) selama pengujian 14 hari. Wadah penyimpanan suspensi liposom dibungkus dengan alumunium foil agar terlindung dari cahaya. a.

Pengamatan organoleptis dan pH Suspensi liposom diamati aspek penampilan, rasa, dan aroma pada hari pertama dan hari ke-14 sebelum dilakukan pengujian aktivitas


46

antioksidan. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan indikator pH universal dengan cara memasukkan pH strips ke dalam suspensi liposom dan dibandingkan warnanya dengan standar (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1975). b.

Ukuran diameter partikel rata-rata Diameter partikel rata-rata suspensi liposom diukur dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 3.b. Pengukuran diameter partikel rata-rata suspensi liposom dilakukan pada hari pertama sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan.

7.

Penentuan aktivitas antioksidan suspensi liposom ekstrak rosella a.

Pembuatan pereaksi DPPH Pembuatan pereaksi DPPH dilakukan dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 5.a.

b.

Penentuan panjang gelombang maksimum Pembuatan pereaksi DPPH dilakukan dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 5.b.

c.

Preparasi sampel ekstrak rosella total dalam suspensi liposom Aktivitas antioksidan total dalam suspensi liposom diukur dengan melakukan uji secara metode DPPH terhadap ekstrak rosella yang terjerap maupun tidak terjerap dalam fosfolipid liposom. Sebanyak 1 mL liposom ditambahkan dengan Triton X-100 10% (1:1) dan divortex. Larutan dimasukkan dalam labu takar 10 mL, ditambahkan dengan


47

metanol hingga batas tanda dan dianalisis kandungan antioksidannya dengan metode DPPH. d.

Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam liposom dilakukan dengan prosedur yang sama yang telah disebutkan pada poin 5.d.

F. Analisis Hasil Persen pemisahan fase sebagai parameter pemilihan formula optimum dari masing-masing tahap optimasi dihitung berdasarkan persamaan berikut: %pemisahan fase = [

]

------------(2)

Keterangan: Volume awal

= volume multiemulsi A/M/A yang dimasukkan dalam tabung berskala yaitu 25 mL

Volume pemisahan

= volume fase air yang terpisah dari multiemulsi setelah penyimpanan 24 jam

Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom dihitung nilai % inhibisi berdasarkan persamaan berikut: % inhibisi = [ Keterangan: Akontrol = absorbansi kontrol (DPPH) Asampel = absorbansi larutan uji

]

---------------------(3)


48

Aktivitas antioksidan ditunjukkan dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi efektif sampel yang dibutuhkan untuk memberikan penghambatan DPPH sebesar 50% dengan analisis regresi linear dari plot kurva respon dosis antara % inhibisi dan konsentrasi, kemudian memplotkan nilai 50% pada sumbu y masing-masing kurva regresi linear. Aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A dibandingkan pada beberapa rentang waktu selama 1 bulan yaitu hari ke-1, 3, 7, 14, dan 28. Aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A dibandingkan dengan aktivitas antioksidan suspensi liposom pada rentang waktu hari ke-1 dan 14. Aktivitas antioksidan dari masing-masing jenis sediaan dibandingkan pula dengan aktivitas antioksidan kontrol positif BHT dan dinyatakan dalam mikromol ekuivalen Trolox (TE) per 100 gram sampel (TE/100gram). Menurut penelitian oleh Prakash (2011), BHT memiliki aktivitas antioksidan sebesar 395000 TE/100gram. Pengujian kesamaan variansi secara statistik dengan uji F untuk menguji kesamaan (homogenitas) variasi dua populasi sehingga dapat ditentukan metode untuk pengujian signifikansi dengan uji t. Uji signifikansi secara statistik dengan uji t dilakukan terhadap nilai IC50 ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom pada hari pertama, serta terhadap laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom dari hari pertama hingga hari ke-14. Nilai t yang diperoleh dibandingkan dengan nilai t yang telah ditetapkan pada taraf kepercayaan 95% (Miller dan Miller, 2010).


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Multiemulsi A/M/A yang dibuat dalam penelitian ini memiliki efek antioksidan karena mengandung ekstrak rosella sebagai zat aktif. Sediaan multiemulsi A/M/A formula optimum diamati sifat dan stabilitas fisisnya, serta dilakukan pengujian terhadap aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom. Multiemulsi merupakan sistem emulsi air dalam minyak dalam air atau minyak dalam air dalam minyak, yang fase terdispersinya mengandung droplet yang lebih kecil dengan fase yang berbeda (Jiao dan Burgess, 2008). Bentuk sediaan multiemulsi dipilih karena memiliki kapasitas yang baik untuk menjebak zat aktif yang bersifat hidrofilik dalam droplet-droplet air internal, memberikan efek protektif terhadap zat aktif yang mudah terdegradasi, dan dapat memberikan efek pelepasan yang terkendali dari zat aktif (Jigar, Adarsh, Dhaval dan Vijay, 2011). Penelitian oleh Pinsuwan dkk. (2010) menunjukkan bahwa liposom yang mengandung ekstrak rosella memiliki entrapment efficiency yang tinggi, meningkatkan permeasi pada kulit, dan mengurangi iritasi pada kulit. Struktur liposom yang berupa vesikel lipid lapis ganda dapat melindungi zat aktif dari pengaruh lingkungan sehingga meningkatkan stabilitas zat aktif dalam sediaan. Multiemulsi dan liposom memiliki kelebihan masing-masing dalam perannya sebagai pembawa yang melindungi zat aktif. Maka dari itu, dalam penelitian ini dilakukan formulasi multiemulsi A/M/A yang mengandung ekstrak

49


50

rosella dan dibandingkan aktivitas antioksidannya dengan suspensi liposom yang mengandung zat aktif yang sama untuk mengevaluasi kemampuan kedua jenis formulasi tersebut dalam melindungi ekstrak rosella.

A. Ekstraksi Kelopak Bunga Rosella Ekstraksi yang dilakukan oleh Sanjayadi dilakukan dengan proses maserasi. Pada umumnya, ekstrak yang diperoleh dari tempat yang berbeda dan jenis spesies yang berbeda dapat pula memberikan aktivitas yang berbeda. Namun, penelitian oleh Borras-Linares, dkk. (2015) mengenai pengujian aktivitas antioksidan dari ekstrak etanolik 25 varietas Hibiscus sabdariffa dengan metode DPPH memiliki profil aktivitas yang sama, maka dari itu metode maserasi ekstrak rosella yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan pula untuk tanaman rosella dengan spesies yang berbeda.

B. Penetapan Bobot Tetap Ekstrak Rosella Penetapan bobot tetap ekstrak rosella dilakukan untuk mengurangi jumlah metanol dalam ekstrak rosella yang akan diformulasikan menjadi multiemulsi A/M/A sehingga dapat mengurangi resiko penyebab ketidakstabilan emulsi. Metanol dalam fase air dapat mengurangai efek antarmuka dari emulsifier dengan menurunkan perbedaan polaritas antara minyak dan air (Salager, 2000). Metanol juga memberikan efek toksik pada kulit. Metanol dapat terabsorbsi melewati lapisan-lapisan kulit sehingga menyebabkan toksisitas sistemik. Metanol juga mengiritasi kulit serta menyebabkan kulit kering dan kemerahan (Pritchard,


51

2007). Bobot tetap yang didapatkan juga digunakan untuk menghitung konsentrasi ekstrak rosella yang akan diuji aktivitas antioksidannya. Penetapan bobot tetap yang dilakukan sebanyak 3 kali replikasi menunjukkan bahwa sebanyak 500 μL ekstrak rosella memiliki bobot tetap sebesar 0,5117 gram.

C. Pembuatan Multiemulsi A/M/A Ekstrak Rosella Multiemulsi A/M/A dibuat dengan dua tahap emulsifikasi yaitu pembuatan emulsi primer air dalam minyak (A/M) dan pembuatan emulsi sekunder (multiemulsi) air dalam minyak dalam air (A/M/A). Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan multi emulsi A/M/A terdiri dari zat aktif dan eksipien. Zat aktif yang digunakan adalah ekstrak metanol kelopak bunga rosella. Eksipien berperan dalam meningkatkan stabilitas zat aktif dan formulasi, mengatur permeasi dan pelepasan zat aktif, serta meningkatkan nilai estetika sediaan (Heather dan Adam, 2012). Eksipien yang digunakan antara lain parafin cair, aquadest, Span 80, Tween 80, setil alkohol, dimethicone, xanthan gum. Parafin cair dipilih sebagai fase minyak dalam emulsi primer karena telah banyak dipakai dalam formulasi sediaan topikal seperti krim dan dapat berperan sebagai emollient. Minyak mineral seperti parafin cair umumnya menghasilkan multimulsi A/M/A yang lebih stabil dibandingkan dengan minyak nabati (Kumar dkk., 2012), karena bersifat inert dan tidak sensitif terhadap oksidasi dan cahaya (Rawlings dan Lombard, 2012). Multiemulsi dibuat dengan menggunakan dua atau lebih emulsifier yaitu Span 80 yang bersifat hidrofobik untuk menstabilkan emulsi primer A/M dan


52

Tween 80 yang bersifat hidrofilik untuk menstabilkan emulsi sekunder (multiemulsi) M/A. Tween 80 sering dikombinasikan dengan Span 80 dalam multiemulsi A/M/A karena struktur kimia yang mirip dengan Span 80 (Kumar, dkk., 2012). Span 80 dan Tween 80 berfungsi sebagai emulsifier yang berperan dalam menurunkan tegangan permukaan antara fase minyak dan air sehingga dapat meningkatkan stabilitas multiemulsi A/M/A. Optimasi campuran emulsifier Span 80 dan Tween 80 untuk membuat emulsi primer A/M dengan konsentrasi emulsifier sebesar 10% b/b menunjukkan bahwa formula emulsi primer dengan HLB 5,8 memiliki stabilitas yang baik dibandingkan formula lainnya karena walaupun menunjukkan pemisahan fase yang masih cukup tinggi yaitu sebesar 56%. Setil alkohol berfungsi sebagai stiffening agent sehingga dapat meningkatkan konsistensi emulsi air dalam minyak. Setil alkohol sebagai kosurfaktan dapat memfasilitasi transport emulsifier dari lapisan antarmuka menuju fase minyak dan menyebabkan masuknya droplet internal ke dalam fase minyak dengan cepat (Garti dan Bisperink, 1998). Optimasi setil alkohol menunjukkan bahwa formula dengan konsentrasi setil alkohol sebanyak 4% ; 4,5% ; 5% ; dan 5,5% tidak stabil dengan persen pemisahan fase sebesar lebih dari 8%. Konsentrasi setil alkohol sebanyak 6% memiliki stabilitas yang baik dan memberikan konsistensi sediaan yang kental dan berbusa. Dimethicone berfungsi untuk mengurangi efek foaming yang ditimbulkan oleh setil alkohol sehingga mengurangi resiko rusaknya ekstrak rosella akibat udara yang terjerap dalam busa. Dimethicone menyebar pada permukaan busa


53

sehingga menyebabkan menurunnya tegangan muka dan pecahnya lapisan antar busa. Optimasi dimethicone menunjukkan bahwa formula dengan konsentrasi dimethicone sebanyak 2% ; 4% ; dan 6% memiliki gejala pemisahan karena adanya garis retak berisi udara pada sediaan. Konsentrasi dimethicone 8% memiliki stabilitas yang baik dapat menghilangkan busa serta menghasilkan sediaan dengan penampilan yang lebih mengkilap. Optimasi terhadap rasio fase emulsi primer dan fase air eksternal menunjukkan bahwa formula dengan rasio 3:6 dan 5:6 tidak stabil dengan persen pemisahan fase sebesar berturut-turut 4% dan 2%. Formula dengan ratio 4:6 memiliki stabilitas yang baik setelah penyimpanan selama 24 jam. Optimasi emulsifier sekunder Tween 80 untuk emulsi sekunder menunjukkan bahwa formula dengan konsentrasi tween sebanyak 4% dan 6% tidak stabil dengan persen fase pemisahan lebih dari 10%. Konsentrasi tween 80 sebanyak 2% menghasilkan sediaan yang stabil ditinjau dari fase pemisahannya selama 24 jam. Konsentrasi emulsifier yang tinggi dapat mengecilkan ukuran droplet namun dapat pula menyebabkan multiemulsi menjadi tidak stabil dan terjadi pemisahan fase setelah beberapa hari (Kumar dkk., 2012). Thickening agent merupakan salah satu variabel yang penting untuk dipertimbangkan dalam membuat multiemulsi. Xanthan gum sebagai thickening agent dapat meningkatkan viskositas fase air eksternal melalui ikatan biopolimer hidrofilik sehingga dapat mencegah pelepasan tak terkendali dari bahan aktif yang terjerap dalam partikel emulsi primer dan menghasilkan multiemulsi yang stabil (Lutz dan Aserin, 2008).


54

Optimasi proses pembuatan emulsi primer antara lain terhadap kecepatan pencampuran

dan

lama

pencampuran

menunjukkan

bahwa

kecepatan

pencampuran optimal adalah skala kecepatan lima dengan lama pencampuran 10 menit. Pembuatan emulsi primer A/M dilakukan pada pengadukan kecepatan tinggi untuk menghasilkan partikel emulsi yang berukuran lebih kecil. Semakin kecil ukuran partikel, maka emulsi pimer A/M akan semakin stabil. Emulsi primer yang stabil juga dapat meningkatkan kestabilan emulsi sekunder. Optimasi

proses

pembuatan

multiemulsi

A/M/A

tehadap

lama

pencampuran menunjukkan bahwa lama pencampuran selama 10; 12; dan 15 menit dengan skala kecepatan satu menunjukkan stabilitas yang baik setelah penyimpanan selama satu minggu sehingga dipilih lama pencampuran selama 10 menit untuk pembuatan multiemulsi A/M/A yang akan dilakukan pengujian. Emulsi primer didisperikan dalam fase air eksternal pada pengadukan kecepatan rendah untuk mencegah pecahnya droplet air dalam emulsi primer A/M. Optimasi formula multiemulsi A/M/A dipilih formula dengan persen pemisahan fase terendah (lampiran 7). Persen pemisahan fase menjadi parameter dalam pemilihan formula optimum karena merupakan fenomena ketidakstabilan yang dapat terlihat secara visual. Berdasarkan hasil optimasi formula, didapatkan formula optimum emulsi primer (A/M) (tabel III) dan multiemulsi A/M/A (tabel IV). Multiemulsi A/M/A yang telah tercampur homogen disimpan dalam wadah flakon, ditutup dengan alumunium foil, dan dijenuhkan dengan gas nitrogen untuk mencegah kontaminasi dan degradasi aktivitas antioksidan zat aktif ekstrak rosella yang bersifat fotosensitif.


55

Tabel III. Formula emulsi primer tipe air dalam minyak (A/M) Komposisi Jumlah (gram) Parafin cair 60,31 Span 80 7,48 Tween 80 1,22 MgSO4 0,61 Setil alkohol 5,56 Dimethicone 7,41 Aquadest 17,41 Tabel IV. Formula emulsi ganda tipe air dalam minyak dalam air (A/M/A) Komposisi Jumlah (gram) Emulsi primer 37,72 Tween 80 2,00 Xanthan gum 0,40 Aquadest 59,88

D. Hasil Evaluasi Multiemulsi A/M/A Ekstrak Rosella 1.

Pengamatan organoleptis dan pH Pengamatan organoleptis multiemulsi A/M/A menunjukkan bahwa multiemulsi berwarna merah muda dengan konsistensi seperti krim. Warna merah muda ditimbulkan oleh ekstrak rosella yang berwarna merah (gambar 13).

Gambar 13. Multiemulsi A/M/A ekstrak rosella


56

Multiemulsi A/M/A masih memiliki bau khas minyak yang berasal dari eksipien yang digunakan karena tidak ditambahkan penutup bau (corrigen

odoris)

dalam

formula

multiemulsi

A/M/A.

Pengamatan

organoleptis juga dilakukan terhadap sampel multiemulsi A/M/A ekstrak rosella pada rentang waktu perlakuan yaitu 1, 3, 7, 14, dan 28 hari. Secara visual, tidak terjadi perubahan warna sampel pada masing-masing waktu perlakuan (lampiran 2). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa antosianin dalam multiemulsi A/M/A belum mengalami degradasi menjadi senyawa kalkon yang berwarna coklat. Multiemulsi A/M/A bersifat asam dengan pH 4. Sifat multiemulsi yang asam dipengaruhi oleh adanya zat aktif ekstrak rosella yang juga bersifat asam. Multiemulsi A/M/A yang dihasilkan pada penelitian ini telah sesuai untuk penggunaan secara topikal karena telah sesuai dengan nilai pH kulit yang berkisar antara 4 hingga 6. Formulasi yang ditujukan untuk aplikasi pada kulit harus memiliki pH pada rentang tersebut (Lambers, Piessens, Bloem, Pronk, dan Finkel, 2006). Aplikasi suatu formulasi yang memiliki nilai pH yang sangat tinggi (basa kuat) maupun sangat rendah (asam kuat) dapat menyebabkan efek destruktif pada kulit (Sashi, Anroop, Vipin, dan Neelam, 2012).

2.

Pengukuran diameter partikel rata-rata Pengukuran

diameter

partikel

rata-rata

multiemulsi

A/M/A

dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan terhadap multiemulsi menunjukkan bahwa partikel internal yang terjerap dalam


57

partikel eksternal tidak dapat terlihat dengan jelas dikarenakan ukurannya yang kecil dan saling tumpang tindih satu sama lain di dalam partikel eksternal sehingga sulit untuk dilakukan pengukuran. Ukuran diameter partikel rata-rata multiemulsi yang diukur setelah pembuatan adalah sebesar 12,191 μm (perbesaran 40 kali) (gambar 14) dengan distribusi ukuran partikel terbanyak pada rentang 9,527-12,113 μm. Emulsi ganda umumnya terdiri dari 50-100 droplet air pada setiap partikel minyak, oleh karena itu partikel eksternal multiemulsi akan memiliki ukuran yang lebih besar dibandingkan emulsi biasa dan dapat menjerap zat aktif lebih banyak, dengan demikian meningkatkan aktivitasnya. Ukuran multiemulsi A/M/A yang lebih besar dibandingkan suspensi liposom memungkinkan pentrasi yang lebih lambat melalui lapisan-lapisan kulit sehingga multiemulsi A/M/A lebih tertahan pada kulit. Ukuran diameter partikel rata-rata multiemulsi yang diukur setelah penyimpanan hari ke–28 adalah sebesar 8,647 μm (perbesaran 40 kali) (gambar 15) dengan distribusi ukuran partikel terbanyak pada rentang 5,979– 9,537 μm. Gambar 15 menunjukkan bahwa tidak ada droplet internal yang terjebak dalam sistem multiemulsi A/M/A. Hal ini disebabkan karena penambahan elektrolit yaitu MgSO4 ke dalam fase air internal yang bertujuan untuk meningkatkan stabilitas multiemulsi A/M/A. Gradien osmotik yang tinggi yang disebabkan oleh adanya elektrolit menginduksi masuknya fase air eksternal ke dalam droplet internal untuk menyeimbangkan arus keluar yang dihasilkan oleh tekanan Laplace dan menyebabkan droplet internal pecah


58

serta melepaskan zat aktif serta elektrolit ke fase air eksternal. Gradien osmotik menurun dan keseimbangan tekanan tercapai, namun hilangnya droplet internal dalam sistem multiemulsi A/M/A merupakan proses ireversibel (Jiao dan Burgess, 2008).

Gambar 14. Foto mikroskopik multiemulsi A/M/A ekstrak rosella hari ke–1 (perbesaran 40 kali)

Gambar 15. Foto mikroskopik multiemulsi A/M/A ekstrak rosella hari ke–28 (perbesaran 40 kali)


3.

59

Uji tipe fase emulsi Pengujian tipe fase dilakukan untuk mengetahui jenis fase luar dari emulsi primer dan multiemulsi. Masing-masing emulsi primer dan multiemulsi dilarutkan dalam aquadest sebagai fase air dan parafin cair sebagai fase minyak. Hasil pengujian menunjukkan bahwa emulsi primer larut dalam minyak dan tidak larut dalam air, hal ini menunjukkan bahwa emulsi primer yang dibuat merupakan tipe A/M. Sedangkan multiemulsi larut dalam air dan tidak larut dalam minyak, hal ini menunjukkan bahwa multiemulsi yang dibuat merupakan tipe A/M/A (lampiran 3).

4.

Uji mekanik (sentrifugasi) Uji mekanik dilakukan ada multiemulsi A/M/A menunjukkan bahwa sampel terbagi menjadi empat lapisan. Lapisan yang terbentuk dari lapisan paling atas hingga lapisan paling bawah berturut-turut adalah minyak, emulsifier, air, dan xanthan gum (lampiran 4). Resistensi multiemulsi terhadap sentrifugasi bergantung pada kekuatan ikatan lapisan antara fase air dan minyak. Hasil uji ini menunjukkan bahwa multiemulsi A/M/A kurang stabil terhadap gerakan atau pengocokan yang kuat akibat pemisahan secara gravitasional yang dipercepat.

5.

Volume pemisahan Hingga hari ke–28, seluruh sampel belum menunjukkan adanya ketidakstabilan berupa creaming (lampiran 5). Hal ini dikarenakan ditambahkannya setil alkohol untuk meningkatkan viskositas fase internal dan


60

xanthan gum untuk meningkatkan viskositas fase eksternal. Jenis dan jumlah emulsifier yang tepat juga dapat menjaga agar barier antar fase tetap kuat sehingga mencegah koalesen droplet minyak yang dapat menyebabkan pemisahan fase. Selain itu, MgSO4 ditambahkan formula sebagai elektrolit untuk menjaga tekanan osmotik antar fase sehingga dapat mencegah perpindahan fase air eksternal ke fase air internal. Perpindahan air dari fase eksternal ke internal dapat menyebabkan droplet air internal membesar hingga menjadi pecah dan mengeluarkan senyawa yang dibawa ke fase eksternal (Jiao dan Burgess, 2008).

E. Evaluasi Suspensi Liposom Ekstrak Rosella 1.

Pengamatan organoleptis dan pH Pengamatan organoleptis suspensi liposom menunjukkan bahwa suspensi liposom berwarna merah tua, warna merah lebih gelap/tua dibandingkan pada multiemulsi A/M/A dengan penampilan yang jernih dan cair (gambar 16). Suspensi liposom tidak berbau tengik. Pengamatan organoleptis dilakukan terhadap suspensi liposom ekstrak rosella pada rentang waktu perlakuan yaitu 1 dan 14 hari. Secara visual, tidak terjadi perubahan warna sampel pada kedua waktu perlakuan dan tidak muncul bau tengik pada hari ke–14. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa antosianin belum mengalami degradasi menjadi senyawa kalkon yang berwarna coklat. Suspensi liposom bersifat asam dengan pH 4. Sifat suspensi liposom yang asam dipengaruhi oleh adanya zat aktif ekstrak rosella yang juga bersifat asam. Seperti halnya pada multiemulsi A/M/A, suspensi telah sesuai untuk


61

penggunaan secara topikal karena telah sesuai dengan nilai pH kulit yang berkisar antara 4 hingga 6. Formulasi yang ditujukan untuk aplikasi pada kulit harus memiliki pH pada rentang tersebut (Lambers dkk., 2006).

R1

R2

R3

Gambar 16. Suspensi liposom ekstrak rosella pada hari ke-1

2.

Pengukuran diameter partikel rata-rata Pengukuran diameter partikel rata-rata suspensi liposom dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan terhadap suspensi liposom menunjukkan bahwa liposom berbentuk bulat dengan ukuran yang relatif seragam berupa unilamelar yaitu tersusun oleh satu lapis membran. Ukuran diameter partikel rata-rata liposom adalah sebesar 2,450 μm (perbesaran 40 kali). Berdasarkan hasil ukuran diameter partikel tersebut maka liposom ekstrak rosella digolongkan dalam liposom jenis Giant Unilamelar Vesicle (GUV) (Ulrich, 2002) (gambar 17). Ukuran diameter partikel rata-rata liposom lebih kecil dibandingkan dengan multiemulsi A/M/A. Ukuran sistem pembawa yang lebih kecil memungkinkan penetrasi yang lebih cepat melewati lapisan-lapisan kulit hingga ke sirkulasi sistemik.


62

Gambar 17. Foto mikroskopik suspensi liposom ekstrak rosella (perbesaran 40x)

F. Penentuan Aktivitas Antioksidan Multiemulsi A/M/A Ekstrak Rosella dan Liposom dengan Metode DPPH Metode peredaman terhadap radikal DPPH (2,2-difenil-1-pikril-hidrazil) digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dalam waktu yang relatif singkat dan mudah. Penambahan sampel ekstrak rosella ke dalam larutan DPPH menyebabkan penurunan terhadap densitas optik pada panjang gelombang 515 nm yang menjadi indikasi atas kapasitas peredaman dari sampel multiemulsi maupun liposom. Peredaman oleh antioksidan terhadap radikal DPPH terjadi karena kemampuan untuk mendonorkan hidrogen dari gugus hidroksil fenolik sehingga menghasilkan produk akhir yang stabil dan tidak terjadi oksidasi lebih lanjut sistem biologis (Prakash, 2001). Metanol digunakan sebagai pelarut dalam pengujian aktivitas antioksidan karena ekstrak rosella dan DPPH larut dan stabil di dalamnya. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 15 menit dalam kuvet plastik spektrofotometri yang terlindung dari cahaya. Penurunan absorbansi disertai dengan perubahan warna dari ungu menjadi kuning, diukur pada berbagai seri konsentrasi dengan 3 kali


63

replikasi. Absorbansi DPPH akan mengalami penurunan seiring dengan peningkatan konsentrasi dari sampel yang ditambahkan. Ekstrak rosella yang diformulasikan dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom mengandung antosianin sebagai antioksidan karena kaya akan gugus hidroksil (-OH). Antosianin akan bereaksi dengan radikal DPPH (gambar 18). Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh antosianin tersebut akan menghasilkan radikal bebas baru yang sifatnya lebih stabil dan tidak reaktif akibat adanya penstabilan oleh resonansi (gambar 19).

O

O

N

N

N

NH

OH

H OH

O2N

NO2

O 2N

NO 2

HO

O OH

HO

O OH

OH NO2

OH

NO 2

O

O

Gambar 18. Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh antosianin

O

O

HO

HO

O

O

HO

O

O

OH

HO

O

OH

OH

OH

O OH

OH

OH

O

O OH

OH

OH

OH O

OH O

Gambar 19. Pembentukan radikal bebas yang lebih stabil oleh resonansi

1.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Penentuan panjang gelombang serapan maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang yang menghasilkan nilai absorbansi tertinggi terhadap senyawa yang diukur. Secara teoritis DPPH memiliki serapan pada panjang gelombang berkisar antara 515 nm hingga 520 nm. Namun secara


64

praktis perlu dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum menyesuaikan pada instrumen yang digunakan. Pengukuran panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan DPPH dalam pelarut metanol untuk mendapatkan gelombang serapan maksimum hanya dari larutan DPPH tanpa adanya gangguan dari serapan senyawa lain dari sampel.

Gambar 20. Spektrum serapan larutan DPPH 0,0776 mM dalam metanol

Berdasarkan hasil pengukuran panjang gelombang larutan DPPH, diperoleh serapan maksimum pada panjang gelombang 515 nm (gambar 20). Analisis senyawa dalam sampel menggunakan metode DPPH dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena perubahan absorbansi untuk setiap seri konsentrasi terjadi signifikan pada panjang gelombang tersebut sehingga akan menghasilkan kepekaan analisis yang maksimal.


2.

65

Hasil pengukuran aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A dan liposom dengan metode DPPH Trolox

merupakan

standar

yang

banyak

digunakan

untuk

membandingkan aktivitas antioksidan dari berbagai senyawa sedangkan metode DPPH digunakan untuk menguji kemampuan senyawa seperti misalnya antosianin untuk bertindak sebagai peredam radikal bebas. Pengukuran aktivitas antioksidan berdasarkan pada kinetika reaksi, maka dari itu fluktuasi suhu, dan lingkungan sekitar memberikan pengaruh terhadap sensitifitas dan validitas pengujian. Berdasarkan hal tersebut, senyawa antioksidan yang lebih stabil digunakan sebagai standar referensi yaitu BHT (Butil Hidroksi Toluen). Aktivitas antioksidan dari antosianin dalam ekstrak rosela dinyatakan dalam mikromol ekivalen Trolox per 100 gram (TE/100 gram) agar hasil yang didapatkan dapat dibandingkan dengan penelitian lainnya. Nilai aktivitas antioksidan BHT adalah sebesar 395000 TE/100 gram, berdasarkan hasil penelitian Prakash (2001). Kontrol positif BHT memiliki mekanisme peredaman radikal yang sama seperti antosianin karena dapat meredam radikal bebas dan menyebabkan abstraksi hidrogen oleh radikal bebas. Hasil reaksi tersebut menghasilkan radikal bebas yang telah distabilkan dengan menerima atom hidrogen dan radikal bebas baru yang terbentuk dari BHT (gambar 21.). Radikal bebas baru tersebut relatif tidak reaktif karena distabilkan oleh resonansi dan gugus yang terikat pada cincin aromatis secara stearik menghambat reaksi lebih lanjut (Savin, 2014).


66

Gambar 21. Reaksi peredaman radikal bebas oleh BHT (Savin, 2014)

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sampel ekstrak rosella dari multiemulsi maupun liposom mampu menurunkan intensitas warna ungu dari DPPH. Hasil pengukuran dengan metode DPPH dilakukan terhadap supernatan multiemulsi yang mengandung ekstrak rosella pada kisaran konsentrasi sampel yaitu 0,246–2,459 mg/mL. Konsentrasi sampel dihitung berdasarkan jumlah ekstrak yang dimasukkan dalam formulasi multiemulsi hingga proses preparasi dengan sentrifugasi. Plot nilai 50% pada sumbu y pada masing-masing kurva regresi linear menghasilkan rata-rata IC50 multiemulsi A/M/A pada hari pertama adalah sebesar 22457,24 TE/100 gram dan mengalami penurunan pada hari berikutnya. IC50 multiemulsi A/M/A pada hari ke–3, 7, 14, dan 28 berturut-turut adalah 1506,45; 16781,73; 15239,05; 16242,91 TE/100 gram di mana terjadi kenaikan dan penurunan

IC50 (TE/100 gram)

IC50 yang tidak proporsional setiap harinya (gambar 22). 25000.00 20000.00 15000.00 10000.00 0

5

10

15

20

25

30

Hari ke Gambar 22. Kurva aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A pada rentang waktu perlakuan hari ke-1, 3, 7, 14, dan 28


67

Ekstrak rosella dalam fase air internal pada multiemulsi A/M/A dapat berpindah ke fase air eksternal akibat pecahnya lapisan minyak yang memisahkan kedua fase tersebut untuk mencapai kesetimbangan konsentrasi sehingga semakin banyak ekstrak rosella yang tidak terlindungi dan menyebabkan penurunan aktivitas antioksidan pada multiemulsi A/M/A pada hari ke-28, seperti terlihat pada gambar 15. Xanthan gum yang ditambahkan pada fase eksternal multiemulsi A/M/A sebagai penstabil emulsi memiliki sifat viskoelastis sehingga terjadi penurunan viskositas fase eksternal selama penyimpanan. Hal tersebut menyebabkan mudahnya perpindahnya fase eksternal ke fase internal. Gambar 23 menunjukkan bahwa uji aktivitas antioksidan yang dilakukan dalam penelitan ini dan entrapment efficiency yang dilakukan oleh Li (2015) terhadap multiemulsi A/M/A ekstrak rosella memiliki profil yang sama selama rentang waktu pengujian 28 hari sehingga dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan yang terukur dalam penelitian ini dihasilkan oleh

Aktivitas antioksidan & entrapmet efficiency

ekstrak yang terukur pada spektrum penelitian entrapment efficiency tersebut.

25 20 15

Aktivitas antioksidan (IC50)

10 5

Entrapment efficiency (mg ektrak total)

0 0

10

20

30

Hari keGambar 23. Perbandingan aktivitas antioksidan dan entrapment efficiency multiemulsi A/M/A ektrak rosella


68

Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dibandingkan dengan ektrak rosella dalam suspensi liposom dengan waktu pengujian selama 14 hari. Hasil pengukuran dengan metode DPPH dilakukan terhadap supernatan liposom yang mengandung ekstrak rosella pada kisaran konsentrasi sampel yaitu 0,039–0,390 mg/mL. Konsentrasi sampel dihitung berdasarkan jumlah ekstrak yang dimasukkan dalam formulasi liposom hingga proses preparasi dengan sentrifugasi. IC50 liposom pada hari pertama adalah sebesar 84528,39 TE/100 gram dan pada hari ke-14 adalah sebesar

IC50 (TE/100 gram)

57340,96 TE/100 gram (gambar 24). 90000.00 80000.00 70000.00 60000.00 50000.00 40000.00 0

5

10

15

Hari keGambar 24. Kurva aktivitas antioksidan suspensi liposom pada rentang waktu perlakuan selama hari ke 1 dan 14

Menurut penelitian oleh Li (2015), entrapment effieciency liposom pada hari pertama lebih rendah dibandingkan pada muliemulsi A/M/A, namun dalam penelitian ini suspensi liposom menujukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi. Hal ini dapat disebabkan oleh struktur lipid bilayer liposom yang lebih rigid dibandingkan lapisan minyak pada multiemulsi A/M/A sehingga memiliki kemampuan yang lebih baik dalam menjaga zat aktif ekstrak rosella sehingga tidak keluar ke fase eksternal.


69

Laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom setelah penyimpanan selama 14 hari ditunjukkan oleh nilai slope masing-masing kurva regresi linear penurunan aktivitas antioksidan yang bernilai negatif sebesar berturut-turut untuk multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom yaitu 0,028 dan 0,0299 (gambar 25). Hasil tersebut menunjukkan bahwa penurunan aktivitas antioksidan pada liposom lebih besar dibandingkan pada multiemulsi A/M/A. Penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom selama 14 hari berkorelasi linear dengan laju disipasi antosianin yang dilakukan oleh Li (2015). y = -0.0299x + 11.375 R² = 0.9925

11.50

ln IC50

11.00 10.50 y = -0,028x + 10,023 R² = 0,5637

10.00

Multiemulsi A/M/A Suspensi Liposom

9.50 9.00 0

5

10 Hari ke-

15

Gambar 25. Laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom

Perbedaan terhadap laju penurunan aktivitas antioksidan antara dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom kemungkinan dapat disebabkan oleh perbedaan suhu penyimpanan pada kedua jenis sediaan tersebut yaitu -4oC pada multiemulsi A/M/A dan 4oC pada suspensi liposom, di mana pada suhu penyimpanan suspensi liposom yang lebih tinggi


70

dibandingkan multiemulsi A/M/A dapat meningkatkan ketidakstabilan antosianin dalam sediaan. Uji signifikansi antara laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom secara statistik menggunakan uji t untuk mengetahui perbedaan antara dua kelompok data yang berbeda yaitu multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom. Berdasarkan hasil perhitungan uji t didapatkan nilai t adalah 70,17. Nilai tersebut lebih besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 2,57 pada taraf kepercayaan 95%, maka dapat disimpulkan bahwa tidak ada perbedaan antara laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom (Lampiran 16). Penelitian kemampuan penetrasi multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ekstrak rosella yang dilakukan oleh Kwartono (2015) berdasarkan nilai slope regresi linear jumlah ekstrak rosella yang tertahan pada kulit menunjukkan bahwa multiemulsi A/M/A lebih tertahan di kulit dibandingkan suspensi liposom. Jumlah ekstrak rosella yang tertahan di kulit dihitung berdasarkan selisih antara jumlah ekstrak rosella yang dimasukkan dalam kompartemen donor (teoritis) dengan jumlah ekstrak rosella yang terdeteksi pada kompartemen donor (sisa) dan reseptor (terpenetrasi) setelah pengujian dalam rentang waktu 6 jam. Penelitian terhadap aktivitas antioksidan, entrapment efficiency, dan tingkat penetrasi multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ekstrak rosella memberikan hasil yang memiliki keterkaitan satu sama lain dan memberikan


71

kesimpulan hasil yaitu entrapment efficiency multiemulsi A/M/A lebih tinggi dibandingkan suspensi liposom namun kemampuan membran minyak multiemulsi A/M/A dalam melindungi antosianin dalam ekstrak rosella lebih rendah sehingga menyebabkan keluarnya ekstrak rosella dari fase internal ke fase eksternal. Antosianin dalam ekstrak rosella di fase eksternal mengalami kerusakan oleh faktor lingkungan seperti suhu, udara, serta pH selama penyimpanan dan dengan demikian menurunkan aktivitas antioksidan antosianin dalam ekstrak rosella. Uji signifikansi antara IC50 ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom secara statistik menggunakan uji t tidak berpasangan untuk mengetahui perbedaan antara dua kelompok data yang berbeda yaitu multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom. Berdasarkan hasil perhitungan uji t didapatkan nilai t adalah 16,75. Nilai tersebut lebih besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 3,18 pada taraf kepercayaan 95%, maka dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak rosella pada hari ke-1 dalam suspensi liposom dan (Lampiran 17).

multiemulsi A/M/A berbeda signifikan


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1.

Multiemulsi A/M/A formula optimum menghasilkan multiemulsi A/M/A yang stabil setelah penyimpanan selama 28 hari pada suhu -4oC, terlindung dari cahaya, dan diberi gas nitrogen ditunjukkan dengan tidak adanya pemisahan fase dan pengamatan secara mikroskopik yang memperlihatkan bahwa multiemulsi A/M/A menjerap emulsi primer yang mengandung ekstrak rosella, serta memiliki pH 4 yang sesuai dengan pH kulit.

2.

Aktivitas antioksidan ekstrak rosella dalam sediaan suspensi liposom lebih tinggi dibandingkan dalam multiemulsi A/M/A, ditunjukkan dengan nilai IC50 liposom dan multiemulsi A/M/A berturut-turut adalah 84528,39 dan 22457,24 TE/100 gram dengan laju penurunan aktivitas antioksidan ekstrak rosella antara dalam liposom dan dalam multiemulsi A/M/A selama 28 hari tidak berbeda signifikan.

B. Saran 1.

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang optimasi jenis dan konsentrasi elektrolit dalam formula multi emulsi A/M/A ini untuk meningkatkan stabilitas multiemulsi A/M/A.

2.

Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai identifikasi dan uji kualitatif senyawa yang menghasilkan aktivitas antioksidan dalam ekstrak rosella.

72


DAFTAR PUSTAKA Backer, C.A., dan Bakhuizen van den Brink, R.C., 1965, Flora of Java (Spermathophytes Only),Volume I, The Rijksherbarium, Groningen, hal. 421,429,431. Benichou, A., dan Aserin, A., 2008, Recent Developments in O/W/O Multiple Emulsions, in Multiple Emulsions Technology and Applications, John Wily & Sons, Inc., New Jersey, hal. 167. Benson, H.A.E., 2005, Transdermal Drug Delivery: Penetration Enhancement Techniques, Current Drug Delivery, 2, 27-28. Billany, M., 2001, Suspension and Emulsion, in Aulton’s Pharmaceutics The Science of Dosage Form Design, Second Edition, Churchill Livingstone, London, hal. 334–358, 341. Borras-Linares, I., dkk., 2015, Characterization of Phenolic Compounds, Anthocyanidin, Antioxidant and Antimicrobial Activity of 25 Varieties of Mexican Roselle (Hibiscus sabdariffa), Industrial Crops and Products, 19, hal. 385-394. Davis, A.F., Gyurik, R.J., Hadgraft, J., Pellett, M.A., dan Walters, K.A., 2002, Formulation Strategies for Modulating Skin Permeation, in Dermatological and Transdermal Formulations, Marcel Dekker, Inc., New York, hal. 315 – 316. Devasagayam, T.P.A., Tilak, J.C., Baloor, K.K., Sane, K.S., Ghaskadbi, S.S., dan Lele, R. D., 2004, Free Radicals and Antioxidants in Human Health: Current Status and Future Prospects, JAPI, 52, 794-804. Djeridane, A., Yousfi, M., Nadjemi, B., Boutassouna, D., Stocker, P., dan Vidal, N., 2006, Antioxidant activity of Some Algerian Medicinal Plants Extracts Containing Phenolic Compounds, Food Chemistry, 97(4), 654. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1975, Farmakope Indonesia, Edisi III, Jakarta, hal. xxxiii, 757. Epstein, H., dan Simion, F.A., 2001, Emulsion-Based Skincare Products: Formulating and Measuring Their Moisturizing Benefits, in Handbook of Cosmetic Science and Technology, Marcel Dekker, Inc., New York, hal. 511-528. Farombi, E.O., dan Fakoya, A., 2005, Free Radical Scavenging and Antigenotoxic Activities of Natural Phenolic Compounds in Dried Flowers of Hibiscus sabdariffa L., Mol. Nutr. Food. Res., 49, 1120-1128. Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2008, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 240-246. 73


74

Garti, N., dan Bisperink, C., 1998, Double Emulsions: Progress and Applications, Current Opinion in Colloidal & Interface Science, 3, 657-667. Gokturk, B.N., Ozkan, G., dan Yasar, S., 2007, Evaluation of Antiradical and Antioxidant Potential of Grape Extracts, Food Control, 18(9), 1131. Halliwell, B., 2001, Free Radical and Other Reactive Species in Disease, Encyclopedia of Life Science, Nature Publishing Group, hal. 1-7. Heather, A.E., dan Adam, C.W., 2012, Transdermal and Topical Drug Delivery: Principles and Practice, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, hal. 265, 281. Jiao, J., dan Burgess, D.J., 2008, Multiple Emulsion Stability: Pressure Balance and Interfacial Film Strength, in Multiple Emulsions Technology and Applications, John Wily & Sons, Inc., New Jersey, hal. 1-19. Jigar, V., Adarsh, S., Dhaval, R., dan Vijay, P., 2011, Development of Stable Multiple Emulsion of Atorvastatin, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, 2(2), 419 – 428. Kay, C., 2004, Analysis of The Bioactivity, Metabolism, and Pharmacokinectics of Anthocyanin in Humans, Thesis, University of Guelph, Canada, 1-9. Kedare, S.B., dan Singh, R.P., 2011, Genesis and Development of DPPH Method of Antioxidant Assay, J Food Sci Technol, 48 (4), 412-415. Kulkami, V.S., 2005, Liposomes in Personal Care Products, in Delivery System Handbook for Personal Care and Cosmetic Products, William Andrew Publishing, USA, hal. 296. Kumar, R., Kumar, M.S., dan Mahadevan, N., 2012, Multiple Emulsion : A Review, International Journal of Recent Advances in Pharmaceutical Research, 2(1), 9-19. Kunwar, A., dan Priyadarsini, K.I., 2011, Free Radicals, Oxidative Stress and Importance of Antioxidants in Human Health, Journal of Medical & Allied Sciences, 1(2), 53-60. Kwartono, Y., 2015, Perbandingan Kemampuan Penetrasi Multiemulsi A/M/A dan Suspensi Liposom yang Mengandung Ekstrak Rosella (Hibiscus sabdariffa L.), Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Laleh, G.H., Frydoonfar, H., Heidary, R., Jameei, R., dan Zare, S., 2006, The Effect of Light, Temperature, pH and Species on Stability of Anthocyanin Pigments in Four Berberis Species, Pakistan Journal of Nutrition, 5(1), 90-92.


75

Lambers, H., Piessens, S., Bloem, A., Pronk, H., dan Finkel, P., 2006, Natural Skin Surface pH is on Average Below 5, which is Beneficial for Its Resident Flora, Internation Journal of Cosmetic Science, 28, 359-370. Li, M., 2015, Pengaruh Penyimpanan Terhadap Stabilitas Ekstrak Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) dalam Formulasi Multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Lutz, R., dan Aserin, A., 2008, Multiple Emulsions Stabilized by Biopolymer, Multiple Emulsions Technology and Applications, John Wily & Sons, Inc., New Jersey, hal. 85–116. Mahadevan, N., Shivali., dan Kamboj, P., 2009, Hibiscus sabdariffa Linn. – An Overview, Natural Product Radiance, 8(1), 77-83. Mahmood, T., Akhtar, N., dan Manickam, S., 2014, Interfacial Film Stabilized W/O/W Nano Multiple Emulsions Loaded with Green Tea and Lotus Extracts: Systematic Characterization of Physicochemical Properties and Shelf-storage Stability, Journal of Nanobio Technology, 12(20), 1-8. Martin, A., Swarbrick, J., dan Cammarata, A., 1993, Dasar-dasar Farmasi Fisik dalam Ilmu Farmasetik, diterjemahkan oleh Yoshita, UI Press, Jakarta, hal. 1022-1030. Maryani, H., dan Kristiana, L., 2005, Khasiat Manfaat Rosela, PT. Agro Media Pustaka, Jakarta, hal. 2-33. Mates, J.M., 2000, Effects of Antioxidant Enzymes in The Molecular Control of Reactive Oxygen Species Toxicology, Toxicology, 153, 83-104. Meier, W., dan Schreiber, J., 2005, Intelligent Polymers and Self Organizing Liposome Gel Delivery System, in Delivery System Handbook for Personal Care and Cosmetic Products, William Andrew Publishing, USA, hal. 593. Mohd-Esa, N., Hern, F.S., Ismail, A., and Yee, C.L., 2010, Antioxidant Activity in Different Parts of Roselle (Hibiscus Sabdariffa L.) Extracts and Potential Exploitation of The Seeds, Food Chemistry, 122, 1055. Miguel, M.G., 2011, Anthocyanins: Antioxidant and/or Anti-inflammatory Activities, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 1(6), 7-15. Miller, J.N., dan Miller, J.C., 2010, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, Sixth Edition, Pearson Education Limited, England, hal. 3847, 266-267.


76

Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazil (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2), 211-219. Myers, D., 2006, Surfactant Science and Technology, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, hal. 280-322. Pandel, R., Poljšak, B., Godic, A., dan Dahmane, R., 2013, Skin Photoaging and the Role of Antioxidant in Its Prevention, ISRN Dermatology, 2013, 1-11. Pinsuwan, S., Amnuaikit, T., Ungphaiboon, S., dan Itharat, A., 2010, LiposomeContaining Hibiscus sabdariffa Calyx Extracts Formulations with Increased Antioxidant Activity, Improved Dermal Penetration and Reduced Dermal Toxicity, J Med Assoc Thai, 93(7), 216-226. Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Medallion Laboratories Analytical Progress, 19 (2), 1-4. Pritchard, J.D., 2007, Methanol Toxicological Overview, Health Protection Agency,5. Ranade, V.V., dan Hollinger, M.A., 2004, Drug Delivery System, Second Edition, CRC Press, Boca Raton, Florida. Rawlings, A.V., dan Lombard, K.J., 2012, A Review on The Extensive Skin Benefits of Mineral Oil, International Journal of Cosmetic Science, 34, 511-518. Rowe, R.C., Sheskey, P.J., dan Quinn, M.E., 2009, Handbook of Pharmaceutical Excipient, Sixth Edition, Pharmaceutical Press, London, hal. 155-156, 233-234, 474-475, 549-553, 675-678, 782-784. Salager, J., 2000, Emulsion Properties and Related Khow-how to Attain Them, in Pharmaceutical Emulsions ad Suspensions, Marcell Dekker, Inc., New York, hal. 90-91. Sashi, P., Anroop, N., Vipin, S., dan Neelam, S., 2012, Skin Kinetics and Dermal Clearance, International Research Journal of Pharmacy, 3(8), 15. Savin, K.A., 2014, Writing Reaction Mechanism in Organic Chemistry, Third Edition, Elsevier, Oxford, hal. 243. Shasi, K., Satinder, K., dan Bharat, P., 2012, A Complete Review on: Liposom, International Research Journal of Pharmacy, 3 (7), 10. Shier, D., Butler, J.L., dan Lewis, R., 2006, Hole’s Essentials of Human Anatomy and Physiology, ninth edition, Mc Graw Hill, New York, hal. 113–117.


77

Sonakpuriya, P., Bhowmick, M., Pandey, G.K., Joshi, A., dan Dubey, B., 2010, Formulation and Evaluation of Multiple Emulsion of Valsartan, International Journal of PharmTech Research, 5(1), 132-146. Stojiljković, D., Pavlović, D., dan Arsić, I., 2014, Oxidative Stress, Skin Aging, and Antioxidant Therapy, Scientific Journal of the Faculty Medicine, 31(4), 207-217. Tadros, T.F., 2005, Applied Surfactants Principles and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA., Weiheim, hal. 2, 115–136. Tee, P.L., Yusof, S., dan Mohamed, S., 2002, Antioxidants Properties of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) in Linoleic Acid Model System, Nutrition and Food Science, 32, 17-20. Ulrich, A.S., 2002, Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles, Bioscience Reports, 22(2), 129-146. Wallace, T.C., dan Giusti, M.M., 2014, Anthocyanin in Health and Disease, CRC Press, Florida, hal. 59-61. Walters, K.A., dan Roberts, M.S., 2002, The Structure and Function of Skin, Dematological and Transdermal Formulations, Marcel Dekker, Inc., New York. Watson, D.G., 1999, Pharmaceutical Analysis A Textbook for Pharmacy Students and Pharmaceutical Chemists, Churchill Livingstone, London, hal. 75-76, 80. Yang, L., dkk., 2012, Antioxidant Capacity of Extracts From Calyx Fruits of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.), African Journal of Biotechnology, 11(17), 4063-4068.


LAMPIRAN

78


Lampiran 1. Skema pembuatan emulsi ganda

Pengadukan kecepatan tinggi fase air Minyak + emulsifier lipofilik

Emulsi primer A/M

Pengadukan kecepatan rendah Emulsi primer A/M air + emulsifier hidrofilik

Multiemulsi A/M/A

79


Lampiran 2. Foto multiemulsi A/M/A selama rentang waktu pengujian Hari ke - 3

Hari ke - 7

Hari ke - 14

Hari ke - 28

80


Lampiran 3. Foto hasil uji tipe fase emulsi Emulsi primer dalam air

Emulsi primer dalam minyak

(tidak larut)

(larut)

Multiemulsi dalam air

Multiemulsi dalam minyak

(larut)

(tidak larut)

81


Lampiran 4. Foto hasil uji mekanik (sentrifugasi) multiemulsi A/M/A

Lapisan minyak

Lapisan emulsifier

Lapisan air

Lapisan xanthan gum

82


Lampiran 5. Foto hasil uji volume pemisahan multiemulsi A/M/A Multiemulsi A/M/A hari ke - 1

Multiemulsi A/M/A hari ke - 28

83


Lampiran 6. Penetapan bobot tetap ekstrak rosella Replikasi Cawan porselen (gram) Cawan porselen + ekstrak rosella 500μL (gram) Berat ekstrak awal (gram) Cawan porselen + berat ekstrak akhir (gram) Berat ekstrak akhir (gram)

I 27,4435 28,0144

II 22,4916 23,0566

III 21,7966 22,3513

0,5709

0,5650

0,5547

27,5029

22,5462

21,8380

0,5115

0,5104

0,5133



Rata-rata berat ekstrak awal =



Rata-rata berat ekstrak akhir =



Konsentrasi ekstrak dalam multiemulsi A/M/A = =

84


85

Lampiran 7. Optimasi formula dan pencampuran multiemulsi A/M/A ekstrak rosella a.

Optimasi emulsifier primer berdasarkan nilai HLB HLB 5 5,3 5,5 5,8 Volume pemisahan 16,5 16,1 15 14 (mL) Persen pemisahan 66% 64,4% 60% 56% fase  Untuk optimasi selanjutnya digunakan formula emulsi primer dengan HLB 5,8.

b. Optimasi kecepatan pencampuran emulsi primer Skala kecepatan 4 5 Volume pemisahan 14 13 (mL) Persen pemisahan 56% 52% fase  Untuk optimasi selanjutnya dilakukan pencampuran dengan skala kecepatan 5 untuk membuat emulsi primer. c.

Optimasi lama pencampuran emulsi primer Waktu (menit) 10 15 20 Volume 13 13 14 pemisahan (mL) Persen 52% 52% 56% pemisahan fase  Untuk optimasi selanjutnya dilakukan pencampuran selama 10 menit untuk membuat emulsi primer.

d. Optimasi eksipien setil alkohol sebagai stiffening agent Konsentrasi 4 4,5 5 5,5 6 8 10 (%b/b) Volume 3 2,5 2 2 0 0 0 pemisahan (mL) Persen 12% 10% 8% 8% 0% 0% 0% pemisahan fase berbusa Berbusa berbusa padat padat  Untuk optimasi selanjutnya digunakan formula emulsi primer dengan konsentrasi setil alkohol sebesar 6%.


86

e.

Optimasi eksipien dimethicone sebagai antifoaming agent Konsentrasi (%b/b) 2 4 6 8 Volume pemisahan 0 0 0 0 (mL) Persen pemisahan 0% 0% 0% 0% fase  Untuk optimasi selanjutnya digunakan formula emulsi primer dengan konsentrasi dimethicone sebesar 8%.

f.

Optimasi rasio fase emulsi primer dan fase air eksternal Rasio emulsi 3:4 4:6 5:6 primer : air Volume pemisahan 1 0 0,5 (mL) Persen pemisahan 4% 0% 2% fase  Untuk optimasi selanjutnya digunakan formula dengan rasio fase emulsi primer dan air eksternal sebesar 4:6.

g.

Optimasi jumlah emulsifier sekunder Konsentrasi (%b/b) 2 4 6 Volume pemisahan 0 2,6 2,8 (mL) Persen pemisahan 0% 10,4% 11,2% fase  Untuk optimasi selanjutnya digunakan formula multiemulsi A/M/A dengan konsentrasi emulsifier sekunder 2%.

h. Optimasi lama pencampuran multiemulsi A/M/A Waktu (menit) 10 12 15 Volume pemisahan 0 0 0 (mL) Persen pemisahan 0% 0% 0% fase  Untuk optimasi selanjutnya dilakukan pencampuran selama 10 menit dengan skala kecepatan 1 untuk membuat multiemulsi A/M/A.


Lampiran 8. Perhitungan jumlah emulsifier campuran emulsi primer berdasarkan nilai HLB HLB = X*HLB(X) + Y*HLB(Y) X = Span 80 HL 4,3 Y = Tween 80 HLB 15 X+Y = 1LB emulsi primer = 5 5 = X*4,3 + (1 – X)*15 5 = 4,3X + 15 – 15X X = 0,935 Y = 0,065  HLB emulsi primer = 5,3 5,3= X*4,3 + (1 – X)*15 5,3= 4,3X + 15 – 15X X = 0,907 Y = 0,093  HLB emulsi primer = 5,5 5,5= X*4,3 + (1 – X)*15 5,5= 4,3X + 15 – 15X X = 0,888 Y = 0,112  HLB emulsi primer = 5,8 5,8= X*4,3 + (1 – X)*15 5,8= 4,3X + 15 – 15X X = 0,860 Y = 0,140 HLB

5

5,3

5,5

5,8

Span 80 (10%b/b)

9,35

9,07

8,88

8,60

Tween 80 (10%b/b)

0,65

0,94

1,12

1,40

87


88

Lampiran 9. Perhitungan diameter globul rata-rata multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ekstrak rosella n = 75 k = 1 + 3,322log95 = 7,23 ≈ 7 

Emulsi primer A/M I=

(

Kelas (k) 1 2 3 4 5 6 7

)

Rentang (μm) 2,487 - 3,122 3,123 - 3,758 3,759 - 4,394 4,395 - 5,03 5,031 - 5,666 5,667 - 6,302 6,303 - 6,938

Nilai Tengah/d (μm) 2,805 3,441 4,077 4,713 5,349 5,985 6,621 Jumlah(∑)

Jumlah (n) 3 17 13 21 11 5 5 75

nxd 8,414 58,489 52,995 98,963 58,834 29,923 33,103 340,718

diameter rata-rata = 

Multiemulsi hari ke-1 I=

(

Kelas (k) 1 2 3 4 5 6 7

)

Rentang (μm) 9,527 - 10,819 10,820 - 12,113 12,114 - 13,406 13,407 - 14,699 14,700 - 15,992 15,993 - 17,286 17,287 - 18,579

diameter rata-rata =

Nilai Tengah/d (μm) Jumlah (n) 10,173 20 11,466 24 12,760 12 14,053 11 15,346 6 16,640 0 17,933 2 Jumlah(∑) 75

nxd 203,463 275,194 153,117 154,583 92,078 0,000 35,866 914,300




89

Multiemulsi hari ke-28 I=

(

)

Kelas (k) 1 2 3 4 5 6 7

Rentang (μm) 4,199 - 5,978 5,979 - 7,757 7,758 - 9,537 9,538 - 11,316 11,317 - 13,096 13,097 - 14,875 14,876 - 16,655


Jumlah (n) 7 23 25 9 7 2 2 75

nxd 35,618 157,961 216,186 93,843 85,446 27,972 31,531 648,557


Jumlah (n) 7 12 12 15 19 6 4 75

nxd 8,903 20,287 25,311 37,920 55,988 20,193 15,137 183,738

diameter rata-rata = 

Liposom I=

(

)

Kelas (k) 1 2 3 4 5 6 7 diameter rata-rata =

Rentang (μm) 1,063 - 1,481 1,482 - 1,899 1,900 - 2,318 2,319 - 2,737 2,738 - 3,156 3,157 - 3,574 3,575 - 3,993


90

Lampiran 10. Konsentrasi larutan uji ekstrak rosella dalam multiemulsi A/M/A Bobot tetap ekstrak = Konsentrasi ekstrak dalam multiemulsi = Konsentrasi ekstrak saat preparasi = Konsentrasi ekstrak sampel =

7,376 mg/mL

Lampiran 11. Konsentrasi larutan uji ekstrak rosella dalam suspensi liposom Bobot tetap ekstrak = Konsentrasi ekstrak dalam liposom = Konsentrasi ekstrak sampel liposom =

1,1696 mg/mL


91

Lampiran 12. Penimbangan DPPH dan BHT untuk penentuan aktivitas antioksidan multiemulsi A/M/A Penimbangan DPPH Hari Berat (gram) 1 3 7 14 28

Konsentrasi (mM)

Volume pengukuran (ul)

1,2934 1,268 1,3441 1,3187 1,3187

180 190 180 170 180

0,051 0,050 0,053 0,052 0,052

Contoh perhitungan konsentrasi DPPH mol = M=

Penimbangan BHT Hari Berat (gram) 1 0,200 3 0,200 7 0,201 14 0,201 28 0,203

Konsentrasi (mg/mL) 0,32 0,32 0,322 0,322 1,325

Contoh perhitungan konsentrasi BHT M=

8 mg/mL

Intermediet C1 . V1 = 8mg/mL .5mL = C2 =

C2 . V2 C2 . 50mL 0,8 mg/mL

Sampel C1 . V1 = 0,8mg/mL .10mL = C2 =

C2 . V2 C2 . 25mL 0,32 mg/mL


92

Lampiran 13. Aktivitas antioksidan multiemulsi A/MA ekstrak rosella dengan metode DPPH

Hari Replikasi

Hari ke-1

BHT

I

II

III

Konsentrasi sampel (mg/mL) 0,011 0,021 0,032 0,043 0,053 0,064 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 0,246 0,492 0,983 1,229 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 1,721

Absorbansi Absorbansi kontrol sampel

0,815

0,815

0,815

0,815

0,655 0,578 0,513 0,449 0,392 0,333 0,632 0,566 0,477 0,385 0,33 0,579 0,463 0,291 0,215 0,572 0,525 0,463 0,383 0,327 0,259

% inhibisi 19,632 29,080 37,055 44,908 51,902 59,141 22,454 30,552 41,472 52,761 59,509 28,957 43,190 64,294 73,620 29,816 35,583 43,190 53,006 59,877 68,221


Hari

Replikasi

BHT

Hari ke-3

I

II

III

Konsentrasi sampel (mg/mL)

0,011 0,021 0,032 0,043 0,053 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475

Absorbansi kontrol

0,815

0,815

0,815

0,815

93

Absorbansi sampel

% inhibisi

0,661 0,568 0,495 0,41 0,339 0,662 0,595 0,475 0,397 0,345 0,273 0,655 0,598 0,541 0,461 0,382 0,326 0,606 0,534 0,437 0,359 0,302

18,896 30,307 39,264 49,693 58,405 18,773 26,994 41,718 51,288 57,669 66,503 19,632 26,626 33,620 43,436 53,129 60,000 25,644 34,479 46,380 55,951 62,945


Hari

Replikasi

BHT

Hari ke-7

I

II

III


0,011 0,021 0,032 0,043 0,054 0,064 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 1,721

Absorbansi kontrol

0,843

0,843

0,843

0,843

94

Absorbansi sampel

% inhibisi

0,729 0,604 0,51 0,438 0,351 0,306 0,724 0,617 0,532 0,447 0,386 0,316 0,596 0,529 0,432 0,364 0,316 0,692 0,615 0,524 0,449 0,363 0,297 0,22

13,523 25,890 37,423 46,258 56,933 62,454 14,116 24,294 34,724 45,153 52,638 61,227 26,871 35,092 46,994 55,337 61,227 17,912 24,540 35,706 44,908 55,460 63,558 73,006


Hari

Replikasi

BHT

Hari ke-14

I

II

III


0,011 0,021 0,032 0,043 0,054 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 1,721 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475

Absorbansi kontrol

0,811

0,811

0,811

0,811

95

Absorbansi sampel

% inhibisi

0,601 0,527 0,431 0,358 0,316 0,643 0,532 0,487 0,416 0,391 0,293 0,221 0,639 0,554 0,475 0,396 0,353 0,252 0,605 0,544 0,458 0,375 0,321 0,247

25,894 35,018 46,856 55,857 61,036 20,715 34,402 39,951 48,705 51,788 63,872 72,750 21,208 31,689 41,430 51,171 56,473 68,927 25,401 32,922 43,527 53,761 60,419 69,544


Hari

Replikasi

Hari ke-28

BHT

I

II

III


0,022 0,033 0,043 0,054 0,065 0,076 0,087 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475 0,246 0,492 0,738 0,983 1,229 1,475

Absorbansi kontrol

0,833

0,833

0,833

0,833

96

Absorbansi sampel

% inhibisi

0,54 0,479 0,433 0,373 0,322 0,269 0,22 0,712 0,606 0,522 0,464 0,355 0,33 0,674 0,594 0,484 0,43 0,382 0,326 0,698 0,659 0,509 0,445 0,41 0,301

35,174 42,497 48,019 55,222 61,345 67,707 73,589 14,526 27,251 37,335 44,298 57,383 60,384 19,088 28,691 41,897 48,379 54,142 60,864 16,206 20,888 38,896 46,579 50,780 63,866


Hari

1

3

7

14

28

Sampel BHT Replikasi I Replikasi II Replikasi III BHT Replikasi I Replikasi II Replikasi III BHT Replikasi I Replikasi II Replikasi III BHT Replikasi I Replikasi II Replikasi III BHT Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Regresi Linear y = 733,57x + 12,9 r = 0,9986 y = 39,175x + 12,454 r = 0,9968 y = 44,914x + 19,387 r = 0,9973 y = 31,925x + 12,961 r = 0,998 y = 922,55x + 9,7914 r = 0,9990 y = 39,539x + 9,7996 r = 0,9931 y = 33,835x + 10,29 r = 0,9978 y = 39,075x + 6,6503 r = 0,9967 y = 922,67x + 5,7516 r = 0,9944 y = 38,466x + 5,5908 r = 0,9981 y = 36,181x + 9,5215 r = 0,9940 y = 38,214x + 7,431 r = 0,9989 y = 848,96x + 17,596 r = 0,9924 y = 32,956x + 15,043 r = 0,9912 y = 37,499x + 12,881 r = 0,9965 y = 36,424x + 16,252 r = 0,9981 y = 590,08x + 22,831 r = 0,9996 y = 36,289x + 8,6263 r = 0,9916

y = 33,9x + 13,005 r = 0,9878 y = 39,005x + 5,9704 r = 0,9846

IC50 (mg/mL)

TE/100gram

0,0506

395000

0,9584

20843,70

0,6816

29309,29

1,1602

17218,73

0,0436

395000

1,0167

16932,51

1,1736

14668,73

1,1094

15518,12

0,0480

395000

1,1545

16407,88

1,1188

16931,85

1,1139

17005,47

0,0382

395000

1,0607

14213,76

0,9899

15231,12

0,9265

16272,27

0,0460

395000

1,1401

15951,83

1,0913

16665,43

1,1288

16111,48

97

Rata-rata TE/100gram 395000

22457,24

395000

15706,45

16781,73

395000

15239,05

395000

16242,91


98

Lampiran 14. Penimbangan DPPH dan BHT untuk penentuan aktivitas antioksidan suspensi liposom Penimbangan DPPH Hari Berat (gram) 1 14

Konsentrasi (mM)

Volume pengukuran (ul)

1,2934 1,3187

185 180

0,051 0,052

Penimbangan BHT Hari Berat (gram) 1 0,202 14 0,202

Konsentrasi (mg/mL) 0,323 0,323


99

Lampiran 15. Aktivitas antioksidan suspensi liposom ekstrak rosella dengan metode DPPH Hari

Replikasi

BHT

Hari ke-1

I

II

III


0,022 0,032 0,043 0,054 0,065 0,075 0,039 0,078 0,117 0,156 0,195 0,234 0,273 0,312 0,351 0,390 0,117 0,156 0,195 0,234 0,273 0,312 0,351 0,390 0,039 0,078 0,117 0,156 0,195 0,234 0,273 0,312 0,351 0,390

Absorbansi kontrol

0,824

0,824

0,824

0,824

Absorbansi sampel

% inhibisi

0,594 0,552 0,463 0,431 0,369 0,336 0,728 0,695 0,616 0,588 0,503 0,439 0,396 0,352 0,315 0,229 0,606 0,544 0,497 0,455 0,409 0,373 0,327 0,286 0,691 0,654 0,602 0,537 0,493 0,446 0,414 0,325 0,315 0,275

27,913 33,010 43,811 47,694 55,218 59,223 11,650 15,655 25,243 28,641 38,956 46,723 51,942 57,282 61,772 72,209 26,456 33,981 39,684 44,782 50,364 54,733 60,316 65,291 16,141 20,631 26,942 34,830 40,170 45,874 49,757 60,558 61,772 66,626


Hari

Replikasi

BHT

Hari ke-14

I

II

III


0,022 0,032 0,043 0,054 0,065 0,075 0,086 0,039 0,078 0,117 0,156 0,195 0,234 0,273 0,312 0,351 0,390 0,078 0,117 0,156 0,195 0,234 0,273 0,312 0,351 0,390 0,039 0,078 0,117 0,156 0,195 0,234 0,273 0,312 0,351 0,390

Absorbansi kontrol

0,839

0,839

0,839

0,839

100

Absorbansi sampel

% inhibisi

0,555 0,472 0,404 0,376 0,322 0,269 0,219 0,754 0,683 0,655 0,602 0,551 0,52 0,454 0,395 0,366 0,309 0,707 0,682 0,618 0,554 0,529 0,46 0,395 0,364 0,326 0,744 0,737 0,662 0,598 0,532 0,472 0,442 0,411 0,345 0,308

33,850 43,743 51,847 55,185 61,621 67,938 73,897 8,495 17,112 20,510 26,942 33,131 36,893 44,903 52,063 55,583 62,500 14,199 17,233 25,000 32,767 35,801 44,175 52,063 55,825 60,437 9,709 10,558 19,660 27,427 35,437 42,718 46,359 50,121 58,131 62,621


Hari

1

14

Replikasi BHT Replikasi I Replikasi II Replikasi III BHT Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Regresi Linear y = 602,56x + 15,284 r = 0,9913 y = 171,89x + 4,1505 r = 0,9963 y = 138,71x + 11,801 r = 0,9981 y = 149,38x + 10,299 r = 0,9956 y = 591,47x + 23,6 r = 0,9932 y = 150,91x + 3,4547 r = 0,9980 y = 156,58x + 0,8738 r = 0,9960 y = 159,43x + 2,0874 r = 0,9936

IC50 (mg/mL)

TE/100gram

0,0576

395000

0,2667

85318,36

0,2754

82638,47

0,2658

85628,33

0,0446

395000

0,3084

57162,40

0,3137

56194,19

0,3005

58666,29

101

Rata-rata TE/100gram 395000

84528,39

395000

57340,96


102

Lampiran 16. Uji signifikansi (t-test) IC50 multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ekstrak rosella setelah penyimpanan hari ke-1 IC50 (TE/100gram) 20843,70 17218,73 29309,29 85318,36 82638,47 85628,33

Multiemulsi A/M/A Suspensi Liposom

Mean

SD2

SD

22457,24

6204,6793 38498045,22

84528,39

1644,0390

2702864,23

 H0 = tidak ada perbedaan antara kedua variansi Ftest = Ftable(2,2) = 39,00 > 14,24  H0 diterima, maka tidak ada perbedaan antara kedua variansi  H0 = aktivitas antioksidan ekstrak rosella pada hari ke-1 dalam liposom lebih besar daripada atau sama dengan multiemulsi A/M/A ( √

)

(

)

( √

√

√

)

(

)

√

√

Degree of freedom = n1 + n2 – 2 = 3 + 3 – 2 = 4 T4 = 2,78 (P=0,05) < |t| = 16, 7493 H0 diterima, aktivitas antioksidan ekstrak rosella pada hari ke-1 dalam liposom lebih besar daripada multiemulsi A/M/A


103

Lampiran 17. Uji signifikansi (t-test) laju penurunanIC50 multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom ekstrak rosella pada hari ke-1 hingga ke-14

Multi emulsi A/M/A Liposom 

SD 0,012338 0,001296

Mean -0,028051 -0,029851

H0 = tidak ada perbedaan antara dua variansi Ftest = Ftable(5,5) = 7,147< 90,6287  H0 ditolak  ada perbedaan antara dua variansi



H0 = slope laju penurunan aktivitas antioksidan multi emulsi A/M/A lebih dari atau tidak ada perbedaan dengan slope laju penurunan aktivitas antioksidan suspensi liposom ( √

)

√

(

)

(

)

=

Degree of freedom = (

)

(

)

(

)

(

)

T5 = 2,57 (P=0,05) < |t| = 70,1754  H0 diterima, slope laju penurunan aktivitas antioksidan multi emulsi A/M/A lebih dari atau tidak ada perbedaan dengan slope laju penurunan aktivitas antioksidan suspensi liposom


BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “Perbandingan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.) dalam Multiemulsi A/M/A dan Suspensi Liposom” dengan nama lengkap Eva Mayangsari, merupakan putri bungsu dari pasangan The Weng Tjok dan Ang Lek Lek. Penulis lahir di Pontianak, 17 Januari 1994. Pendidikan formal yang telah ditempuh penulis yaitu TK Karya Yosef Pontianak (1997-1999), tingkat Sekolah Dasar di SD Karya Yosef Pontianak (1999-2005), tingkat Sekolah Menengah Pertama di SMP Santo Petrus Pontianak (20052008), tingkat Sekolah Menengah Atas di SMA Santo Petrus Pontianak (2008-2011). Pada tahun 2011, penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama menempuh pendidikan sarjana, penulis mengikuti Pekan Ilmiah Nasional XXVI tahun 2013 yang dilaksanakan di Universitas Mataram dan memenangkan medali perak kategori presentasi poster. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi. Penulis pernah menjabat sebagai Sekretaris periode 2012 – 2013 dalam kepengurusan Komunitas Mahasiswa Buddhis Kong Hu Cu (KMBK) Dharma Virya Universitas Sanata Dharma. Selain itu juga aktif dalam beberapa kegiatan kepanitiaan, seperti Koordinator Dana dan Usaha Acara Donor Darah JMKI (2012), Koordinator Acara Seminar Motivasi Andrie Wongso (2012), Sekretaris Pharmacy Performance Road to School (PPRToS) 2013, dan Steering Committee Seminar Vegetarian Gobind Vashdev (2013).

104

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents