PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI

PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA COKLAT (Sargassum polycystum C. Agardh) DENGAN METODE FOLIN-CIOCALTEAU

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Dewi Riana Primawati NIM : 048114057

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008



SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

ii


Penelitian Untuk Skripsi



Telah disetujui oleh :

Pembimbing

Ignatius Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si Tanggal : 15 Juli 2008

iii


Pengesahan Skripsi Berjudul PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA COKLAT (Sargassum polycystum C. Agardh) DENGAN METODE FOLIN-CIOCALTEAU

Oleh : Dewi Riana Primawati NIM : 048114057 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 26 Juni 2008

Pembimbing

Ign. Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si. Panitia Penguji :

1. Ign. Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si. 2. Christine Patramurti, M.Si, Apt 3. Erna Tri Wulandari, M.Si, Apt

iv


Jauh di dalam pikiranmu ada keinginan untuk mundur. Tapi itu tak mungkin tak ada . Jadi simpan pikiranmu dalam-dalam. (Curahee, catatan pasukan kompi Easy 056) -Band of Brothers-

Kupersembahkan untuk Mama, Papa, adik-adikku Adit dan Ndaru yang bisa dijadikan teman bicara Bicara hati dan pikiran Terimakasih untuk selalu menjadi ada Almamater tercinta

v


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama

: Dewi Riana Primawati

Nomor Mahasiswa

: 048114057

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : PENETAPAN

KADAR

PHLOROTANNIN

DALAM

FRAKSI

ETIL

ASETAT ALGA COKLAT (Sargassum polycystum C. Agardh) DENGAN METODE FOLIN-CIOCALTEAU beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 17 Juli 2008 Yang menyatakan

(Dewi Riana Primawati)


KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan YME sehingga penulis dapat

menyelesaikan

skripsi

dengan

judul

“PENETAPAN

KADAR

PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA COKLAT (Sargassum

Polycystum

C.

Agardh)

DENGAN

METODE

FOLIN-

CIOCALTEAU”. Skripsi ini disusun guna melengkapi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Tersusunnya skripsi ini tidak luput dari bantuan dan dorongan berbagai pihak. Untuk itu penulis mengucapkan terimakasih kepada : 1. Ignatius Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah menyediakan waktu dan tenaga untuk mengarahkan, memberikan saran dalam penyusunan skripsi ini. 2. Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si, Apt selaku dosen pendamping proyek yang telah menyediakan waktu dan tenaga untuk mengarahkan, memberikan saran dalam penyusunan skripsi ini. 3. Christine Patramurti, M.Si, Apt selaku dosen penguji yang telah meluangkan waktunya, memberikan saran dan kritik yang berguna pada penyusunan skripsi ini. 4. Erna Tri Wulandari, M.Si, Apt selaku dosen penguji yang telah meluangkan waktunya, memberikan saran dan kritik yang berguna pada penyusunan skripsi ini.

vi


5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M. S., Apt., selaku dosen yang telah memberi masukan dan saran selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

6. Dr. Sabikis, Apt., selaku dosen yang telah memberi masukan dan saran, selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 7. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si, selaku dosen yang telah memberi masukan dan saran selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 8. Mama dan Papa, adik-adikku Adit dan Ndaru yang telah memberikan dukungan moral dan materiil selama menyusun skripsi ini. 9. Teman-teman kelompok proyek alga Dipta, Henri, Fani, Andri, Angel dan Elsa yang telah berjuang bersama selama setengah tahun lebih mewujudkan proyek ini, terimakasih untuk kebersamaan yang penuh suka dan duka. 10. Para laboran : Pak Prapto, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Wagiran, Mas Sigit, dan Mas Otok yang telah banyak membantu dalam menjalankan penelitian. Maaf kami sering merepotkan. 11. Sahabat-sahabatku Nana, Tere, Ela dan Ika, buat semangat yang diberikan selama ini di tengah kesibukan masing-masing. 12. Teman-teman satu kelompok praktikum di kelas FST Tere, Ela, Ika, Novi, Rinta, Tika, Yoyo, dan Coco untuk pengalaman tak terlupakan. 13. Teman-teman Fakultas Farmasi angkatan 2004/2005 terutama kelas FST untuk keceriaannya di tengah sibuknya membuat laporan dan makalah. 14. Afrizal Malna untuk imajinasi gilanya, satu meter ke kiri akan membawa saya kemana saja. Mike Mohede untuk “I Believe I Can Fly” yang sudah

vii


menemani

masa-masa

mata

bengkak.

Disordine

E

Piacevolle

(Ketidakteraturan itu Menyenangkan). 15. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah banyak membantu penyelesaian skripsi ini. Semoga Tuhan YME memberikan perlindungan dan karunianya kepada semua pihak yang telah berjasa dalam penyusunan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih banyak kekurangannya. Untuk itu kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Akhir kata semoga skripsi ini dapat memberi manfaat bagi para pembaca.

Penulis

Dewi Riana Primawati

viii


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Yogyakarta, 18 Juli 2008 Penulis

Dewi Riana Primawati NIM : 048114057

ix


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL…………..………………………………………................ ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……………………….................iii HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………….......….iv HALAMAN PERSEMBAHAN………...…………………………………...........v KATA PENGANTAR............................................................................................vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA.................................................................ix DAFTAR ISI............................................................................................................x DAFTAR GAMBAR............................................................................................xiv DAFTAR TABEL..................................................................................................xv DAFTAR LAMPIRAN.........................................................................................xvi INTISARI............................................................................................................xvii ABSTRACT ........................................................................................................xviii BAB I. PENGANTAR.............................................................................................1 A. Latar Belakang............................................................................................1 B. Perumusan Masalah....................................................................................3 C. Keaslian Penelitian.....................................................................................4 D. Manfaat Penelitian......................................................................................4 1. Manfaat teoritis...........................................................................................4 2. Manfaat praktis...........................................................................................4 E. Tujuan Penelitian.........................................................................................4 1.Tujuan umum...............................................................................................4

x


2. Tujuan khusus.............................................................................................5 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.....................................................................6 A. Uraian Alga Coklat Sargassum polycystum C. Agardh...........................6 1. Morfologi.................................................................................................6 2. Ekologi dan penyebaran..........................................................................7 3. Kandungan kimia.....................................................................................8 B. Polifenol Alga (phlorotannin)...................................................................9 C. Soxhletasi................................................................................................11 D. Ekstraksi..................................................................................................12 E. Spektrofotometri Visibel.........................................................................13 F. Kolorimetri..............................................................................................16 G. Metode Folin-Ciocalteau.........................................................................18 H. Kesalahan Dalam Metode Analisis.........................................................18 1.Kesalahan sistematik (determinate error)...............................................19 2.Kesalahan tidak sistematik (intermediate error).....................................19 I. Keterangan Empiris.................................................................................20 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN..............................................................22 A. Jenis Rancangan Penelitian.....................................................................22 B. Variabel Penelitian..................................................................................22 C. Definisi Operasional................................................................................22 D. Bahan dan Alat........................................................................................23 1.Bahan......................................................................................................23 2. Alat.........................................................................................................24

xi


E. Tata Cara Penelitian................................................................................24 1. Preparasi sampel alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh...........24 2. Uji kualitatif senyawa fenolik................................................................25 a. Preparasi ekstrak...............................................................................25 b. Uji tanin dan polifenol......................................................................25 3. Isolasi crude phlorotannin dari alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh.........................................................26 4. Optimasi metode kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau.........................27 a. Pembuatan larutan uji dan larutan standar..........................................27 b. Penetapan operating time (OT)...........................................................27 c. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks)..........................27 d.Pembuatan seri larutan baku................................................................28 5. Estimasi kadar polifenol total pada sampel fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh....................................28 F. Analisis hasil...........................................................................................29 1. Analisis hasil uji kualitatif senyawa fenolik.......................................29 2. Analisis hasil validasi metode.............................................................29 3. Analisis hasil penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh.....................................30 BAB IV. PEMBAHASAN.....................................................................................31 A. Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum polycystum C. Agardh.........31 B. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik Alga Coklat Sargassum polycystum C. Agardh..........................................................35

xii


C. Isolasi Crude phlorotannin dari Alga Coklat Sargassum polycystum C. Agardh .........................................................37 D. Prinsip Reaksi Kolorimetri dengan Metode Folin-Ciocalteau.................39 E. Optimasi Kolorimetri dengan Metode Folin-Ciocalteau..........................41 1. Penentuan operating time (OT)...............................................................41 2. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks)..............................42 F. Penetapan Kurva Baku Phloroglucinol....................................................45 G. Penetapan Kadar Fraksi Etil Asetat Sargassum polycystum C.Agardh...47 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN...............................................................49 A. Kesimpulan.............................................................................................49 B. Saran.......................................................................................................49 C. Keterbatasan...........................................................................................49 DAFTAR PUSTAKA............................................................................................50 LAMPIRAN..........................................................................................................55 BIOGRAFI PENULIS..........................................................................................68

xiii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Thallus Sargassum polycystum C. Agardh............................................8 Gambar 2. Struktur kimia beberapa polifenol alga ...............................................10 Gambar 3. Peralatan soxhlet..................................................................................11 Gambar 4. Gambar tingkat energi elektronik........................................................15 Gambar 5. Oksidasi fenol oleh Polifenol oksidase................................................32 Gambar 6. Reaksi pada penetapan kadar air dengan metode Karl Fisher.............34 Gambar 7. Reaksi fenol dengan pereaksi FeCl3....................................................36 Gambar 8. Kesetimbangan reaksi phloroglucinol dalam suasana basa.................40 Gambar 9. Reaksi oksidasi phloroglucinol...........................................................40 Gambar 10. Reaksi phloroglucinol dengan Folin Ciocalteau...............................40 Gambar 11. Spektra operating time dari phloroglucinol pada konsentrasi 4,0 ppm...........................................................................42 Gambar 12. Spektra panjang gelombang maksimum dari phloroglucinol pada tiga konsentrasi..........................................................................44 Gambar 13. Kurva hubungan antara konsentrasi baku phloroglucinol dengan absorbansi ..........................................................................46

xiv


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Data hubungan antara konsentrasi phloroglucinol dengan absorbansi....45 Tabel II. Kadar phlorotannin dalam sampel (mg PE/g fraksi)..............................48

xv


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi alga coklat dari Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada..................................................................................................56 Lampiran 2. Penetapan kadar air serbuk alga Sargassum polycystum C. Agardh dengan motede Karl Fischer..............................................................58 Lampiran 3. Foto penapisan fitokimia alga Sargassum polycystum C. Agardh....60 Lampiran 4. Hasil penapisan fitokimia serbuk alga Sargassum polycystum C. Agardh..........................................................................................60 Lampiran 5. Foto hasil fraksinasi...........................................................................61 Lampiran 6. Spektra operating time (OT)..............................................................62 Lampiran 7. Spektra scanning panjang gelombang maksimum (λ maks)..............62 Lampiran 8. Hasil scanning panjang gelombang maksimum (λ maks) pada konsentrasi 1,0 ppm........................................................................63 Lampiran 9. Hasil scanning panjang gelombang maksimum (λ maks) pada konsentrasi 3,0 ppm........................................................................63 Lampiran 10. Hasil scanning panjang gelombang maksimum (λ maks) pada konsentrasi 6,0 ppm........................................................................64 Lampiran 11. Penimbangan baku phloroglucinol..................................................64 Lampiran 12. Contoh perhitungan baku phloroglucinol........................................65 Lampiran 13. Hasil pembacaan baku phloroglucinol replikasi pertama pada panjang gelombang hasil scanning.................................................66 Lampiran 14. Kurva baku phloroglucinol.............................................................66 Lampiran 15. Data penimbangan sampel...............................................................67 Lampiran 16. Absorbansi sampel...........................................................................67 Lampiran 17. Contoh perhitungan kadar sampel...................................................67 Lampiran 18. Data kadar phlorotannin pada sampel Sargassum polycystum C. Agardh.........................................................................................68

xvi


INTISARI Sargassum terdistribusi di seluruh perairan Indonesia. Salah satu spesies Sargassum yang terdapat di Indonesia adalah Sargassum polycystum C. Agardh. Tanaman alga memiliki kandungan kimia phlorotannin. Telah banyak dilakukan penelitian terhadap aktivitas phlorotannin, namun belum ditindaklanjuti dengan pemanfaatan phlorotannin sebagai senyawa aktif pada makanan, obat-obatan dan kosmetik. Pengembangan senyawa aktif pada alga coklat yang dilakukan selama ini lebih kepada kandungan utama alga coklat yaitu alginat. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan crude phlorotannin dari Sargassum polycystum C. Agardh dan menetapkan kadarnya. Isolasi dilakukan dengan metode soxhletasi dengan pelarut metanol p.a. Ekstrak yang diperoleh kemudian difraksinasi. Hasil fraksinasi adalah crude phlorotannin berupa fraksi etil asetat Sargassum polycystum C. Agardh. Konsentrasi polifenol total dalam crude phlorotannin ditetapkan secara spektrofotometri dengan metode Folin-Ciocalteau. Larutan standar yang digunakan adalah phloroglucinol seri konsentrasi 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm dengan pelarut aseton 75%. Konsentrasi polifenol total dihitung ekuivalen dengan phloroglucinol (mg PE/g fraksi). Hasil penetapan kadar phlorotannin pada tiga kali penetapan kadar pada tiga kali replikasi sampel adalah sebesar 6,92 mg PE/g fraksi; 7,15 mg PE/g fraksi; dan 6,81 mg PE/g fraksi diukur dengan panjang gelombang 750,1 nm dengan persamaan kurva baku y = 0,12274x + 0,0175. Kadar phlorotannin pada alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh adalah 6,96 ± 0,17 mg PE/g fraksi. Kata kunci : Sargassum polycystum C. Agardh , phlorotannin, Folin-Ciocalteau

xvii


ABSTRACT

Sargassum spread widely in Indonesia marine territorial. Sargassum polycystum C. Agardh is one of the species of Sargassum. Alga have chemical compound called phlorotannin. There are many experimental about phlorotannin activity, but not developed yet, especially as active compound in food, medicine, and cosmetic. Nowadays development of active compound are more for main active compound that is alginate. This research’s objectives are to get phlorotannin crude of brown alga Sargassum polycystum C. Agardh and determine the concentration. The isolation method are soxhletation with methanol pro analysis (p.a.). The extract was fractionated. Result from fractionated are ethyl acetate fraction of Sargassum polycystum C. Agardh Total polyphenol concentration in phlorotannin crude was determined using spectrophotometry with Folin-Ciocalteau method. Standar solution is phloroglucinol with concentration 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 5.0; and 6.0 ppm in 75 % acetone. Phlorotannin concentration was equivalently calculated with phloroglucinol (mg PE/g fraction). Phlorotannin concentration in tree replication are 6,92 mg PE/g fraction; 7,15 mg PE/g fraction; and 6,81 mg PE/g fraction, measured using 750,1 nm wavelenght and linear regression equation y = 0,12274x + 0,0175. The phlorotannin concentration in Sargassum polycystum C. Agardh is 6,96 ± 0,17 mg PE/g fraction. Keywords : Sargassum polycystum C. Agardh, phlorotannin, Folin-Ciocalteau

xviii


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Selama ini pemanfaatan alga sebagai komoditi perdagangan atau bahan baku industri masih relatif kecil jika dibandingkan dengan keanekaragaman jenis alga yang ada di Indonesia. Komponen kimiawi yang terdapat dalam alga sangat bermanfaat bagi bahan baku industri makanan, kosmetik, farmasi dan lain-lain (Putra, 2003). Di Indonesia baru dikenal lima genus alga yang bernilai ekspor tinggi, yaitu Gelidium, Gelidiella, Hypnea, Eucheuma, dan Gracilaria. Dua genus di antaranya telah dibudidayakan dan berkembang di masyarakat, yaitu Eucheuma dan Gracilaria (Yun, 2002). Alga-alga tersebut termasuk dalam genus alga merah.

Genus alga yang lain, termasuk genus alga coklat masih belum

dibudidayakan sehingga memiliki nilai ekonomis yang rendah. Salah satu genus alga coklat yang terdapat di Indonesia adalah Sargassum. Diperkirakan terdapat lebih dari 15 jenis Sargassum dan yang telah dikenal mencapai 12 jenis (Kadi, 2007). Sargassum memiliki kandungan berupa phlorotannin. Phlorotannin merupakan polifenol yang ada pada tanaman alga terutama alga coklat, yang tidak dimiliki oleh tanaman terestrial. Polifenol pada tanaman terestrial terdiri dari asam elagat dan galat, sedangkan polifenol alga terdiri dari unit phloroglucinol (1,3,5trihydroxybenzene) (Burtin, 2003). 1


2

Beberapa aktivitas biologi phlorotannin yang telah diteliti di antaranya adalah antiproliferasi dan antioksidan (Nakamura et al., 1996; Kang et al., 2005a; Athukorala et al., 2006; Yuan & Walsh, 2006), efek protektif terhadap ionizing radiation (Kang et al., 2006), kemampuan untuk mengabsorbsi sinar UV (Roleda et al., 2006), sitoprotektif terhadap stress oksidatif (Kang et al., 2005b), dan inhibitor HIV-1 reverse transcriptase dan protease (Ahn et al., 2004). Dari penelitian yang telah dilakukan, menunjukkan bahwa phlorotannin dapat dikembangkan menjadi senyawa aktif pada makanan, obat-obatan dan kosmetik. Hal ini belum ditindaklanjuti. Pengembangan senyawa aktif pada alga coklat yang dilakukan selama ini lebih kepada kandungan utama yaitu alginat (Kadi, 2007). Sargassum polycystum C.Agardh merupakan spesies alga coklat yang tersebar luas di Indonesia. Telah dilakukan penelitian mengenai aktivitas antioksidan senyawa golongan triterpenoid dari Sargassum polycystum C. Agardh di Pulau Seribu (Anggadiredja, 1997). Namun belum dilakukan penelitian mengenai senyawa phlorotannin dalam Sargassum polycystum C. Agardh. Dalam upaya peningkatan pemanfaatan phlorotannin dari Sargassum polycystum C. Agardh sebagai senyawa aktif pada makanan, obat-obatan dan kosmetik, perlu dilakukan penetapan kadar phlorotannin pada Sargassum polycystum C. Agardh. Hal ini dapat pula meningkatkan nilai manfaat dan ekonomis Sargassum polycystum C. Agardh. Pengukuran kadar phlorotannin pada penelitian ini dilakukan pada fraksi etil asetat karena fraksi etil asetat alga coklat mengandung phlorotannin yang


meliputi

phloroglucinol,

phlorofucofuroeckol,

dieckol,

8,8’-bieckol

3

dan

phlorotannin golongan tetramer (Nagayama et al., 2002). Senyawa-senyawa phlorotannin tersebut memiliki kemampuan sebagai antioksidan yang telah diuji dengan metode free radical scavenging activity menggunakan DPPH dan Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) assay (Kang et al., 2003). Selain itu senyawa-senyawa tersebut memberikan serapan maksimum pada daerah UV-B (Shibata et al., 2006). Penelitian mengenai estimasi kandungan polifenol total pada rumput laut dan ekstraknya telah dilakukan oleh Zhang, et al. (2006) dengan metode sederhana berdasarkan reaksi kolorimetri Folin-Ciocalteau. Metode FolinCiocalteau memiliki sensitivitas yang tinggi dalam mengukur senyawa-senyawa yang memiliki gugus fenolik dan sederhana karena hanya membutuhkan satu reagen yaitu reagen Folin-Ciocalteau (Singleton dan Rossi, 1965).

B. Perumusan Masalah Rumusan permasalahan adalah sebagai berikut : 1. Apakah phlorotannin dapat diisolasi dari alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh? 2. Berapakah kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh ?


4

C. Keaslian Penelitian Sepengetahuan peneliti, penelitian tentang penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh dengan metode Folin-Ciocalteau belum pernah dilakukan.

D. Manfaat Penelitian 1. Manfaat teoritis Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kadar phlorotannin pada alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh sehingga dapat dikembangkan sebagai senyawa aktif pada makanan, obat-obatan dan kosmetik dan meningkatkan nilai manfaat dan ekonomis Sargassum polycystum C. Agardh. 2. Manfaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi ilmu pengetahuan mengenai biota laut dan pemanfaatannya, khususnya alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh sebagai senyawa aktif pada bahan makanan, obat-obatan dan kosmetik.

E. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Tujuan umum penelitian ini adalah mengisolasi phlorotannin dan mengetahui kandungannya dalam alga coklat.


5

2. Tujuan khusus Tujuan khusus penelitian ini dapat diuraikan sebagai berikut : a. Mengisolasi

phlorotannin

dalam

Sargassum

polycystum

C.

Agardh

menggunakan pelarut etil asetat. b.Mengetahui kadar phlorotannin pada fraksi etil asetat Sargassum polycystum C. Agardh dengan menggunakan metode Folin-Ciocalteau.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Uraian Alga Coklat (Sargassum polycystum C. Agardh) 1. Morfologi Sargassum polycystum C. Agardh memiliki sinonim Sargassum brevifolium Greville, Sargassum pygmaeum Kützing, Sargassum ambiguum Sonder,dan Sargassum polycystum var. horridulum Grunow (Guiry, 2006). Sargassum polycystum C. Agardh memiliki thalli dengan panjang 3-5 cm, berwarna coklat kekuningan dan ditumbuhi holdfast. Poros utama berbentuk silinder dengan permukaan kasar karena adanya beberapa pertumbuhan ke luar. Poros utama mendukung daun-daun cabang dan gelembung udara. Thalli muda memiliki daun dengan panjang termasuk tangkai adalah 13-42 mm dan lebar 2,5-11,5 mm. Secara umum daun berbentuk lonjong sedikit runcing, dengan tepi bergigi tajam, seperti tampak dalam gambar 1. Thalli dewasa memiliki daun dengan jumlah lebih sedikit dan ukurannya lebih kecil. Panjang daun termasuk tangkai adalah 7-15 mm dan lebar 1,7-4 mm. Sargassum polycystum C. Agardh memiliki kantung udara (bladder) berbentuk bola atau seperti telur dengan garis tengah 1,5 -3 mm. Cryptostomata tersebar merata di permukaan gelembung. Kantung udara dapat tunggal atau dalam jumlah banyak yang dihubungkan dengan cabang primer atau sekunder. Pada thalli dewasa gelembung lebih banyak tetapi lebih kecil (Anonim, 2002).

6


7

2. Ekologi dan penyebaran Lingkungan tempat tumbuh Sargassum terutama di daerah perairan laut yang jernih yang memiliki substrat dasar batu karang, karang mati, batuan vulkanik, dan benda-benda yang bersifat massive yang berada di dasar perairan. Sargassum hidup di perairan dengan kedalaman 0,5 – 10 m. Sargassum tumbuh subur pada daerah tropis dengan suhu perairan 27,25 – 29,300C dan salinitas 3233,5%. Kebutuhan intensitas cahaya matahari Sargassum berkisar 6500 – 7500 lux. Sargassum tumbuh berumpun dengan untaian cabang-cabang (Kadi, 2007). Sargassum polycystum C. Agardh banyak ditemukan pada daerah pantai (beach/tide pool area), paparan terumbu (reef flats), punggung terumbu (ridge), dan Goba (lagoon)(Kadi, 2007). Sargasum polycystum C. Agardh merupakan alga yang kosmopolitan di daerah tropis hingga subtropis. Alga tersebut bukan merupakan alga endemik perairan Indonesia, tetapi banyak ditemukan di perairan nusantara terutama di Kepulauan Timur Indonesia (Anonim, 2002). Alga ini dapat ditemukan di daerah Kepulauan Anambas, Kepulauan Bangka-Belitung, Kepulauan Natuna, Selat Sunda, Teluk Lampung, Kepulauan Seribu, Kepulauan Karimunjawa, Pantai Selatan Pulau Jawa, Pantai Bali, Pantai Lombok, Pantai-pantai Sumbawa, Pantai Sumba, Kupang, Kalimantan Timur, Kepulauan Selayar, Kepulauan Spermonde, Sulawesi Utara, Pulau Ternate dan Bacan, dan Ambon (Kadi,2007). Perkembangbiakan genus Sargassum terjadi melalui reproduksi aseksual (vegetatif) dan seksual (generatif). Reproduksi aseksual dilakukan melalui


8

fragmentasi yaitu perkembangan dari potongan thallus. Cara ini banyak dilakukan untuk usaha budidaya. Reproduksi seksual dilakukan dengan perkembangan individu melalui organ jantan (antheridia) dan organ betina (oogenia) (Kadi,2007). 3. Kandungan kimia Kandungan bahan kimia utama Sargassum adalah sebagai sumber alginat dan mengandung protein, vitamin C, tanin, iodin, dan fenol (Trono dan Ganzon, 1988). Kandungan protein pada Sargassum polycystum C. Agardh (6,26%) lebih tinggi dibandingkan Sargassum cristaefolium (3,45%) (Ungson, 2003). Telah diteliti kandungan kimia ekstrak Sargassum polycystum C. Agardh, yang menunjukkan aktivitas biologi pada uji hayati pendahuluan menggunakan Artemia salina Leach. Penapisan fitokimia menunjukkan adanya golongan steroid atau triterpenoid (Lestari,1997).

Gambar 1. Thallus Sargassum polycystum C. Agardh, A.)papila, B.) thallus berupa daun, C.) kantung udara (bladder), D.) thallus berupa tangkai


9

B. Polifenol Alga (Phlorotannin) Alga coklat (Phaeophyceae) mengandung tanin yang dapat melindungi alga dari herbivora. Tanin ini terdiri dari phloroglucinol yang berikatan bersama untuk membentuk seri polyphloroglucinol yang disebut juga phlorotannin (McInnes, Ragan, dan Walter, 1984). Phlorotannin merupakan tanin tipe ketiga yang berbeda dari tanin terhidrolisis dan tanin terkondensasi (Hernes, 2001). Phlorotannin berbeda dari polifenol pada tanaman terestrial. Polifenol pada tanaman terestrial terdiri dari asam elagat dan galat, sedangkan polifenol alga terdiri dari unit phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) (gambar 2). Phlorotannin terdiri dari berbagai macam molekul dengan struktur dan derajat polimerisasi yang berbeda, sehingga memiliki potensi aktivitas biologik yang berbeda pula (Burtin, 2003). Phlorotannin merupakan hasil polimerisasi dari phloroglucinol dan merupakan produk dari jalur asetat-malonat (Waterman dan Mole, 1994). Senyawa ini memiliki bobot molekul yang rendah (102-103 amu), sedang (103-104 amu) dan tinggi (≥ 104 amu) (McInnes, Ragan, dan Walter, 1984). Phlorotannin

dengan

bobot

molekul

yang

rendah

terdiri

dari

phloroglucinol, dimer dari phloroglucinol yang berikatan karbon-karbon secara langsung (2,2’,4,4’6,6’-hexahydroxybiphenyl) atau dengan ikatan eter (2,3’,4,5’,6pentahydroxybiphenyl ether), trimer,dan tetramer (Ragan ,1984). Dalam alga coklat terdapat phlorotannin terlarut dan phlorotannin yang berada pada dinding sel (phlorotannin tidak terlarut) (Targett et al., 1992).

10


Menurut Ragan dan Craigie (cit., Burtin, 2003) kandungan tertinggi terdapat pada alga coklat, dimana phlorotannin berkisar antara 5-15 % dari berat kering. Phlorotannin telah diisolasi dari beberapa spesies dalam beberapa genus alga coklat yaitu Eisenia, Fucus, Crystophora, Chordas Cystoseria, Laminaria, Bifurcaria yang terdiri dari unit phloroglucinol C-C dan atau C-O yang berpasangan secara oksidatif (Glombitza dan Gestberger, 1985). Salah satu phlorotannin adalah fucofuroeckol dari Eisenia arbarea(gambar 3) (Glombitza dan Gestberger, 1985). OH HO OH

OHHO

O

OH

OH

O

OH

OH HO

OH

O

HO

O O

OH OH

HO

OHHO

HO

(B)

(A)

HO

OH

OH

(D)

(C)

OH

OH

OH

OH

O

OH OH

O HO

O

HO

O O OH HO

O O

O

OH

HO

OH OH

O O

OH HO

O

OH OH

HO OH OH

(E)

(F)

Gambar 2. Struktur kimia beberapa polifenol alga : (A) Phloroglucinol, (B) 2,2’,4,4’6,6’hexahydroxybiphenyl, (C) 2,3’,4,5’,6-pentahydroxybiphenyl ether, (D) Fucofuroeckol (E)Phlorofucofuroeckol-A, (F) 8,8’-bieckol

Aktivitas antioksidan polifenol pada alga coklat dan alga merah telah diperlihatkan pada percobaan in vitro (Nakamura et al., 1996). Namun peran


11

phlorotannin dalam mencegah penyakit yang berhubungan dengan oxidative stress masih sedikit diketahui (Burtin, 2003).

C. Soxhletasi Soxhletasi adalah suatu prosedur untuk memperoleh kandungan senyawa organik dari jaringan tumbuhan kering seperti biji kering, akar dan daun. Soxhletasi dilakukan dengan mengekstraksi serbuk bahan secara terus menerus dengan alat soxhlet menggunakan pelarut secara bergantian (Harborne, 1987). Peralatan sohxlet tertera pada gambar 3.

Gambar 3. Peralatan Soxhlet, A.) tempat meletakkan kantong saring, B.) labu alas bulat, C.) pipa naiknya uap, D.) pendingin

Sampel

diekstraksi

menggunakan

larutan

yang

cocok.

Adanya

pemanasan menyebabkan pelarut menguap dan akan diembunkan oleh pendingin menjadi tetesan. Tetesan-tetesan akan terkumpul dan apabila sudah melewati batas lubang maka akan terjadi sirkulasi. Sirkulasi terjadi berulang-ulang sehingga menghasilkan penyarian yang lebih baik (Anonim, 1986). Keuntungan soxhletasi antara lain cairan penyari yang diperlukan jumlahnya sedikit dan secara langsung hasil yang diperoleh lebih pekat, serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni maka dapat menyari zat aktif lebih


12

banyak dan penyarian dapat diteruskan sesuai kebutuhan tanpa perlu menambah volume cairan penyari. Kerugian cara penyarian dengan alat soxhlet yaitu larutan ekstrak dipanaskan secara terus menerus sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (Anonim, 1986).

D. Ekstraksi Ekstraksi merupakan suatu metode pemisahan komponen dari suatu campuran dengan menggunakan suatu pelarut (Anwar, 1994). Dasar ekstraksi mengacu pada hukum Nernst yaitu apabila suatu zat terlarut dilarutkan ke dalam pelarut yang tidak saling campur maka zat tersebut akan terdistribusi ke dalam kedua pelarut tersebut (Khopkar, 1990). KD =

[X ] 1

[X 2 ]

[X1] adalah konsentrasi zat terlarut dalam fase pertama (fase organik) dan [X2] adalah konsentrasi pada fase kedua (fase air). KD adalah koefisien partisi atau distribusi pada saat kesetimbangan tercapai. Semakin besar konsentrasi zat terlarut dalam pelarut organik maka nilai KD akan meningkat. Metode yang digunakan pada ekstraksi cair-cair adalah : 1. Ekstraksi bertahap (batch) Metode ini dilakukan dengan mengocok larutan air atau suspensi dengan pelarut organik yang tidak saling campur dengan air kemudian didiamkan sehingga terbentuk dua lapisan dan selanjutnya dipisahkan (Anwar, 1994).


13

2. Ekstraksi kontinyu Metode ini digunakan jika perbandingan distribusi relatif kecil sehingga untuk pemisahan yang kuantitatif diperlukan beberapa tahap ekstraksi. Efisiensi pada ekstraksi ini tergantung pada viskositas fase organik (Khopkar, 1990). 3. Ekstraksi kontinyu counter current Metode ini dilakukan dengan mengalirkan fase cair pengekstraksi pada arah yang berlawanan dengan larutan yang mengandung zat yang diekstraksi. Metode ini biasanya digunakan untuk pemisahan zat, isolasi atau pemurnian (Anwar, 1994). E. Spektrofrotometri Visibel Spektofotometri UV-Visibel adalah salah satu teknik analisis fisikakimia

yang

mengamati

interaksi

atom

atau

molekul

dengan

radiasi

elektromagnetik pada panjang gelombang 190-380 nm (UV) dan 380-780 nm (visibel) dengan menggunakan instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Pada umumnya semua molekul dapat menyerap radiasi elektromagnetik di daerah UV dan visibel karena memiliki elektron, baik berkelompok maupun tunggal yang dapat tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi. Panjang gelombang yang menunjukkan terjadinya serapan tergantung pada kekuatan ikatan elektron dalam molekul tersebut (Day dan Underwood, 1986). Spektra serapan ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif karena jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap memiliki hubungan dengan jumlah molekul penyerap (Skoog et al.,1998). Hal ini digambarkan sebagai berikut :


T=

It = 10 −abc Io

A = log

14

(1)

1 = abc T

(2)

Keterangan: T

= persen transmitan

A = absorbansi molar

Io

= intensitas radiasi yang

b = tebal kuvet

datang It

c = konsentrasi analit

= intensitas radiasi yang Diteruskan (Mulja dan Suharman, 1995)

Bila c dinyatakan dalam mol per liter, dan panjang alur (b) dinyatakan dalam sentimeter, persamaan menjadi : A = ε .c.b

(3)

Istilah ε diketahui sebagai daya serap molar, disebut juga koefisien ekstingsi molar. (Silverstein, Bassler dan Murril, 1986) Radiasi pada senyawa organik dapat menimbulkan eksitasi dari satu orbital ke orbital yang lain. Biasanya terjadi dari orbital elektron berpasangan atau orbital ikatan menuju orbital elektron tidak berpasangan. Probabilitas transisi dinyatakan sebagai berikut : ε = 0,87 x 1020 P.a

(4)

Probabilitas transisi (P) memiliki nilai dari 0 sampai 1. a merupakan daerah sasaran pada sistem absorbsi. Sistem absorbsi disebut juga kromofor. Pada panjang kromofor pada umumnya yaitu 10 Å, nilai ε akan menjadi 105. Dengan probabilitas transisi yang tinggi maka nilai ε akan lebih besar daripada 10.000, sedangkan dengan probabilitas transisi yang rendah nilai ε akan


15

lebih kecil daripada 1.000. Secara umum, semakin panjang kromofor, maka semakin besar absorpsinya (Williams dan Fleming, 1980). Molekul yang mengabsorbsi dapat melakukan transisi yang meliputi elektron π,σ, n, elektron-elektron d dan f , dan spektrum muatan elektron. 1. Elektron π,σ, n Jenis transisi ini terjadi pada molekul-molekul organik dan sebagian kecil anion anorganik. Molekul tersebut mengabsorpsi radiasi elektromagnetik karena adanya elektron valensi, yang akan tereksitasi ke tingkat yang lebih tinggi (Khopkar, 1990).

Gambar 4. Gambar tingkat energi elektronik (Mulja dan Suharman, 1995)

2. Elektron-elektron d dan f Unsur-unsur blok d mengabsorpsi pada daerah UV dan tampak. Terjadinya transisi logam golongan f disebabkan karena elektron-elektron pada orbital f (Khopkar, 1990). 3.Spektrum muatan elektron Pada spesies ini, ε > 10.000. Spektrum absorpsi ini merupakan cara yang peka untuk menentukan spesies absorpsi. Komponen ini harus terdiri dari elektron donor dan elektron akseptor sehingga transfer elektron dapat terjadi dan


16

menghasilkan absorpsi radiasi (Khopkar, 1990). Kompleks charge transfer terdiri dari gugus elektron donor yang berikatan dengan elektron aseptor. Ketika mengabsorpsi radiasi, elektron dari donor berpindah ke orbital aseptor (Skoog et al., 1993). Absorbsi radiasi visibel oleh kompleks logam disebabkan satu atau lebih transisi yaitu eksitasi logam, eksitasi ligan, atau transisi charge transfer (Christian, 2004). Pada kompleks ion logam dan ligan terjadi transisi orbital elektron d dari ion logam ke orbital π* dari ligan atau dari orbital elektron π ligan ke orbital d dari ion logam (Ohannesian dan Streeter, 2002).

F. Kolorimetri Kolorimetri adalah teknik pengukuran cahaya yang diabsorbsi oleh zat berwarna baik warna yang terbentuk dari asalnya maupun akibat reaksi dengan zat lain (Khopkar, 1990). Metode kolorimetri merupakan salah satu metode analisis yang didasarkan pada gugus yang dapat bereaksi membentuk warna kompleks serta memiliki rantai panjang. Pengukuran intensitas warna dilakukan menggunakan instrumen spektrofotometer visibel. Metode ini melibatkan perbandingan intensitas warna secara visual yaitu warna larutan senyawa yang diteliti dibandingkan dengan warna suatu standar atau seri standar (Butz dan Nobel, 1961). Menurut definisi yang diperluas, sebagai kolorimetri juga tercakup pengubahan senyawa tidak berwarna menjadi zat yang berwarna dan penentuan


17

fotometrinya dilakukan dalam daerah sinar tampak (400-800 nm) (Roth dan Baschke, 1994). Kriteria untuk analisis kolorimetri yang baik adalah : 1. Menghasilkan reaksi warna yang khusus Reaksi-reaksi yang ada sangat sedikit sekali untuk beberapa substansi tertentu, tetapi justru memberikan warna.–warna yang banyak membentuk kelompok warna tersendiri yang berhubungan dengan substansi khusus. 2. Adanya proporsi yang sesuai antara warna dan konsentrasi Untuk kolorimeter visual sangat penting bahwa intensitas warna harus meningkat secara liniear dengan konsentrasi dari substansi yang ditentukan. 3. Stabilitas warna Warna yang dihasilkan pada setiap reaksi harus sama untuk mendapatkan hasil yang akurat. Hal ini menerapkan reaksi-reaksi dari warna yang akan dicapai secara maksimal. Waktu untuk mencapai warna yang maksimal harus cukup lama untuk mendapatkan pengukuran yang akurat. 4. Reprodusibel Prosedur kolorimetri harus memberikan hasil yang reprodusibel dalam kondisis yang spesifik. 5. Kejernihan larutan Larutan harus bebas dari pengotor jika pembanding yang dipakai dibuat dengan standar. Kekeruhan akan menyerap cahaya (Vogel, 1978).


18

G. Metode Folin-Ciocalteau Metode Folin-Ciocalteau merupakan oksidasi atau reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua senyawa fenolik (Folin, 1944). Menurut Waterman dan Mole (cit., Khadambi, 2007), dasar metode FolinCiocalteau adalah oksidasi gugus fenolik-hidroksil. Selama reaksi berjalan, gugus fenolik-hidroksil

bereaksi

dengan

pereaksi

Folin-Ciocalteau,

membentuk

kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru dengan suatu struktur yang belum diketahui dan menghasilkan warna biru ungu yang dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (Jansoon, 2005). Reaksi Folin Ciocalteau melibatkan reaksi antara ion fenolat dengan kompleks ion polimerik dari asamasam fosfomolibdat dan fosfotungstat (Anonim, 2006). Keseluruhan reaksi yang terjadi pada reaksi Folin-Ciocalteau adalah rusaknya pereaksi dalam keadaan basa, ionisasi fenol dalam keadaan basa, proses reduksi pereaksi oleh fenolat untuk menghasilkan kompleks warna biru, dan rusaknya kompleks warna biru tersebut (Singleton dan Rossi, 1965). Fenolat hanya ada pada larutan basa tetapi reagen Folin-Ciocalteau dan produk kompleks warna biru tidak stabil pada kondisi basa (Jansoon, 2005).

H. Kesalahan Dalam Metode Analisis Kesalahan dalam metode analisis sangat sukar untuk dihilangkan namun sumber kesalahan tetap harus ditekan seminimal mungkin.


19

1. Kesalahan sistematik (determinate errors) Kesalahan sistematik adalah hasil analisis yang menyimpang secara tetap dari harga kadar yang sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis, sehingga kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur (Mulja dan Suharman, 1995). Kesalahan sistematik dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: a. Kesalahan personil dan operasi. Kesalahan ini disebabkan oleh cara pelaksanaan analisis, bukan karena metode. Kesalahan operasi umumnya bersifat fisis (bukan khemis), misalnya kesalahan pengamatan visual pada titik akhir titrasi, kekeliruan cara pencucian endapan, dan sebagainya. Jadi kesalahan ini bersifat individual dan sangat dipengaruhi oleh keterampilan analis dalam melakukan pekerjaan analisis. b. Kesalahan alat dan pereaksi . Kesalahan ini disebabkan oleh pereaksi yang kurang murni, alat yang kurang valid atau pemakaian alat yang kurang tepat walaupun alatnya sendiri baik, contohnya pengambilan volume tepat dengan pipet ukur atau gelas ukur, penggunaan buret 50 mL (buret makro) untuk analisis mikro, dan sebagainya. c. Kesalahan metode. Kesalahan ini dapat disebabkan oleh kesalahan pengambilan sampel, kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna, atau ikut mengendapnya zat-zat yang tidak diinginkan (Day dan Underwood, 1986). Kesalahan sistematik dapat dihindari atau diperkecil dengan: 1). Mengkalibrasi instrumen dan melakukan koreksi secara berkala (biasanya tiap 3 bulan atau disesuaikan dengan frekuensi pemakaian alat). 2). Memilih metode dan prosedur standar dari badan resmi.


20

3). Memakai bahan kimia dengan derajat untuk analisis. 4). Meningkatkan pengetahuan dan keterampilan para analis. 5). Melakukan penetapan blangko atau kontrol dengan zat baku. 6). Melakukan penetapan paralel (in duplo atau in triplo). 2. Kesalahan tidak sistematik (indeterminate errors) Kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan yang tidak tetap dari hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan fluktuasi dari instrumen yang dipakai (derau). Penyebab kesalahan ini tidak dapat ditentukan dan tidak dapat dikontrol maka kesalahan ini disebut juga kesalahan acak (random error) (Mulja dan Suharman, 1995).

I. Keterangan Empiris Kadar phlorotannin di dalam alga coklat berkisar 5-15 % berat kering (Burtin, 2003). Penapisan fitokimia pada alga coklat dilakukan dengan menggunakan pereaksi FeCl3 dan garam gelatin. Apabila reaksi tersebut menghasilkan endapan maka sampel alga coklat mengandung senyawa fenolik. Penyarian dengan menggunakan cara maserasi kurang sempurna dan membutuhkan waktu yang lama. Penyarian dengan menggunakan cara soxhletasi memiliki keuntungan yaitu tidak membutuhkan waktu yang terlalu lama dan pelarut yang dibutuhkan tidak terlalu banyak karena ekstraksi terjadi secara berulang dan menggunakan panas. Sirkulasi terjadi berulang-ulang sehingga menghasilkan penyarian yang lebih baik (Anonim, 1986).


21

Simplisia makro alga dalam bentuk serbuk dapat disari menggunakan pelarut tertentu dengan alat soxhlet (Cannel, 1998). Penyarian dalam penelitian ini menggunakan cara sohxletasi. Telah dilakukan perbandingan antara hasil penyarian dengan pelarut etanol dan metanol. Penyarian menggunakan pelarut metanol menghasilkan jumlah ekstrak yang lebih banyak. Polifenol yang dianalisis dalam penelitian ini adalah phlorotannin dalam fraksi etil asetat yang meliputi

phloroglucinol, phlorofucofuroeckol, dieckol,

8,8’-bieckol, dan phlorotannin golongan tetramer. Metode yang digunakan untuk menetapkan kadar phlorotannin pada penelitian ini adalah metode Folin-Ciocalteau. Metode ini dipilih karena metode ini spesifik untuk menetapkan kadar polifenol. Gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan

pereaksi

Folin-Ciocalteau,

membentuk

kompleks

fosfotungstat-

fosfomolibdat menghasilkan warna biru ungu yang dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (Jansoon, 2005). Standar yang digunakan dalam penelitian ini adalah phloroglucinol. Phloroglucinol merupakan monomer dari phlorotannin (Zhang et al., 2006). Kadar phlorotannin akan dihitung ekivalen terhadap phloroglucinol (mg PE/g fraksi).


BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk dalam penelitian non-eksperimental karena tidak ada intervensi atau perlakuan terhadap parameter yang diamati.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel dalam penelitian ini adalah kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh. 2. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah waktu pemanenan alga, tempat pengambilan alga, suhu penyimpanan alga, waktu lamanya proses ekstraksi, dan pH. 3. Variabel pengacau tidak terkendali dalam penelitian ini adalah umur alga (bukan tanaman budidaya), bagian alga yang terpanen, suhu air laut, kondisi substrat karang tempat tumbuh alga, suhu dan kelembaban ruang percobaan.

C. Definisi Operasional 1. Alga coklat adalah simplisia alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh yang diambil dari Pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta dengan ciri-ciri memiliki thalli dengan panjang 3-5 cm, berwarna coklat kekuningan, ditumbuhi holdfast, poros utama berbentuk silinder dengan permukaan kasar, dan daun berbentuk lonjong sedikit runcing dengan tepi bergigi tajam.

22


23

2. Phlorotannin adalah polifenol alga dalam fraksi etil asetat yang terdiri dari beberapa molekul dengan gugus yang heterogen, meliputi phloroglucinol, phlorofucofuroeckol, dieckol, 8,8’-bieckol, dan phlorotannin golongan tetramer. 3. Ekstrak kental adalah ekstrak metanol hasil soxhletasi serbuk alga coklat pada suhu 120±200, kemudian dipekatkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporatorsampai kurang lebih 1/10 dari volume mula-mula. 4. Fraksi Etil Asetat Alga Coklat adalah fraksi yang diperoleh dari fraksinasi ekstrak metanol simplisia alga coklat hasil soxhletasi dan diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sampai pekat kemudian dipanaskan di atas waterbath hingga kering. 5. Parameter validasi metode analisis yang digunakan dalam penelitian ini adalah akurasi, presisi, dan linearitas. 6. Kadar phlorotannin adalah kadar polifenol dalam alga coklat yang dihitung ekivalen terhadap phloroglucinol (mg PE/g fraksi).

D. Bahan dan Alat 1. Bahan Bahan yang digunakan adalah alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh yang diambil dari pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta, Metanol, kloroform, etil asetat, aseton, natrium bikarbonat, phloroglucinol (p.a., E. Merck, Germany), pereaksi Folin-Ciocalteau dari Sigma Chem, Co., USA, dan akuadest.


24

2. Alat Alat-alat yang digunakan meliputi autoklaf Sanshenyiliaogixie YX-400Z, oven Memmert ULM 500, UM 400, dan U 50, oven Termaks seri 88725, blender Retsch bv, alat titrasi Karl Fischer Mettler DL-18, seperangkat spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lambda 20, timbangan elektrik BP 160 dan Scaltec SBC 22 readability 0, 01 mg, corong Buchner, vacum rotary evaporator (Buchi), waterbath (Abo-Tech), mikropipet 0, 5 – 10 μl dan 100 – 1000 μl (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup (Scott-Germany), soxhlet, labu alas bulat, heating mantle, corong pisah 500 mL, alat sentrifus, homogenizer, dan alat-alat gelas.

E. Tata Cara Penelitian 1. Preparasi sampel alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh Alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir dan menggunakan tangan untuk menghilangkan sedimen dan epifit yang menempel, kemudian dipanaskan dengan autoklaf pada suhu 1200 C selama 30 menit untuk menginaktifkan enzim polifenol oksidase. Selanjutnya dikeringkan dengan oven pada suhu 90°C dan diserbuk dengan derajat halus 20/30. Penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan menggunakan metode Karl Fischer. Serbuk alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh ditimbang sebanyak 2 g, kemudian tambahkan 10 mL metanol, lalu didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Dilakukan pre-titrasi pada alat, lalu dilakukan uji kebocoran alat, hingga didapat angka drift 10-50 pada alat. Standardisasi dilakukan dengan


25

cara spuit berisi air ditimbang, kemudian 1 tetes air dimasukkan ke dalam alat. Kemudian ditimbang kembali untuk menentukan berat air yang dimasukkan dan kesetaraan air dihitung. Dimasukkan 1 mL metanol dan dititrasi dengan alat (blanko). Kadar air dihitung. Dimasukkan 1 mL sampel, titrasi dengan alat, kadar air dalam sampel dihitung. Kadar air dalam sampel dihitung dengan menggunakan rumus: Kadar air =

x − blanko (10) × 100% berat yang ditimbang

x = angka yang muncul pada alat (%) dikali 10.000 mg atau berat yang dimaksudkan untuk konversi.

2. Uji kualitatif senyawa fenolik a. Preparasi ekstrak Tiga puluh mL metanol 80% ditambahkan pada 10 g serbuk alga dengan derajad halus 20/30. Lalu diletakkan ke dalam wadah dan dipanaskan pada waterbath selama ± 1 jam. Kemudian didinginkan pada suhu ruang dan disaring menggunakan corong Buchner yang sesuai dengan dilapisi kertas saring. Ditambahkan 5 mL metanol 80% dan disaring kembali (Fong, 1992). b. Uji tanin dan polifenol Sejumlah volume yang setara dengan 10 g ekstrak metanol 80% yang telah disiapkan sebelumnya pada

langkah preparasi ekstrak, diuapkan

menggunakan waterbath. Ditambahkan 25 mL akuadest panas dan dicampur secara merata. Dibiarkan hingga dingin pada suhu kamar. Ditambahkan 3-4 tetes larutan NaCl 10%. Kemudian ekstrak disaring dengan menggunakan vacuum.


26

Filtrat dibagi ke dalam 4 tabung masing-masing 3 mL. Pada tabung I ditambahkan 4-5 tetes larutan gelatin 1%. Pada tabung II ditambahkan 4-5 tetes pereaksi garam gelatin (gelatin 1% dan NaCl 10 %). Pada tabung III ditambahkan 3-4 tetes ferri klorida. Tabung IV dijadikan kontrol dan tidak ditambahkan pereaksi apapun. Diamati warna yang terbentuk pada setiap tabung (Fong, 1992).

3. Isolasi crude phlorotannin

dari alga coklat Sargassum polycystum C.

Agardh Serbuk alga ditimbang sebanyak 80 g, sesuai dengan kapasitas sohxlet, kemudian dimasukkan ke dalam kertas filter Schleicher dan Schuell. Setelah itu dimasukkan ke dalam labu soxhlet. Kemudian pelarut metanol diberikan sebanyak 2 kali sirkulasi. Soxhletasi dilakukan dengan suhu 120±200C kurang lebih selama 30 jam. Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian dipekatkan sampai 1/10 dari volume mula-mula. Selanjutnya ditambahkan metanol hingga 120 mL, lalu ditambahkan 120 mL kloroform, dan 45 mL air dalam corong pisah 500 mL. Kemudian digojog dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Pisahkan antara lapisan atas dan lapisan bawah. Selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat sebanyak dua kali, masing-masing 75 mL pada setiap kali penambahan. Kumpulkan fraksi etil asetat (bagian atas), selanjutnya diuapkan sehingga diperoleh ekstrak yang merupakan crude phlorotannin.


27

4. Optimasi metode kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau a.

Pembuatan larutan standar dan larutan sampel Pembuatan larutan standar phloroglucinol. Standar phloroglucinol

ditimbang seksama lebih kurang 0,05 g, kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75% sampai volume 50,0 mL. Seri konsentrasi larutan intermediet dipipet dari larutan induk sebanyak 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 mL. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dan dilarutkan ke dalam aseton 75% untuk konsentrasi 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm. Pembuatan larutan sampel. Ditimbang 0,05 g fraksi etil asetat alga coklat, kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75% hingga volumenya 50,0 mL. b. Penetapan operating time (OT) Larutan intermediet dengan konsentrasi 4,0 ppm dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang berisi 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuadest. Operating time diukur pada spektrofotometer visibel. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang teoritis (750 nm). c. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks) Larutan intermediet dengan konsentrasi 1,0; 3,0; dan 6,0 ppm masingmasing dipipet sebanyak 0,5 mL ke dalam labu takar 50,0 mL yang berisi 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dilarutkan sampai volume 50,0 mL dengan akuadest. Campuran tersebut divortex setiap 15


28

menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diambil bagian supernatannya. Setelah itu ketiga larutan tersebut discan menggunakan spektrofotometer visibel untuk melihat panjang gelombang maksimumnya. d. Pembuatan seri larutan baku Masing-masing larutan intermediet dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dilarutkan dengan akuadest sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut divortex setiap 15 menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diambil bagian supernatannya. Absorbansi diukur pada panjang gelombang hasil scanning dengan menggunakan spektrofotometer visibel. Dihitung persamaan kurva baku yang diperoleh.

5. Estimasi kadar polifenol total pada sampel fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh Fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh ditimbang lebih kurang 0,05 g dengan seksama, kemudian dilarutkan dalam aseton 75%S sampai volumenya 50,0 ml. Sepuluh mL larutan sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol FolinCiocalteau yang telah diencerkan dengan akuadest (1:1). Didiamkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dilarutkan dengan


29

akuadest sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut divortex setiap 15 menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diambil bagian supernatannya. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang hasil scanning larutan baku dengan menggunakan spektrofotometer visibel. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan phloroglucinol (mg PE/g fraksi).

F. Analisis hasil 1. Analisis hasil uji kualitatif senyawa fenolik Apabila terbentuk warna hijau kebiruan atau hitam kehijauan setelah penambahan larutan FeCl3 (diasumsikan terbentuk endapan setelah penambahan garam gelatin) maka terdapat senyawa tanin tipe katekol, sedangkan jika terbentuk warna hitam kebiruan setelah penambahan larutan FeCl3 (diasumsikan terjadi endapan setelah penambahan garam gelatin) maka terdapat senyawa tanin tipe pirogalol. Apabila tidak ada endapan tetapi terjadi perubahan warna menjadi kehijauan atau hitam kebiruan maka tidak terdapat senyawa tanin (Fong, 1992). Apabila terbentuk endapan pada penambahan gelatin 1% menandakan adanya kandungan senyawa fenolik. Endapan yang timbul setelah penambahan garam gelatin (gelatin 1% dan NaCl 10%) menunjukkan adanya kandungan fenolik berupa tanin (Robinson, 1995). 2. Analisis hasil validasi metode Validasi metode analisis dilihat dari linearitas. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linier y = B x + A. Hubungan


30

linier yang ideal dicapai jika nilai B = 0 dan r = +1 atau -1 bergantung pada arah garis, sedangkan nilai A menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan (Harmita, 2004). 3. Analisis hasil penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum polycystum C. Agardh Kadar phlorotannin diperoleh dengan memasukkan nilai absorbansi sampel ke dalam persamaan kurva baku phloroglucinol. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan phloroglucinol (mg PE/g fraksi).


BAB IV PEMBAHASAN A. Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum polycystum C. Agardh Simplisia alga coklat diambil dari Pantai Drini, Gunungkidul, Yogyakarta pada tanggal 21 Maret 2007. Alga coklat diambil pada daerah pantai (beach area). Kondisi lingkungan pada saat pengambilan sampel adalah air laut dalam keadaan surut pada pukul 16.00-17.00 WIB, musim penghujan dan suhu air laut 270C. Identifikasi alga coklat dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada. Dari hasil identifikasi diketahui alga coklat yang digunakan dalam penelitian ini termasuk ke dalam genus Sargassum dan spesies Sargassum polycystum C. Agardh (lampiran 1). Daerah pantai tempat diambilnya sampel alga coklat bersubstrat karang Secara ekologis, alga coklat berperan dalam pembentukan ekosistem terumbu karang dan tempat hidup biota laut antara lain sebagai tempat untuk meletakkan benih ikan dan udang. Pengotor yang ada pada alga coklat dapat mempengaruhi reaksi yang terjadi dalam penentuan kadar phlorotannin. Pasir pada habitat alga coklat mengandung silikat dan kalsium. Menurut Auterhoff dan van Joacim Knabe (1978), silikat dapat membentuk kompleks molibdat H6[SiMo12O40].n H2O dengan pereaksi Folin-Ciocalteu, sehingga bila tidak dihilangkan akan mengganggu analisis sampel. Sedangkan kalsium dalam suasana basa dapat mengakibatkan terbentuknya endapan berupa kalsium fosfat (Ca3(PO4)2) setelah

31


32

bereaksi dengan reagen Folin (Kahn, 1916). Endapan yang terbentuk dapat mengganggu proses analisis. Pencucian sampel alga coklat dilakukan dengan air mengalir untuk menghilangkan pasir. Pencucian dilanjutkan dengan pembersihan biota laut lain yang menempel pada alga coklat dengan menggunakan tangan karena tidak dapat hilang hanya dengan pencucian menggunakan air. Pemanasan sampel alga coklat dalam autoklaf bertujuan untuk menginaktifkan enzim polifenol oksidase. Enzim ini mengkatalisis proses oksidasi regioselektif monofenol menjadi o-difenol yang d iikuti dengan reaksi dehidrogenasi menjadi o-kuinon (gambar 5). OH

O

OH

O

OH

O Enzim PPO

O Enzim PPO

o-kuinon

Gambar 5. Oksidasi fenol oleh Polifenol oksidase (Sullivan et.al, 2003) Proses polimerisasi yang terjadi mengakibatkan polifenol memiliki rantai yang panjang. Polifenol dengan rantai yang terlalu panjang tidak memiliki kemampuan sebagai daya antioksidan dan memberikan serapan pada daerah visibel sehingga tidak dapat dikembangkan sebagai produk sunscreen. Menurut Yagar dan Sagiroglu (2002), aktivitas polifenol oksidase akan hilang sebesar 20% pada suhu 650C dan akan hilang sebesar 65% dengan pemanasan pada suhu 700C selama 30 menit. Pada suhu di atas 600C, semakin tinggi suhu maka enzim ini akan semakin kurang reaktif.


33

Senyawa-senyawa yang tidak diketahui dalam bahan organik asing dapat turut mereduksi kompleks asam dalam pereaksi Folin-Ciocalteau, sehingga akan berpengaruh terhadap warna larutan sampel yang dihasilkan (membentuk warna biru-hijau). Alga harus segera dikeringkan dan diekstraksi untuk menghindari proses degradasi karena kandungan kimia yang terdapat di dalam organisme dapat dengan cepat terdegradasi oleh karena proses oksidasi, enzimatik, atau polimerisasi (Cannel, 1998). Alga coklat dikeringkan dengan oven pada suhu 900C untuk mencegah tumbuhnya jamur dan mikrobia. Proses dilanjutkan dengan pembuatan serbuk dari simplisia alga menggunakan blender agar mempermudah proses isolasi. Isolasi senyawa aktif dari simplisia dalam bentuk serbuk lebih mudah karena memiliki luas permukaan yang lebih besar bila dibandingkan dengan simplisia kering. Proses pengeringan dengan oven membantu proses pembuatan serbuk simplisia karena simplisia sudah dalam keadaan kering. Serbuk simplisia kemudian diayak agar memiliki derajat halus 20/30. Serbuk diayak dengan derajat kehalusan serbuk 20/30 untuk mendpatkan serbuk yang lebih homogen dan ukuran partikel tidak terlalu besar atau kecil karena termasuk dalam ukuran seruk agak kasar (Anonim, 1979). Partikel serbuk dengan ukuran tidak terlalu besar dapat meningkatkan efisiensi ekstraksi serbuk simplisia karena semakin besar luas permukaan serbuk yang kontak dengan cairan penyari. Partikel serbuk dengan ukuran yang terlalu kecil dapat menyumbat poripori kertas filter yang digunakan dalam soxhletasi sehingga menghambat proses


34

ekstraksi. Serbuk yang sangat halus menyebabkan cairan pengekstraksi akan sulit dipisahkan dari sisa yang tertinggal setelah proses ekstraksi selesai. Kadar air dari serbuk simplisia kemudian diukur menggunakan metode Karl Fischer. Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Karl Fischer karena Sargassum polycystum C. Agardh mengandung senyawa triterpenoid yang merupakan turunan terpenoid dan termasuk dalam golongan minyak atsiri. Golongan minyak atsiri mudah menguap sehingga penetapan kadar air tidak dilakukan menggunakan metode Gravimetri yang memerlukan pemanasan. Senyawa yang mudah menguap dapat mempengaruhi perhitungan kadar air pada metode Gravimetri. Metode Karl Fischer menggunakan pereaksi berupa iodin, sulfur dioksida, metanol anhidrat, dan piridin anhidrat. Prinsip reaksi ini adalah I2 dan SO2 akan bereaksi hanya jika ada air (Vogel, 1978). I2 + SO2 + 2H2O → H2SO4 + 2HI

(1)

Penetapan kadar air dengan metode Karl Fischer berdasar atas reaksi redoks antara SO2 dan I2 menghasilkan garam asam hidroiodat dan garam alkil sulfat seperti yang tercantum pada gambar 6 (Evans, 2002).

SO2

I2

H20

2

3 N

N

N HI

SO2

O

CH3OH N SO2

N O

H

SO4CH3

Gambar 6. Reaksi pada penetapan kadar air dengan metode Karl Fischer


35

Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2690-1992 tentang rumput laut memberlakukan persyaratan kadar air yang berbeda dengan kisaran antara 15-35% tergantung pada genus alganya. SNI hanya mengatur 4 genus alga yang banyak dibudidayakan seperti Euchema, Gelidium, Gracilaria, dan Hypnea. Persyaratan kadar air genus Sargassum belum dicantumkan secara khusus. Kadar air yang berlebih di dalam alga dapat mengakibatkan pertumbuhan mikroorganisme yang dapat merusak kandungan kimia alga. Hasil pengukuran kadar air pada Sargassum polycystum C Agardh adalah 5,58 ± 1,3% b/b. Kadar air tersebut sudah memenuhi standar yang ditetapkan oleh SNI.

B. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik Alga Sargassum polycystum C. Agardh Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder yang banyak ditemukan pada tanaman. Senyawa fenolik yang berguna bagi manusia adalah asam fenolik, flavonoid, dan polifenol dengan bobot molekul yang besar (Svobodova, 2003). Penapisan fitokimia perlu dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan senyawa fenolik pada simplisia. Penapisan fitokimia dilakukan dengan uji tanin karena phlorotannin merupakan tanin yang terdiri dari phloroglucinol yang berikatan bersama (Mc Innes, Ragan, dan Walter, 1984). Penapisan fitokimia dilakukan dengan menggunakan gelatin 1%, garam gelatin (gelatin 1% dan NaCl 10%), dan pereaksi FeCl3.


HO

H O

O

36

OH

OH

+

3

HO

FeCl3

Fe3+

HO

O

+ 3HCl

OH O

OH

OH

phloroglucinol

kompleks berwarna biru-ungu

Gambar 7. Reaksi fenol dengan pereaksi FeCl3 Penambahan gelatin 1% akan menimbulkan endapan karena kandungan tanin dalam ekstrak. Namun protein dalam sampel juga dapat memberikan uji positif. Kepekaan reaksi dapat ditingkatkan dengan menambahkan sedikit natrium klorida (Robinson, 1995). Penambahan NaCl 10% dimaksudkan untuk menghilangkan protein sehingga mencegah terjadinya reaksi positif palsu. Kandungan protein dalam sampel juga dapat menyebabkan terbentuknya endapan maka campuran disaring dan filtrat yang diperoleh ditambah gelatin. Hasil uji kualitatif menunjukkan setelah penambahan gelatin 1% terjadi endapan putih di dasar tabung, yang menunjukkan adanya senyawa fenol berupa tanin. Terbentuknya endapan disebabkan karena kemampuan tanin menyamak kulit. Selain itu, endapan menunjukkan adanya tanin yang tidak larut dengan gelatin dalam HCl atau NaCl. Tanin memiliki afinitas yang kuat terhadap gelatin sehingga mengalami presipitasi (Thomas dan Frieden, 1923).


37

Penambahan FeCl3 menyebabkan perubahan warna menjadi coklat pekat akibat terbentuknya kompleks berwarna violet-biru yang menandakan adanya senyawa polifenol (Robinson, 1995).

C.

Isolasi Crude Phlorotannin dari Sargassum polycystum C. Agardh Sebelum dilakukan isolasi crude phlorotannin maka dilakukan penyarian

dengan cara sohxletasi. Dipilih penyarian dengan cara sohxletasi karena terjadi sirkulasi berulang-ulang sehingga menghasilkan penyarian yang lebih baik (Anonim, 1986). Pelarut pada metode soxhletasi tidak akan mengalami titik jenuh seperti pada metode maserasi, karena pelarut diuapkan dan akan menarik kembali senyawa aktif dari seruk simplisia sehingga penyarian lebih maksimal. Phlorotannin bersifat relatif polar oleh karena itu dalam penyarian digunakan pelarut metanol yang juga relatif polar. Phloroglucinol yang digunakan sebagai standar merupakan monomer dari phlorotannin. Phloroglucinol memiliki titik lebur 200-2190C (Anonim, 2001). Soxhletasi dilakukan pada suhu yang lebih rendah daripada titik lebur phloroglucinol yaitu 1200C±200C. Ekstrak metanol yang diperoleh dari hasil soxhletasi dipekatkan sampai kurang lebih 1/10 dari volume mula-mula sehingga diperoleh ekstrak kental. Kemudian ekstrak kental tersebut difraksinasi. Ekstraksi untuk mendapatkan fraksi dilakukan dengan cara ekstraksi cair-cair bertahap. Senyawa dipisahkan setelah kesetimbangan tercapai. Sebelum dilakukan ekstraksi, volume ekstrak hasil isolasi disamakan dengan menambahkan metanol hingga volume yang sama.


38

Tahap awal ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut air dan kloroform. Metanol-air akan berada pada lapisan atas karena memiliki berat jenis yang lebih kecil jika dibandingkan dengan pelarut kloroform. Phlorotannin akan tertarik ke dalam pelarut air, sedangkan lipid akan tertarik ke dalam kloroform (Padda, 2006). Senyawa dalam Sargassum polycystum C. Agardh yang tertarik ke dalam kloroform antara lain alginat, iodin, steroid, triterpenoid, dan phlorotannin yang memiliki berat molekul yang tinggi. Ekstraksi tahap selanjutnya menggunakan pelarut etil asetat. Etil asetat akan berada di lapisan atas karena memiliki berat jenis yang lebih kecil dibandingkan

metanol-air.

Phlorotannin

yang

meliputi

phloroglucinol,

phlorofucofuroeckol, dieckol, 8,8’-bieckol, dan phlorotannin golongan tetramer akan tertarik ke dalam fraksi etil asetat. Phlorotannin ini termasuk ke dalam phlorotannin dengan berat molekul yang rendah. Senyawa yang lebih polar dibandingkan phlorotannin seperti vitamin C akan tertarik ke dalam fraksi metanol-air. Phlorotannin didapatkan dengan menguapkan fraksi etil asetat di atas waterbath dengan suhu 500C. Phlorotannin dalam fraksi etil asetat bersifat sangat higroskopis. Oleh karena itu disimpan di dalam oven agar tidak mudah rusak oleh adanya lembab. Hasil dari ekstraksi tergantung pada banyaknya ekstraksi yang dilakukan. Hasil yang paling baik diperoleh jika jumlah ekstraksi dilakukan berulangkali dengan jumlah pelarut sedikit (Khopkar, 1990). Proses ekstraksi


39

dengan pelarut etil asetat dilakukan sebanyak dua kali. Hal ini bertujuan agar phlorotannin dapat diekstraksi dengan sempurna. Proses pengelompokkan komponen campuran dari bahan alam dalam ekstrak berdasarkan kesamaan karakter fitokimia disebut fraksinasi (Houghton, 2002). Pengelompokkan untuk mendapatkan fraksi etil asetat adalah kelarutan berdasarkan polaritas.

D. Prinsip Reaksi Kolorimetri dengan Metode Folin-Ciocalteau Penetapan kadar polifenol crude phlorotannin setelah difraksinasi dilakukan secara kolorimetri dengan menggunakan pereaksi reagen FolinCiocalteau. Pereaksi Folin-Ciocalteau berupa larutan asam berwarna kuning yang mengandung kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam heteropoli (Singleton dan Rossi, 1965). Reagen Folin-Ciocalteau yang digunakan adalah dengan pengenceran (1:1) (Anonim,

1994),

karena

pengenceran

reagen

Folin-Ciocalteau

dengan

perbandingan hingga (1:12) tidak memberikan perbedaan yang berarti (Singleton dan Rossi, 1965). Prinsip reaksi sampel fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteau melibatkan reaksi ion fenolat dengan kompleks ion polimerik dari asam fosfomolibdatfosfotungstat. Fenol akan menjadi fenolat dan lebih reaktif dalam suasana basa. Oleh karena itu dalam metode Folin-Ciocalteau ini ditambahkan natrium karbonat (Na2CO3) 1,9 M agar fenol sampel lebih mudah bereaksi dengan pereaksi FolinCiocalteau (gambar 9).


40

O

OH

Na2CO3 OH

HO

OH

HO

3,5-Dihydroxy-phenol anion

phloroglucinol

Gambar 8. Kesetimbangan reaksi phloroglucinol dalam suasana basa

Fenol teroksidasi dengan cepat hanya dalam keadaan yang cukup basa agar dapat memberikan jumlah ion fenolat yang cukup. Sebagian fenol akan terionisasi pada pH 9-10. Ketika fenol yang sudah terionisasi bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteau, maka kesetimbangan akan bergeser dan akan dihasilkan lebih banyak fenolat (Singleton dan Rossi, 1965). O

OH

oksidator + H2O HO

4H+

+

4e

OH

HO

OH

+

O

Gambar 9. Reaksi oksidasi fenol menjadi ion fenolat

Ion fenolat dioksidasi oleh asam dalam pereaksi Folin-Ciocalteau dan kompleks

molibdenum-tungstat

akan

direduksi

oleh

sampel

sehingga

menghasilkan warna biru (molybdenum-blue). Reaksi ini tertera pada gambar 10. O

OH

+

HO

H3PO4(MoO3)12

+

H2O

+

HO

OH

H7(PMo12O40)

OH O

Pereaksi Folin-Ciocalteau

2,6-Dihydroxy-(1,4)benzokuinon

Gambar 10. Reaksi senyawa fenolik dengan Folin-Ciocalteau

Kompleks oktahedral molybdenum-blue


41

Folin-Ciocalteau memiliki bilangan oksidasi 2 dan 4, dengan uraian : H3PO4(MoO3)12 + 2e- + 2H+ H3PO4(MoO3)12 + 4e- + 4H +

H5(PMo12O40) H7(PMo12O40)

(2) (3)

Hasil dari reaksi yang terjadi adalah kompleks oktahedral molybdenumblue dan suatu kuinon. Kompleks oktahedral yang terbentuk merupakan kompleks MoO3-fosfat dengan fosfor (P) sebagai pusatnya. Menurut Auterhoff dan Knabe (1978), kompleks molybdenum-blue yang terbentuk berupa koloid. Asam fosfat (H3PO4) pada reagen Folin-Ciocalteau akan menyebabkan terbentuknya kompleks asam fofomolibdat yang berbentuk cairan non-koloidal sehingga dapat dianalisis menggunakan spektrofotometer. Kondisi optimum agar reaksi dapat berjalan cukup cepat dan memberikan warna yang bertahan cukup lama yaitu adanya reagen Folin-Ciocalteau dalam jumlah banyak dan suasana basa yang sedang (Singleton dan Rossi, 1965).

E. Optimasi Kolorimetri dengan Metode Folin-Ciocalteau 1. Penentuan operating time (OT) Senyawa baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah phloroglucinol. Phloroglucinol merupakan monomer dari phlorotannin. Operating time adalah waktu yang dibutuhkan untuk reaksi berjalan dengan sempurna dan mencapai keadaan stabil.


42

Operating time dalam penelitian ini didapatkan saat warna molybdenumblue dari reaksi antara kompleks asam molibdat tungstat dengan fenolat sudah stabil. Pengukuran operating time dilakukan dengan menggunakan larutan baku konsentrasi 4,0 ppm pada panjang gelombang teoritis yaitu 750 nm. Penentuan

Absorbance

operating time dilakukan dengan mengukur serapan kompleks selama 90 menit.

Time (min) Gambar 11. Spektra operating time dari phloroglucinol pada konsentrasi 4,0 ppm

Dari kurva pengukuran operating time (gambar 11) terlihat bahwa serapan warna yang dihasilkan oleh kompleks telah stabil dari menit 50-90 dengan absorbansi 0,454. Kestabilan warna ini menandakan reaksi yang terjadi sudah optimum sehingga jika pengukuran absorbansi dilakukan pada rentang waktu tersebut dapat meminimalkan terjadinya kesalahan pengukuran. 2. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks) merupakan faktor penting di dalam analisis kimia dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Tujuan


43

dari penentuan panjang gelombang maksimum dalam penelitian ini adalah untuk mencari panjang gelombang saat kompleks yang terbentuk dapat memberikan serapan yang optimum. Panjang gelombang maksimum ini yang digunakan untuk mengukur serapan kompleks yang akan dianalisis. Panjang gelombang maksimum tidak tergantung pada struktur molekul suatu senyawa tetapi bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UV-Vis sehingga jika ada dua senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama, belum tentu kedua senyawa tersebut adalah sama. Hal inilah yang menyebabkan panjang gelombang maksimum digunakan sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif (Mulja dan Suharman, 1995). Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum. Selain itu, kurva serapan disekitar panjang gelombang maksimum tersebut relatif datar sehingga jika dilakukan pengukuran ulang atau replikasi, kemungkinan terjadinya kesalahan yang disebabkan oleh pengukuran ulang atau replikasi menjadi kecil. Scanning panjang gelombang dilakukan pada rentang panjang gelombang 400-900 nm. Pengukuran dilakukan pada tiga konsentrasi baku yaitu 1,0 ppm; 3,0 ppm, dan 6,0 ppm. Dari penentuan panjang gelombang maksimum diperoleh λmaks pada konsentrasi 1,0 ppm adalah 758,7 nm, pada konsentrasi 3,0 ppm adalah 750,1 nm dan pada konsentrasi 6,0 ppm adalah 743,4 nm.


44

Dari hasil scanning panjang gelombang maksimum, didapatkan kecenderungan bahwa semakin besar konsentrasi, maka panjang gelombang maksimum akan bergeser ke panjang gelombang yang lebih kecil. Hal ini disebabkan oleh reduksi reagen Folin-Ciocalteau yang tidak terkontrol. Auterhoff dan Knabe (1978) menyebutkan terdapat dua bentuk reduksi reagen Folin-Ciocalteau yang ditunjukkan pada persamaan (2) dan (3). Reaksi reduksi tersebut ditentukan oleh pH. Keterbatasan penelitian ini adalah tidak dikontrolnya pH pada saat dianalisis. Dengan demikian reaksi reduksi reagen dapat terjadi dalam dua bentuk, sehingga berpengaruh pada hasil reaksi redoks yang menyebabkan terjadinya pergeseran panjang gelombang.

Absorbance unit (au)

C B A

Wavelength (nm) Gambar 12. Spektra panjang gelombang maksimum phloroglucinol pada tiga konsentrasi (A = 1,0 ppm; B = 3,0 ppm;C = 6,0 ppm)


45

Panjang gelombang yang diperoleh pada tiga konsentrasi memberikan hasil yang berbeda. Oleh karena itu absorbansi standar phloroglucinol dibaca pada ketiga panjang gelombang tersebut. Hasil pembacaan absorbansi menunjukkan perbedaan yang tidak berbeda jauh. Pembacaan absorbansi seri baku dan sampel dipilih panjang gelombang 750,1 nm karena merupakan panjang gelombang yang mendekati panjang gelombang maksimum teoritis phloroglucinol yaitu 750 nm (Zhang, et al., 2006).

F. Penetapan Kurva Baku Phloroglucinol Penetapan kurva baku phloroglucinol dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Hubungan yang linier antara konsentrasi baku phloroglucinol dengan absorbansi dapat diketahui dari nilai koefisien korelasi (r) masing-masing replikasi yang mendekati satu (tabel 1). Tabel I. Data hubungan antara konsentrasi phloroglucinol dengan absorbansi Replikasi I Kadar phloroglucinol Absorbansi terhitung (mg/100 mL) 0,1024 0,138 0,2048 0,269 0,3071 0,405 0,4095 0,516 0,5119 0,648 0,6143 0,768 A 0,015 B 1,233 r 0,9997

Replikasi II Kadar phoroglucinol Absorbansi terhitung (mg/100 mL) 0,1046 0,132 0,2091 0,257 0,3137 0,407 0,4182 0,514 0,5228 0,643 0,6274 0,712 A 0,020 B 1,155 r 0,9956

Replikasi III Kadar phoroglucinol Absorbansi terhitung (mg/100 mL) 0,1016 0,121 0,2032 0,238 0,3048 0,379 0,4064 0,542 0,5080 0,602 0,6096 0,720 A 0,011 B 1,190 r 0,9941


46

Kurva baku yang dibuat minimal tiga kali dengan minimal tiga konsentrasi larutan baku yang diukur. Hal ini dilakukan supaya diperoleh hasil yang menggambarkan hasil yang sebenarnya. Penggunaan minimal tiga konsentrasi

akan

menghasilkan

tiga

titik

pada

kurva

baku

sehingga

menggambarkan linearitas yang sesungguhnya. Jika hanya digunakan dua konsentrasi maka hasil yang didapatkan akan selalu linear. Hal ini disebabkan dua titik akan membentuk garis lurus. Nilai korelasi (r) persamaan kurva baku pada replikasi I adalah 0,9997, replikasi II adalah 0,9956 dan replikasi III adalah 0,9941. Dari ketiga persamaan tersebut, dipilih satu persamaan baku dengan linearitas yang paling baik yaitu replikasi pertama dengan nilai r sebesar 0,9997. Persamaan kurva baku yang diperoleh adalah y = 1,2274x + 0,0175. 0.9 0.8 0.7

Absorbansi

0.6 0.5

y = 1,2274x + 0,0175 r = 0,9997

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Konsentrasi baku phloroglucinol (mg/100 ml)

Gambar 13. Kurva hubungan antara konsentrasi baku phloroglucinol dengan absorbansi


47

Nilai r sebesar 0,9997 mendekati ± 1 yang artinya terdapat korelasi antara konsentrasi dengan absorbansi , yaitu peningkatan konsentrasi akan diikuti dengan peningkatan absorbansi secara proporsional (gambar 13). Menurut Mulja dan Suharman (1995) dan Anonim (2004) data linearitas dapat diterima apabila memiliki nilai r > 0,999. Persamaan kurva baku pada replikasi I telah memenuhi ketentuan tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa kenaikan konsentrasi sebanding dengan kenaikan absoransi. Semakin besar konsentrasi, maka semakin besar pula absorbansinya.

G. Penetapan Kadar Phlorotannin dalam fraksi Etil Asetat Sargassum polycystum C. Agardh Penetapan kadar phlorotannin dilakukan dengan menimbang fraksi etil asetat dari alga coklat sebanyak 0,05 g. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali, menggunakan pelarut aseton 75%. Fraksi etil asetat ini sukar larut, oleh karena itu dilarutkan dengan dipanaskan pada suhu 500C sambil terus diaduk. Penambahan aseton 75% dilakukan sedikit demi sedikit hingga mencapai volume 50 mL agar fraksi etil asetat alga coklat dapat larut sempurna. Fraksi etil asetat alga coklat tersebut diambil 0,5 mL dan ditambahkan dengan aseton 75% hingga 50 mL sebanyak dua kali replikasi. Reaksi dengan Folin-Ciocalteau dilakukan sama seperti pada standar phloroglucinol. Pengukuran absorbansi sampel dilakukan pada panjang gelombang 750,1 nm dan pada panjang gelombang lain hasil scanning.


48

Tabel II. Kadar phlorotannin dalam sampel (mg PE/g fraksi ) Sampel Sargassum polycystum C Kadar Rata-rata kadar Agardh phlorotannin 1 6,73 Replikasi I 6,92 2 7,10 1 7,39 Replikasi II 7,15 2 6,91 1 6,52 Replikasi III 6,81 2 7,10 Rata-rata kadar phlorotannin dalam sampel 6,96 Pengukuran absorbansi sampel dilakukan pada panjang gelombang 750,1 nm dan pada panjang gelombang lain hasil scanning. Penetapan kadar sampel menggunakan panjang gelombang 750,1 nm sesuai dengan persamaan baku yang dipilih. Kadar phlorotannin yang didapatkan dari tiga kali replikasi sampel adalah 6,92 mg PE/g sampel; 7,15 mg PE/g sampel; dan 6,81 mg PE/g sampel. Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat Sargassum polycystum C. Agardh adalah 6,96 ± 0,17 mg PE/g sampel.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Phlorotannin dapat diisolasi dari Sargassum polycystum C. Agardh. 2. Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat Sargassum polycystum C. Agardh yang terukur dengan metode Folin-Ciocalteau adalah 6,96 ± 0,17 mg PE/g fraksi. B. Saran 1. Perlu dilakukan validasi penetapan kadar phlorotannin dengan metode FolinCiocalteau.

C. Keterbatasan 1. Phlorotannin yang diteliti meliputi phloroglucinol, phlorofucofuroeckol, dieckol, 8,8’-bieckol, dan phlorotannin golongan tetramer dalam fraksi etil asetat. 2. Proses penyarian dilakukan dengan metode soxhletasi selama kurang lebih 30 jam dengan suhu 120±200 C 3. pH dalam penelitian ini tidak dikendalikan sehingga menghasilkan dua bentuk kompleks molybdenum blue yaitu H5(PMo12O40) dan H7(PMo12O40).

49


DAFTAR PUSTAKA Ahn, M.J., Yoon, K.D., Min, S.Y., Lee, J.K., Kim, J.H., Kim, T.G., et al., 2004, Inhibition of HIV-1 Reverse Transcriptase and Protease by Phlorotannin From The Brown Alga Ecklonia cava, Biol. Pharm. Bull, 27(4), 544547. Anggadiredja J., Andyani R., Hayati, Muawanah, 1997, Antioxidant activity of Sargassum polycystum (Phaeophyta) and Laurencia obtusa (Rhodophyta) from Seribu Islands, J. App. Phycol., 9 (5) , 477-479(3). Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 25-26, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Ed. IV, 1157, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2001, The Merck Index : An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, thirteenth edition, 1299, Merck and Co., Inc., USA. Anonim, 2002, Seaweed of the Central West Coast of India : Sargassum polycystum C.Agardh, Sargassum polycystum C.Agawww. nio. res. in/ Biology /seaweed/system_Sargassum%20polysystem.htm - 9k -, diakses tanggal 4 Februari 2008 Anonim, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical Methods for Active Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority, Kingston, http://www.apvma.gov.au, 3-5.

Anonim, 2006, Dietary Supplements Methods Executive Summary July 2006, AOAC International, www.aoac.org/dietsupp6/Dietary-Supplement-website/Jul2006.htm, diakses tanggal 13 November 2007. Anwar, C., Purwono, B., Pranowo, H.D., Wahyuningsih, T.D., 1994, 15, Pengantar Praktikum Kimia Organik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Athukorala, Y., Kim, K.N., and Jeon, Y.L., 2006, Antiproliferative and Antioxidant Properties of an Enzymatic Hydrolysate from Browm Alga Ecklonia Cava, Food Chem. Toxicol., 44(7), 1065-1074. Burtin, P., 2003, Nutrional Value of Seaweeds, Electron. J. Environ. Agric. Food Chem., 2(4), 498-503.

50


51

Butz, H.W. and Nobels, H.J., 1961, Instrumental Methods for the Analysis of Food Additievs, 109-123, Interscience Publishers, New York-London. Cairns, D., 2003, Essentials of Pharmaceutical Chemistry, Second Edition, 60, 184-185, Pharmaceutical Press, Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, London. Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, 6th edition, 65-66,483-484, John Wiley and Sons, Inc., New York Cannel, Richard J.P., 1998, Natural Products Isolation, 376, Humana Press, Totowa, New Jersey. Day, R.A. and Underwood, A.L., 1986, Quantitative Analysis, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana P., 388-390, Erlangga, Jakarta. Evans, W.C., 2002, Trease and Evans: Pharmacognosy, 15th Ed., 98, W.B. Saunders, London. Fong, H.H., Tinwu M., Farnsworth, N.R., 1992, Phytochemical Screening, Departemen of Pharmacognosy and Pharmacology, Colloge of Pharmacy, University of Illinois of the Medical Center, 803 Southwood, Stract Chicago, Illinois 60162, 32, 62. Folin, Otto, Ciocalteau, Vintila, 1944, On Tyrosine and Tryptophane Determinations in Proteins, Jour.Bio.Chem., 73 : 627-650, 1927, in. Todd-Sanford, 10, 412. Guiry,

2006, Sargassum polycystum C. http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/, November 2007.

Agardh diakses

J. Agardh tanggal 7

Glombitza, K.and Gerstberger, G., 1985, Phytochemistry, 24, 543-551. Harbone, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, 1-38, Penerbit ITB, Bandung. Hernes, P.J., Benner, R., Cowie, G.L., Goni, M.A., Bergamasachi, B.A., Hedges, J.L., 2001, Tannin Diagenesis in Mangrove Leaves from a Tropical Estuary : A Novel Molecular Approach, Geochemica et Cosmochimica Acta, 65(18), 3109-3122 Houghton, Peter L., 2001, Laboratory Handbook for the Fractinatio of Natural Extracts, 54, St Edmundsbury Press, London.


52

Jansoon, Ninna, 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green Tea,http://209.85.165.104/search?q=cache:Nj311vjKCdcJ:chemw.sc.mahid ol.ac.th/scess/scch108/2005_06_SCCH108Lab02.pdf+FolinCiocalteau+met hod+colorimetric&hl=en&ct=clnk&cd=9&gl=id, diakses tanggal 24 Oktober 2007.

Lestari,

1997, Telaah Fitokimia Sargassum polycystum C. Agardh, sargassaceaefa.lib.itb.ac.id/go.php?id=jbptitbfa-gdl-s1-1997-dwilestari575 - 23k - , diakses tanggal 3 Maret 2008.

Kadi, A., 2007, Beberapa Catatan Kehadiran Marga Sargassum di Perairan Indonesia, http://www.oseanografi.lipi.go.id/volxxxno.42.pdf., diakses tanggal 20 Februari 2007. Kahn, R.L., 1916, The Folin and Denis Method of Nitrogen Determinations by Direct Nesslerization, and Its Application to Spinal Fluids, J. Biol. Chem., 26 , 473. Kang K., Park, Y., Hwang, H.J., Kim, S.H., Lee, J.G., Shin, H.C., 2003, Antioxidative Properties of Brown Algae Polyphenolics and Their Prespective Agent Against Vascular Risk Factors, Arch Phem Res, 26(4), 286-293 Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Koh, Y.S., Yoo, B.S., Kim, J.H., et al., 2005a, Triphlorethol-A from Ecklonia cava Protects V-79-4 Lung Fibroblast Against Hydrogen Peroxide Induced Cell Damaged, Free Radic. Res., 39(8), 883-892. Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Zhang, R., Jung, M.S., Ham, Y.M., et al., 2005b, Cytoprotective Effect of Floroglucinol on Oxidative Stress Induced Cell Damaged via Catalase Activation, J.Cell Biochem., 97(3), 609-620. Kang, K.A., Zhang, R., Lee, K.H., Chae, S., Kim, B.J., Kwak, Y.S., et al., 2006, Protective Effect of Triphlorethol-A from Ecklonia cava Against Ionizing Radiation in Vitro, J.Radial.Res., 47(1), 61-68. Khopkar, S.M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkan oleh Saptohardjo, A., 193, 204, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 26-28, Airlangga University Press, Surabaya.


53

Nagayama, K.,Iwamura, Y., Shibata, I., Hirayama, I., and Nakamura, T., 2002, Bactericidal Activity of Phlorotannins from The Brown Alga Ecklonia kurome, JAC, 50, 889-893. Nakamura, T., Nagayama, K., Uchida, K., and Tanaka, R., 1996 , Antioxidant activity of phlorotannin isolated from the brown alga Eisenia bicyclis , Fisheries Sci., 62(6), 923-926. Ohanessian., L. And Streeter, A.J., 2002, Handbook of Pharmaceutical Analysis, Vol.117, 209, 210 Marcel Dekker, Inc., New York, United State. Putra, S.E., 2003, Alga Laut sebagai Biotarget Industri, http://www.chem-istry.org/?sect=fokus&ext=24, diakses tanggal 7 November 2007. Padda, M.S., 2006, Phenolic Composition And Antioxidant Activity of Sweetpotatoes [Ipomoea batatas (L.) Lam], 15, Disertasi, Punjab Agricultural University. Ragan, M.A., 1984, The High Weight Polyphloroglucinols of the Marine Brown Alga Fucus vesiculosus L. : Degradative Analysis, J.Chem, 63, 294 Robinson, Trevor., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 78, Ed. VI, Penerbit ITB, Bandung. Roleda, M.Y., Wiencke, C., and Luder, U.H., 2006, Impact of Ultraviolet Radiation on Cell Structure, UV-absorbing Compounds, Photosynthesis, DNA Damage, and Germination in Zoospore of Arctic Saccorhiza dermatodea, J.Exp.Marine.Biol.Ecol., 57(14), 3847-3856. Roth, H.J. and Blaschke, G., 1994, Pharmaceutival Analysis, diterjemahkan oleh Sarjoko Kisman dan Slamet Ibrahim, 359-361, 373, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Shibata, T., Hama, Y., Miyasaki, T., Ito, M., Nakamura, T., 2006, Extracellular Secretion of Phenolic Substances from Living Brown Algae, J Appl Phycol, 18, 787-794 Silverstein, R. M., Bassler, G. C., and Murril, T. C., 1986, Spectrophotometric Identification of Organic Compounds, diterjemahkan oleh A. J. Hartono dan A.V. Purba, Edisi V, 306-309, Erlangga, Jakarta. Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolibdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 144-158.


54

Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental Analysis, 5th Ed., 11-14, 140, H. Brace College, Philadelphia. Svobodova, A., Psotova, J., and Walterova, D., 2003, Natural phenolics in prevention of UV-Induced Skin Damage (A Review), Biomed. Papers, 147(2), 137-145. Sullivan, M., Thoma, S., Samac, D. and Hatfield, R., 2003, Cloning of Red Clover and Alfafa Polyphenol Oxydase Genes and Expression of Active Enzymes in Transgenic Alfafa, Molecular Breeding of Forage and Turf, 190. Trono, J.R.,G.C and Ganzon E.T., 1988, 327, Philippine Seaweeds, National Book Store. Inc., Philippine. Ungson , J.R., 2003, Feeding of Abalone Juveniles with Two Species of Sargassum (Sargassum cristaefolium and Sargassum polycystum), Philip. Jour. Sci, 132 (1). Vogel, A.I., 1978, A Text Book of Quantitative Inorganic Analysis, Fourth edition, 728, The English Languange Book Society, Richard Clay Ltd., Bungay. Waterman, P.G. and Mole, S., 1994, Analysis of Phenolic Plant Metabolites: Extraction and Chemical Quantification, Black. Sci. Pub., 66-69. Williams, D.H., Fleming, I., 1980, Spectroscopic Methods in Organic Chemistry, 2-3, McGraw-Hill Book Company (UK) Limited, London. Yagar, H. and Sagiroglu, A., 2000, Partially Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase of Quince, Turk J. Chem., 26, 97-103 Yuan, Y.V., and Walsh, N.A., 2006, Antioxidant and Antiproliferative Activities of Extract from a Variety of Edible Seaweeds, J.Fd.Chem.Toxicol., 44, 1144-1150. Yun, 2002, Rumput Laut untuk Pasta Gigi hingga Pewarna Tekstil, http://www.kompas.com/kompas-cetak/0205/11/utama/rump01.htm, diakses tanggal 7 November 2007. Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., Dennis, D.A., and Barrow, C.J., 2006, A Simple 96-well Microplate Method for Estimation of Total Polyphenol Content in Seaweeds, J. App. Phyco., 18, 445-450.


LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Keterangan Hasil Determinasi Alga Coklat dari Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada

55


56


57

Lampiran 2. Penetapan Kadar Air Serbuk Alga Sargassum polycystum C. Agardh dengan metode Karl Fischer Serbuk Alga

Replikasi

Sargassum polycystum C. Agardh

1 2 3

Bobot yang ditimbang (mg) 1999,5 1999,7 2001,2

Hasil / angka yang di alat (%) 0,1714 0,1205 0,1476

Kadar air (%)

Kadar air rata-rata (%)

6,83 4,28 5,63

Drift = 109 Blanko Berat air + spuit = 8,6898 g Berat spuit + sisa air = 8,6694 g Air yang dimasukkan = 0,0204 g Angka di alat = 0,0349 % Kadar air

=

0,0349 x 10.000 x 1 mg 100

= 3,49 mg Keterangan : 10.000 adalah angka untuk konversi perhitungan blanko dan sampel agar didapat angka yang mempermudah perhitungan

Replikasi I Penimbangan = 1999, 5 mg 0,1714 x 10.000 x 1 mg = 17,14 mg 100

Kadar air =

(17,14 − 3,49) x 10 x 100 % = 6,8267 % 1999,5

5,58


Replikasi II Penimbangan = 1999,7 mg 0,1205 x 10.000 x 1 mg = 12,05 mg 100

Kadar air =

(12,05 − 3,49) x 10 x 100 % = 4,2806 % 1999,7

Replikasi III Penimbangan = 2001,2 mg 0,1476 x 10.000 x 1 mg = 14,76 mg 100

Kadar air =

(14,76 − 3,49) x 10 x 100 % = 5,6316 % 2001,2

58


59

Lampiran 3. Foto penapisan fitokomia alga Sargassum polycystum C. Agardh

A

B

C

D

Keterangan: A = Ekstrak alga + 1% gelatin B = Ekstrak alga + 1% gelatin + 10% NaCl C = Ekstrak alga + FeCl3 D = kontrol. Lampiran 4. Hasil penapisan fitokimia serbuk alga Sargassum polycystum C.Agardh Ekstrak alga + 1% gelatin Æ positif jika memberikan endapan Ekstrak alga + 1% gelatin + 10% NaCl Æ positif jika memberikan endapan Ekstrak alga + FeCl3 Æ positif jika berwarna kebiruan atau hitam kehijauan Serbuk Sargassum polycystum C. Agardh

1% Gelatin

1% Gelatin + 10% NaCl

FeCl3

+ (coklat tua jernih dengan sedikit endapan)

+ (coklat tua jernih dengan sedikit endapan)

+ (coklat tua pekat dengan sedikit endapan)

Kontrol Coklat jernih


Lampiran 5. Foto hasil fraksinasi

A

B

Keterangan : A : Fraksi metanol-air (bawah) dan fraksi etil asetat (atas) ke-I B : Fraksi metanol-air (bawah) dan fraksi etil asetat (atas) ke-II

60


61

Absorbance

Lampiran 6. Spektra operating time (OT)

Time (min)

Lampiran 7. Spektra scanning panjang gelombang maksimum (λ maks) pada tiga konsentrasi (1,0 ppm;3,0 ppm,6,0 ppm)

Wavelength (nm)

Absorbance unit (au)


62

Lampiran 8. Hasil scanning panjang gelombang maksimum (λ maks) pada konsentrasi 1,0 ppm



63


Lampiran 11. Penimbangan baku phlorogucinol Replikasi I Berat kertas + zat

= 0,45148 g

Berat kertas + sisa

= 0,40029 g

Zat

= 0,05119 g

Replikasi II Berat kertas + zat

= 0,44832 g

Berat kertas + sisa

= 0,39604 g

Zat

= 0,05228 g

Replikasi III Berat kertas + zat

= 0,44613 g

Berat kertas + sisa

= 0,39533 g

Zat

= 0,05080 g


Lampiran 12. Contoh perhitungan baku phloroglucinol Replikasi I Baku = 0,05119 g = 51,19 mg/50 mL = 102,38 mg/ 100 mL = 1,0238 mg/mL Konsentrasi 1 = 0,5 mL x 1,0238 x

1 0,5 x x 103 ppm = 0,5119 ppm 10 50

Konsentrasi 2 = 1,0 mL x 1,0238 x

1 0,5 x x 103 ppm = 1,0238 ppm 10 50


1 0,5 x x 103 ppm = 2,0476 ppm 10 50


1 0,5 x x 103 ppm = 3,0714 ppm 10 50


1 0,5 x x 103 ppm = 4,0952 ppm 10 50


1 0,5 x x 103 ppm = 5,1190 ppm 10 50


1 0,5 x x 103 ppm = 6,1428 ppm 10 50

64


65

Lampiran 13. Hasil pembacaan baku phloroglucinol replikasi pertama pada panjang gelombang hasil scanning Konsentrasi (ppm) 1,0238 2,0476 3,0714 4,0952 5,1190 6,1428 A B r

Panjang gelombang (nm) 746,5 750,1 0,137 0,138 0,269 0,269 0,403 0,405 0,518 0,516 0,649 0,648 0,767 0,768 0,014 0,015 0,123 0,123 0,9998 0,9998

729,1 0,135 0,266 0,401 0,516 0,650 0,774 0,000640 0,125 0,9999

765,8 0,139 0,267 0,401 0,512 0,641 0,755 0,01946 0,121 0,9998

Lampiran 14. Kurva baku phloroglucinol

0.9 0.8 0.7

Absorbansi

0.6 0.5

y = 1,2274x + 0,0175 r = 0,9997

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Konsentrasi baku phloroglucinol (mg/100 ml)

0.8


Lampiran 15. Data penimbangan sampel Replikasi 1 15,8584 15,9083 15,91057 15,86049 0,05008

Wadah Wadah + zat Wadah + zat Wadah + sisa Zat

Replikasi 2 16,3010 16,3510 16,35324 16,30296 0,05028

Replikasi 3 15,4555 15,5056 15,50727 15,456909 0,05037

Lampiran 16. Absorbansi sampel Sampel Sargassum polycystum C Agardh Replikasi I 1 2 Replikasi II 1 2 Replikasi III 1 2

Absorbansi 0,183 0,192 0,200 0,188 0,179 0,193

Lampiran 17. Contoh perhitungan kadar sampel Replikasi I duplo 1 Absorbansi = 0,183 Persamaan regresi linear = y = 0,12274x + 0,0175 0,183 = 0,12274x + 0,0175 x = 1,34838 ppm Kadar polifenol =

50 x 1,34838 ppm = 6, 7419 ppm 10

Kadar polifenol dalam 50 mL = 6,7419 ppm = 33,7095 x 10-5 g

33,7095 x10 −5 = x 100% b/b = 0,6731 % b/b = 6,731 mg PE/g sampel 0,05008

66


67

Lampiran 18. Data kadar phlorotannin pada sampel Sargassum polycystum C. Agardh Sampel Sargassum polycystum C. Kadar Agardh phlorotannin 1 6,73 Replikasi I 2 7,10 1 7,39 Replikasi II 2 6,91 1 6,52 Replikasi III 2 7,10 Rata-rata kadar phlorotannin dalam sampel

Rata-rata kadar 6,92 7,15 6,81 6,96


BIOGRAFI PENULIS Dewi Riana Primawati, penulis skripsi berjudul “Penetapan Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum polycystum C. Agardh dengan Metode Folin-Ciocalteau”, lahir di Dili pada tanggal 3 Desember 1986. Penulis adalah putri dari Bapak Stephanus Priyo Sambodo dan Ibu Maria

Magdalena

Herli

Kristanti.

Penulis

menyelesaikan pendidikan di TK Ratu Damai, Dili pada tahun 1992, S.D. Kanisius Condongcatur pada tahun 1998, SLTP Negeri 1 Depok, Yogyakarta pada tahun 2001, dan SMU Negeri 6 Yogyakarta pada tahun 2004. Penulis melanjutkan studi di program S1 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis pernah menjadi asisten dosen untuk mata kuliah Praktikum Farmakognosi Fitokimia II pada semester genap 2006-2007, Praktikum Spektroskopi dan Kimia Dasar pada semester ganjil 2007-2008. Penulis pernah menjabat sebagai anggota DDU pada kepanitiaan “Pharmacy Event Cup 2006”.

68

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents