PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL KULIT BUAH JERUK LEMON (Citrus x limon (L.) Burm. f.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Wisnu Brahmana Putra NIM: 098114111

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013

i


ii


iii


iv


v


LEMBAR PERSEMBAHAN

vi


PRAKATA Puji dan Syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas kasih dan penyertaan yang diberikan hingga penuli dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL KULIT BUAH JERUK LEMON (Citrus x limon (L.) Burm. f.)”.Penelitian ini dilakukan untuk memenuhi salah satu syarat tugas akhir untuk mencapai gelar sarjana ilmu Farmasi bidang studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menyadari bahwa penulisan skirpsi ini tidak terwujud tanpa bimbingan, bantuan dan pengarahan berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt sebagai Dekan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Pembimbing utama skripsi ini atas segala kesabaran dan perhatian dalam memberikan bimbingan, pengarahan, tuntunan, dukungan dan motivasi selama penelitian dan penyusunan skripsi. 3. Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Penguji skripsi atas bantuan, masukan, dan perhatian kepada penulis demi kemajuan skripsi ini. 4. Dra. Maria Margaretha Yetty Tjandrawati, M.Si sebagai Dosen Penguji skripsi yang banyak memberikan saran demi kemajuan skripsi ini. 5. Ibu Rini Dwiastuti, M.Si.,Apt. selaku Kepala Laboratorium Farmasi yang telah memberikan izin penggunaan fasilitas laboratorium guna penelitian skripsi ini.

vii


6. Semua staf laboratorium Farmasi yang bersedia membantu selama penelitian berlangsung terkhusus laboran Laboratorium FarmakognosiFitokimia (Mas Wagiran) dan Kimia Analisis Instrumen (Mas Bimo). 7. Theresia Nindy, Tri Pamulatsih, Yenny, Augustinus Teti, Febrin Nessy, Putut Wibisono untuk semua semangat saling menguatkan selama pengerjaan skripsi. 8. Agustina Erni Purnamasari yang telah banyak membantu dan atas semua kesabarannya mendengarkan setiap keluh kesah. 9. Semua pihak yang penulis tidak dapat sebutkan satu persatu yang turut membantu selama penyusunan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dan bermanfaat demi pengembangan ilmu pengetahuan, serta menjadi acuan bagi penelitian-penelitian selanjutnya.

Yogyakarta, 12 Juli 2013

Penulis

viii


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...........................................................................................i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................ii HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ..........................................................................v LEMBAR PERSEMBAHAN .............................................................................vi PRAKATA ..........................................................................................................vii DAFTAR ISI .......................................................................................................ix DAFTAR TABEL ...............................................................................................xiii DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xiv DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xv INTISARI ................................................................................................xvi ABSTRACT ..........................................................................................................xvii BAB I. PENGANTAR ........................................................................................1 A. Latar Belakang ........................................................................................1 1. Perumusan masalah ...........................................................................3 2. Keaslian penelitian ............................................................................3 3. Manfaat penelitian .............................................................................4 B. Tujuan Penelitian ....................................................................................4 1. Tujuan umum ....................................................................................4

ix


2. Tujuan khusus ...................................................................................4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.................................................................5 A. Jeruk Lemon. ...........................................................................................5 1. Keterangan botani .............................................................................5 2. Morfologi ..........................................................................................6 B. Antioksidan .............................................................................................6 1. Radikal Bebas....................................................................................6 2. Antioksidan .......................................................................................7 C. Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) ...........................................8 D. Fenolik ....................................................................................................9 E. Flavonoid ................................................................................................10 F. Rutin ........................................................................................................11 G. Ekstraksi ..................................................................................................12 H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ............................................................12 I. Spektrofotometer Visible ........................................................................13 J. Validasi Metode ......................................................................................14 K. Landasan Teori ........................................................................................16 L. Hipotesis..................................................................................................17 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ..........................................................18 A. Jenis Penelitiandan Rancangan Penelitian ..............................................18 B. Variabel Penelitian ..................................................................................18 1. Variabel utama ..................................................................................18 2. Variabel pengacau .............................................................................18

x


C. Definisi Operasional................................................................................19 D. Bahan dan Alat Penelitian .......................................................................20 1. Bahan penelitian ................................................................................20 2. Alat penelitian ...................................................................................20 E. Tata Cara Penelitian ................................................................................20 1. Determinasi tanaman .........................................................................20 2. Pemilihan dan pengumpulan sampel .................................................21 3. Pembuatan simplisia .........................................................................21 4. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia .....................................................21 5. Penetapan aktivitas antioksidan ........................................................22 a. Kualitatif .....................................................................................22 b. Kuantitatif ...................................................................................22 6. Penetapan kadar fenolik dalam ekstrak .............................................25 F. Analisis Hasil ..........................................................................................26 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................................27 A. Hasil Determinasi ....................................................................................27 B. Hasil Preparasi Sampel ...........................................................................27 1. Hasil ekstraks sampel ........................................................................27 2. Hasil fraksinasi ekstrak metanol kulit lemon ....................................29 C. Hasil Uji Kualitatif Flavonoid dengan Metode KLT ..............................31 D. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan .................................34 1. Penentuan operating time (OT) .........................................................34 2. Penentuan panjang gelombang maksimum uji aktivitas

xi


antioiksidan .......................................................................................35 E. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ..................................36 1. Linearitas ...........................................................................................39 2. Presisi ................................................................................................40 3. Spesifitas ...........................................................................................41 F. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH .............42 G. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ................45 1. Penentuan operating time (OT) .........................................................45 2. Penentuan panjang gelombang maksimum .......................................46 H. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total .................46 1. Linearitas ...........................................................................................48 2. Presisi ................................................................................................48 3. Spesifitas ...........................................................................................49 I. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total .............................................49 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................53 A. Kesimpulan .............................................................................................53 B. Saran ........................................................................................................53 DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................54 LAMPIRAN ........................................................................................................57 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................77

xii


DAFTAR TABEL

Tabel I.

Rentang Accuracy yang Diperbolehkan ........................................ 15

Tabel II.

Rentang CV yang masih Diterima................................................. 15

Tabel III.

Hasil Scanning Panjang Gelombang Maksimum DPPH .............. 36

Tabel IV.

Hasil Pengukuran Absorbansi Seri Baku Rutin yang Direaksikan dengan Radikal DPPH .............................................. 37

Tabel V.

Hasil Pengukuran Absorbansi Seri Fraksi Etil Asetat yang Direaksikan dengan Radikal DPPH .............................................. 38

Tabel VI. Nilai % CV Uji Aktivitas Antioksidan Rutin dan Fraksi Etil Asetat ...................................................................................... 40 Tabel VII. Hasil Perhitungan IC50 Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Kulit Buah Lemon........................................................... 43 Tabel VIII. Tingkat Kekuatan Antioksidan Senyawa Uji dengan Metode DPPH ............................................................................... 43 Tabel IX. Hasil Scanning Panjang Gelombang Maksimum Penetapan Kandungan Fenolik Total pada Asam Galat ................................. 46 Tabel X.

Hasil Pengukuran Absorbansi Baku Asam Galat .......................... 48

Tabel XI. Nilai % CV Penetapan Kandungan Fenolik Total .......................... 49 Tabel XII. Kadar Asam Galat dan Absorbansinya Setelah Direaksikan dengan Pereaksi Folin-Ciocalteu yang Diukur pada λ 750 nm ........................................................................................ 52 Tabel XIII. Hasil Perhitungan Kandungan Fenolik Total ................................ 53

xiii


DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan ................................... 9 Gambar 2. Struktur Hesperidin dan Naringin .................................................. 11 Gambar 3. Struktur Rutin ................................................................................. 11 Gambar 4. Hasil Kromatogram Uji Kualitatif dengan Uap Ammonia ........... 32 Gambar 5. Hasil Kromatogram Uji Kualitatif dengan Semprot Besi (III) Klorida ............................................................................................ 33 Gambar 6. Grafik Penentuan OT Rutin............................................................ 34 Gambar 7. Grafik Penentuan OT Fraksi Etil Asetat ........................................ 35 Gambar 8. Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Rutin ..... 38 Gambar 9. Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat ...................................................................................... 39 Gambar 10. Grafik Penentuan OT Asam Galat ............................................... 45 Gambar 11. Grafik Penentuan OT Fraksi Etil Asetat ...................................... 45 Gambar 12. Kurva Persamaan Regresi Linear Penentapan Kadar Fenolik Total Asam Galat ......................................................................... 48 Gambar 13. Struktur Asam Galat ..................................................................... 51 Gambar 14. Reaksi Senyawa Fenol dengan Reagen Folin-Ciocalteu .............. 51 Gambar 15. Kurva Persamaan Regresi Linear Asam Galat ............................. 52

xiv


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar Buah Jeruk Lemon ......................................................... 58 Lampiran 2. Perhitungan Rendemen ................................................................ 58 Lampiran 3. Data Penimbangan untuk Pengujian Aktivitas Antioksidan ....... 59 Lampiran 4. Perhitungan Rf Rutin dan Fraksi Etil Asetat ............................... 60 Lampiran 5. Data konsentrasi bahan untuk pengujian aktivitas antioksidan ... 61 Lampiran 6. Scanning Larutan Pengkoreksi untuk Pengujian Aktivitas ......... 63 Lampiran 7. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ............................... 66 Lampiran 8. Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPH ........... 68 Lampiran 9. Perhitungan Nilai IC50 Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Kulit Lemon.................................................................. 71 Lampiran 10. Penimbangan Uji Kandungan Fenolik Total ............................. 72 Lampiran 11. Scanning Kontrol Asam Galat ................................................... 73 Lampiran 12. Optimasi Penentuan Kandungan Fenolik Total ......................... 75 Lampiran 13. Penentuan Kandungan Fenolik Total ........................................ 77 Lampiran 14. Uji Statistik dengan R 2.14.1 ..................................................... 75

xv


Intisari

Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu, maupun metabolisme dari dalam tubuh. Oleh karenanya diperlukan suatu substansi yang berfungsi untuk melindungi tubuh dari dampak negatif radikal bebas, yaitu antioksidan. Antioksidan alami dapat berasal dari buah dan sayuran salah satu sumber antioksidan adalah kulit jeruk lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.) yang diketahui mengandung senyawa golongan flavonoid yaitu naringin dan hesperidin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan menetapkan kandungan fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-difenil-2pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50). Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH memiliki λ maksimum di 516,0 nm. Ketika elektronnya berpasangan oleh keberadaan senyawa antioksidan, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Penentuan kandungan fenolik total dilakukan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan menggunakan baku standar asam galat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon mempunyai nilai IC50 sebesar 407,5 ± 6,32 µg/mL dan memiliki kandungan fenolik total sebesar 6,8 ± 1,19 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon. Kata kunci: kulit jeruk lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.), antioksidan, DPPH, IC50, kandungan fenolik total

xvi


Abstract

Free radicals can derived from pollution, dust, and metabolism of the body. Therefore needed a substance that serves to protect the body from the negative effects of free radicals, which is an antioxidant. Natural antioxidants can be derived from fruit and vegetable sources of antioxidants is one of the lemon peel (Citrus x limon (L.) Burm. f.) Are known to contain flavonoid compounds that naringin and hesperidin. This study aims to determine the antioxidant activity and total phenolic content sets from ethyl acetate fraction of methanol extract of lemon peel. Radical antioxidant activity assays using 1,1-diphenyl-2-pikrilhidrazil (DPPH) and is expressed by the value Inhibition Concentration 50 (IC 50). The existence of active antioxidant compounds will change DPPH solution color from purple to yellow. DPPH has a λ maximum at 516.0 nm. When the electron pairs by the presence of antioxidant compounds, the absorbance decreases corresponding stoichiometric number of electrons captured. Determination of total phenolic content performed by Folin-Ciocalteu reagent using gallic acid standarization. The results showed that the ethyl acetate fraction of methanol extract of lemon peel had IC50 values of 407,5 ± 6,32 µg/mL and has a total phenolic content of 6,8 ± 1,19 mg gallic acid equivalents per gram of ethyl acetate fraction of methanol extract of the lemon peel. Keywords:lemon peel(Citrus x limon (L.) Burm. f.), antioxidant, DPPH, IC50, total phenolic content

xvii


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Seiring berjalannya waktu makhluk hidup akan mengalami proses menjadi lebih tua secara alami, akan tetapi proses menjadi tua atau penuaan ini terkadang terlalu cepat yang disebabkan oleh banyak faktor, misalnya radikal bebas. Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu, maupun metabolisme dari dalam tubuh. Oleh karena itu diperlukan suatu substansi yang berfungsi untuk melindungi tubuh dari dampak negatif radikal bebas, yaitu antioksidan. Antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994). Di dalam tubuh sudah terdapat antioksidan yang dihasilkan secara alami misalnya enzim SOD (superoxyde dismutase), glutation, dan katalase, akan tetapi diperlukan suplai antioksidan dari luar untuk melindungi tubuh dari radikal bebas dalam jumlah besar. Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi karena ternyata dari hasil penelitian yang telah dilakukan bahwa antioksidan sintetik seperti BHT (Butylated Hydroxy Toluena) ternyata dapat meracuni

1


2

binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumbersumber antioksidan alami baru (Takashi dan Takayumi, 1997). Antioksidan alami dapat berasal dari buah dan sayuran. Salah satu sumber antioksidan adalah jeruk lemon. Berdasarkan penelitian sebelumnya telah diketahui adanya kandungan flavonoid naringin dan hesperidin pada jeruk, kulit, maupun biji (Tripoli, Guardia, Giammanco, Majo and Giamanco, 2007). Oleh karena itu peneliti ingin menggali informasi lebih spesifik yaitu apakah kulit buah jeruk lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.)memiliki daya antioksidan, dan seberapa besar kemampuannya dalam meredam dampak dari radikal bebas. Ekstraksi senyawa dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol dan fraksinansi dengan etil asetat. Pemilihan pelarut ini didasarkan karena adanya gugus hidroksi yang terdapat pada senyawa fenolik yang larut dalam pelarut polar. Metode yang digunakan untuk pengujian antioksidan pada penelitian ini adalah metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Berdasarkan metode ini, kemampuan antioksidan suatu senyawa dinyatakan oleh nilai IC50. Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal bebas. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005).


1.

3

Perumusan masalah Berdasarkan latar belakang diatas, maka rumusan masalah dari penelitian ini adalah sebagai berikut: a.

Apakah fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah jeruk lemon memiliki aktivitas antioksidan?

b.

Berapa nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50?

c.

Berapakah kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemonyang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?

2. Keaslian penelitian Uji aktivitas antioksidan kulit jeruk lemon ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Rafaela Guimaraes, Lillian Barros, Joao Barreira, Mª Joao Sousa, Ana Maria Carvalho, Isabel Ferreira (2009) dengan judul penelitian Targeting Excessive Free Radicals with Peels and Juices of Citrus Fruits: Grapefruit, Lemon, Lime and Orange. Pada penelitian yang dilakukan oleh Guimaraes dkk.(2009) menggunakan metode liofilisasi untuk pengeringannya, sedangkan dalam penelitian ini dilakukan pengeringan dengan oven pada suhu 50˚C. Berdasarkan pengamatan penulis, modifikasi penelitian yang dilakukan belum pernah dikerjakan


3.

4

Manfaat penelitian a.

Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan kesehatan masyarakat tentang penggunaan obat alternatif dalam bidang kesehatan.

b.

Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang penggunaan dan manfaat kulit buah jeruk lemon sebagai antioksidan.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum Memberi informasi tambahan baru tentang antioksidan alami dalam rangka pemanfaatan limbah dan ikut berpartisipasi dalam memberi sumbangsih dalam dunia penelitian. 2. Tujuan khusus a.

Mengetahuifraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah jeruk lemon memiliki daya antioksidan.

b.

Mengetahui kadar antioksidan yang terkandung dalam kulit buah jeruk lemon dengan menggunakan radikal DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

c.

Mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah jeruk lemonyang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Jeruk Lemon 1.

Keterangan botani Klasifikasi tanaman jeruk lemon menurut Anonim, 2012 sebagai berikut: a. Klasifikasi Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Super Divisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Sub Kelas

: Rosidae

Ordo

: Sapindales

Famili

: Rutaceae

Genus

: Citrus

Spesies

: Citrus x limon (L.) Burm. f.

b. Nama umum Sinonim

: Citrus limon

Indonesia

:Jeruk asam

Inggris

:Lemon

5


2.

6

Morfologi tanaman Pohon lemon tingginya bisa mencapai 10 sampai 20 kaki (3- 6 meter) dan terdapat duri tajam pada rantingnya. Daunnya ketika masih muda berwarna kemerahan, tetapi ketika sudah tua menjadi hijau gelap pada bagian atas dan berwarna hijau terang pada bagian bawah. Bentuk daunnya lonjong, elips ataupun oval. Panjang dari daunnya 6,25 sampai 11,25 cm. Bunganya memiliki 4 atau 5 kelopak. Berwarna putih pada bagian dalam, sedangkan luarnya berwarna keunguan. Buahnya berbentu oval dengan panjang 7 sampai 12 cm dan terdapat tonjolan puting. Kulit buah lemon ini berwarna kuning bercahaya dengan kelenjar minyak. Biji buah lemon berbentuk oval, tetapi beberapa lemon tidak memiliki biji (Morton, 1987).

B. Antioksidan 1.

Radikal bebas Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya (Winarsi, 2007). Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari molekulmolekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat


7

merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker (Winarsi, 2007).

2.

Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal (Winarsi, 2007). Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994). Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoksida dismutase, katalase, glutation peroksidase, dan glutation reduktase (Winarsi, 2007). Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu sebagai berikut: a) Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E, b) Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA, c) Inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen, dan


8

d) Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation peroksidase (Huang, et al., 2005). Aktivitas senyawa polifenol (flavonoid) sebagai antioksidan meliputi tiga mekanisme sebagai berikut. a. Aktivitas penangkapan radikal seperti reactive oxygen species (ROS) ataupun radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid seperti R·, RO·, dan ROO· dengan proses transfer elektron melalui atom hidrogen. b. Mencegah spesies senyawa reaktif produksi katalisis transisi metal seperti reaksi melalui khelasi metal. c. Interaksi dengan antioksidan lainnya, seperti lokalisasi dan penggabungan dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi, 2000).

C. Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan radikal bebas DPPH (Shivaprasad, et al., 2005). DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dinis, Maderia, dan Almeida,1994). Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara


9

stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

N

N

N

NH

+

O2 N

RH

+

O2N

NO2

R

NO2

NO2

NO2

DPPH

DPPH-H

Gambar 1. Reaksi Radikal DPPH dengan Antioksidan (Windono et al.,2001).

D. Fenolik Senyawa fenolik adalah substansi organik dimana terdiri dari senyawa aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen hidroksil (OH). Senyawa induk adalah fenol tetapi kebanyakan senyawa fenolik merupakan polifenol. Sumber senyawa fenolik sangat sedikit pada sumber hewani akan tetapi sangat melimpah pada sumber tumbuhan. Diantara 8000 senyawa polifenol tumbuhan yang diketahui, golongan yang terbanyak adalah flavonoid (Mann, Davidson, Hobbs, Banthorpe, dan Harborne, 1994). Sejauh

ini, senyawa

fenolik

tumbuhan

merupakan

golongan

mayoritas senyawa yang bertindak sebagai antioksidan atau penangkapan radikal bebas. Hal inimenjadi sangat beralasan untuk mendeterminasi jumlah kandungan


10

fenolik total pada ekstrak tanaman yang telah dipilih (Veeru, Kishkar, dan Meennakashi, 2009). Mekanismenya melalui kemampuan gugus fenol menangkap radikal bebas dengan memberikan atom hidrogennya, sehingga senyawa fenolik berubah menjadi radikal fenoksil. Radikal fenoksil ini terstabilkan oleh resonansi ( Brunneton, 1999).

E. Flavonoid Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid, hal inidisebabkan adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika senyawa-senyawa ini bereaksi dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Dengan demikian fase propagasi yang meliputi reaksi radikal berantai dapat dihambat (Cuvelier, Richards, and Besset, 1991). Menurut Peterson et al. (2006) flavonoid yang dominan dalam jeruk (citrus) adalah didymin, eriocitrin, hesperidin, naringin, narirutin, neoeriocitrin, neohesperidin, poncirin. Penyarian flavonoid dari dalam simplisia tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut polar, semi polar, maupun non polar sesuai dengan kelarutan flavonoid yang diekstraksi. Kelarutan flavonoid berbeda-beda sesuai golongan dan substitusinya (Robinson, 1995). Pelarut yang kurang polar digunakan untuk mengekstraksi aglikon flavonoid, sedangkan pelarut yang lebih polar digunakan untuk glikosida flavonoid atau antosianin. Flavonoid merupakan senyawa

polar

karena

mempunyai

sejumlah

gugus

hidroksi

yang


11

tidaktersubstitusi. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, etil asetat, dimetilsulfoksida, dimetilformamid dan air (Markham, 1998). OH

CH2

OH

O

HO

OH

HO

HO

OH O

O O

HO

OCH3

O

HO

O

O

O O

CH2

OH

O

HO HO OH

OH

OH

O

hesperidin

O

naringin

Gambar 2. Struktur Hesperidin dan Naringin (Peterson et al.,2006)

F. Rutin Rutin biasa disebut juga kuersetin-3-rutinoside karena merupakan gilkosida dari kuersetin, sehingga keduanya memiliki kemiripan struktur dan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat karena memiliki tiga ciri pada strukturnya, yaitu: 3’,4’-dihidroksi pada cincin B; 2,3-ikatan rangkap pada cincin C. Rutin merupakan komponen yang terdapat pada asparagus, soba, dan keluarga jeruk (Astawan dan Leomitro, 2008). OH

B

O

HO

A

C C

OH

OH

OR

O

R= D- Glucose - L - Rhamnose

Rutin Gambar 3. Struktur Rutin (Metodiewa, Kochman, and Karolczak, 2008)


12

G. Ekstraksi Penyarian merupakan peristiwa perpindahan mzat aktif yang semula berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif dalam cairan penyari tersebut (Trevor, 1995). Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI,1995).

H. Kromatografi Lapis Tipis(KLT) Kromatografi lapis tipis adalah cara pemisahan dengan adsorbsi pada lapisan tipis adsorben. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa organik, komplek senyawa organik alam maupun sintetik. Metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan yaitu waktu lebih cepat dan diperoleh pemisahan yang lebih baik dibandingkan kromatografi kertas (Sastrohamidjojo, 2007). Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah bahan penjerap (adsorben). Dua sifat penting yang harus diperhatikan untuk KLT adalah besar dan kecilnya partikel penjerap serta homogenitasnya, sebab daya lekat pada pendukung sangat ditentukan oleh kedua sifat tersebut. Partikel yang kasar tidak dapat memberikan pemisahan yang baik dan untuk memperbaikinya dapat digunakan partikel yang halus (umumnya 1-25 µm). Beberapa macam penjerap yang digunakan alumunium, selulosa, sephadex, keiselguhr, celite, poliamid, dan kalsium fosfat (Sastrohamidjojo, 2007).


13

Fase gerak adalah suatu medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Pemilihan fase gerak untuk KLT tergantung pada polaritas pelarut tersebut. Efek elusi dapat naik dengan kenaikan kepolaran pelarut, sedangkan laju rambat tergantung kepada viskositas pelarut (Sastrohamidjojo, 2007). KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama (Gandjar dan Rohman, 2010). Harga Rf dapat ditentukan sebagai berikut : Rf = Harga Rf ini adalah tetapan fisika yang dipengaruhi oleh bebrapa factor seperti tebal lapisan, kelembaban udara, fase gerak, bahan penjerap dan suhu (Sastrohamidjojo, 2007).

I.

Spektrofotometri Visibel

Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut “spektrometer” atau spektrofotometer (Sastrohamidjojo, 2007). Prinsip spektrofotometri adalah adanya interaksi dari energi radiasi elektromagnetik dengan zat kimia. Dari interaksi ini dikembangkan teknik-teknik analisis kimia yang memanfaatkan sifat-sifat interaksi tersebut (Sudarmadji,1991). Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi :


14

1.

Sumber tenaga radiasi yang stabil,

2.

Sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, celah-celah, dan lain-lain,

3.

Monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal,

4.

Tempat cuplikan yang transparan, dan

5.

Detektor radiasi yang dihubungkan dengan pencatat (Sastrohamidjojo, 2007).

J.

Validasi Metode

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter-parameter validasi metode analisis yang diperlukan untuk menilai ketepatan metode analisis antara lain meliputi akurasi, presisi, linearitas, dan spesifitas. 1. Akurasi Akurasi metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kriteria kecermatan sangat bergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD). Akurasi ditentukan dengan % recovery (Harmita, 2004). Tabel I. Rentang Accuracy yang Diperbolehkan (Harmita, 2004)


Analit pada matrik sampel 100 >10 >1 >0,1 0,01 0,001 0,000.1 (1 ppm) 0,000.01 (100 ppb) 0,000.001 (10 ppb) 0,000.000.1 (1 ppb)

15

Rata-rata yang diperboleh (%) 98-102 98-102 97-103 95-105 90-107 90-107 80-110 80-110 60-115 40-120

2. Presisi Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004). Presisi dinyatakan dalam standar deviasi atau Coeffisien of variant, dan tabel berikut merupakan syarat presisi yang dapat diterima berdasarkan kadar analit. Tabel II. Rentang CV yang masih dapat Diterima (Harmita, 2004)

Analit pada matrik sampel >1 0,001 0,000.1 (1 ppm) 0,000.000.1 (1 ppb)

CV (%) 2,5 5 16 32

3. Linieritas Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel.


16

Persyaratan data linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003). 4. Spesifitas Spesifitas suatu metode adalah kemampuan yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa placebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil merupakan selisih dari hasil uji keduanya (Harmita, 2004).

K. Landasan Teori Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul sekitarnya misalnya protein, asam lemak tak jenuh, dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan yang mampu menginaktivasi terjadinya radikal. Kulit buah jeruk lemon (Citrus x limon (L.) ini diduga memiliki daya antioksidan karena mengandung flavonoid yaitu naringin dan hesperidin. Metode DPPH adalah metode yang dapat digunakan untuk mengukur aktivitas antiradikal dalam uji antioksidan. DPPH merupakan radikal bebas yang


17

dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen. Keberadaan dari senyawa antioksidan ini akan menurunkan intensitas warna DPPH dari ungu menjadi kuning.

L. Hipotesis Fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon mempunyai aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH. Kadar fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental karena adanya perlakuan terhadap senyawa uji, dengan tahapan penelitian sebagai berikut. 1. Pemilihan dan pengumpulan sampel, 2. Pembuatan simplisia, 3. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia, 4. Penetapan aktivitas antioksidan, 5. Penetapan kadar fenolik dalam fraksi etil asetat kulit buah jeruk lemon.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel utama a. Variabel bebas: konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon. b. Variabel tergantung: aktivitas antioksidan (%IC) fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon. 2. Variabel pengacau a. Variabel pengacau terkendali: cara pengeringan dan pembuatan simplisia, dan jumlah (g) kulit lemon yang digunakan.

18


19

b. Variabel pengacau tak terkendali: tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur lemon yang dipanen, cara panen, cahaya matahari, cuaca atau musim, curah hujan, dan kelembaban ruang.

C. Definisi Operasional 1. Kulit buah jeruk lemon adalah kulit dari buah jeruk lemon yang didapatkan dari salah satu supermarket di Yogyakarta, buah berbentuk oval dengan tonjolan puting pada bagian ujung buah, dan berwarna kuning. 2. Ekstrak kulit buah lemon adalah ekstrak kental kulit buah jeruk lemonyang diperoleh dari hasil maserasi dengan metanol. 3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak metanol kulit buah lemon dengan menggunakan etil asetat yang telah difraksinasi dengan air dan washbensin. 4. Persen inhibition concentration (%IC) adalah kemampuan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon untuk menangkap radikal DPPH yang dinyatakan dalam persen. 5. Inhibition concentration 50 (IC50) merupakan nilai konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon yang mampu menangkap 50% radikal DPPH.


20

D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: kulit buah lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.) yang didapatkan dari salah satu supermarket di Yogyakarta. Bahan kimia kualitas pro analitik (E.merck) meliputi metanol dan kloroform. Bahan kimia kualitas pro analitik Sigma. Co., USA meliputi DPPH, rutin, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. Bahan kimia kualitas teknis Brataco Chemica meliputi metanol, washbensin, dan etil asetat. Bahan kimia kualitas farmasetis berupa akuades.

2. Alat-alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa vortex (junke & kunkel), spetrofotometer UV-Vis Mini 1240, blender, corong, Buchner, oven, mikropipet 10-1000 µL, makropipet 1-10 mL, neraca analitik, vacum rotary evaporator (junke & kunkel), dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany, dan Iwaki).

E. Tatacara Penelitian 1.

. Determinasi tanaman Determinasi buah jeruk lemon dilakukan dengan membandingkan ciriciri buah lemon dengan ciri-ciri buah lemon yang disebutkan Morton (1987) dalam buku acuan.


2.

21

Pemilihan dan pengumpulan sampel Sampel kulit buah jeruk lemon didapatkan dari salah satu supermarket di Yogyakarta. Kulit buah jeruk lemon yang digunakan adalah buah jeruk lemon yang siap dikonsumsi.

3.

Pembuatan simplisia Kulit buah jeruk lemon dicuci bersih, ditiriskan dan diiris tipis. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50o C selama 3 x 24 jam. Simplisia kering ditandai dengan kult jeruk yang telah menjadi rapuh kemudian diserbuk kasar dengan menggunakan mesin penyerbuk dan dilewatkan ayakan dengan ukuran 40 mesh.

4.

Ekstraksi dan fraksinasi simplisia Sebanyak 1 kg serbuk simplisia kulit buah lemon dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah dengan metanol sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama tiga hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan kertas saring dengan bantuan

corong

Buchner

dan

pompa

vakum.

Ampas

penyaringan

diremaserasi dengan metanol kembali selama dua hari. Kemudian filtrat dicampur dengan filtrat terdahulu. Keseluruhan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak metanol kental kulit buah lemon.


22

Ekstrak metanol kental kulit buah lemon dilarutkan dalam 300 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : washbensin (1:1 v/v), dihasilkan fraksi air dan washbensin. Kemudian fraksi air diekstraksi kembali menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga didapatkan fraksi etil asetat kental. Fraksi etil asetat ini yang digunakan untuk analisis selanjutnya.

5.

Penetapan aktivitas antioksidan a. Kualitatif Fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon dan standar rutin masing-masing dilarutkan dalam metanol kemudian ditotolkan pada lempeng selulosa gel. Lempeng tersebut dielusi dengan fase gerak kloroform : metanol (1:1 v/v). Setelah dielusi, bercak diamati pada UV 365 nm dengan jarak rambat 10 cm. Pereaksi semprot yang digunakan adalah uap ammonia dan besi (III) klorida. b. Kuantitatif 1.

Pembutan larutan DPPH 0,4 mM Sebanyak 15,8 mg serbuk DPPH dimasukkan ke dalam labu takar 100,0 ml, lalu ditambahkan metanol hingga batas tanda. Dihomogenkan dengan bantuan vortex untuk melarutkan DPPH.


2.

23

Pembuatan larutan rutin 0,250 mg/ml Sebanyak 2,5 mg rutin dimasukkan dalam labu takar 10 ml, masukkan metanol hingga batas tanda. Buat larutan pembanding dengan konsentrasi 12,25; 19,25; 26,25; 33,25; dan 40,25 μg/mL.

3. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan Ekstrak kulit buah jeruk lemonditimbang sebanyak 100 mg ditambahkan metanol sampai 25,0 ml. Larutan tersebut kemudian dibuat larutan uji dengan konsentrasi 300,0; 350,0; 400,0; 450,0; dan 500,0 µg/mL. 4. Penentuan operating time Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 ml, ditambahkan masing-masing 1 mL larutan pembanding rutin 12,25; 26,25; 40,25 µg/mL. Kemudian tambahkan metanol hingga batas tanda. Larutan dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu baca absorbansinya pada λ 517 nm tiap 10 menit selama 1 jam. Tentukan operating time reaksi. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 300; 400; 500 µg/mL. 5. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 12,12; 26,25, dan 40,25 µg/mL larutan DPPH 0,4 mM. Setelah itu di add hingga batas tanda dan divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum


24

dengan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 300; 400; 500 µg/mL. 6. Penentuan aktivitas antioksidan Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu takar 5,0 ml kemudian ditambahkan 1,0 ml larutan uji atau pembanding pada berbagai konsentrasinya. Tambahkan metanol hingga batas tanda. Larutan divortex selama 30 detik dan didiamkan selama operating time. Baca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakuakan dengan 3 kali replikasi. Aktivitas antioksidan (%IC) dihitung dengan rumus: -

% IC =

x 100%

7. Validasi metode uji aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur 6. divalidasi dengan parameter akurasi (% recovery), presisi (% CV), spesifitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r). % Recovery % CV =

x 100%

-

x 100%


25

6. Penetapan kadar fenolik dalam ekstrak a. Pembuatan larutan asam galat Dibuat larutan asam galat dengan konsentrasi 500 μg/ml dalam aquades : metanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 1,0;1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ml. Larutan tersebut kemudian ditambahkan aquades: metanol p.a (1:1) ad sampai 10 ml, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL. b. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat konsentrasi 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL ditambahan dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 ml Na2CO3 1 M. Setelah OT, baca absorbansi pada panjang gelombang maksimum terhadap blangko yang terdiri dari aquades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-ciocalteu, dan larutan

Na2CO3 1 M.

Pengerjaan dilakukan 3 kali. c. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total Hasil dari prosedur pembuatan kurva baku asam galat divalidasi berdasarkan parameter akurasi (% recovery), presisi (% CV), linearitas (nilai r), serta spesifitas (spektra kontrol). d. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Larutan uji 1000 µg/mL diambil 6,5 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa


26

ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat). Lakukan 3 kali replikasi.

F. Analisis hasil Data aktivitas antioksidan digunakan untuk menghitung IC50 dengan menggunakan persamaan regresi linear dengan konsentrasi larutan uji sebagai sumbu x dan % IC sebagai sumbu y. Setelah itu dianalisis dengan menggunakan statistik untuk melihat ada tidaknya perbedaan bermakna antara IC50 larutan pembanding dengan larutan uji. Dari uji kandungan fenolik total didapatkan nilai mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linear dengan data kurva baku secara intrapolasi.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A.

Hasil Determinasi

Determinasi perlu dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam menggunakan buah jeruk lemon. Buah lemon yang digunakan memiliki ciri-ciri bentuk oval dengan tonjolan puting pada ujung buahnya, kulitnya berwarna kuning dengan kelenjar minyak. Daging buahnya berwarna kuning pucat, dan memiliki biji berbentuk elips. Hal ini berarti bahan yang digunakan memang benar kulit yang berasal dari buah jeruk lemon karena sesuai dengan ciriciri buah lemon yang disebutkan Morton (1987) dengan nama spesies Citrus limon.

B. Hasil Preparasi Sampel 1. Hasil ekstrak sampel Ekstraksi bertujuan untuk menarik kandungan kimia yang diinginkan dari sampel menggunakan pelarut yang sesuai dimana komponen yang diinginkan dapat larut di dalamnya. Dasar dari ekstraksi adalah perpindahan massa aktif yang semula berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif dalam cairan penyari tersebut (Trevor, 1995). Semakin banyak permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari maka proses ekstraksi bertambah baik (Harborne,1987).

27


28

Pembuatan ekstrak kulit buah lemon diawali dengan melakukan sortasi basah. Sortasi basah ini bertujuan untuk menghilangakn pengotor seperti debu dan tanah dari kulit buah jeruk lemon. Setelah itu kulit buah lemon di angin-anginkan untuk menghilangkan air sisa pencucian yang terdapat pada kulit buah lemon. Sebelum di blender, kulit buah lemon di oven terlebih dahulu selama 3 hari pada suhu pengeringan yanitu 50˚C untuk memudahkan dalam pemblenderan. Kulit buah lemon di blender bertujuan untuk memperkecil ukuran kulit buah lemon sehingga luas permukaan akan semakin besar. Semakin besar luas permukaan maka kesempatan sampel untuk bersentuhan dengan cairan penyari akan semakin besar sehingga proses penyarian akan lebih efektif. Penyari yang digunakan dalam ekstraksi ini adalah metanol. Metanol merupakan pelarut yang biasa digunakan untuk melarutkan senyawa organik. Pemilihan metanol dibandingkan dengan etanol yaitu karena metanol memiliki kepolaran yang lebih besar daripada etanol (metanol= 6.6 dan etanol= 5.2) sehingga lebih mudah berinteraksi dengan senyawa fenolik yang cenderung polar. Selain itu viskositas metanol lebih kecil dibandingkan dengan etanol, sehingga metanol dapat berdifusi menembus sel-sel dibandingkan etanol. Meode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Dibandingkan dengan metode ekstraksi yang lain, maserasi memiliki cara kerja yang sederhana dan tidak menggunakan pemanasan seperti perkolasi dan soxhletasi, karena flavonoid mudah rusak dengan adanya pemanasan. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk kulit buah lemon selama 3 hari ke dalam cairan


29

penyari, yaitu metanol dan menggunakan bantuan alat pengadukan yaitu shaker. Pengadukan sendiri bertujuan untuk meningkatkan kontak antara cairan penyari dengan sampel sehingga penyarian lebih efektif. Selain itu, pengadukan juga diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar sampel sehingga tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan di dalam dan di luar sel (Baraja, 2008). Setelah maserasi berlangsung selama 3 hari, dilakukan penyaringan dan remaserasi menggunakan penyari metanol selama 2 hari. Remaserasi ini bertujuan untuk memaksimalkan proses penyarian senyawa-senyawa yang tidak tersari akibat penyari yang sudah jenuh sebelumnya. Selama proses maserasi labu ditutup dengan alumunium foil untuk meminalisir rusaknya fenolik akibat terpapar sinar matahari dan UV. Hasil dari maserasi dan remaserasi di saring dengan kertas saring dengan corong Buchner dan pompa vacuum. Setelah itu sari metanol diuapkan dengan vaccum rotary evaporator pada suhu 50˚C dan tekanan rendah hingga diperoleh sari pekat metanol. Sari pekat kemudian di uapkan dengan oven hingga terbentuk ekstrak kental. Bobot ekstrak metanol yang didapat adalah 52,74 g dan rendeman yang di dapat adalah 35,16 % (lampiran 2).

2. Hasil fraksinasi ekstrak metanol kulit lemon Fraksinasi bertujuan untuk mendapatkan fraksi yang berisi senyawa murni. Ekstrak metanol merupakan pelarut yang dapat menyari senyawasenyawa polar non target yang terdapat di kulit buah lemon seperti vitamin


30

dan mineral. Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan senyawa target dengan senyawa non target berdasarkan kesamaan karakteristik fisikokimianya sehingga didapatkan senyawa yang diinginkan seperti senyawa fenolik. Ekstrak metanol yang didapat dilarutkan dengan air hangat agar lebih melarutkan ekstrak metanol. Larutan tersebut kemudian di partisi dengan menggunakan washbensin. Partisi ini dilakukan dengan perbandingan pelarut air : washbensin 1:1 v/v dimana bagian yang polar akan cenderung larut dalam air dan bagian yang non polar akan larut dalam washbensin. Fraksi washbensin akan berada di bagian atas karena berat jenis air (0,996) lebih besar daripada berat jenis washbensin (0,730) (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Fraksi washbensin akan mengandung senyawa yang tidak diperlukan untuk analisis seperti lemak, minyak, dan vitamin, sedangkan senyawa fenolik akan tertinggal didalam fraksi air. Fraksi air tersebut kemudian difraksi kembali dengan etil asetat. Etil asetat merupakan pelarut semi polar dan dapat melarutkan senyawa semi polar pada dinding sel seperti aglikon flavonoid (Harborne, 1987). Fraksi air dan etil asetat akan terpisah, fraksi etil asetat akan berada di atas sedangkan fraksi air akan berada di bawah karena berat jenis air lebih besar (0,996) daripada berat jenis etil asetat (0,898). Fraksi etil asetat yang telah dipisahkan kemudian diupakan dengan vaccum rotary evaporator untuk meminimalkan pemanasan agar stabilitas senyawa fenolik tetap terjaga. Sisa fraksi etil asetat kemudian diuapkan


31

dengan oven sampai didapatkan ekstrak kental. Bobot fraksi air yang didapat sebesar 0,64 g dengan rendemen fraksi yaitu 0,4267% (lampiran 2).

C. Hasil Uji Kualitatif Flavonoid dengan Metode KLT Pada penelitian ini dilakukan uji kualitatif terhadap fraksi etil asetat untuk mengetahui apakah di dalam kulit buah lemon mengandung flavonoid. Sebagai pembanding digunakan rutin yang merupakan senyawa golongan flavonoid. Metode yang digunakan adalah KLT (kromatografi lapis tipis). Fase diam yang dipakai adalah selulosa dan fase gerak yang dipakai adalah kloroform : metanol 1:1 v/v. Fase diam yang digunakan selulosa bukan silica gel GF254 karena adanya ikatan Ca yang terdapat pada gypsum (perekat) silica gel GF254 terhadapflavonoid sehingga flavonoid tidak dapat terelusi dengan baik.


32

Rf 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 A B Gambar 4. Kromatogram KLT Uji Kualitatif Flavonoid dengan Uap Ammonia Keterangan: Fase gerak= kloroform : metanol 1:1v/v a = Fraksi etil asetat bercak a Fase diam = selulosa b = Fraksi etil asetat bercak b Jarak elusi = 10 cm A = Pada cahaya tampak Pereaksi = Uap ammonia B = Deteksi UV 365

Deteksi bercak menggunakan uap ammonia. Bercak tidak nampak sebelum dan setelah di uapi dengan uap ammonia untuk baku rutin dan sampel pada cahaya tampak. Ketika dilihat pada UV 365 terdapat tiga bercak, dua bercak berasal dari fraksi etil asetat sedangkan satu bercak berasal dari baku rutin. Bercak rutin dengan warna ungu gelap dengan Rf 0,43 Sedangkan untuk fraksi etil asetat kedua bercak memberikan warna yang berbeda-beda. Bercak a berwarna ungu gelap sama dengan rutin dengan Rf 0,98 untuk bercak b memberikan warna ungu terang dengan Rf 0,92. Hal tersebut membuktikan bahwa di dalam kulit lemon


33

terdapat flavonoid yang ditunjukan dari bercak a yang memiliki warna yang sama dengan bercak rutin, tetapi flavonoid yang terkandung dalam kulit buah lemonbukanlah rutin karena nilai Rf bercak a berbeda dengan nilai Rf rutin. Sedangkan bercak b diperkirakan golongan flavonol.

Rf 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 A B Gambar 5. Kromatogram KLT Uji Kualitatif Flavonoid dengan Semprot Besi (III) Klorida Keterangan : Fase gerak= kloroform : metanol 1:1v/v a = Fraksi etil asetat bercak a Fase diam= selulosa b = Fraksi etil asetat bercak b Jarak elusi= 10 cm A = Pada cahaya tampak Deteksi = Besi (III) Klorida B = Deteksi UV 365

Penyemprotan dengan besi (III) klorida memberikan kromatogram mirip dengan perlakuan menggunakan uap ammonia, hanya saja bercak a pada fraksi etil asetat terlihat lebih jelas jika dibandingkan dengan bercak a pada perlakuan dengan uap ammonia, tetapi untuk Rf-nya tidak mengalami perubahan. Bercak


34

rutin memiliki Rf 0,43; bercak a dengan Rf 0,98; sedangkan bercak b dengan Rf 0,92.

D. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1.

Penentuan operating time ( OT ) Penentuan OT bertujuan untuk menentukan rentang waktu yang tepat

ketika reaksi telah berjalan optimal. Penentuan OT dilakukan dengan mengukur absorbansi DPPH setiap 5 menit selama 60 menit pada larutan pembanding, yaitu rutin yang telah direaksikan dengan DPPH dan juga larutan uji, yaitu sampel yang telah direaksikan dengan DPPH. Panjang gelombang maksimum yang digunakan untuk penentuan OT adalah λ maksimum teoritis, yaitu 517 nm (Dehpour, 2009). Penentuan Operating Time Rutin 0,9 0,8

Absorbansi

0,7 0,6 0,5

12,25 µg/mL

0,4 26,25 µg/mL

0,3

40,25 µg/mL

0,2 0,1 0 0

10

20

30 40 waktu (menit)

50

60

70

Gambar 6. Grafik Penentuan OT Rutin


35

Penentuan Operating Time Fraksi Etil Asetat 0,6

Absorbansi

0,5 0,4 300 µg/mL

0,3

400 µg/mL

0,2

500 µg/mL 0,1 0 0

10

20

30 40 waktu (menit)

50

60

70

Gambar 7. Grafik Penentuan OT Fraksi Etil Asetat

Berdasarkan Gambar 6.penentuan OT tersebut dapat diketahui bahwa absorbansi stabil setelah menit ke-40 hingga menit ke-60 pada tiga konsentrasi, sehingga dapat disimpulkan bahwa operating time untuk reaksi radikal DPPH dengan rutin maupun dengan larutan uji adalah 40 menit.

2. Penentuan panjang gelombang maksimum metode uji aktivitas antioksidan Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang dimana senyawa uji dapat memberikan absorbansi paling optimum. Dalam penelitian ini senyawa yang diukur adalah absorbansi dari DPPH. DPPH mampu memberikan serapan karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya, adanya delokalisasi elektron pada DPPH akan menghasilkan warna violet.


36

Penentuan panjang gelombang dengan melarut DPPH dengan metanol tanpa ditambahakan dengan sampel kemudian dibuat tiga konsentrasi larutan DPPH yang kemudian di scanning pada panjang gelombang 400-600 nm. Pengukuran serapan DPPH tanpa ditambahkan sampel bertujuan untuk mengukur serapan DPPH saja tanpa adanya gangguan dari senyawa-senyawa yang terdapat di dalam sampel. Tabel III. Hasil Scanning Panjang Gelombang Maksimum DPPH

Konsentrasi larutan DPPH 12,25 µg/mL 26,25 µg/mL 40,25 µg/mL

λ maksimum hasil scanning 515,0 nm 516,0 nm 516,0 nm

λ maksimum teoritis 517,0 nm

Dari hasil scanning ketiga konsentrasi ditetapkan λ maksimum 516,0 nm. Hal ini dikarenakan dari scanning ketiga konsentrasi, panjang gelombang yang sering muncul adalah pada panjang gelombang 516,0 nm. Panjang gelombang maksimum yang di dapat berbeda dengan panjang gelombang maksimum teoritis yaitu 517,0 nm. Hal ini diperbolehkan sesuai ketentuan yang tercantum dalam Farmakope Indonesia edisi IV dimana batas pergeseran maksimum yang diperbolehkan adalah 2 nm sehingga panjang gelombang yang diperoleh pada penelitian ini diperbolehkan untuk digunakan.

E. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan Tujuan dilakukan validasi metode analisis adalah untuk memastikan atau menjamin bahwa metode yang digunakan dapat dipercaya berdasarkan parameter-


37

parameter yang sesuai dan benar. Parameter-parameter tersebut adalah akurasi, presisi, linieritas dan spesifitas. Validasi analisis ini dilakukan dengan menggunakan tiga kali replikasi larutan pembanding rutin dan larutan uji fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon sehingga didapatkan tiga persamaan regresi linier antara konsentrasi rutin dan larutan uji dengan %IC. Tabel IV. Hasil Pengukuran Absorbansi Seri Baku Rutin yang Direaksikan dengan Radikal DPPH

Replikasi

I

II

III

C (µg/mL) 12,25 19,25 26,25 33,25 40,25 12,25 19,25 26,25 33,25 40,25 12,25 19,25 26,25 33,25 40,25

Abs. kontrol

0,913

0,919

0,863

Abs. larutan uji 0,679 0,492 0,385 0,273 0,201 0,621 0,503 0,402 0,337 0,212 0,640 0,511 0,394 0,300 0,211

% IC 25,63 46,11 57,83 70,10 77,98 32,43 45,27 56,27 63,33 76,93 25,84 40,78 54,3 65,24 75,55

Persamaan regresi linier y = 1,838x + 7,271 r = 0,9858

y = 1,529x + 14,699 r = 0,9958

y = 1,770x + 5,895 r = 0,997

Dari tiga persamaan yang terdapat pada Tabel IV. kemudian dipilih 1 persamaan yang memiliki nilai r paling mendekati 1 atau -1, sehingga didapatkan untuk seri baku rutin digunakan persamaan regresi liniear dari replikasi 3,yaitu y = 1,770x + 5,895 dengan r = 0,997.


38

Tabel V. Hasil Pengukuran Absorbansi Seri Fraksi Etil Asetat yang Direaksikan dengan Radikal DPPH

C (µg/mL) 300 350 400 450 500 300 350 400 450 500 300 350 400 450 500

Replikasi

I

II

III

Abs. kontrol

0,837

0,809

0,798

Abs. larutan uji 0,487 0,447 0,412 0,389 0,359 0,498 0,461 0,402 0,360 0,329 0,495 0,445 0,421 0,367 0,331

% IC 41,82 46,60 50,78 53,53 57,11 38,44 43,02 50,31 55,50 59,33 37,97 44,24 47,24 54,01 58,52

Persamaan regresi linier y = 0,075x + 19,96 r = 0,99510

y = 0,109x + 5,912 r = 0,9949

y = 0,102x + 7,7 r = 0,99512

Sedangkan untuk seri konsentrasi fraksi etil asetat ektrak metanol kulit buah lemon pada tabel V. digunakan persamaan regresi linear dari replikasi 3, yaitu y = 0,10174x + 7,7 dengan r = 0,99512.

Aktivitas Antioksidan (%)

Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Rutin 100 y = 1,770x + 5,895 R = 0,997

80 60 40 20 0 0

10

20 30 konsentrasi µg/mL

40

Gambar 8. Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Rutin

50


39

Aktivitas Antioksidan (%)

Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil asetat 70 60 50 40 30 20 10 0

y = 0,10174x + 7,7 R = 0,99512

250

300

350

400 450 konsentrasi µg/mL

500

550

Gambar 9. Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat

1. Linearitas Linearitas

menunjukkan

kemampuan

metode

untuk

dapat

menghasilkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas ini diindikasikan dari nilai koefisien korelasinya (r). Dari tiga kali replikasi untuk seri baku rutin didapatkan nilai koefisien korelasi (r) yang paling baik adalah replikasi tiga dengan nilai r = 0,997, sedangkan untuk seri konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon digunakan replikasi tiga dengan nilai r = 0,99512. Menurut APVMA (2004), persyaratan koefisien korelasi yang dapat diterima adalah > 0,99, sehingga dapat disimpulkan nilai koefisien korelasi rutin dan fraksi air ekstrak metanol kulit buah lemon masih memenuhi persyaratan linearitas yang baik.


40

2. Presisi Presisi merupakan simpangan baku dari beberapa kali keterulangan penentuan kadar yang dianalisis dengan metode yang sesuai. Presisi dari metode analisis dinyatakan dalam CV (Coeffisien of Variant). Semakin kecil nilai CV semakin baik presisinya dan semakin terjamin metode yang digunakan. Tabel VI. Nilai %CV Uji Aktivitas Antioksidan Rutin dan Fraksi Etil Asetat

Rutin

Fraksi etil asetat Konsentrasi %CV Konsentrasi %CV SD (%) SD (%) (µg/mL) (%) (µg/mL) (%) 12.25 3.866786 0.138264 300 2,10031 0,053294 19.25 2.865734 0.065051 350 1,82000 0,040789 26.25 1.768964 0.031514 400 1,922559 0,038884 33.25 3.490478 0.052708 450 1,027246 0,018902 40.25 1.218729 0.015865 500 1,123432 0,019263 Keterangan:SD = Standard Deviation; CV = Coefficient of Variation Berdasarkan Tabel VI, dapat diketahui bahwa nilai %CV rutin yang tertinggi adalah 0,138264%, sedangkan untuk %CV fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon yang tertinggi adalah 0,053294%. Menurut APVMA (2004), persyaratan %CV yang baik untuk analit konsentrasi 100 ppm adalah %CV< 5%, sedangkan untuk bahan alam %CV < 15%.Hal ini berarti %CV rutin dan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon memenuhi syarat presisi yang baik.

3. Spesifitas Spesifitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur secara akurat

dan

spesifik

suatu

analit.

Pada

pengukuran

menggunakan


41

spektrofotometri visibel untuk mengukur rutin dan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon, spesifikasi metode dapat dilihat dari ada tidaknya serapan dari komponen-komponen lain seperti sampel maupun pelarut yang mengganggu pengukuran absorbansi DPPH pada panjang gelombang 515,0 nm. Hasil scanning pada larutan pembanding rutin (lampiran 5c.) dan larutan uji fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon (lampiran 5e.) pada panjang gelombang 515,0 nm tidak terdapat serapan, sehingga ketika rutin direaksikan dengan radikal DPPH maka yang terbaca hanya absorbansi DPPH hasil reaksi, sehingga dapat disimpulkan baik pada rutin maupun pada fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon bahwa metode ini memiliki spesifitas yang baik.

F. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH Tujuan dari penentuan aktivitas antioksidan adalah untuk mengetahui ada tidaknya dan seberapa besar aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon dalam mengurangi radikal bebas. Uji aktivitas antioksidan dengan metode penangkapan radikal terhadap radikal 1,1-difenil-2pikrilhidrazil (DPPH) dengan prinsip adanya penangkapan radikal DPPH oleh senyawa antioksidan. Radikal DPPH akan bereaksi dengan senyawa antioksidan sehingga DPPH akan tereduksi oleh proses donasi hidrogen yang menyebabkan elektron tersebut tidak dapat beresonansi dan terjadi penurunan intensitas


42

warnanya dari ungu menjadi kuning yang kemudian dapat diukur menggunakan spektrofotometer visibel karena adanya penurunan absorbansi. Pada penentuan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon ini digunakan rutin sebagai senyawa pembanding rutin digunakan sebagai senyawa pembanding karena rutin merupakan senyawa flavonoid yang sudah diketahui memiliki aktivitas antioksidan karena memiliki OH fenolik. Aktivitas antioksidan ini dinyatakan dengan IC50. IC50 merupakan konsentrasi senyawa antioksidan yang dapat menurunkan 50% radikal DPPH. Nilai IC50 ini dihitung dari hubungan antara konsentrasi uji dengan persen aktivitas antioksidan dalam persamaan regresi linear. Semakin kecil nilai IC50 berarti semakin baik senyawa uji tersebut dalam menurunkan radikal bebas, karena semakin kecil nilai IC50 berarti semakin sedikit konsentrasi yang diperlukan untuk menurunkan 50% radikal DPPH. Tabel VII. Hasil Perhitungan IC50 Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Kulit Buah Lemon

1

IC50 (µg/mL) Replikasi 2

3

24,463

23,088

24,918

Bahan Uji Rutin

Rata-rata (µg/mL)

SD

CV (%)

24,2

0,78

3,217

Fraksi 400,427 406,266 415,766 407,5 6,32 1,551 Etil asetat Keterangan: SD = Standar Deviation; CV = Coefficient of Variant


43

Tabel VIII. Tingkat Kekuatan Antioksidan Senyawa Uji dengan Metode DPPH (Ariyanto cit., Widodo, 2011)

Bahan Uji

IC50 (µg/mL)

Rutin

24,2

Fraksi Etil asetat

407,5

Tingkat Aktivitas Antioksidan (nilai IC50) dengan metode DPPH Sangat kuat Kuat Sedang Lemah (<50 (50-100 (101-150 (>150 µg/mL ) µg/mL) µg/mL) µg/mL) √ √

Dari dataTabel VII. didapatkan nilai rata-rata IC50 rutin sebesar 24,2 ± 0,78 µg/mL sedangkan nilai rata-rata IC50fraksi etil asetat sebesar 407,5 ± 6,32 µg/mL. Berdasarkan nilai IC50 tersebut dapat diketahui bahwa aktivitas antioksidan rutin memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat karena kurang dari 50 µg/mL sedangakn untuk fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon memiliki aktivitas antioksidan yang lemah karena lebih dari 150 µg/mL. Untuk menguji kebermaknaan nilai IC50 rutin dengan IC50 fraksi etil asetat esktrak metanol kulit buah lemon maka dilakukan analisis secara statistik menggunakan software R-2.14.1. Untuk mengetahui kebermaknaan perlu dilihat normalitas distribusinya terlebih dahulu dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk karena sampel yang digunakan ≤50. Dari perhitungan didapatkan nilai signifikansi (p) rutin adalah 0,1509 dan nilai p fraksi etil asetat adalah 0,5213. Hal ini berarti %IC rutin maupun fraksi etil asetat memiliki distribusi normal karena memiliki nilai p yang lebih besar dari nilai p yang ditentukan, yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%). Setelah itu dilanjutkan dengan uji parametrik menggunakan Independent Sample T-Test. Digunakan Independent Sample T-Test karena nilai IC50 antara rutin dan fraksi etil asetat tidak saling berhubungan. Hipotesis alternatif yang


44

digunakan adalah nilai IC50 rutin lebih besar daripada nilai IC50 fraksi etil asetat, dan hipotesis null (H0) adalah nilai IC50 rutin tidak lebih kecil dari nilai IC50 fraksi etil asetat. Dari hasil pengujian didapatkan nilai p-nya sebesar 0,000 antara rutin dan fraksi etil asetat. Nilai p ini lebih kecil daripasa nilai p yang ditentukan, yaitu 0,05 maka H0 ditolak. Sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin lebih kecil daripada nilai IC50 fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon.

G. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total Penentuan Operating time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk menentukan rentang waktu yang tepat ketika reaksi telah berjalan optimal. Penentuan OT dilakukan dengan mengukur absorbansi reaksi antara asam galat dengan pereaksi FolinCiocalteu setiap 5 menit selama 60 menit.

Penentuan Operating Time Asam Galat 1 Absorbansi

1.

0,8 0,6

50 µg/mL

0,4

100 µg/mL

0,2

150 µg/mL

0 0

10

20

30 40 50 waktu (menit)

60

70

Gambar 10. Grafik Penentuan OT Asam Galat


45

Absorbansi

Penentuan Operating Time Fraksi Etil Asetat 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

650 µg/mL

0

10

20

30 40 50 waktu (menit)

60

70

Gambar 11. Grafik Penentuan OT Fraksi Etil Asetat

Dari grafik pada gambar 10 didapatkan bahwa pada grafik penentuan OT untuk asam galat didapatkan absorbansi senyawa molybdenum blue, yaitu hasil reaksi antara asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu stabil pada menit ke-30 hingga menit ke-60, sedangakan untuk absorbansi reaksi fraksi etil asetat dengan Folin-Ciocalteu memberikan kestabilan pada menit ke-45 hingga menit ke-60. Hal ini dapat disimpulkan bahwa operating time untuk asam galat adalah 30 menit dan operating time untuk fraksi etil asetat adalah 45 menit.

2. Penentuan panjang gelombang maksimum Penentuan

panjang

gelombang

maksimum

bertujuan

untuk

menentukan panjang gelombang dimana senyawa uji dapat memberikan absorbansi paling optimum. Dalam penelitian ini senyawa yang diukur adalah absorbansi dari molybdenum blue, yaitu hasil reaksi antara asam galat dengan


46

pereaksi Folin-Ciocalteu. Menurut Zhang et al.,(2006) panjang gelombang maksimum untuk pereaksi Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenolik adalah 750 nm. Tabel IX. Hasil Scanning Panjang Gelombang Maksimum Penetapan Kandungan Fenolik Total pada Asam Galat

Konsentrasi asam galat (µg/mL) 50 100 150

λ maksimum

λ maksimum teoritis

750 750 747

750

Dari hasil scanning ketiga konsentrasi asam galat ditetapkan panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 750 nm sesuai dengan teoritis. Hal ini karena dari kedua konsentrasi yaitu konsentrasi rendah dan sedang menunjukkan serapan panjang gelombang maksimum pada 750 nm. Sehingga untuk menentukan kandungan fenolik total digunakan panjang gelombang 750nm.

H. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total Validasi metode penetapan kandungan Fenolik total dapat dilakukan dengan mengukur akurasi, presisi, linearitas, dan spesifitas dari ketiga replikasi baku asam galat. Di buat persamaan regresi linier antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi yang diperoleh dari reaksi antara asam galat dengan FolinCiocalteu, sehingga akan didapatkan tiga persamaan regresi linear.


47

Tabel X. Hasil Pengukuran Absorbansi Baku Asam Galat

Konsentrasi (µg/mL) 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0

Replikasi

I

II

III

Absorbansi 0,280 0,393 0,550 0,649 0,787 0,226 0,373 0,453 0,620 0,756 0,222 0,346 0,495 0,624 0,758

Persamaan regresi linier

y = 0,0051x + 0,0238 r = 0,998

y = 0,0053x – 0,00372 r = 0,9956

y = 0,0054x – 0,051 r = 0,99969

Dari ketiga persamaan tersebut kemudian dipilih persamaan dengan nilai r yang mendekati 1 atau -1, sehingga didapatkan persamaan dari replikasi ke-3 dengan y = 0,0054x – 0,051 (r = 0,99969) Kurva Persamaan Regresi Linear Absorbansi Baku Asam Galat

Absorbansi

0,8 0,6 y = 0,0054x - 0,051 R = 0,99969

0,4 0,2 0 0

20

40

60 80 100 Konsentrasi µg/mL

120

140

Gambar 12. Kurva Persamaan Regresi Linear Absorbansi Baku Asam Galat

160


48

1. Linearitas Linearitas

menunjukkan

kemampuan

metode

untuk

dapat

menghasilkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas ini diindikasikan dari nilai koefisien korelasinya (r). Dari 3 kali replikasi untuk seri baku rutin didapatkan nilai koefisien korelasi (r) yang paling baik adalah replikasi 3 dengan r = 0,99969. Menurut APVMA (2004), persyaratan untuk koefisien korelasi yang dapat diterima adalah > 0,99. Hal ini berarti kurva baku asam galat yang digunakan memenuhi persyaratan linearitas.

2. Presisi Presisi merupakan simpangan baku dari beberapa kali keterulangan penentuan kadar yang dianalisis dengan metode yang sesuai. Presisi dari metode analisis dinyatakan dalam CV (Coeffisien of Variant). Tabel XI. Nilai %CV Penetapan Kandungan Fenolik Total

Konsentrasi (µg/mL) 50 75 100 125 150

SD (%) 1,027 4,366 9,012 2,910 3,216

%CV (%) 0,020 0,056 0,088 0,023 0,021

Menurut APVMA (2004), persyaratan %CV yang baik untuk analit konsentrasi 100 ppm adalah %CV<5%. Dari tabel XI. dapat diketahui bahwa nilai % CV dari asam galat yang tertinggi adalah 0,088%. Hal ini berarti % CV baku asam galat memenuhi persyaratan presisi yang baik.


49

3. Spesifitas Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Berdasarkan hasil scanning pada larutan asam galat (lampiran 5d.) dan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon (lampiran 5f.) pada panjang gelombang 750 nm tidak menunjukkan adanya serapan, sehingga absorbansi yang dihasilkan pada panjang gelombang 750 nm merupakan hasil reaksi antara bahan uji dengan pereaksi. Oleh karena itu dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memiliki spesifitas yang baik.

I. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total Penetapan kandungan fenolik total bertujuan untuk mengetahui jumlah senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon. Hal ini dikarenakan jumlah senyawa fenol dalam senyawa uji berkolerasi dengan aktivitas antioksidannya sehingga perlu dilakukan penentuan kandungan fenolik totalnya (Verru et al.,2009). Penetapan kandungan fenolik total ini menggunakan metode FolinCiocalteu dengan menggunakan spektrofotometer. Kandungan fenolik total dalam sampel dinyatakan alam ekivalen asam galat, yaitu jumlah kesetaraan miligram asam galat dalam 1 gram sampel. Sebagai pembanding digunakan asam galat karena asam galat merupakan senyawa fenolik yang memiliki tiga gugus hidroksi Fenolik dan juga ketersediaan di alam melimpah dan tersedia dalam kemurnian


50

yang tinggi dan stabil, serta nilainya yang relatif lebih murah dibandingkan dengan standar yang lain. O HO OH

HO OH

Gambar 13. Struktur Asam Galat

Prinsip dari metode Folin-Ciocalteu adalah adanya gugus hidroksi fenolik pada senyawa fenol dapat mereduksi kompleks fosfomolibdat fosfotungstat yang terdapat dalam reagen Folin-Ciocalteu menjadi kompleks yang berwarna biru. Fenolik hanya tersedia dalam kondisi basa sehingga diperlukan penambahan natrium karbonat. Pada kondisi basa senyawa fenol akan menjadi ion fenolat yang akan lebih mudah dioksidasi oleh asam kompleks fosfomolibdat fosfotungstat.

Gambar 14. Reaksi Senyawa Fenol dengan Reagen Folin-Ciocalteu (Pereira, 2012)


51

Tabel XII. Kadar Asam Galat dan Absorbansinya Setelah Direaksikan dengan Pereaksi Folin-Ciocalteu yang Diukur Pada λ 750nm

Replikasi

I

II

III

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi

50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0

0,280 0,393 0,550 0,649 0,787 0,226 0,373 0,453 0,620 0,756 0,222 0,346 0,495 0,624 0,758


y = 0,0051x + 0,0238 r = 0,998

y = 0,0053x – 0,00372 r = 0,9956

y = 0,0054x – 0,051 r = 0,99969

Absorbansi

Kurva Persamaan Regresi Linear Asam Galat 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

y = 0,0054x - 0,051 R = 0,99969

0

20

40

60 80 100 Konsentrasi µg/mL

120

140

Gambar 15. Kurva Persamaan Regresi Linear Asam Galat

160


52

Tabel XIII. Hasil Perhitungan Kandungan Fenolik Total

Replikasi


Absorbansi

Kandungan fenolik (µg/mL)

1 2 3 4 5

650 650 650 650 650

0,397 0,430 0,434 0,439 0,529

64,074 89,074 89,815 90,741 107,407

Kandungan fenolik total (mg ekivalensi asam galat per gram fraksi) 4,923 6,846 6,923 7,000 8,231

x (ratarata) ± SD

6,8 ± 1,19

Berdasarkan hasil perhitungan didapatkan bahwa kandungan kandungan fenolik total rata-rata pada sampe; sebesar 6,8 ± 1,19mg ekivalen asam galat per gram

fraksi

etil

asetat

ekstrak

metanol

kulit

buah

lemon.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1.

Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dalam IC50sebesar 407,5 ± 6,32 µg/mL.

2.

Kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon sebesar 6,8 ± 1,19 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon.

B. Saran 1. Perludilakukan validasi lebih lanjut terkait dengan akurasi dari fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.). 2. Perlu dilakukan isolasi lebih lanjut untuk mengetahui senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan dalam kulit lemon (Citrus x limon (L.) Burm. f.). 3. Perlu dilakukan uji korelasi lebih lanjut dengan uji statistik antara kandungan fenolik total dengan aktivitas antioksidan.

53


54

DAFTAR PUSTAKA

APVMA, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical methods for Active Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, Kingston. Astawan, M., dan Leomitro, A.K., 2008, Khasiat Warna-Warni Makanan, Gramedia Pustaka Utama anggota IKAPI, Jakarta, 42. Baraja, M., 2008, Uji Toksisitas Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting Dalam Pengembangan Obat Asli Indonesia, Info POM Vol.6 No.4, Juli 2005. Bruneton, J., 1999, Pharmacognoie,Phytochimie, Plantes Medicales, diterjemahkan oleh Hatton, C.K., hal.2999,Lavosie Publising, Paris Cuvelier, M.E., Richards, H., and Bessets, C., 1991, Comparsion of The Antioxidative of Some Acid Phenols: structure activity Relationship, Biosch. Biotech. Biochem., 56 (2), 324-325. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4),405-412. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia,jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.1061, 1036. Dinis, T.C., Maderia, V.M., dan Almeida, L.M., 1994, Action of Phenolic Derivates (Acetoaminophen, Salycilate and 5-Aminosalycilate) as Inhibitors of Membrane Lipid Peroxidation and as Peroxyl Radical Scavengers, ABB, 161-169, 315. Gandjar, I., B., dan Rohman, A., 2010, Kimia Farmasi Analisis, edisi VI, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal.366. Halliwel, B., 1994, Free Radicals and Antioxidants: a Personal View, Nutr. Rev., 52, 253-265. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, 47-109, diterjemahkan oleh Padmawinata, K.,Penerbit ITB, Bandung. Harmita, 2004, Majalah Ilmu Kefarmasian Vol.I, No.3: Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara, 117-135, Departemen Farmasi FMIPA UI,Jakarta. Huang, D., Ou, B., and Prior, R. L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant Capacity Assays, J. Agric. Food Chem, United State. Mann, J., Davidson, R.S., Hobbs, J.B., Banthorpe, D.V., dan Harborne, J.B., 1994, Natural Products: Their Chemistry and Biological Significance, Longman Group UK Limited, London England, pp. 361-367 Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, 1-103, diterjemahkan oleh Padwanita, K., Penerbit ITB, Bandung. Morton, J. 1987, Citrus limon,http://www.hort.purdue.edu/newcrop/morton/ lemon.html, diakses tanggal 10 April 2012.


55

Mulja,M.,dan Hanwar,D.,2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice),Majalah Farmasi Airlangga, vol.III No.2,Agustus,71-76. Niki, E., dan Noguchi, N., 2000, Evaluation of Antioxidant Capacity ; What Capacity is Being Measured by Which Method?, IUBMB Life, 50, 323329. Pereira, X.N., Souza, F.S., Roberto, J.G., Almeida, Tolentino, J.L., Augusto, L.A., L. Quintans, J., and J. Maria,B., 2012, Phytochemicals as Nutraceuticals Global Approaches to Their Role in Nutrition and Health, Intech Europe,15. Peterson, J.J., Beecher, G.R., Bhagwat, S.A., Dwyer, J.T., Gebhardt, S.E., Haytowitz, D.B., Hoden, J.M., 2006, Flavanones in grapefruit, lemons, and limes: A compilation and review of the data from the analytical literature. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 191-213, diterjemahkan oleh Padwanita, K., Penerbit ITB, Bandung. Satrohamidjojo, 2007, Kromatografi, Edisi Keempat,Liberty, Yogyakarta, hal. 89117. Satrohamidjojo, 2007, Spektroskopi, Edisi Ketiga,Liberty, Yogyakarta, hal. 39-42. Shivaprasad, H.N., Mohan, S., Kharya, M.D., Shiradkar, M.R., dan Lakshman, K., 2005, In-Vitro Models for Antioxidant Activity Evaluation: a Review, http://www.pharmainfo.net/reviews/vitro-models-antioxidantactivityevaluation- review, diakses tanggal 4 Mei 2012. Sudarmaji, S., Haryono, B., Suhardi, 1991, Analisa Untuk Bahan Makanan dan Pertanian, Penerbit Liberty, Yogyakarta. Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkapan Radikal Bebas Beberapa Kecambah dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia, 2 (2),53-61. Takashi. Miyake and Takayumi Shibamoto, (1997), Antioxidant Activities of Natural CompoundFound in Plants,J. Agric. Food. Chem. 45. 1819-1822. Trevor R, 1995, Kandungan Organik Tumbuhan, edisi VI, diterjemahkan oleh Kosasih, Padmawinata,ITB, Bandung. Tripoli, E., M. Guardia, S. Giammanco, D. Majo, and M. Giamanco, 2007. Citrus Flavonoids: Molecular Structure, Biological Activity and Nutrional Properties: A review. Food Chem. 104:466-479. USDA, 2013, Citrus ×limon (L.) Burm. f. (pro sp.) [medica × aurantifolia] lemon,http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=CILI5&photoID=cili_002_ahp .tif, diakses pada tanggal 12 Juli 2013. Verru, P., Kishor,M.P., dan Meenakshi,M., 2009, Screning of Medical Plant Extracs for Antioxidant Activity, JMPR, 3 (8). 608-612. Winarsi, W., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, pp. 13-15, 77-81. Windono,T.,Soediman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita, A.,dan Erowati, T.I., 2001, Uji Peredam Radikal Bebas Terhadap 1,1-Diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis vinifera L.) Probolinggo Biru dan Bali,Artocarpus, Surabaya, 1 (1), 34-43.


56

Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., Dennis, D.A., and Barrow, C.J., 2006, A Simple 96-Well Microplate Method for Estimation of Total Polyphenols Content in Seaweeds, J.Appl. Phycol., 18,445-450.


57

LAMPIRAN Lampiran 1. Gambar Buah Jeruk Lemon

Lampiran 2. Perhitungan Rendemen a.

Rendemen ekstrak metanol Penimbangan Cawan 1 (g)

Cawan 2 (g)

Cawan 3 (g)

Cawan 4 (g)

Bobot cawan

51,92

62,15

61,91

59,90

Bobot cawan + ekstrak

64,90

88,58

72,12

63,02

Bobot ekstrak

12,98

26,43

10,21

3,12

Total Bobot ekstrak

52,74 gram

Bobot kulit lemon yang digunakan

= 150 gram

Rendemen ekstrak metanol

= = = 35,16 %

x 100% x 100%


58

b. Rendemen fraksi etil asetat Penimbangan Bobot cawan

= 62,15 gram

Bobot cawan + fraksi

= 62,79 gram

Bobot fraksi

= 0,64 gram

Rendemen fraksi etil asetat

=

x 100%

= = 0,4267 % Lampiran 3. Data Penimbangan untuk Pengujian Aktivitas Antioksidan a. Penimbangan DPPH Replikasi 1 ( g ) Bobot kertas 0,2056 Bobot kertas + 0,2096 DPPH Bobot kertas + 0,2057 sisa Bobot DPPH 0,0039

Replikasi 2 (mg) 0,2090

Replikasi 3 (mg) 0,1974

0,2131

0,2013

0,2092

0,1974

0,0039

0,0039

Replikasi 1 (g) 0,1980



0,2005

0,2082

0,2082

0,1980

0,2056

0,2056

0,0025

0,0026

0,0026

b. Penimbangan Rutin

Bobot kertas Bobot kertas + Rutin Bobot kertas + sisa Bobot Rutin


59

c. Penimbangan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit lemon

Bobot cawan Bobot cawan + fraksi Bobot cawan + sisa Bobot fraksi




14,4852

12,7884

14,4852

14,4652

12,7684

14,4652

0,02

0,02

0,02

Lampiran 4. Perhitungan Rf Rutin dan Fraksi Etil Asetat Rf = Rf rutin = Rf fraksi etil asetat a = Rf fraksi etil asetat b =

= 0,98


Lampiran 5. Data Konsentrasi Bahan untuk Pengujian Aktivitas Antioksidan a. Konsentrasi DPPH Replikasi 1 BM = 394,33 Mol

=

M

=

= =

= 0,0099 mmol = 0,396 mM

b. Konsentrasi Rutin Replikasi 1 

Konsentrasi larutan stok =



Konsentrasi seri baku 12,25 µg/mL C1. V1 = C2. V2 250 µg/mL. V1 = 12,25 µg/mL. 10mL V1 = 0,49 mL



Konsentrasi seri baku 19,25 µg/mL C1. V1 = C2. V2 250 µg/mL. V1 = 19,25 µg/mL. 10mL V1 = 0,77 mL Konsentrasi seri baku 26,25 µg/mL C1. V1 = C2. V2 250 µg/mL. V1 = 26,25 µg/mL. 10mL V1 = 1,05 mL Konsentrasi seri baku 33,25 µg/mL C1. V1 = C2. V2 250 µg/mL. V1 = 33,25 µg/mL. 10mL V1 = 1,33 mL Konsentrasi seri baku 40,25 µg/mL C1. V1 = C2. V2 250 µg/mL. V1 = 40,25 µg/mL. 10mL V1 = 1,61 Ml







= 250 µg/mL

60


c. Konsentrasi Fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon Replikasi 1 

Konsentrasi larutan stok =



Konsentrasi seri baku 300 µg/mL C1. V1 = C2. V2 2000 µg/mL. V1 = 300 µg/mL. 10mL V1 = 1,5 mL









Konsentrasi seri baku 450 µg/mL C1. V1 = C2. V2 2000 µg/mL. V1 = 450 µg/mL. 10mL V1 = 2,25 mL Konsentrasi seri baku 500 µg/mL C1. V1 = C2. V2 2000 µg/mL. V1 = 500 µg/mL. 10mL V1 = 2,5 mL



= 2000 µg/mL

61


Lampiran 6. Scanning Larutan Pengkoreksi untuk Pengujian Aktivitas antioksidan a. Scanning pelarut metanol

b. Scanning metanol : air (1:1)

62


c. Scanning rutin

d. Scanning asam galat

63


64

e. Scanning Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Kulit lemon (400-600 nm)

f. Scanning fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit lemon (600-900 nm)


65

Lampiran 7. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan Operating Time a. Penentuan OT Rutin Absorbansi konsentrasi pada λ 515,0 nm waktu (menit) 12,25 µg/mL 26,25 µg/mL 40,25 µg/mL 5 0,798 0,663 0,541 10 0,769 0,620 0,440 15 0,748 0,590 0,380 20 0,732 0,568 0,337 25 0,722 0,548 0,305 30 0,714 0,532 0,281 35 0,708 0,517 0,261 40 0,703 0,505 0,245 45 0,700 0,494 0,234 50 0,697 0,486 0,225 55 0,695 0,478 0,216 60 0,693 0,472 0,209

b. Penentuan OT fraksi Etil asetat ektrak metanol kulit lemon Absorbansi konsentrasi pada λ 515,0 nm waktu (menit) 300 µg/mL 400 µg/mL 500 µg/mL 5 0,569 0,523 0,389 10 0,538 0,484 0,337 15 0,523 0,462 0,311 20 0,510 0,441 0,292 25 0,501 0,432 0,277 30 0,494 0,421 0,264 35 0,486 0,411 0,254 40 0,482 0,405 0,250 45 0,482 0,405 0,250 50 0,482 0,405 0,249 55 0,483 0,405 0,249 60 0,482 0,405 0,249


2. Penentuan λ Maksimum a. Spektra DPPH 0,020

b. Spektra DPPH 0,060

66


c. Spektra DPPH 0,080

Lampiran 8. Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPH % IC =

x 100%

1. Rutin Konsentrasi 12,25 µg/mL % IC =

x 100% = 25,63%

Konsentrasi 19,25 µg/mL % IC =

x 100% = 46,11%


x 100% = 57,83%

67


68


x 100% = 70,10%


Replikasi

I

II

III

Konsentrasi ( µg/mL ) 12,25 19,25 26,25 33,25 40,25 12,25 19,25 26,25 33,25 40,25 12,25 19,25 26,25 33,25 40,25

x 100% = 77,98%

Absorbansi kontrol

0,913

0,919

0,863

Absorbansi larutan uji 0,679 0,492 0,385 0,273 0,201 0,621 0,503 0,402 0,337 0,212 0,640 0,511 0,394 0,300 0,211

2. Fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit lemon Konsentrasi 300 µg/mL % IC =

x 100% = 41,82%

% IC 25,63 46,11 57,83 70,10 77,98 32,43 45,27 56,27 63,33 76,93 25,84 40,78 54,3 65,24 75,55


y = 1,838x + 7,271 r = 0,9858

y = 1,529x + 14,699 r = 0,9958

y = 1,770x + 5,895 r = 0,997


69

Konsentrasi 350 µg/mL % IC =

x 100% = 46,60%


x 100% = 50,78%


x 100% = 53,53%


Replikasi

I

II

III

Konsentrasi ( µg/mL ) 300 350 400 450 500 300 350 400 450 500 300 350 400 450 500

x 100% = 57,11% Absorbansi kontrol

0,837

0,809

0,798

Absorbansi larutan uji 0,487 0,447 0,412 0,389 0,359 0,498 0,461 0,402 0,360 0,329 0,495 0,445 0,421 0,367 0,331

% IC 41,82 46,60 50,78 53,53 57,11 38,44 43,02 50,31 55,50 59,33 37,97 44,24 47,24 54,01 58,52


y = 0,075x + 19,96 r = 0,99510

y = 0,109x + 5,912 r = 0,9949

y = 0,102x + 7,7 r = 0,99512


70

Lampiran 9. Perhitungan Nilai IC50Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Kulit Lemon 1. Rutin Replikasi I Persamaan regresi linier : y = 1,838x + 7,271 (y = aktivitas antioksidan, x = kadar rutin dalam µg/mL) IC50 merupakan kadar rutin yang dapat menurunkan 50% radikal bebas y = 1,838x + 7,271 50 = 1,838x + 7,271 x= Replikasi I II III

= 23,248 µg/mL Persamaan regresi linier y = 1,838x + 7,271 y = 1,529x + 14,699 y = 1,770x + 5,895

IC50 ( µg/mL ) 23,248 µg/mL 23,088 µg/mL 24,918 µg/mL

2. Fraksi etil asetat ektrak metanol kulit lemon Replikasi I Persamaan regresi linier : y = 0,075x + 19,96 (y = aktivitas antioksidan, x = kadar sampel dalam µg/mL) IC50 merupakan kadar sampel yang dapat menurunkan 50% radikal bebas y = 0,075x + 19,96 50 = 0,075x + 19,96 x= Replikasi I II III

= 400,533 µg/mL Persamaan regresi linier y = 0,075x + 19,960 y = 0,109x + 5,912 y = 0,102x + 7,700

IC50 ( µg/mL ) 400,533 µg/mL 404,477 µg/mL 414,706 µg/mL


71

Lampiran 10. Penimbangan Uji Kandungan Fenolik Total 1. Penimbangan asam galat Replikasi 1 (g) Bobot kertas 0,2111 Bobot kertas + asam 0,2161 galat Bobot kertas + sisa 0,2111 Bobot asam galat 0,0050



0,2106

0,2157

0,2056 0,0050

0,2107 0,0050

2. Penimbangan fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit lemon Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot cawan 14,4652 14,4652 14,4652 Bobot cawan + fraksi 14,4717 14,4717 14,4717 Bobot cawan + sisa 14,4652 14,4652 14,4652 Bobot fraksi 0,0065 0,0065 0,0065

Lampiran 11. Scanning Kontrol Asam Galat


Lampiran 12. Optimasi Penentuan Kandungan Fenolik Total 1. Penentuan OT a. asam galat waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi konsentrasi pada λ 515,0 nm 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 0,224 0,482 0,717 0,231 0,500 0,749 0,239 0,511 0,772 0,242 0,524 0,784 0,245 0,531 0,793 0,245 0,532 0,794 0,245 0,532 0,794 0,245 0,532 0,794 0,245 0,532 0,794 0,245 0,532 0,794 0,245 0,532 0,794 0,245 0,532 0,794

b. fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit lemon waktu (menit)

650 µg/mL

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

0,362 0,387 0,401 0,410 0,418 0,422 0,426 0,428 0,430 0,430 0,430 0,430

72


2. Penentuan λ Maksimum Asam Galat a. Spektra asam galat 50 µg/mL

b. Spektra asam galat 100 µg/mL

73


c. Spektra asam galat 150 µg/mL

Lampiran 13. Penentuan Kandungan Fenolik Total Baku asam galat replikasi 1 Konsentrasi asam galat =

= 500 µg/mL









Konsentrasi seri baku 100,0 µg/mL C1. V1 = C2. V2 500 µg/mL. V1 = 100 µg/mL. 10mL V1 = 2 mL



Konsentrasi seri baku 125,0 µg/mL C1. V1 = C2. V2

74


75

500 µg/mL. V1 = 125,0 µg/mL. 10mL V1 = 2,5 mL 


Konsentrasi Baku Asam Galat Replikasi

I

II

III

Konsentrasi (µg/mL) 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0

Absorbansi 0,280 0,393 0,550 0,649 0,787 0,226 0,373 0,453 0,620 0,756 0,222 0,346 0,495 0,624 0,758


y = 0,0051x + 0,0238 r = 0,998

y = 0,0053x – 0,00372 r = 0,9956

y = 0,0054x – 0,051 r = 0,99969

Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Kulit Lemon Persamaan regresi linier : y = 0,0054x – 0,051 Replikasi 1 Bobot sampel = 6,5 mg absorbansi sampel = 0,397 y = 0,0054x – 0,051 0,397 = 0,0054x – 0,051


x=

76

= 64,074 µg/mL

kandungan fenolik total x.

= 0,064 .

= 4,923 mg ekivalensi asam galat per gram fraksi

Replikasi


Absorbansi

Kandungan fenolik (µg/mL)

1 2 3 4 5

650 650 650 650 650

0,397 0,430 0,434 0,439 0,529

64,074 89,074 89,815 90,741 107,407

Lampiran 14. Uji Statistik dengan R 2.14.1

Kandungan fenolik total (mg ekivalensi asam galat per gram fraksi) 4,923 6,846 6,923 7,000 8,231


77

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Kulit Buah Jeruk Lemon (Citrus Limon, Burm. F.)” memiliki nama lengkap Wisnu Brahmana Putra. Dilahirkan di kota Yogyakarta, 15 November 1990 dari pasangan Bapak Cahyo Edy Purnomo dan Ibu Veronica Wisniarti. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Pangudi Luhur pada tahun 1996 hingga 1997 lalu melanjutkan pendidikan dasar di SD Pangudi Luhur pada tahun 1997 hinga 2003. Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMP Maria Immaculata Marsudirini pada tahun 2003 hingga 2006 dan SMA Kolese De Britto pada tahun 2006 hingga 2009. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis pernah menjadi asisten dosen untuk mata kuliah praktikum Biofarmasetika (2013), asisten dosen untuk mata kuliah praktikum Formulasi dan Teknologi Sediaan Farmasi (2013). Penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan dan kepanitiaan antara lain: Kordinator Tim Bola Basket UKF Farmasi USD (2011/2012), Kordinator Sie Perlengkapan kegiatan Tiga Hari Temu Farmasi (TITRASI) (2011), dan Kordinator Sie Perlengkapan dalam kegiatan Temu Alumni Akbar Fakultas Farmasi (2012), dan Sie Acara kegiatan Pharmacy Performance and Event Cup (2010).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents