PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM BUAH MELON (Cucumis melo L.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Florentina Silviana Devi NIM: 118114149

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 2015


VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM BUAH MELON (Cucumis melo L.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Florentina Silviana Devi NIM: 118114149

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 2015

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

“ Hidup untuk bermimpi, Hidup untuk berusaha, Hidup untuk bersyukur dan kembalilah pada sebuah mimpi, usaha dan syukur”

Karya ini kudedikasikan untuk orang tua, keluarga, teman-teman dan almamaterku Universitas Sanata Dharma.

iv


v


vi


PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan atas berkat karunia yang telah dilimpahkan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM BUAH MELON (Cucumis melo L.)” sebagai tugas akhir untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.). Selama pelaksanaan penelitian penulis mendapatkan banyak dukungan motivasi, bantuan arahan, bimbingan, kritik, saran dan doa dari berbagai pihak. Maka dari itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih, terutama kepada: 1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku pembimbing utama skripsi yang telah memberikan bimbingan, arahan, kritik, saran, doa, semangat motivasi, dan bantuan lainnya sejak awal hingga akhir penelitian. 2. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, Selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 3. Jeffry Julianus, M.Si dan F. Dika Octa riswanto, M.Sc., selaku dosen penguji yang memberikan kritik dan saran untuk membangun skripsi ini. 4. Sanjayadi M.Si., yang telah banyak memberikan arahan, bimbingan, kritik, saran, doa, membantu dalam optimasi kesesuaian sistem GC-ECD yang digunakan serta memberi semangat motivasi dan dukungan sejak awal hingga akhir penelitian. 5. Nina setiawati, M.Sc., Apt. selaku kepala laboratorium Universitas Sanata Dharma yang memberikan perijinan untuk menggunakan laboratorium.

vii


6. Seluruh dosen dan karyawan fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma atas bantuan selama proses pembelajaran menempuh jenjang S1 Farmasi. 7. Bapak Lukas Sumari dan mamak Katarina Katrin selaku orang tua yang selalu mendoakan, mendukung, dan memberi motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan program studi S1 farmasi. 8. Agnes Reka Wati, Stevanus midut, mamak Sri, Biyung, Pakpoh, selaku keluarga penulis yang selalu mendoakan dan memberi motivasi hingga penulis menyelesaikan studi S1 Farmasi. 9. Serlika Rostiana, Rizki Seviana, Rushadi Jatmiko, selaku tim skripsi yang selalu memberikan pengertian, kerja sama, motivasi, dukungan, bantuan doa, dalam proses penyelesaian skripsi. 10. Mas Bimo, Pak Kethul, Pak Mus, Pak Parlan, Pak Kunto, seluruh staf laboratorium Universitas Sanata Dharma dan staf keamanan serta kebersihan Universitas Santa Dharma. 11. Teman-teman FSM-D dan FST-B 2011 selaku teman-teman kelas yang telah memberikan banyak kesan kenangan dan pengalaman selama empat tahun ini. 12. Seluruh pihak yang mungkin tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi. 13. Mas bebek, Mas Enggal, dan pak Bantul selaku pemilik ladang melon yang membantu mengurus melon sebagai subjek uji dalam penelitian hingga panen.

viii


ix


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL.......................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................... v HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................... vi PRAKATA ...................................................................................................... vii DAFTAR ISI ..................................................................................................... x DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xvii INTISARI..................................................................................................... xviii ABSTRACT ......................................................................................................xix BAB I PENGANTAR ....................................................................................... 1

x


A. Latar Belakang ........................................................................................... 1 1. Permasalahan ........................................................................................ 4 2. Keaslian Penelitian ................................................................................ 4 3. Manfaat Penelitian ................................................................................ 4 B. Tujuan Penelitian ........................................................................................ 5 Bab II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................. 6 A. Difenokonazol ............................................................................................. 6 1. Sifat Fisika Kimia ................................................................................. 7 2. Toksisitas ............................................................................................. 8 B. Kandungan Buah Melon ........................................................................... 10 C. Solid Phase Extraction (SPE) ................................................................... 12 D. Ekstraksi .................................................................................................... 14 E. Gas Chromatography (GC) ...................................................................... 17 1. Pengertian ............................................................................................ 17 2. Prinsip pemisahan ............................................................................... 19 3. Kinerja GC .......................................................................................... 20 4. Instrumentasi ...................................................................................... 22 F. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 29 1. Akurasi ............................................................................................... 30 2. Presisi ................................................................................................. 30 3. Linearitas dan rentang ......................................................................... 31

xi


4. Limit of Quantitation (LOQ) ............................................................... 31 G. Metode Kuantifikasi .................................................................................. 31 1. Metode standar eksternal..................................................................... 32 2. Metode standar internal ....................................................................... 32 3. Metode standar adisi ........................................................................... 33 H. Landasan Teori .......................................................................................... 34 I. Hipotesis.................................................................................................... 35 BAB III METODE PENELITIAN.................................................................. 38 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................ 38 B. Variabel Penelitian .................................................................................... 38 1. Variabel bebas ..................................................................................... 38 2. Variabel tergantung ............................................................................. 38 3. Variabel pengacau terkendali .............................................................. 39 C. Definisi Operasional.................................................................................. 39 D. Bahan Penelitian........................................................................................ 40 E. Alat Penelitian ........................................................................................... 41 F. Tata Cara Penelitian .................................................................................. 41 1. Uji kesesuaian sistem GC-ECD .......................................................... 41 2. Preparasi sampel dengan metode QUeChERS .................................... 42 3. Pembuatan seri larutan baku Difenokonazol....................................... 42 4. Optimasi clean-up SPE C18 ................................................................. 43

xii


5. Validasi metode analisis ...................................................................... 47 G. Analisis Hasil ............................................................................................ 50 H. Rancangan Penelitian ................................................................................ 55 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 65 A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD............................................................... 66 1. Optimasi instrument GC-ECD ............................................................ 66 2. Kinerja instrument GC-ECD ............................................................... 67 B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS ........................................ 77 C. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 87 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 100 A. Kesimpulan ............................................................................................ 100 B. Saran ........................................................................................................ 101 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 102 LAMPIRAN .................................................................................................. 106 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 120

xiii


DAFTAR TABEL Tabel I. Kandungan dan Komposisi Gizi Buah Melon Tiap 100 gram ........... 10 Tabel II. Kriteria Validasi ................................................................................. 30 Tabel III. Hasil Optimasi Kondisi GC ............................................................ 67 Tabel IV. Nilai Rata-rata N, Rs, danTF Puncak Difenokonazol Kurva Baku Solven .......................................................................................................... 69 Tabel V.Nilai %RSD Kurva Baku Solven ....................................................... 71 Tabel VI. Uji Sensitivitas .................................................................................. 74 Tabel VII. Nilai Response Factor ..................................................................... 75 Tabel VIII. Nilai %D......................................................................................... 77 Tabel IX. Kadar Air Buah dalam Melon ........................................................... 78 Tabel X. Hasil Optimasi Lama Sentrifugasi ..................................................... 80 Tabel XI. Penentuan Kapasitas SPE (Sigmaaldrich) ....................................... 83 Tabel XII. Optimasi Penentuan Kapasitas SPE C18 .......................................... 83 Tabel XIII. Nilai % Recovery Hasil Optimasi Kelayakan Penggunaan SPE Berulang .......................................................................................................... 86 Tabel XIV. Hasil Optimasi Clean-up SPE C18 ................................................. 87 xiv


Tabel XV. Nilai %Recovery Metode Adisi C .................................................. 89 Tabel XVI. Nilai SD, Dan %RSD Metode Adisi C .......................................... 90 Tabel XVII. Nilai %Recovery Metode Adisi B ............................................... 90 Tabel XVIII. Nilai SD, Dan %RSD Metode Adisi B ....................................... 90 Tabel XIX. Nilai %Recovery, SD,Dan %RSD Metode Adisi A...................... 91 Tabel XX. Nilai N, Rs, TF Dan Tr Dari Kurva Adisi ....................................... 95 Tabel XXI. Hasil % Recovery pada Kisaran 0,263-0,789 ng............................ 95 Tabel XXII. Hasil %RSD sebagai Presisi Kurva Adisi .................................... 96

xv


DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur Difenokonazol ..................................................................... 7 Gambar 2. Proses Skematik Prosedur Spe ........................................................ 12 Gambar 3. Diagram Skematik Kromatografi Gas ............................................. 22 Gambar 4. Struktur Difenokonazol ................................................................... 66 Gambar 5. Kromatogram Difenokonazol dalam Pelarut Heksan...................... 68 Gambar 6. Kurva Baku Solvent antara Luas Puncak Difenokonazol/DCB vs Kadar Difenokonazol ................................................................................. 73 Gambar 7. Luas Puncak Difenokonazol yang Diperoleh dari Hasil Fraksinasi setelah Washing dengan 5% Meoh Vs 100% UPW .................................. 84 Gambar 8. Luas Puncak Difenokonazol Hasil Elusi Difenokonazol dalam SPE C18 per mL metanol ......................................................................................... 85 Gambar 9.Linearitas Kurva Adisi ..................................................................... 93 Gambar 10. Kromatogram Kurva Adisi ............................................................ 94

xvi


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Perhitungan Resolusi (Rs) .............................................................. 105 Lampiran 2. Perhitungan IDL & IQL ................................................................ 106 Lampiran 3. Certificate Of Analysis DCB .......................................................... 109 Lampiran 4. Certificate Of Analysis Asetonitril ................................................. 110 Lampiran 5. Certificate Of Analysis Heksan....................................................... 111 Lampiran 6. Certificate Of Analysis Metanol ..................................................... 112 Lampiran 7. Certificate Of Analysis MgSO4 ................................................................................. 114 Lampiran 8. Certificate Of Analysis Na2Hsitrat .................................................. 115 Lampiran 9. Certificate Of Analysis Na3Sitrat .................................................... 116 Lampiran 10. Certificate Of Analysis NaCl ........................................................ 117 Lampiran 11. Certificate Of Analysis Formulasi Difenokonazol Donasi dari PT.Syngenta ................................................................................ 118

xvii


INTISARI Kondisi iklim tropis Indonesia yang panas dan lembab memicu perkembangan dan penyebaran jamur antaknosa (Colletotrichum gloesporioides) menyebakan kerusakan pada buah melon (Cucumis melo L.). Untuk mengontrol jamur antraknosa, para petani menggunakan difenokonazol. Oleh karena itu, untuk menjamin konsumen, tingkat residue difenokonazol yang tertinggal dalam melon diawasi. Tujuan dari studi ini adalah menvalidasi metode analisis untuk residu difenokonazol dalam buah melon, agar metode ini dapat diterapkan untuk analisis residu pestisida di laboratorium Indonesia. Proses ektraksi pada pengembangan metode ini dibantu dnegan metode LLE dari QuEChERS, dimana proses cleanup menggunakan SPE C18 dan determinasi menggunakan GC-ECD serta kuantifikasi standar internal menggunakan dekaklorobifenil (DCB). Performa kerja GC-ECD menunjukan presisi dari rasio area, waktu retensi <20%, ketika integritas standar menujukan RSD dari response factor dan %difference <20%. Range linearitaspada konsentrasi 0,053-0,526 ng dengan r 0,890 - 0,999, Instrumental Detection Limit (IDL) 0,01-0,07 ng/ml dan Instrumental Quantitation Limit (IQL) 1,06 ng/g . Recovery fortifikasi sampel ekstrak blank pada konsentrasi 0,158-0,684 ng sebesar 86-91 % dan tidak ada efek matrik secara signifikan. Kesalahan pada tahap ekstraksi, cleanup dan determinasi secara berturutturut 0,133%, 8,753%, dan 8,670%. Recovery fortifikasi sampel pada 0,158-0,684ng sebesar 71-115% . LOQ sebesar 0,002 g/g dan LLMV 7,364 ng/g, oleh karena itu metode ini sesuai untuk mengawasi kadar residu difenokonazol dalam buah melon, yang memiliki Batas Maksimum Residu (BMR) sebesar 0,7 mg/kg. Kata kunci : Difenokonazol, Residu pestisida, Amistartop, QuEChERS, Solid Phase Extraxtion, GC-ECD , Validasi Metode.

xviii


ABSTRACT Indonesian tropical climate which is warm and humid promote the development and spread antrachnose (Colletotrichum gloesporioides) causing significant damage in melon (Cucumis melo L.). To control the antracmose, farmers used difenoconazole. For that reason, to assure the safety of the consumer, the level of difenoconazole residue in melon should be monitored. The purpose of this study is to develop a valid analytical method for difenoconazole residue in melon can be done in common pesticide residue laboratory in Indonesia. The extraction process of the development method was done following the assisted LLE method of the QuEChERS, while the clean-up process was done using C18 SPE catridge and determinate by GC-ECD and quantified by internal standardization using decachlorobiphenyl (DCB) as internal standard. The performance of the GC-ECD shows precision of ratio area, retention time less than 20%, while the standard integrity shows RSD of the response factor and %difference <20%. Linearity range was 0,053-0,526 ng with r 0,890-0,999,. Instrumental detection Limit (IDL) was 0,01-0,07 ng/ml and Instrumental Quantitation Limit (IQL) was 1,06 ng/g, Recovery of fortified blank extract at 0,158-0,684 ng was 8691% and no matrix effect was observed. The error at extraction step, cleanup step and determination step were 0,133%, 8,753%, and 8,670 % respectively. The recovery of Fortified sample at 0,158–0,684 ng was 71-115%. The LOQ was 0,002 g/g and the LLMV 7,364 ng/g, therefore this method is fit for monitoring difenoconazole residue in melon, which has Maximum Residue Limit (MRL) of 0.7 mg/kg. Key words: Difenokonazol, Pesticide residue, Amistartop, QuEChERS, Solid Phase Extraxtion, GC-ECD, method validation

xix


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Indonesia merupakan negara agraris, Sebagian besar penduduk Indonesia bermata pencaharian sebagai petani. Budidaya tanaman hortikultura yang meliputi sayuran dan buah-buahan semakin banyak diminati petani, karena komoditas ini mampu memberikan keuntungan lebih tinggi dibandingkan padi dan palawija dalam luas area tanam yang sama. Salah satu komoditas hortikultura yang dimaksud adalah tanaman melon (Samadi,2007). Melon merupakan salah satu buah yang ekslusif, yang telah memasyarakat. Melon banyak dibudidayakan di Bogor, Lampung, Jakarta, Jawa Barat, Yogyakarta, Jawa Tengah (seperti Sukoharjo, Surakarta, Sragen, Karanganyar dan Klaten), dan Jawa Timur (Malang, Ngawi, Walikukun, Kedung Galar, Ngrambe, Pacitan, Madiun). Buah ini sangat digemari, terutama apabila dihidangkan sebagai buah segar. Di dalam perusahaan makanan dan minuman, melon sering kali dimanfaatkan sebagai bahan penyedap rasa untuk memberikan aroma segar yang khas dari buah melon. Selain itu saat ini sedang gencar mengenai ekspor buah tropis. Pasar ekspor dunia menuntut pengadaan buah-buah tropis untuk memenuhi kebutuhan konsumen. Salah satu buah tropis yang dimaksud adalah melon. Namun ekspor ini terganggu dengan

1


2

pengadaan buah melon, karena adanya kendala-kendala dalam budidaya buah melon. Saat ini Indonesia hanya mampu mengekspor buah melon satu bulan sekali. Iklim tropis di Indonesia menyebabkan budidaya melon tidak terlepas dari adanya kendala serangan hama penyakit terutama karena jamur antraknosa. Adanya serangan hama penyakit yang berat dapat menurunkan produktivitas tanaman, bahkan menyebabkan gagal panen. Oleh karena itu, perlu dilakukan usaha pengendalian pemberantasan hama dan penyakit. Pengendalian dan pemberantasan fungi umumnya menggunakan fungisida yang berlebihan sehingga dapat membahayakan kesehatan konsumen. Sehingga untuk melindungi kesehatan konsumen nasional dan internasional perlu diadakan pengawasan terhadap kadar fungisida agar tidak melebihi kadar maksimum yang diperbolehkan (Sudarmo,1999). Fungisida adalah bahan kimia yang dipergunakan untuk membunuh dan menghentikan perkembangan jamur. Fungisida yang popular digunakan oleh petani saat ini adalah AMISTARTOP Azoxystrobin 200 g/L dan Difenokonazol 125 g/L. Penggunaannya menurut INDOGAP sesuai label adalah maksimum tiga kali aplikasi dengan konsentrasi 0,5 mL/L. Komposisi fungisida terdiri dari dua bahan zat atau senyawa kimia yaitu difenokonazol dan azoxystrobin. Difenokonazol merupakan bahan aktif fungisida golongan tiga yang menghambat pertumbuhan mycelia, dimana pertumbuhan jamur/fungi menjadi lambat atau berhenti dan efektif untuk mencegah infeksi selanjutnya atau invasi dari jaringan-jaringan host. Penggunaan dan aplikasi fungisida pada tanaman akan meninggalkan sisa-sisa fungsida yang disebut dengan


3

residu pestisida. Residu fungisida difenokonazol dengan kadar tertentu pada tanaman dapat membahayakan kesehatan dan lingkungan sekitar. Oleh karena itu untuk menjamin bahwa melon asal Indonesia layak konsumsi tanpa adanya dampak negatif dari residu pestisida perlu dilakukan analisis dengan metode analisis yang valid. Analisis penetapan kadar residu pestisida dengan kadar yang kecil pada buah melon, diperlukan suatu pengembangan metode yang selektif dan sensitif. Dalam beberapa tahun terakhir ini, salah satu metode analisis baku yang sering digunakan untuk menganalisis residu pestisida adalah metode baku AOAC 2007.01 yaitu analisis multiresidu dengan dasar QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) yang dalam ekstraksinya menggunakan asetonitril, clean-up sampel cukup dilakukan dengan dispersive Solid Phase Extraction (d-SPE) kemudian dideterminasi dengan LC/MS/MS. Analisis dengan LC/MS/MS menjadi kendala bagi para analisis residu pestisida di Indonesia. Pada umumnya laboratorium analisisis di Indonesia tidak memiliki instrumen

tersebut, begitu juga metode residu

difenokonazol pada matriks buah melon belum tersedia. Oleh karena itu untuk mengatasi masalah tersebut diperlukan suatu modifikasi metode dengan instrumen yang mudah ditemui tanpa mengurangi selektifitas dan sensitifitas. Pada penelitian ini modifikasi QuEChERS dilakukan dengan kromatografi Gas (GC) yang dilengkapi detektor penangkap elektron (ECD) yang kurang spesifik jika dibandingkan dengan LC MS/MS. Perlu adanya penyesuaian terutama pada tahap clean-up yang dilanjutkan dengan validasi penuh menggunakan matriks buah melon.


4

1. Permasalahan Dari uraian masalah di atas, dapat disampaikan perumusan masalah : a. Apakah instrumen GC-ECD (electron Capture Detector/ECD) sesuai untuk penetapan kadar residu difenokonazol dalam matriks buah melon? b. Bagaimana proses validasi metode analisis modifikasi QuEChERS

untuk

analisis residu difenokonazol dalam matriks buah melon? c. Bagaimana optimasi proses ekstraksi dan clean-up residu difenokonazol dalam matriks buah melon dengan SPE? 2. Keaslian penelitian Sampai saat ini belum ada penelitian mengenai “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol dalam Buah Melon (Cucumis melo L.)”. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat metodologis.Penelitian ini dapat memberikan pengetahuan tambahan terhadap perkembangan metode QuEChERS dalam analisis residu fungisida difenokonazol dengan menggunakan Gas Chromatography (GC) pada sampel buah melon. b. Manfaat praktis. Penelitian ini dapat digunakan sebagai prosedur analisis penetapan kadar residu fungisida difenokonazol dalam buah melon dengan hasil yang akurat dengan menggunakan Gas Chromatography Electron Capture Detector (GC-ECD).


5

B. Tujuan Penelitian Tujuan umum dari penelitian ini adalah 1. Mengembangkan metode QuEChERS dalam analisis penetapan kadar residu fungisida difenokonazol dalam buah melon hingga didapatkan hasil yang valid. 2. Mampu melakukan validasi metode analisis residu difenokonazol pada buah melon (Cucumis melo L.) dengan instrumen Gas Chromatography Electron Capture Detector (GC-ECD). Tujuan khusus penelitian ini adalah : 1. Mengetahui proses ekstraksi QuEChERS serta pelarut yang cocok untuk

mencari difenokonazol dari buah melon ( Cucumis melo L.). 2. Mendapatkan komposisi fase diam dan fase gerak optimum pada proses

clean-up menggunakan SPE C18. 3. Mampu menetapkan kadar residu pestisida difenokonazol dengan kondisi

Gas Chromatography Electron Capture Detector (GC-ECD) yang optimal.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Difenokonazol Difenokonazol merupakan fungisida spektrum luas yang digunakan untuk berbagai penyakit pada berbagai buah, sayur, sereal dan tanaman lainnya. Fungisida difenokonazol termasuk golongan fungisida triazol yang bekerja secara sistemik dan memiliki daya preventif dan kuratif. Difenokonazol bekerja menghambat demetilasi selama

sintesis

ergosterol

sehingga

menghentikan

perkembangan

jamur.

Difenokonazol merupakan molekul yang berpotensi dapat bergerak, tidak mudah untuk dicuci karena kelarutan dalam air rendah. Difenokonazol tidak volatil, persisten di dalam tanah dan pada lingkungan akuatik (Anonim1, 2015). Nama umum

: difenokonazol

Sinonim

: CGA 169374

Nama IUPAC

:1-[2-[2-chloro-4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-4methyl[1,3]dioxolan-2-ylmethyl]-1H-1,2,4-triazole

Rumus molekul

: C19H17Cl2N3O3

Massa molekul

:406,3

6


7

Rumus struktur (terdapat dua cincin karbon kiral pada struktur difenokonazol yang menghasilkan diastereoisomer pasangan cis-trans) :

Gambar 1. Struktur Difenokonazol (EFSA, 2011). 1. Sifat Fisika Kimia Bentuk fisik

: putih, tidak berbau, bubuk Kristal halus

Titik lebur

: 82-83 ºC

Titik didih

: 100,8 ºC pada 3,7 mPa

Suhu dekomposisi

: 337 ºC

Kepadatan relatif

: 1,39 pada 22 ºC

Tekanan uap

: 3,32 × 10-8 Pa pada 25 ºC

Kelarutan di dalam air

: 15 mg/L pada 25 ºC

Log Pow (koefisien partisi)

: 4,4 pada 25 ºC

Konstanta disosiasi dalam pKa

: 1,1 pada 20 ºC

Konstanta Henry‟s law

: 9,0 × 10-7 Pa m3 mol-1 pada 25 ºC

Kelarutan dalam pelarut organic : Aseton

> 500 g/L

Diklorometan

> 500 g/L

Etil asetat

> 500 g/L


Hexan

3,0 g/L

Metanol

> 500 g/L

Oktanol

110 g/L

Toluen

> 500 g/L

8

(EFSA, 2011). 2. Toksisitas Toksisitas Akut LD50 oral pada tikus

: 1453 mg/kg bb

LD50 oral pada mencit

: > 2000 mg/kg bb

LD50 dermal pada kelinci : > 2010 mg/kg bb LD50 inhalasi pada tikus : > 3,3 mg/L (4 jam paparan) Iritasi kulit

: tidak iritasi

Iritasi mata

: tidak iritasi

Toksisitas Jangka Pendek Target/Efek

: Tikus : penurunan berat badan dan jantung, penurunan nafsu makan dan minum, liver (pada dosis tinggi setelah paparan secara oral), liver dan tiroid setalah paparan secara dermal Mencit : penurunan berat badan, penurunan berat indung telur, liver (pembesaran dan peningkatan berat, vakuolisasi dan koagulasi nekrosis)


9

Anjing : penurunan berat badan, liver (berat meningkat dan perubahan secara klinis), pembentukan katarak (pada dosis tinggi) NOAEL oral

: Rat : 20 mg/kgbb/d (90 hari) Mouse : 34 mg/kgbb/d (90 hari) Anjing : 31 mg/kgbb/d (28 minggu)

NOAEL dermal

: Rat : 100 mg/kgbb/d (28 hari)

Genotoksisitas

: difenokonazol mungkin menjadi genotoksik secara in vivo

Toksisitas Jangka Panjang dan Karsinogenisitas Target/Efek

: Rat : penurunan berat badan, liver (berat relative meningkat, hepatosit hipertropi) Tikus : penurunan berat badan, liver (berat meningkat, perubahan histopatologi termasuk nekrosis, hipertropi, perubahan lemak dan stasis empedu)

NOAEL

: Rat : 1,0 mg/kgbb/d (2 tahun) Tikus : 4,7 mg/kgbb/d (18 bulan)

Karsinogenisitas

: adenoma/karsinoma liver pada mice, hanya pada dosis tinggi, difenokonazol dianggap tidak menimbulkan resiko karsinogenik pada manusia.


10

Toksisitas Reproduksi Target/Efek

: Parental : menurunkan berat badan Keturunan : menurunkan berat badan melalui laktasi Reproduksi : tidak ada efek samping

NOAEL parental

: 16,8 mg/kgbb/d

NOAEL reproduksi

: 189 mg/kgbb/d

NOAEL keturunan

: 16,8 mg/kgbb/d

Toksisitas Perkembangan Target/Efek

: Perkembangan : variasi skeletal (rat), peningkatan jumlah resorpsi (rat,

rabbit)

Maternal : penurunan berat badan dan nafsu makan (rat, kelinci), aborsi dan kematian NOAEL maternal

: Rat : 15,6 mg/kg bb/d Kelinci : 25 mg/kgbb/d

NOAEL perkembangan

: Rat : 15,6 mg/kg bb/d Kelinci : 25 mg/kgbb/d

Neurotoksisitas Neurotoksisitas akut

: data tidak tersedia, tidak ada indikasi neurotoksik pada studi toksisitas akut

Neurotoksisitas berulang

: data tidak tersedia, tidak ada indikasi neurotoksik pada studi toksisitas akut

Neurotoksisitas tertunda

: data tidak tersedia.


11

B. Kandungan Buah Melon Kandungan gizi buah melon dapat dilihat pada Tabel. Tabel I. Kandungan dan Komposisi Gizi Buah Melon tiap 100 gram Komposisi Gizi

Banyaknya (Jumlah)

Energi

29 kcal.

Protein

0,50 gram

Lemak

0,10 gram

Karbohidrat

6,8 gram

Serat

0,70 gram

Abu

0,70 gram

Kalsium

6 mg

Fosfor

6 mg

Kalium

180,00 mg

Zat besi

0,18 mg

Natrium

11 mg

Thiamin

0,07 mg

Riboflavin

0,01 mg

Vitamin B6

0,07 mg

Vitamin C

8,0 mg

Niacin

0,40 mg

Air

91,0 gram (Roe, 2013).


12

C. Solid Phase Extraction (SPE) SPE C18 kolom digunakan untuk menyaring

komponen matriks sampel

nonpolar, terutama pigmen dari ekstrak sampel. Ketika suatu ekstrak yang dielusikan dengan asetonitril-air, aseton-air, atau asetonitril ke dalam kolom SPE C18, maka pigmen dan lipid yang bersifat non-polar akan tertahan didalam kolom. Dua strategi yang diterapkan dalam clean-up SPE untuk ekstrak sampel yaitu isolasi analit dan isolasi matriks. Pada isolasi analit, analit akan teradsorbsi dalam sorben SPE non polar. Kolom SPE dapat dibilas dengan larutan berair untuk menghilangkan campuran koekstraktan, diikuti elusi dari analit yang terjebak dalam kolom dengan pelarut organik. Analit pestisida dielusi melalui kolom. Strategi kedua isolasi matriks, strategi ini lebih banyak digunakan dalam clean-up residu pestisida. Pada umumnya prosedur clean-up dengan SPE isolasi matriks dirancang untuk menjebak komponen matriks dalam kolom dan mengelusi baik pestisida polar maupun non-polar melalui kolom.

Gambar 2. Proses Skematik prosedur SPE


13

GC merupakan suatu metode deteksi yang selektif terutama untuk determinasi pestisida. Sistem GC digunakan untuk skrining berbagai pestisida yang mengandung heteroatom seperti halogen, fosfor, sulfur dan nitrogen. Detektor sistem GC tidak hanya memiliki sensitivitas yang tinggi, tetapi juga memiliki spesifitas yang baik, oleh karena itu suatu clean-up sampel dipersyaratkan sebelum suatu sampel dideterminasi dengan GC. Pada metode QuEChERS, sampel diekstraksi dengan gojogan yang kuat dalam pelarut asetonitril. Magnesium sulfat dan NaCl ditambahkan dan kemudian gojog kuat dan di sentrifugasi. Aliquot yang menghasilkan supernatan kemudian di clean-up menggunakan dispersive SPE, dicampur dengan sorben SPE PSA dan MgSO4. Beberapa tipe kolom yang sering digunakan untuk clean-up dengan SPE yaitu C18, styrene-divivyl benzene (SDVB), aminopropyl (NH2) , primary secondary amine (PSA), trimethyl ammonium strong exchange (SAX), graphitized carbon black (GCB), florisil, silica, dan alumina. Analysis of pesticides in food and environmental sampel (Tadeo,2008) Ada empat tahapan dalam prosedur SPE yaitu a. Pengkondisian Kolom penjerap dialiri dengan menggunakan pelarut sampel untuk membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diinginkan ketika sampel diaplikasikan dapat dihindari. Penjerap nonpolar dan penjerap penukar ion dikondisikan menggunakan metanol kemudian akuades.


14

b. Retensi sampel. Sampel dalam pelarut organik dilewatkan ke catridge baik untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang diharapkan terelusi. c. Pembilasan. Seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi. d. Elusi. Tahap akhir dari penggunaan SPE untuk mengambil analit yang dituju jika analit tersebut tetahan pada penjerap (Gandjar dan Rohman, 2009). D. Ekstraksi Liquid-liquid Extraction (LLE) merupakan salah satu ekstraksi yang sering digunakan untuk memisahkan suatu analit dari komponen lain yang tidak diharapkan. LLE adalah suatu metode pemisahan dengan menggunakan 2 fase pelarut yang saling tidak bercampur dengan memperhatikan nilai P-nya. Metode ini digunakan dengan menggunakan tabung sentrifuge dimana hanya memerlukan sampel yang lebih sedikit (Cairns, 2004). Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel atau clean-up sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Di samping itu, ekstraksi pelarut juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada dalam sampel dengan jumlah kecil sehingga tidak memungkinkan atau menyulitkan untuk deteksi atau kuantifikasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).


15

Dalam bentuk paling sederhana, suatu alikuot larutan air digojog dengan pelarut organik yang tidak campur dengan air. Kebanyakan prosedur ekstraksi caircair melibatkan ekstraksi analit dari fase air ke dalam pelarut organik yang bersifat non polar atau agak polar seperti heksana, metilbenzen, atau diklorometan. Meskipun demikian, proses sebaliknya (ekstraksi analit dari pelarut organik non polar ke dalam air) juga mungkin terjadi (Gandjar dan Rohman, 2007). Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah molekulmolekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang bersifat non polar atau agak polar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar dan senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air (Gandjar dan Rohman, 2007). Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan bahwa “Pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur.” Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi (KD) dan dirumuskan sebagai berikut: KD = Keterangan: KD = koefisien partisi [S]org = konsentrasi analit dalam fase organik [S]aq = konsentrasi analit dalam fase air


16

Pada prakteknya, analit seringkali berada dalam bentuk kimia yang berbeda karena adanya disosiasi (ionisasi), protonasi, dan juga kompleksasi atau polimerasi karenanya ekspreksi yang lebih berguna adalah rasio distribusi atau rasio partisi (D). Persamaannya adalah sebagai berikut: D= Keterangan: D

= rasio partisi

(Cs)org = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase organik (Cs)aq = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase air Analit yang mempunyai rasio distribusi besar (104 atau lebih) akan mudah terekstraksi ke dalam pelarut organik meskipun proses kesetimbangan (yang) berarti 100% solut terekstraksi atau tertahan) tidak pernah terjadi (Gandjar dan Rohman, 2007). Kebanyakan ekstraksi dilakukan dengan menggunakan corong pisah dalam waktu beberapa menit. Akan tetapi untuk efektivitas ekstraksi analit dengan rasio distribusi yang kecil (< 1), ekstraksi hanya dapat dicapai dengan mengenakan pelarut baru pada larutan sampel secara terus menerus (Gandjar dan Rohman, 2007). Pelarut organik yang dipilih untuk ekstraksi pelarut adalah pelarut yang mempunyai kelarutan yang rendah dalam air (< 10%), dapat menguap sehingga memudahkan penghilangan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi, dan mempunyai kemurnian yang tinggi untuk meminimalkan adanya kontaminasi sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).


17

Beberapa masalah yang sering dijumpai ketika melakukan ekstraksi pelarut yaitu terbentuknya emulsi, analit terikat kuat pada partikulat, analit terserap oleh partikulat yang mungkin ada, analit terikat pada senyawa yang mempunyai berat molekul tinggi, dan adanya kelarutan analit secara bersama-sama dalam kedua fase. Terjadinya emulsi merupakan hal yang paling sering dijumpai. Oleh karena itu, jika emulsi antara kedua fase ini tidak dirusak maka recovery yang diperoleh kurang baik. Emulsi dapat dipecah dengan cara: a. Penambahan garam ke dalam fase air b. Pemanasan atau pendinginan corong pisah yang digunakan c. Penyaringan melalui glass-wool d. Penyaringan dengan menggunakan kertas saring e. Penambahan sedikit pelarut organik yang berbeda f. Sentrifugasi (Gandjar dan Rohman, 2007). E. Gas Chromatography( GC) 1. Pengertian Kromatografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang didasarkan pada perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu kromatografi gas dan kromatografi cair (McNair & Miller, 1998). Kromatografi gas adalah teknik pemisahan yang mana solut-solut yang mudah menguap dan stabil dengan pemanasan bermigrasi melalui kolom yang


18

mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya (Gandjar dan Rohman, 2007). Kromatografi gas pada dasarnya merupakan metode pemisahan yang tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa tanpa menggunakan baku pembanding. Optimasi kromatografi gas antara lain sensitivitas dan selekstivitas/spesifitas instrumen terhadap analit yang dianalisis. Polaritas dan volatilitas dari komponen yang akan dipisahkan menjadi pertimbangan untuk memilih fase diam yang cocok (Grob, 1995). Kromatografi Gas merupakan teknik analisis yang cepat, memiliki hasil yang baik untuk analisis pestisida multikomponen, memiliki sensitifitas tinggi dengan detektor yang spesifik (Nollet, 2004). Kromatografi gas dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi dari komponen yang kita analisis dengan waktu retensi zat baku pembanding (standar) pada kondisi analisis yang sama. Analisis kuantitatif diakukan dengan cara perhitungan relatif dari tinggi atau luas puncak kromatogram komponen yang dianalisis terhadap zat baku pembanding (standar) yang dianalisis (Johnson & Stevenson, 1991). Komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan diantara fase diam dan fase gerak. Suatu kromatografi gas yang baik terdiri dari komponen-komponen penting yaitu gas pembawa dan regulator tekanan,


19

injektor, kolom, oven, detektor, dan pencatat signal (Rouessac dan Annick 2007; Orejuela dan Silva, 2004). 2. Prinsip pemisahan Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detektor. Fase gerak dalam kromatografi gas juga biasa disebut sebagai gas pembawa. Syarat gas pembawa adalah tidak reaktif, dan murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada kromatografi gas, fase diam selalu ditempatkan di dalam sebuah kolom. Fase diam ini dapat berupa suatu padatan ( Kromatografi Gas-Padat/ Gas Solid Chromatography). Cara penyerapan komponen pada kromatografi gas padat merupakan proses adsorpsi pada permukaan, sedangkan Kromatografi Gas Cair dinamakan kromatografi partisi (Soeryadi,1997). Pemisahan pada kromatografi gas dapat dilakukan pada suhu tetap yang basanya disebut dengan pemisahan isotermal dan dapat dilakukan dengan menggunakan suhu yang berubah secara terkendali yang disebut dengan pemisahan suhu terprogram. Pemisahan isotermal paling baik dipakai pada analisis rutin atau jika kita mengetahui agak banyak sifat sampel yang akan dipisahkan. Pilihan awal pada pemisahan isotermal ini adalah suhu yang digunakan beberapa derajat di bawah titik didih komponen campuran utama.


20

Ada 2 hal yang perlu diperhatikan terkait dengan penggunaan pemisahan isotemal ini, yaitu: (1) terkait dengan pemilihan suhu. Jika suhu yang diguanakan terlalu tinggi maka komponen akan terelusi tanpa terpisah, sementara jika suhu terlalu rendah maka komponen yang bertitik didih tinggi akan keluar sangat lambat atau bahkan tetap dalam kolom sehingga akan mengacaukan proses kromatografi selanjutnya, dan (2) terkait dengan proses kromatografi, karena makin lama suatu sampel dalam kolom maka semakin lebar alas puncaknya. Kedua hal ini dapat diatasi jika digunakan pemisahan dengan suhu terprogram (Gandjar & Rohman,2007). Pemisahan dengan suhu terprogram mempunyai keuntungan, yakni mampu meningkatkan resolusi komponen-komponen dalam suatu campuran yang mempunyai titik didih pada kisaran yang luas. Disamping itu, pada suhu terprogram juga mampu mempercepat keseluruhan waktu analisis, karena senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi akan terelusi lebih cepat (Gandjar & Rohman,2007). 3. Kinerja GC Pemisahan yang terjadi pada analisis dengan kromatografi gas dipengaruhi oleh efisiensi kolom dan efisiensi pelarut. Efisiensi kolom menentukan pelebaran puncak kromatogram. Efisiensi kolom dapat diukur dengan menghitung jumlah lempeng teoritis (N) dan panjang kolom yang sesuai dengan plat teoritis (Height Equivalent to a Theoritical Plate, HETP). HETP adalah panjang kolom yang diperlukan untuk mencapai kesetimbangan


21

komponen cuplikan diantara fase gerak yang bergerak dan fase diam yang diam. Semakin banyak jumlah lempeng teoritis, semakin kecil HETP, maka efisiensi kolom meningkat dan pemisahan yang terjadi akan semakin baik ( Jennings, et all., 1987). Faktor ikutan didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak tepi muka sampai tepi belakang puncak dibagi dua kali jarak dari maksimum puncak sampai tepi muka puncak, jarak-jarak tersebut diukur pada titik yang ketinggiannya 5% dari tinggi puncak di atas garis dasar. Untuk suatu puncak yang simetris, factor ikutan (Tf) besarnya satu, dan besarnya harga Tf ini akan bertambah jika kromatogram semakin tambah berekor (Jennings, et all., 1987). Pemisahan yang sebenarnya dari dua puncak yang berurutan diukur dengan resolusi atau daya pisah. Resolusi merupakan suatu ukuran keefisienan kolom dan pelarut yang dapat menerangkan sempitnya puncak dan juga pemisahan antara dua maksimum puncak. Resolusi didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak dibagi dengan jumlah lebar masing-masing puncak dengan diukur dari alas puncak. Bila nilai resolusi adalah 1 maka kesempurnaan pemisahan dua puncak adalah 99,7%. Umumnya dalam praktek, nilai resolusi 1,0 tidak cukup baik karena derajat overlap. Pemisahan yang baik dicapai pada resolusi sekitar 1,5 atau lebih (Wittkowski & Matissek,1990). 4. Instrumentasi


22

Pada gambar dibawah ini dapat dilihat skematik dari komponen GC-ECD:

Gambar 3. Diagram skematik kromatografi gas (Nagel, 2004) 1. Gas pembawa. Fase gerak dalam kromatografi gas disebut gas pembawa dan harus murni dan inert secara kimia. Gas pembawa yang umumnya digunakan adalah helium, nitrogen, argon, dan hidrogen (Skoog, West, Holler,and Crouch, 2004). Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan jenis detektor yang digunakan. Gas pembawa untuk detektor ECD biasanya adalah N2 dengan kecepatan alir 30-60 mL/menit.Untuk setiap pemisahan dengan kromatografi gas terdapat kecepatan optimum gas pembawa yang tergantung pada diameter kolom. Kolom kapiler menggunakan kecepatan alir gas yang rendah, yakni antara 0,2 – 2 mL/menit. Karena kecepatan alir gas pembawa pada kolom kapiler sangat rendah, maka pada kebanyakan detektor ditambah gas tambahan yang ditambahkan ke dalam eluen setelah keluar dari kolom tetapi belum mencapai detektor. Gas tambahan umumnya sama dengan


23

gas pembawa, meskipun kadangkala digunakan helium. Gas pembawa bekerja paling efisien pada kecepatan alir tertentu. Gas nitrogen akan efisien jika digunakan dengan kecepatan alir ± 10 mL/menit, sementara helium akan efisien pada kecepatan alir 40 mL/menit (Gandjar dan Rohman, 2007). 2. Sample Injector. Ruang injektor atau inlet berfungsi untuk menghantarkan sampel ke dalam aliran gas pembawa. Sampel yang akan dikromatografi dimasukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik yang biasanya berupa lubang yang ditutupi dengan septum atau pemisah karet. Ruang suntik harus dipanaskan tersendiri (terpisah dari kolom) dan umumnya 10 – 15 ºC lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi seluruh sampel akan menguap segera setelah sampel disuntikkan (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada kolom kapiler, sampel yang diperlukan sangat sedikit bahkan sampai 0,01 μL, karenanya berbeda dengan kolom kemas yang memerlukan 1 –100 μL sampel. Karena pengukuran secara akurat sulit dilakukan jika sampel yang disuntikkan terlalu kecil (pada kolom kapiler), maka ditempuh suatu cara untuk mengecilkan ukuran sampel setelah penyuntikan. Salah satu cara yang dilakukan adalah dengan menggunakan teknik pemecah suntikan (split injection). Dengan menggunakan pemecah suntikan ini, sampel yang banyaknya diketahui, disuntikkan ke dalam aliran gas pembawa dan sebelum masuk ke kolom, gas pembawa ini dibagi menjadi 2 aliran. Satu aliran masuk ke dalam kolom dan satunya lagi akan dibuang. Aliran relatif dalam kedua aliran ini dikendalikan dengan sejenis penghambat seperti katup jarum pada


24

aliran yang dibuang. Laju alir di dalam kedua aliran diukur dan ditentukan nisbah (rasio) pemecahannya. Jika 1 μL sampel dimasukkan ke dalam pemecah aliran yang mempunyai nisbah pemecahan 1:100, maka sebanyak 0,01 μL sampel masuk ke dalam kolom dan sisanya akan dibuang (Gandjar dan Rohman, 2007). 3. Kolom. Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada kromatografi gas. Terdapat 2 jenis tipe kolom yang digunakan dalam gas kromatografi, yaitu kolom kemas dan kolom kapiler atau sering disebut open tubular columns. Dahulu, lebih banyak digunakan kolom kemas untuk melakukan analisis menggunakan gas kromatografi. Untuk aplikasi masa kini, kolom kemas digantikan dengan kolom kapiler karena lebih efisien dan lebih cepat (Skoog, West, Holler, and Crouch, 2004). Semakin sempit diameter kolom, maka efisiensi pemisahan kolom semakin besar atau puncak kromatogram yang dihasilkan semakin tajam. Pada umumnya, seorang analis akan memilih kolom dengan diameter 0,2 mm atau yang lebih kecil ketika menganalisis sampel dengan konsentrasi sekelumit atau ketika seorang analis akan memisahkan komponen yang sangat kompleks (Gandjar dan Rohman, 2007). Kolom kapiler terbuat dari silica (SiO2) dan dilapisi dengan polymide (plastik yang mampu menahan suhu 350 ºC). Pada bagian dalam terdapat rongga yang menyerupai pipa, oleh karena itu kolom kapiler juga disebut Open Tubular Columns. Fase diam melekat mengelilingi dinding dalam


25

kolom. Terdapat 4 macam jenis lapisan pada kolom kapiler ini, yaitu: WCOT (Wall Coated Open Tubular Column), SCOT (Support Coated Open Tubular Column), PLOT (Porous Layer Open Tubular Column), dan FSOT (Fused Silica Open Tubular Column). WCOT (Wall Coated Open Tubular Column) memiliki 0,1–5 μm lapisan tipis fase diam cair yang terdapat pada dinding bagian dalam kolom. SCOT (Support Coated Open Tubular Column) memiliki partikel solid yang dilapisi dengan fase diam cair yang terdapat pada bagian dalam dinding. Pada PLOT (Porous Layer Open Tubular Column) partikel padat sebagai fase diam aktif. Dengan besarnya luas area yang dimiliki, SCOT dapat menampung sampel lebih besar daripada WCOT. Performa SCOT berada diantara WCOT dan kolom kemas. Diameter dalam kolom kapiler memiliki ukuran 0,10 – 0,53 mm dengan panjang 15 sampai 100 m, umumnya adalah 30 m (Harris, 2010). Menurut Moffat, Osselton, and Widdop (2011) kolom kapiler menghasilkan resolusi, sensitivitas, daya tahan yang lebih baik daripada kolom kemas. Kolom kapiler sangat banyak dipakai atau lebih disukai oleh para ilmuwan. Salah satu penyebabnya adalah kemampuan kolom kapiler memberikan harga jumlah plat teori yang sangat besar (> 300.000 plat). Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE- 30; CPSIL-5) dan fenil 5%- metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL- 8). Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50% - metilpolisiloksan 50% (HP-17;


26

DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang polar adalah seperti polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M). Jenis fase diam akan menentukan urutan elusi komponen-komponen dalam campuran. Seorang analis harus memilih fase diam yang mampu memisahkan komponen-komponen dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Kolom kemas mengandung partikel padat berukuran halus yang dilapisi dengan fase diam cair yang dapat menguap. Dibandingkan dengan kolom kapiler, kolom kemas memiliki kapasitas sampel yang lebih besar tetapi menghasilkan puncak lebih lebar, waktu retensi lebih lama, dan resolusi yang lebih buruk. Kolom kemas umumya dibuat dari logam tahan karat atau gelas dengan diameter dalam 3–6 mm dan panjang 1 – 5 m (Harris, 2010). Efisiensi kolom akan meningkat dengan semakin bertambah halusnya partikel fase diam ini. Semakin kecil diameter partikel fase diam, maka efisiensinya akan meningkat. Ukuran partikel fase diam biasanya berkisar antara 60 – 80 mesh (250 – 170 μm) (Gandjar dan Rohman, 2007). 4. Detektor penangkap electron (Electron capture detector/ECD). Detektor penangkap elektron (ECD) merupakan detektor yang dilengkapi dengan sumber radioaktif titrium atau

63

Ni yang menghasilkan partikel-β. Partikel

radioaktif ini bertubrukan dan mengioniasi gas pembawa (make up) gas. Reaksi ini membentuk awan elektron yang stabil pada sel detektor ECD. Analit yang mempunyai gugus elektronegatif akan menangkap elektron bebas yang akan mengurangi jumlah elektron bebas pada awan elektron dalam sel


27

detektor ECD. Penangkapan elektron menyebabkan penurunan arus detektor (Grob, 1995). Bila fase gerak (gas pembawa N2) masuk ke dalam detektor maka sinar β akan mengionisasi molekul N2 menjadi ion-ion N2+ dan menghasilkan elektron (bebas) yang akan bergerak ke anoda dengan lambat. Dengan demikian, di dalam ruangan detektor terdapat semacam awan elektron bebas yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-elektron yang terkumpul pada anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline curent) yang steady dan memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila komponen sampel (senyawa dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak masuk ke ruang detektor yang dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan menangkap elektron sehingga membentuk ion molekul negatif. Ion molekul ini akan dibawa oleh fase gerak (carrier gas). Akibatnya setiap partikel negatif dibawa keluar detektor, berarti menyingkirkan satu elektron dari sistem sehingga arus listrik yang steady tadi akan berkurang. Pengurangan arus ini akan dicatat oleh rekorder sebagai puncak pada kromatogram ( Gandjar & Rohman, 2007). Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007).


28

Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector/ECD) menggunakan sumber radioaktif yaitu tritium (3H) atau nikel (63Ni) yang ditempatkan diantara dua elektroda. Tegangan listrik yang dipasang antara katoda dan anoda tidak terlalu tinggi, antara 2-100 volt. Dasar kerja detektor ini adalah penangkapan elektron oleh senyawa yang memiliki afinitas terhadap elektron bebas, yaitu senyawa yang mempunyai unsur-unsur elektronegatif (Gandjar danRohman, 2007). Bila fase gerak (gas pembawa N2) masuk ke dalam detektor maka sinar β akan mengionisasi molekul N2 menjadi ion dan menghasilkan elektron bebas yangakan bergerak ke anoda dengan lambat. Dengan demikian, di dalam ruangan detektor terdapat semacam awan elektron bebas yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-elektron yang terkumpul pada anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline current) yang steady dan memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila komponen sampel (senyawa dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak masuk ke dalam ruang detektor yang dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan menangkap elektron sehingga membentuk ion molekul negatif. Ion molekul ini akan dibawa oleh fase gerak (carrier gas). Akibatnya setiap partikel negatif dibawa keluar detektor, berarti menyingkirkan satu elektron dari sistem, sehingga arus listrik yang steady akan berkurang. Pengurangan arus ini akan dicatat oleh rekorder sebagai puncak pada kromatogram (Gandjar dan Rohman, 2007).


29

5. Oven.Pemilihan temperatur pada kromatografi gas tergantung pada beberapa faktor. Temperatur injeksi harus relatif tinggi yang memberikan kecepetan penguapan yang paling tinggi sehingga memberikan resolusi yang baik. Temperatur injeksi terlalu tinggi dapat menyebabkan karet septum menjadi rusak dan menyebabkan tempat injeksi menjadi kotor. Temperatur kolom berhubungan dengan kecepatan, sensitivitas, dan resolusi. Pada temperatur kolom yang tinggi, komponen sampel lebih banyak berada pada fase gas sehingga akan cepat terleusi tetapi resolusi nya menjadi buruk. Pada temperatur rendah, komponen sampel akan memiliki lebih banyak waktu untuk berada pada fase diam dan terelusi secara perlahan, resolusi menjadi meningkat tetapi sensitivitas menurun karena puncak yang dihasilkan akan melebar. Temperatur detektor harus cukup tinggi untuk mencegah kondensasi sampel (Christian, 2004). F. Validasi metode analisis Metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang dapat diterima dalam mendapatkan hasil analisis suatu sampel. Validasi merupakan proses verifikasi metode yang sesuai dengan tujuan analisis. Metode dapat berupa hasil pengembangan metode lain, yang didapat dari suatu literatur atau bahkan dari pihak ketiga lainnya. Suatu metode mungkin diadaptasikan atau dimodifikasi untuk dapat memenuhi persyaratan dan kemampuan dari sebuah laboratorium dan atau untuk tujuan metode yang akan digunakan. Beberapa garis besar kriteria


30

validasi metode residu fungisida menurut CCPR 2003 meliputi akurasi, presisi, kisaran linearitas, linearitas, dan IQL (CCPR,2003). Tabel II.Kriteria Validasi

a. Akurasi Akurasi merupakan kedekatan nilai antara hasil uji dan hasil referensi yang diketahui. Akurasi dapat ditetapkan dari hasil perolehan kembali (% recovery). Recovery merupakan fraksi atau persentase dari perolehan kembali suatu analit setelah ekstraksi dan analisis sampel kosong yang telah ditambahkan standar dengan konsentrasi yang diketahui (adisi menggunakan reference material). Suatu % recovery yang dikatakan memenuhi parameter validasi metode residu fungisida jika berada pada rentang 70 - 120% untuk kisaran konsentrasi > 0,01 mg/kg ≤ 0,1 mg/kg ( CCPR, 2014). b. Presisi Presisi adalah Kedekatan antara hasil uji yang diperoleh di bawah kondisi yang ditetapkan. Presisi dapat ditentukan dengan ≥ 3 replikasi pada ≥ 5 level. Presisi


31

dapat ditetapkan dengan melihat % RSD. Suatu metode dikatakan memiliki keterulangan yang baik jika % RSD < 20 % (CCPR,2003). c. Linearitas dan rentang Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004). Suatu linearitas metode analisis residu fungisida dapat dikatakan baik jika R2 ≥ 0,990 (CCPR,2003). d. Limit of Quantitation(LOQ) Konsentrasi terkecil analit yang dapat diukur. Umumnya didefinisikan sebagai konsentrasi minimum analit dalam sampel uji yang dapat ditentukan dengan presisi yang dapat diterima (pengulangan) dan akurasi di bawah kondisi yang dinyatakan dalam hasil uji. IQL yang dapat diterima harus kurang dari ½ MRL atau dibawah positive list sebesar 0.01 g/g (CCPR,2003). G. Metode kuantifikasi Metode kuantifikasi dan proses kalibrasi adalah sama digunakan pada suatu teknik instrumenal untuk analisis senyawa organik seperti contohnya pada instrumen kromatografi gas. Determinasi kuantitatif suatu komponen organik didasarkan pada perbandingan respon instrumental dari suatu senyawa yang tidak diketahui dengan kalibran. Kalibran disiapkan dengan standard reference yang diketahui memiliki kemurnian yang tinggi. Beberapa


32

pendekatan untuk kuantifikasi yaitu dengan menggunakan metode standar eksternal, metode standar internal dan metode standar adisi (Czichos, 2006). 1. Metode standar eksternal Metode standar eksternal merupakan metode yang digunakan untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel dengan menggunakan plot kalibrasi kurva baku eksternal. Larutan-larutan kurva baku eksternal disiapkan dan dianalisis secara terpisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan,selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi atau secara numeric (Rohman, 2009). 2. Metode standar internal Metode standar internal berdasarkan pada perbandingan respon relative

dari

analit

terhadap

respon

satu

atau

lebih

suatu

senyawa.Standar internal ditambahkan ke dalam sampel dan kalibran. Baku stndar internal merupakan senyawa yang berbeda dengan analit , meskipun demikian senyawa ini harus terpisah dengan baik selama proses pemisahan. Baku internal dapat menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel atau konsentrasi karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel


33

atau konsentrasi darena variasi instrumen.suatu baku internal digunakan jika suatu sampel memerlukan perlakuan sampel yang sangat signifikan. Perlakuan yang dimaksud adalah tahapan-tahapan yang meliputi derivatisasi, ekstraksi, filtrasi, dan sebagainya yang mengakibatkan sampel berkurang. Jika baku internal ditambahkan pada sampel sebelum dilakukan preparasi sampel, maka baku internal dapat menjadi faktor koreksi hilangnya sampel-sampel ini. Dalam penelitian ini baku internal yang digunakan adalah standar internal DCB karena preparasi pada metode ini melewati tahapan-tahapan ekstraksi yang cukup panjang. 3. Metode standar adisi Metode standar adisi didasarkan pada adisi suatu senyawa kalibran yang diketahui kuantitas atau konsentrasinya kemudian ditambahkan pada sampel yang tidak diketahui jumlah/konsentrasinya (dengan atau tanpa penambahan standar internal. Dengan menambahkan paling sedikit dua atau lebih alikuot standar, suatu kurva dapat disiapkan. Konsentrasi analit dalam sampel dapat ditentukan dengan ekstrapolasi kurva kalibrasi. Respon analit harus linier pada kisaran konsentrasi yang digunakan dalam kurva baku kalibrasi. Suatu pendekatan dalam standar adisi adalah dengan membagi sampel ke dalam beberapa bagian yang sama kemudian diadisi dengan konsentrasi standar adisi


34

yang meningkat. Selanjutnya dianalisis antara respon analit dengan konsentrasi yang diinjeksikan (Rohman,2009). H. Landasan Teori Difenokonazol merupakan fungisida yang sering digunakan oleh petani melon untuk mencegah dan mengatasi penyakit pada buah melon, terutama jamur/fungi antraknosa. mekanisme aksi difenokonazol adalah dengan menghambat demetilasi sintesis ergosterol. Menurut FAO/WHO pemaparan pestisida di lingkungan dan residu pestisida menganggu kesehatan masyarakat, sehingga ditetapkannya batas minimum residu (BMR) yang diperbolehkan ada dalam buah melon yaitu sebesar 0,7 mg/kg (CCPR,2014). Pada kenyataannya untuk memantau kadar residu difenokonazol yang berada dalam buah melon dianalisis menggunakan LC MS/MS. Pada penelitian ini determinasi dimodifikasi menggunakan GC-ECD. Suatu instrumen GC-ECD dinyatakan berada pada kondisi optimum ketika mampu memberikan kinerja efisiensi kolom, selektivitas, keajegan tR dan TF yang baik, demikian pula %RSD, RF, %D sesuai spesifikasi yang dipersyaratkan. Pada penelitian dilakukan ekstraksi difenokonazol dengan metode QuEChERS. Dilakukan clean-up dengan SPE C18 untuk memisahkan difenokonazol dari koekstraktan yang mengganggu. Proses clean-up bertujuan untuk memisahkan difenoconazol dari koekstraktan matriks sehingga saat determinasi puncak difenokonazol tidak terganggu. Selanjutnya dilakukan


35

validasi penuh metode analisis penetapan kadar difenokonazol dalam buah melon. Metode yang valid selanjutnya digunakan untuk penetapan kadar. Hasil clean-up diinjeksikan ke GC-ECD yang telah teroptimasi. Proses clean-up dikatakan berhasil apabila puncak difenokonazol terpisah dari puncak lainnya. Parameter validasi metode yang diuji dalam penelitian ini adalah adalah IDL, IQL, recovery dalam penelitian ini recovery ekstraksi maupun clean up, determinasi analit dan kisaran kalibrasi. I. Hipotesis 1. Pelarut yang polaritasnya mendekati difenokonazol dapat digunakan untuk mengekstraksi difenokonazol pada kulit dan daging buah melon secara kuantitatif. 2. SPE C18 dapat digunakan sebagai sarana clean up untuk memisahkan matriks dengan difenokonazol perlu fase gerak yang sesuai. 3. Difenokonazol dapat dipisahkan dengan matriks dengan GC dan ditetapkan dengan detector ECD.


BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian tentang “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol Dalam Buah Melon (Cucumis melo L.)” merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental murni karena terdapat perlakuan terhadap subjek uji. Subjek uji yang dimaksud disini adalah buah melon. B. Variabel Penelitian 1. Variabel a. Variabel bebas.Variabel bebas dalam penelitian ini adalah massa adisi difenokonazol yang diadisikan ke dalam ekstrak buah melon, volume fase gerak saat clean-up, lama sentrifugasi. b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah jumlah supernatan yang diperoleh, lama sentrifugasi, waktu retensi, resolusi, efisiensi kolom dengan jumlah lempeng (N), tailing factor, % perolehan kembali dengan SPE C18, koefisien korelasi (r) antara massa total difenokonazol dan AUC, slope kurva baku adisi, presisi, limit of detection (LOD) atau IDL, IQL, limit of quantification (LOQ), koefisien variansi (CV) dan % perolehan kembali metode standar adisi.

36


37

c. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian pelarut yang digunakan, yang dapat diatasi dengan menggunakan pelarut pro analysis (p.a.) yang memiliki kemurnian tinggi. C. Definisi Operasional 1. Difenokonazol yang dianalisis adalah fungisida yang digunakan untuk mengontrol berbagai sayuran, buah-buahan dan berbagai jenis tanaman, yang beraksi dengan menghambat demethylasi sintesis ergosterol. 2.

Buah melon yang dianalisis adalah buah melon yang berasal dari beberapa pasar dan toko buah yang ada di Yogyakarta, yang tidak mengandung difenokonazol.

3. Sistem GC-ECD yang digunakan adalah seperangkat GC yang dilengkapi dengan detektor ECD dengan fase diam C18, suhu kolom, suhu oven, suhu kolom, injektor, CBM (communication bus module), komposisi fase gerak, gas pembawa nitrogen, flow rate yang optimum serta komputer yang dilengkai aplikasi penyaji data kromatogram. 4. Parameter validasi metode clean-up difenokonazol dengan SPE adalah linearitas yang dilihat dari koefisien korelasi (r) dan akurasi yang dilihat dari % perolehan kembali. 5. Parameter validasi metode analisis penetapan kadar difenokonazol dengan GCECD yang diamati dalam penelitian ini adalah akurasi, presisi, linearitas, IDL, dan IQL.


38

6. Instrument Detection Limit (IDL) merupakan nama lain dari Limit of Detection (LOD) yaitu konsentrasi terendah yang dapat dideteksi namun tidak

dapat

dikuantifikasi. 7. Instrument Quantification Limit (IQL) merupakan batas konsentrasi terendah yang dapat dikuantifikasi yang memenuhi presisi dan akurasi. 8. Lower Limit Method Validation (LLMV) merupakan konsentrasi terkecil pada sebuah metode yang telah di validasi. 9. DCB (dekaklorobifenil) merupakan standar internal yang digunakan sebagai faktor koreksi. 10. QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged And Safe) adalah metode ekstraksi menggunakan pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS. 11. Campuran garam QuEChERS yang dimaksud dalam penelitian ini adalah campuran garam QuEChERS campuran MgSO4 4 gram ; NaCl 1 gram ; Na3sitrat 0,5 gram; 0,25 gram Na2Hsitrat.

D. Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku difenokonazol (baku dari PT.Syngeta), standar DCB (Sigma Aldrich) metanol (p.a. E. Merck), asetonitril (p.a E. Merck), aseton (p.a. E. Merck), akuades (Laboratorium Analisis Instrumenal Farmasi USD), akuabides (Laboratorium Analisis Instrumenal Farmasi


39

USD), gas nitrogen UHP dan teknis, sampel buah melon dari berbagai pasar, toko buah dan swalayan di daerah Yogyakarta. E. Alat Penelitian Alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi gas (HP, GC-5890 Series II) dilengkapi dengan detektor ECD (SPE C18 0,4 g),

63

Ni, Kolom SPE C18

neraca analitik (Precisi 125 A. SCS Swiss Quality),

ultrasonifikasi,Vortex, Sentrifugasi, hotplate, stopwatch, ultrasonifikasi, seperangkat komputer dengan CBM-102 (Shimadzu), perangkat lunak Shimadzu Lab solutions: GC Solution versi 2.30.00SU4), perangkat lunak Powerfit v.6.05, vakum, mikropipet, glass fin, syringe, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis. F. Tata Cara Penelitian 1. Uji kesesuaian sistem GC-ECD Penelitian ini merupakan analisis tingkat kelumit sehingga untuk mencapai akurasi dan presisi yang baik diperlukan suatu metode analisis dengan sensitivitas yang cukup tinggi. Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan bahwa Sistem yang akan digunakan untuk analisis sesuai dengan tujuannya. Optimasi terhadap sistem GC-ECD di lakukan dalam uji kesesuaian sistem. Optimasi instrumen GC-ECD dilakukan sesuai dengan prosedur yang ditetapkan dalam petunjuk operasional alat.


40

2. Preparasi sampel dengan metode QuEChERS a. Pengecekan kadar air dalam buah melon. Buah melon dibelah menjadi 4 bagian, diambil salah satu bagian tersebut secara acak. Dipotong sekecil mungkin menggunakan pisau dan telenan yang sudah dicuci. Kemudian diblender hingga halus. Ditimbang 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 60°C. Replikasi sebanyak 3 kali. Hasil pengeringan ditimbang dan dihitung berat rata-ratanya sebagai % kandungan air buah melon. b. Penentuan waktu dan kecepatan sentrifugasi. Ditimbang dalam tabung sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender. Kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama ( 5 menit, 10 menit dan 15 menit dalam 5000 rpm). Amati dan bandingkan jumlah supernatan yang terbentuk. 3. Pembuatan seri larutan baku Difenokonazol a. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok induk). Sejumlah lebih kurang 52.6 mg baku difenokonazol ditimbang dengan seksama lalu dilarutkan ke dalam 1 mL toluen hingga didapat larutan stok induk 52,6 mg/mL. b. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok A). Sebanyak 40 µL stok induk difenokonazol dilarutkan dalam 1000 µL toluen hingga didapat


41

konsentrasi sebesar 0.526 µg/µL yang kemudian disebut dengan stok A. c. Pembuatan larutan intermediet. Sejumlah 10 µL stok A diambil dengan Syringe add dalam 1000 µL heksan sehingga diperoleh larutan intermediet dengan konsentrasi 0.526 x 10-2 µg/µL. d. Pembuatan larutan kurva baku solven. Diambil sebanyak 20µL ; 15µL ; 10µL; 7 µL ;5µL ; 4 µL; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok B kemudian ditambahkan 2 µL DCB add hingga 200 µL dengan pelarut heksan kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2 µL. e. Pembuatan larutan kurva baku adisi .Diambil sebanyak 20µL ; 15µL ; 13 µL ; 10µL; 5µL ; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok B kemudian ditambahkan 2 µL DCB ke dalam flakon berisi ekstrak matriks yang telah kering add hingga 200 µL dengan pelarut heksan kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2 µL. f. Pencucian

flakon

wadah

sampel

supernatan.

Flakon

dicuci

menggunakan akuades kemudian aseton dilanjutkan dengan metanol dan dikeringkan dalam oven. g. Pencucian syringe. Syringe dicuci menggunakan aseton kemudian metanol dan dilanjutkan dengan 5 µL standar difenokonazol. Diulangi hingga 3 kali.


42

4. Optimasi Clean-Up SPE C18 a. Penentuan Kapasitas Solid Phase Extraction (SPE) C18. Ditimbang dalam tabung sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dalam 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil sebanyak 1 mL dimasukan dalam flakon dan dikeringkan dalam oven 60°C hingga tercapai bobot tetap. Replikasi 3 kali. Kemudian ditimbang dan dihitung rata-rata berat setelah dikeringkan. b. Optimasi Washing SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan

dimasukan

dalam

flakon.

Dilakukan

reekstraksi

dengan

menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon supernatant sebelumnya kemudian


43

ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dalam

0,5

mL

akuabides

selanjutnya

di-degassing

dengan

ultrasonifikator selama 5 menit. Aplikasikan sampel yang telah didegassing ke dalam kolom SPE. Washing SPE C18 dengan berbagai macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL akuabides tanpa fraksinasi ; 5 mL metanol 5% dengan 5 fraksinasi ; 5 mL UPW 100% dengan 5 fraksinasi. Selanjutnya cuci ekstrak dalam flakon dengan 3 mL metanol dan elusikan dalam kolom SPE kemudian ditampung dalam flakon baru untuk dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GC-ECD. c. Optimasi Elusi SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan

dimasukan

dalam

flakon.

Dilakukan

reekstraksi

dengan

menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1


44

menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan

1

mL

akuabides

kemudian

di-degassing

dengan

ultrasonifikator selama 5 menit selanjutnya aplikasikan sampel ke dalam kolom SPE C18. Washing dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL kemudian keringkan kolom dengan bantuan gas nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan (1 mL ; 2 mL ; 3 mL ; 4 mL ; 5 mL) metanol. Masukan metanol ke dalam flakon untuk mencuci ekstrak, kemudian aplikasikan ke dalam kolom SPE. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon. Sampel dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GCECD. 5. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan asetonitril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm.


45

Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya lalu ditambahkan (7 µL ; 10 µL) Standar stok C dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian diultrasonifikasi selama 5 menit. Sampel yang telah di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan pipet Pasteur untuk dimasukan ke dalam SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL dan diaplikasikan dalam kolom SPE C18 lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak tercuci bersih, aplikasikan ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GC-ECD. 6. Validasi Metode Analisis


46

Validasi metode analisis merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Perbedaaan langkah kerja validasi metode dengan uji kesesuaian sistem adalah kurva baku yang digunakan. Kurva baku yang digunakan dalam validasi metode analisis adalah kurva baku metode adisi dengan menggunakan matriks ekstrak buah melon sedangkan pada uji kesesuaian sistem kurva baku yang digunakan adalah kurva baku solven. Di bawah ini merupakan langkah kerja secara umum untuk mendapatkan ekstrak buah melon yang siap diadisi: Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian didegassing selama 5 menit. Sampel yang telah di-degassing

dengan

ultrasonifikator

diambil

dengan

pipet

Pasteur

untuk


47

diaplikasikan ke dalam kolom SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak tercuci bersih, lalu sedikit demi sedikit ekstrak tersebut diaplikasikan ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Ekstrak yang didapatkan digunakan sebagai matriks untuk melakukan validasi metode analisis. Parameter validasi metode yang dinilai adalah sebagai berikut : a. Presisi (keterulangan) sistem GC-ECD. Presisi dapat ditentukan dari nilai CV. Parameter presisi dapat diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL larutan ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol stok B 1ul, 3ul, 5ul, 7ul, 10ul, 13ul, 15ul, 20ul,

ke dalam sistem GC-ECD

sebanyak 3 kali. Respon yang berupa luas puncak difenokonazol dari masing-masing konsentrasi larutan baku yang diperoleh dihitung nilai rata-rata, SD dan %CV. b. Linearitas hubungan konsentrasi baku difenokonazol dengan respon sistem GC-ECD. Koefisien korelasi (r) merupakan parameter yang diperlukan

untuk

menentukan

linearitas

hubungan

massa

baku

difenokonazol terhadap respon sistem GC-ECD yang telah optimal. Koefisien korelasi (r) diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL larutan


48

ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol 0,053 ; 0,0789 ; 0,105 ; 0,132 ; 0,184 ; 0,263 ; 0,395 ;0.526 ng/µL ke dalam sistem GCECD. Linearitas hubungan antara massa difenokonazol yang diinjeksikan terhadap respon alat, diplotkan dalam bentuk kurva baku dan dihitung parameter statistiknya seperti intersep (a), slope (b), dan koefisien korelasi (r) dengan menggunakan program powerfit. c. Sensitivitas sistem GC-ECD. Sensitivitas sistem GC-ECD yang telah optimal dapat diketahui dengan menghitung nilai IDL dan slope. Kedua parameter sensitivitas tersebut dapat ditetapkan dengan menginjeksikan 2 µL larutan baku difenokonazol dengan konsentrasi kurva baku adisi ke dalam sistem GC-ECD. Nilai IDL dan slope dapat dihitung dari persamaan kurva baku hasil injeksi. G. Analisis Hasil 1. Uji kesesuaian instrument GC-ECD a. Analisis hasil optimasi sistem GC-ECD. Analisis hasil optimasi sistem GCECD dapat dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Optimasi kecepatan alir gas, inisial temperatur, suhu injektor, suhu kolom, suhu detektor dan suhu oven yang optimal akan memberikan pemisahan puncak senyawa yang optimum. b. Analisis Kinerja instrumen GC-ECD. GC-ECD yang telah optimal untuk analisis kadar residu difenokonazol, dibuktikan oleh nilai Rs, TF, N, dan tR


49

yang memenuhi syarat-syarat batasan yang harus dicapai sebagaimana telah dijelaskan pada beberapa teori . 1) Waktu retensi (tR).Waktu retensi dari masing-masing senyawa dapat dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Keajegan rasio tR/standar internal dan rasio AUC standar/DCB dari penginjekan 6 kali. Kejegannya dihitung dengan rumus % RSD: %RSD = 100-%recovery (Harmita,2004). 2) Daya pisah (resolusi). Resolusi dalam penelitian ini ada 2 yaitu resolusi awal dan resolusi akhir. Resolusi dapat dihitung dengan rumus: Rs=

Keterangan : tR= waktu retensi W1 dan W2 = rata-rata lebar zona 3) Tailing factor (TF). Tailing factor atau TF dapat diterima apabila memiliki nilai <1,2. Jika TF lebih >1,2 maka puncak kromatogram tersebut mengalami tailing/ pengekoran (Dolan et al,2002) TF= 4) Jumlah lempeng teoritik (N). Jumlah lempeng teoritik atau N dapat dihitung dengan rumus : N= 16(

2

Keterangan : tR: waktu retensi Wb=lebar dasar puncak


50

c. Analisis hasil kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif. Analisis hasil Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD secara kuantitatif

menghitung parameter-

parameter yang dibutuhkan, berikut ditentukan syarat-syarat nilai parameter dari nilai CV, r, IDL, dan slope yang harus dicapai agar suatu sistem GC-ECD dapat dinyatakan sesuai untuk penentuan kadar difenokonazol. 1) Linearitas Linearitas ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari kurva baku solven hasil plot antara rasio luas puncak difenokonazol/DCB dan massa standar baku yang diinjeksikan kedalam regresi linear dengan persamaan y = a + bx dengan menggunakan powerfit. 2) Sensitivitas Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung nilai slope, IDL, IQL dengan rumus : Slope dapat diperoleh dari persamaan regresi linear y=a+bx (b=slope; a=intersep) IDL dapat dihitung dengan rumus:

3,3 ×

Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope k=3,3.


51

3) Presisi (keterulangan) Nilai presisi atau keterulang dapat diperoleh dengan menghitung %kesalahan acak (%KV) dengan rumus: Kesalahan Acak (%KV)=

x 100%

4) Percent Difference (%D) Percent Difference (%D) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut % D=

x 100 %

d. Analisis hasil Optimasi Preparasi Sampel. Pengecekan kadar air dalam buah melon.Kadar air didalam melon dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Kadar air =

x 100%

e. Validasi metode analisis Hasil modifikasi QuEChERS dan clean-up 1) Linearitas Linearitas suatu kurva baku ditentukan oleh nilai koefisien korelasi (r). Koefisien korelasi dapat diperoleh dengan mengeplotkan data antara rasio luas puncak difenokonazol/standar internal DCB sebagai sumbu y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x ke dalam program Powerfit® sehingga didapatkan persamaan regresi linear y= a + bx. 2) Selektifitas. Data kromatogram antara sampel sebelum dan sesudah SPE

dibandingkan

selain

itu

resolusi

antara

puncak

analit


52

difenokonazol dengan puncak terdekat dihitung (ICH Harmonised Tripartite,2005). 3) Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :

Perolehan kembali (recovery) =

× 100%

4) Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : Kesalahan Acak (%RSD) =

× 100%

5) Sensitivitas. Limit of Quantitation(LOQ) dihitung dengan rumus :

10 ×

Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope k=10 6) Limit of Detection (LOD). Limit of Detection (LOD) suatu sistem GC-ECD dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear suatu kurva baku. Berikut adalah rumus untuk menghitung LOD:

LOD= 3,3 ×

Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope, k=3,3 (ICH Harmonised,2005).


53

H. Rancangan Penelitian 1. Metode Adisi

Sampel blanko Adisi A: Sampel + standard (Ekstraksi)

Adisi B: Sampel +standard (Cleanup) Adisi C: Sampel + standard (Determinasi_

Sampel sesungguhnya

Kesalahan ekstraksi + cleanup + determinasi

Kesalahan cleanup + determinasi

Kesalahan determinasi

Pada metode adisi dilakukan adisi jalur A, B, dan C untuk membuktikan hipotesis 1.


54

2. Proses Preparasi Sampel : Ektraksi dengan Metode QuEChERS, Clean-up SPE C18 dan Determinasi GC-ECD

Tahap 1 : Proses Sampling dan ekstraksi

sampling melon dilakukan secara acak dari beberapa pasar di Yogyakarta

Preparasi sampel secara kuartering, kemudian blender dan ditimbang sebanyak 5 gram sampel dalam seuah tabung sentrifugasi

tambahkan 5 mL pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS kemudian gojog kuat selama 1 menit, vortex selama 2 menit dan lakukan sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000 rpm.

supernatan pada lapisan yang paling atas yang atas diambil. lakukan reekstraksi dengan menambahkan 5 ml asetonitril ke dalam tabung sentrifugasi, gojog, vortex dan sentrifugasi. supernatan yang terbentuk dimasukan dalam 1 flakon supernatan awal.

keringkan supernatan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Tahap 2 : Proses Cleanup tambahkan 500 µL akuabides ke dalam flakon yang beerisi ekstrak kemudian lakukan degassing selama 5 menit. aplikasikan hasil degassing ke dalam kolom SPE yang telah di conditioning dengan 5 mL metanol dan 5 mL akuabides. washing SPE dengan 5 mL akuabides dan elusi sampel dalam kolom SPE dengan 3 mL metanol. tampung eluat yang keluar dalam sebuah flakon kemudian keringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.

Tahap 3: Proses Determinasi larutkan ekstrak dalam 100 µL heksan ambil 2 µL untuk diinjeksikan ke dalam GCECD. analisis kromatogram yang dihasilkan. untuk membuktikan Hipotesis 3.

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 55

3. Fraksinasi Elusi SPE C18 Metanol

melon

melon

melon

Potong melon secara kuartering dan blender

Timbang 5 gram melon yang telah diblender

Tambahkan campuran garam QuEChERS : 2 gram MgSO4 0,5 gram NaCl 0,5 gram Na3Sitrat 0,25 gram Na2HCitR


Tambahkan 5 ml asetonitril Gojog 1 menit dan vortex 2 selama menit

Sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000rpm

Ambil semua supernatan. lakukan reekstraksi dan gabung supernatan yang terbentuk dan Tambahkan 50 µL standar A

Uapkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen

Tambahkan 1mL akuabides Degassing selama 5 menit

Loading pada SPE yang telah di conditioning

Washing dengan 5 mL akuabides

Fraksinasi masing-masing 1 mL

56


1

2

3

4

Keringkan

Larutkan dengan 200 µL heksan Dan tambah 2 µL DCB. Ambil 2 µL kemudian injeksikan ke dalam GC-ECD

Analisis hasil untuk membuktikan HIPOTESIS 2

5

57


4. Optimasi Washing SPE

melon

melon

melon




58




Ambil supernatant lapisan atas yang terbentuk. Lakukan reekstraksi dengan 5 mL asetonitril. Tambahkan 50 µL standar larutan A


Tambahkan 0,5mL akuabides Degassing selama 5 menit


59


B A Washing dengan 5% MeOH

Washing dengan 100 %UPW

Tampung hasil Elusikan dengan 3 mL MeOH Washing dengan 5% MeOH

Tampung hasil eluat

Keringkan dan larutkan dalam 200 uL heksan tambahkan 2 uL DCB Kemudian injeksikan eluat hasil elusi dan tampungan washing

Analisis hasil kromatogram yang didapatkan untuk membuktikan Hipotesis 1

60


5. Uji Kelayakan SPE untuk Digunakan lebih dari 1 kali

melon

melon

melon




61




Ambil 5 ml supernatant lakukan reekstraksi


Tambahkan 1mL akuabides Degassing selama 5 menit


62




Elusi dengan 3 mL metanol Tamping eluat dan keringkan diatas hotplate dengan gas nitrogen

Cuci SPE dengan 30 mL metanol dan 10 mL akuabides

Loading sampel ke-2 dan 3 dengan langkah seperti diatas

Larutkan sampel dalam 200 uL heksan kemudian injeksikan ke GCECD dan analisis kromatogram Dan analisis hasil

63


BAB IV PEMBAHASAN Penelitian yang berjudul “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol pada Buah Melon (Cucumis melo L.)” dilakukan untuk membuktikan bahwa metode ini dapat digunakan untuk analisis difenokonazol dengan dasar QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged And Safe). Metode ini merupakan hasil modifikasi dari metode analisis baku AOAC 2007.01 yang merupakan metode analisis multi residu dengan dasar preparasi sampel QuEChERS. QuEChERS sendiri merupakan ekstraksi dengan asetonitril, clean-up dengan SPE yang didispersikan kedalam ekstrak dan karena kesetimbangan yang terjadi pada dispersive SPE hanya satu kali diperlukan suatu instrumen yang selektifitasnya tinggi untuk determinasi yaitu LC MS/MS. Determinasi menggunakan LC MS/MS menjadi kendala untuk menerapkan metode ini di Indonesia. Pada umumnya laboratorium tresida pestisida di Indonesia tidak memiliki instrumen tersebut, juga alternatif metode baku analisis residu difenokonazol dalam buah melon belum tersedia hingga saat ini. Salah satu tujuan penelitian ini adalah untuk mengatasi masalah tersebut yaitu dengan melakukan modifikasi pada tahapan cleanup dan instrumen untuk determinasinya. Difenokonazol merupakan suatu senyawa yang memiliki banyak atom klorida, oksida, dan N dengan elektronegativitas yang tinggi yang dapat dideteksi dengan GC-ECD, sehingga instrumen GC-ECD digunakan untuk mendeterminasi residu pestisida difenokonazol dalam buah melon. GC-ECD kurang selektif apabila dibandingkan dengan LC

64


65

MS/MS, sehingga perlu adanya suatu penyesuaian, terutama pada tahap clean-up. Clean-up dengan SPE kolom dapat memberikan kesetimbangan yang jauh lebih banyak sehingga ekstrak yang didapat lebih bersih. Penelitian ini dimulai dari uji kesesuaian sistem GC-ECD diikuti dengan optimasi preparasi sampel kemudian dilanjutkan dengan validasi penuh metode analisis.

Gambar 4. Struktur difenokonazol (EFSA, 2011). A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD 1. Optimasi instrumen GC-ECD Optimasi Instrumen ini dilakukan untuk mengetahui dan mendapatkan kondisi optimum dari instrumen GC-ECD yang akan digunakan, sehingga instrumen mampu memisahkan analit target dari koekstraktan matriks yang menggganggu. Parameter yang dioptimasi meliputi penetapan tipe kolom yang digunakan, tekanan gas/kecepatan alir (flow rate) gas pembawa baik pada kolom,


66

detektor, inlet kolom, suhu injektor, kolom, oven dan detektor. Pada penelitian ini gas pembawa yang digunakan adalah nitrogen dengan kualitas Ultra High Pure (UHP) dengan tipe kolom C18. Berdasarkan optimasi yang dilakukan, didapatkan kondisi GC-ECD yang optimal sebagai berikut : Tabel III. Hasil optimasi kondisi GC-ECD Parameter 1. Injector (split) Suhu injector Volume injector 2. Oven Panjang kolom Fase diam Temperature

Kondisi optimum 230ºC 2uL 12-50 m 5%-phenyl-methylpolysiloxane Terprogram 100 C (3 menit) 30ºC/menit, 245ºC (30 menit) 30ºC/menit, 260ºC(15 menit)

3. Detektor Detektor Suhu detektor 4. Gas Gas Flowrate gas

ECD63Ni 295ºC N2 UHP 1mL/menit

2. Kinerja instrumen GC-ECD Instrumen GC-ECD yang telah optimal akan menghasilkan kinerja yang optimum. Penentuan kinerja GC-ECD baik secara kualitatif maupun kuantitatif ditunjukkan melalui kromatogram yang dihasilkan. Kromatogram memberikan informasi berupa puncak-puncak senyawa-senyawa yang ada dalam matriks, dari hasil tersebut diharapkan instrumen mampu memisahkan antara puncak senyawa


67

difenokonazol dengan koekstraktan matriks. Berikut kromatogram hasil kinerja GCECD yang diperoleh pada penelitian ini: Azoxystrobin

DCB

Difenokonazol

a. Kinerja Pemisahan dengan GC-ECD

Gambar 5. Kromatogram kurva baku difenokonazol dalam pelarut heksan Gambar 5 menunjukan bahwa instrumen mampu memisahkan difenokonazol dari senyawa lainnya. Kinerja pemisahan dengan GCECD dapat dievaluasi berdasarkan nilai N, Rs, dan TF yang dihasilkan. Berikut tabel nilai rata-rata yang didapat dari hasil 6 kali penginjekan standar dengan konsentrasi yang sama:


68

Tabel IV. Nilai rata-rata N, Rs, dan TF puncak baku difenokonazol Parameter N Rs awal Rs akhir

Nilai rata-rata 42500,088 11,423 6,809

TF

0,833

Nilai rata-rata N dalam Tabel

IV

diperoleh dengan

menginjeksikan sebanyak enam kali standar difenokonazol dalam pelarut heksan dengan konsentrasi 0,526 µg/mL ke sistem GC-ECD. Jumlah lempeng teoritis (N) menggambarkan jumlah kesetimbangan yang terjadi dalam sebuah kolom. Semakin tinggi nilai N, semakin banyak kesetimbangan yang terjadi di dalam kolom. Menurut Grob, nilai jumlah plat teoritik (N) yang dipersyaratkan adalah lebih dari 7000. Nilai rata-rata yang didapat pada penelitian ini lebih dari 7000 yaitu sebesar 42500,088 sehingga diharapkan frekuensi terjadinya kesetimbangan analit dalam fase diam dan fase gerak dapat memungkinkan

tercapainya

pemisahan

difenokonazol

secara

sempurna. Resolusi (Rs) merupakan perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak. Sistem GC-ECD dapat dikatakan memiliki kinerja pemisahan yang baik apabila dapat memberikan nilai Rs <1,5 . Pada Rs lebih dari 1,5


69

, GC-ECD mampu memberikan pemisahan puncak yang baik. Nilai Rs yang diperoleh pada penelitian ini adalah sebesar 11,423 untuk resolusi awal dan 6,809 untuk resolusi akhir. Resolusi awal ialah rasio puncak difenokonazol dengan puncak terdekat yang memiliki tR sebelum puncak difenokonzole (puncak DCB), sedangkan resolusi akhir ialah rasio puncak difenokonazol dengan puncak terdekat yang memiliki tR setelah puncak difenokonazol (puncak azoxystrobin). Berdasarkan hasil resolusi awal dan akhir seperti yang telah ditunjukan pada tabel di atas, dapat dikatakan bahwa sistem GC-ECD dalam penelitian memiliki kinerja pemisahan yang baik. Puncak yang memberikan nilai TF>1 menunjukan bahwa puncak tersebut mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Pada penelitian ini diperoleh nilai TF rata-rata sebesar 0.833 sehingga dapat dikatakan bahwa efisiensi kolom sistem GC-ECD untuk analisis senyawa difenokonazol cukup baik. Pada kromatogram di atas senyawa difenokonazol muncul sebagai puncak pada tR 25,88 dan 25,708. Hal ini karena difenokonazol memiliki sifat diastereoisomer cis dan trans dengan dua cincin C kiral pada strukturnya (EFSA,2011). Adanya dua


70

isomer yang memiliki cincin C kiral ini menyebabkan struktur difenokonazol dapat berputar untuk mencapai posisi stabil. Dua isomer yang berbeda ini memiliki sifat fisika kimia yang berbeda dan

akan

terdeteksi

oleh

ECD

pada

tR

yang

berbeda

(Fessenden,1986). Pada analisis residu pestisida tidak jarang ditemukan suatu senyawa yang memiliki multi-peak. Kuantifikasi senyawa multipeak seperti difenokonazol dapat dilakukan dengan menggunakan AUC peak terbesar atau dengan menjumlahkan AUC kedua peak (USDA,2015). Pendekatan yang lebih sering dilakukan ialah dengan menjumlahkan AUC peak difenokonazol yang muncul untuk memperoleh residu keseluruhan. Pendekatan ini lebih sering diterapkan untuk meminimalkan kesalahan kuantifikasi (Cajka, 2007).

Pada

penelitian

ini

kuantifikasi

dilakukan

dengan

menjumlahkan AUC dua peak difenokonazol yang muncul. b. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kualitatif Kinerja instrumen GC-ECD secara kualitatif dapat dilihat dari parameter %RSD dan keajegan tR serta luas area difenokonazol. CCPR menyatakan bahwa spesifikasi persyaratan untuk %RSD>20%. Hasil %RSD dalam penelitian ini memenuhi spesifikasi persyaratan.


71

Tabel V. Nilai %RSD Rasio Rasio AUC Kadar (ng) difenokonazol/DCB difenokonazol/DCB

0.789

Rata-rata SD %RSD

1,208

1,538

1,219

1,317

1,218

1,575

1,224 1,208 1,215 0,007 0,591

1,821 1,538 1,558 0,179 11,514

c. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif Pada penelitian ini evaluasi optimasi uji kesesuaian sistem juga dilakukan untuk kinerja instrumen GC-ECD secara kuantitatif. Evaluasi ini dilakukan dengan menghitung nilai koefisien korelasi untuk linearitas, kisaran linearitas, slope, IDL untuk sensitivitas, presisi area standar/standar internal

dan %CV untuk akurasi.

Parameter-parameter tersebut diperoleh dari seri kurva baku solven. 1) Linearitas Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Kurva baku untuk mencari linearitas dalam penelitian ini menggunakan kurva baku solven yang menghubungkan antara respon yang berupa rasio luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB)


72

(y) dengan konsentrasi difenokonazol yang diinjeksikan (x). Besarnya konsentrasi yang akan diukur berbeda-beda yaitu dimulai dari 0,1051,052 ng sesuai kisaran sampel yang akan ditetapkan dan ditambah standar internal dekaklorobifenil (DCB) dengan konsentrasi 0,0001 mg/mL. Penambahan standar internal dekaklorofenil (DCB) dilakukan secara konstan yaitu 1 µL dalam 100 µL. Dekaklorofenil (DCB) berperan sebagai faktor koreksi kesalahan yang terjadi dalam sistem GC-ECD. Data yang diperoleh kemudian diolah sehingga didapatkan hasil akhir berupa persamaan regresi linear dengan R2 sebesar 0,999 seperti pada gambar berikut ini :

rasio luas puncak difenoconazole/standar internal

Difenokonazol 2.500 y = 2.1034x + 0.0135 R² = 0.9995

2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

kadar yang ditambahkan (ng)

Gambar 6. Kurva baku solvent antara rasio luas puncak difenokonazol/DCB vs kadar difenokonazol Batas nilai R2 yang dipersyaratkan dalam uji kategori impurities, yaitu ≥0.9900 pada kadar maksimum 1 ppb (AOAC, 2005).

1.200


73

Berdasarkan pada hasil penelitian diatas metode hasil modifikasi QuEChERS ini memiliki linearitas yang cukup baik. 2) Sensitivitas Sensitivitas suatu sistem GC-ECD dinyatakan dalam nilai sebuah Instrument Detection Limit (IDL). IDL didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sinyal yang berbeda signifikan dari blanko adalah intersep+3s intersep, oleh karena itu nilai IDL difenokonazol dalam penelitian ini adalah konsentrasi difenokonazol yang memberikan sinyal sebesar intersep + 3s intersep. Pada penelitian ini nilai IDL diperoleh dari 3 kurva baku dengan 7 konsentrasi terendah. Kurva baku pada kisaran linearitas 0,053-0,526 ng memiliki nilai IDL sebesar 0,01 g/g. Tabel VI. Uji sensitivitas Replikasi

Persamaan

Linearitas

Sa0

I

F(x) = 0,15707 + 3,03655 x F(x) = 0,02169 + 2,06485 x F(x) = -0,07459 + 3,78718 x

0,997

II III

0,0297

Slope (b) 3,037

IDL (ng/µL) 0,015

0,999

0,0132

2,065

0,010

0,890

0,183

3,787

0,072

Instrument Quantitation Limit merupakan konssentrasi terkecil dari kurva baku. IQL dapat diterima keterulangannya dengan nilai


74

%RSD<20%. GC-ECD pada penelitian ini memiliki kemampuan mendeteksi nilai IQL sebesar 0,053 ng. 3) Presisi Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik. Nilai presisi secara kuantitatif dinyatakan dalam suatu nilai Respon Faktor, dalam penelitian ini antara rasio jumlah luas area puncak difenokonazol/standar internal (DCB) dengan konsentrasi standar difenokonazol. Berikut ini adalah hasil presisi dari masing-masing dalam penelitian ini : Tabel VII. Nilai Response factor Kadar (ng) 0,053 0,105 0,158 0,210 0,263 0,368 0,526 0,789 1,052 Ratarata SD %RSD

Nilai RF R1 R2 5,236 2,156 4,763 2,214 3,861 2,393 3,936 2,185 3,849 2,097 3,369 2,155 3,317 2,088 3,527 2,123 3,656 2,122 3,946

2,170

0,646 16,367

0,093 4,273


75

Suatu metode dapat dikatakan baik jika memiliki presisi % RF <20% pada konsentrasi maksimum 1ppb (CCPR,2003). Berdasarkan literatur tersebut, presisi penelitian ini dapat diterima dan dikatakan cukup baik. 4) Akurasi Kedekatan hasil injeksi antara larutan standar kurva baku dengan nilai sebenarnya yang digunakan untuk melihat akurasi dalam penelitian ini dinyatakan dalam percent difference (%D). Syarat Percent Difference dapat dinyatakan baik apabila nilainya ≤20% (United State Departement of Agriculture Agricultural Marketing Service, Sciene & Technology Pesticide Data Program,) Nilai %D menggambarkan perbedaan antara % analit terukur dengan analit yang sebenarnya dari sampel. Hasil % D dalam penelitian ini diperoleh :


76

Tabel VIII. Nilai %D Kadar yang ditemukan (ng) 0,053 0,044 0,105 0,102 0,158 0,172 0,210 0,212 0,263 0,257 0,368 0,374 0,526 0,521 0,789 0,801 1,052 1,071 Rata-rata

Kadar (ng)

SD %RSD

%D 15,568 2,757 9,216 0,808 2,461 1,532 0,896 1,495 1,788 1,497 0,608 0,407

Berdasarkan pada tabel VI di atas, nilai %D difenokonazol masuk kriteria persyaratan yaitu %D < 20% . Kesimpulan : Berdasarkan pada nilai presisi, akurasi, kisaran dan linearitas kurva baku serta IDL dan IQL yang dicapai, GC-ECD dapat digunakan dalam penetapan kadar residu fungisida difenokonazol. B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS Preparasi sampel merupakan tahapan penting dalam suatu analisis. Optimasi pada tahapan preparasi sampel perlu dilakukan dengan tujuan mendapatkan hasil optimal. Pada penelitian ini optimasi dilakukan terhadap cara kerja preparasi matriks


77

sampel melon dengan metode modifikasi QuEChERS dan optimasi fase diam SPE C18. 1. Optimasi ekstraksi matriks buah melon a. Pengecekan kadar air dalam buah melon Suatu sampel yang digunakan dalam suatu penelitian harus memiliki kesempatan yang sama untuk dijadikan sampel, sehingga sampling dilakukan secara acak. Sampel yang dimaksud dalam penelitian ini adalah buah melon dari beberapa pasar di Yogyakarta. Sampling analytical portion untuk buah melon dilakukan dengan metode kuartering dan dihomogenkan dengan blender. Tujuan dari pengecekan kadar air dalam buah melon adalah untuk menentukan perlu atau tidaknya tambahan air dalam proses homogenisasi sampel dengan blender. Proses preparasi sampel dengan metode QuEChERS mempersyaratkan bahwa kadar air harus >80% tidak diperlukan tambahan air (Anastasiades). Pada penelitian ini kadar air yang terkandung dalam buah melon sangat tinggi yaitu lebih dari 90% sehingga tidak perlu adanya penambahan air dalam homogenisasi sampel. Tabel IX. Kadar air dalam buah melon Awal (gram) R1 10,068 R2 10,007 Rata-rata % kadar air

Berat akhir setelah oven (gram) 0,402 0,845

Selisih 9,666 9,162 9,378 93,78%


78

1) Ekstraksi dan clean-up dengan metode modifikasi QUECHERS Metode yang digunakan untuk preparasi sampel pada penelitian ini adalah metode QuEChERS yaitu ekstraksi dengan pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS, clean-up dengan SPE yang didispersikan ke dalam ekstrak dan dideterminasi. Pada metode QuEChERS, garam-garam yang digunakan adalah Magnesium sulfat, Natrium Klorida, Natrium Sitrat dan disodium sitrat hydrogenate sesquihydrate. Masing-masing garam memiliki kegunaan yang berbeda, magnesium sulfat anhidrat berfungsi untuk menarik air, natrium klorida berfungsi sebagai agen salting out effect, sedangkan natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate seshydrate ditambahkan untuk mengontrol pH antara 4-6 (Leung phenoomenex,2012-UCT). pH sampel dijaga antara 4-6, hal ini dkarenakan pada kisaran pH 4-6 jumlah koekstraktan dalam hasil ekstraksi lebih sedikit dibandingkan dengan jumlah koekstraktan pada raw material. Sampel yang telah ditambahkan garam dalam tabung sentrifuge ditambahkan pelarut asetonitril kemudian di gojog dan di vortex. Penggojogan bertujuan untuk memecah gumpalan matriks sampel untuk memperoleh luas permukaan yang besar sehingga kesetimbangan yang optimum akan lebih mudah tercapai.


79

Sampel memiliki partikel dengan ukuran dan berat jenis yang bebeda-beda, untuk memisahkan senyawa yang memiliki

ukuran dan

berat jenis yang berbeda dilakukan sentrifugasi. Optimasi sentrifugasi perlu dilakukan untuk mendapatkan waktu dan kecepatan sentrifugasi yang optimum.Pada penelitian ini optimasi sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 5000 rpm selama 5, 10.Dan 15 menit. Hasil akhir menunjukan bahwa selisih supernatan yang terbentuk dari 3 waktu yang berbeda diatas tidak berbeda signifikan, sehingga waktu yang paling singkat yaitu 5 menit yang digunakan untuk preparasi sampel selanjutnya. Tabel X. Hasil optimasi lama sentrifugasi Waktu sentrifugasi dalam 5000 rpm (menit) 5 10 15

Jumlah supernatant (mL) 4,0 4,0 4,2

Ada 3 lapisan yang terbentuk setelah sampel disentrifugasi, berdasarkan berat jenisnya asetonitril (0,789 g/cm3) berada pada lapisan yang paling atas sedangkan air (1 g/cm3) berada di lapisan bawah. Difenokonazol memiliki kelarutan yang cukup tinggi dalam air yaitu 15 mg/L sehingga untuk mengurangi kelarutannya dalam air sampel ditambahkan garam NaCl yang berfungsi untuk memberikan salting out effect. Lapisan asetinitrik diambil untuk di analisis selanjutnya. Pada penelitian ini dilakukan reekstraksi sampel untuk


80

mengantisipasi tertinggalnya analit difenokonazol karena masih tertahan

di

dalam

matriks

sampel.

Reekstraksi

bertujuan

memaksimalkan ekstraksi analit, sehingga %recovery yang diperoleh lebih baik. Total supernatan yang diperoleh dari 5 gram sampel tersebut dikeringkan dengan nitrogen untuk kemudian di clean-up dengan SPE C18 dan dideterminasi dengan GC-ECD. a. Optimasi Clean-up dengan SPE C18 Melon merupakan matriks yang kompleks, sebagian besar kandungan melon bersifat polar salah satu contohnya vitamin C dan karbohidrat. Senyawa yang menjadi analit target pada penelitian ini adalah difenokonazol. Clean-up menjadi salah satu tahapan penting untuk meminimalisir kandungan matriks yang mengganggu analit target. Clean-up merupakan praperlakuan sampel yang bertujuan untuk memisahkan analit dari komponenkomponen matriks yang mungkin menggangu pada saat pengukuran atau deteksi analit. Clean-up dalam penelitian ini menggunakan SPE C18 sistem fase terbalik. Clean-up dengan metode Solid Phase Extraction (SPE) praktis dan hemat pelarut (Watson,1999). Strategi yang digunakan dalam penelitian ini diharapkan fase gerak atau pelarut mampu menahan semua residu analit difenokonazol dalam sebuah SPE C18 dengan ikatan lemah sehingga analit dapat terelusi. Senyawa-senyawa yang cenderung


81

lebih polar akan ikut terelusi dengan fase gerak. Akuabides digunakan sebagai fase gerak saat washing sedangkan metanol digunakan sebagai fase gerak saat elusi. Berdasarkan pada sifat fisika-kimia, difenokonazol memiliki kelarutan sebesar 15 mg/L di dalam air sedangkan dalam metanol sebesar 500 g/L, yang berarti kelarutannya lebih tinggi dalam metanol. Optimasi clean-up yang dilakukan dalam penelitian ini adalah optimasi penentuan kapasitas SPE C18, washing dan elusi SPE C18. a) Penentuan kapasitas SPE C18 Penentuan kapasitas SPE C18 yang akan digunakan dalam penelitian dilakukan dengan menimbang berat ekstrak untuk setiap 1 ml. Hasil penimbangan tersebut didapatkan bahwa 1 ml sampel yang telah dikeringkan dalam oven, memiliki bobot sebesar 2,5 mg. Persyaratan yang harus dipenuhi yaitu bahwa sampel yang akan diloadingkan ke dalam SPE tidak boleh 5% melebihi berat catdrige, sehingga SPE yang digunakan dalam penelitian ini adalah harus lebih dari 50 mg. Semakin besar SPE yang digunakan kapasitas efisiensi penjerapan analit semakin besar. Penelitian ini menggunakan SPE C18 denga berat 400 mg.


82

Tabel XI. Penentuan kapasitas SPE (Sigmaaldrich). Bobot sampel

Volume SPE

Minimum volume eluat

50-100 mg 500mg 0,5-0,1 g 2g 5g 10 g

1 mL 3 mL 6 mL 12 mL 20 mL 60 mL

100-200 uL 1-3 mL 2-6 mL 10-20 mL 20-40 mL 40-100 mL

Kapasitas SPE yang digunakan 2,5-10 mg 25-100 mg 25-100 mg 0,1-0,2 g 1,25-2,5 g 0,5-1 g

Berdasarkan pada optimasi uji kualitatif pencucian SPE, SPE layak untuk digunakan berulang sebanyak 3 kali dengan syarat setiap kali selesai pemakaian, SPE dicuci dengan 10 ml metanol dan 10 ml akuades. Berikut ini adalah data dari penentuan kapasitas SPE C18:

Tabel XII. Optimasi penentuan kapasitas SPE C18

Berat awal zat(gram/ml) Berat setelah oven (gram)

R1

R2

R3

R4

0,793

0,788

0,796

0,792

0,003

0,003

0,003

0,001

Rata-rata (gram)

0,0025

b) Optimasi washing SPE C18 Optimasi SPE C18 juga dilakukan pada tahap washing. Fraksinasi washing dilakukan dengan memvariasi pelarut


83

yang digunakan yaitu 5% MeOH dan 100% UPW. Pada fraksinasi dengan pelarut 5% MeOH sampel diadisi dengan 2 µl larutan standar intermediet A. Berikut grafik luas puncak (AUC) difenokonazol dengan hasil optimasi

AUC

washing dengan pelarut 5% MeOH dan 100% UPW:

568132,5

160506 Washing 1 1

2

fraksinasi setelah washing

Gambar 7. Luas puncak difenokonazol yang diperoleh dari hasil Fraksinasi setelah washing dengan 5% MeOH (washing 1) vs 100% UPW (washing 2) Diagram diatas menjelaskan bahwa eluat setelah washing dengan 5% MeOH menghasilkan luas puncak yang lebih kecil dibandingkan washing dengan 100% UPW.Artinya senyawa pada saat washing dengan 5% MeOH, analit difenokonazol banyak yang hilang ikut tercuci sehingga saat diinjeksikan eluat menghasilkan respon luas puncak


84

yang lebih rendah dibandingkan dengan eluat setelah washing menggunakan 100% UPW. c) Optimasi elusi SPE C18 Optimasi elusi SPE C18 dilakukan dengan fraksinasi menggunakan pelarut metanol dan konsentrasi adisi 2µL larutan standar stok A yang memiliki konsentrasi sebesar 0,526 g/L. Berikut grafik fraksinasi elusi dengan pelarut

AUC

metanol :

342216,75

336295

82787

1

2

3

30562,5

4

jumlah Metanol untuk elusi (ml)

G Gambar 8. Luas puncak hasil elusi difenokonazol dalam SPE C18 per mL metanol

0 5


85

Gambar diatas menjelaskan bahwa dengan 3 mL pelarut MeOH sudah cukup untuk mengelusi analit yang diharapkan. d) Optimasi kelayakan penggunaaan SPE secara berulang Penggunaan SPE berulang dalam penelitian ini didasarkan pada hasil optimasi yang menyatakan bahwa SPE C18 400 gram dapat digunakan tidak lebih dari tiga kali. Optimasi dilakukan dengan mengaplikasikan standar difenokonazol 0,789 ng ke dalam sebuah SPE yang sama sebanyak tiga kali. Tujuan dari optimasi ini adalah untuk melihat

%perolehan

kembali.

Diharapkan

bahwa

penggunaan SPE berulang tidak mempengaruhi perolehan kembali dari masing-masing sampel. Tabel XIII. %Recovery optimasi kelayakan penggunaan SPE berulang Massa (ng)

AUC DCB 16110,5

AUC difenokonazol 30015,1

Ratio 1,863

% Recovery 110,743

% Kesalahan 10,74292

20158,1

36603,9

1,816

109,349

9,349369

25368,2

46977,3

1,852

107,309

7,309574

1,8437

109,134

9,133954

0,789 0,789 0,789 Rata-Rata SD

1,727

% RSD

1,583


86

Berdasarkan pada data diatas didapatkan % kesalahan ≤20% yang berarti bahwa data optimasi memenuhi kriteria persyaratan dan bahwa SPE dapat digunakan 3 kali (AOAC,2005). Hasil optimasi clean-up dengan SPE C18 pada penelitian ini adalah sebagai berikut: Tabel XIV. Hasil optimasi clean-up SPE C18 Optimasi

Hasil

Kapasitas SPE C18

≥ 50 mg, yang digunakan 400 mg

Washing SPE

5 mL akuades

Elusi SPE

3 mL metanol

C. Validasi Metode Analisis Validasi

metode

adalah

serangkaian

proses

yang

dilakukan

untuk

membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Kriteria validasi metode analisis residu pestisida untuk suatu modifikasi metode analisis yang sudah ada adalah LOD, LOQ, recovery dalam penelitian ini recovery ekstraksi maupun clean-up, determinasi analit dan kisaran kalibrasi (CCPR,2014).


87

Pada penelitian ini parameter validasi metode yang diukur adalah linearitas, kisaran linearitas, selektivitas, sensitivitas, akurasi, presisi, dan LOQ. Kinerja cleanup dan GC-ECD dievaluasi dalam penelitian ini. Clean-up dilakukan dengan menggunakan SPE C18, untuk menguji kinerja clean-up SPE C18 yang telah teroptimasi dilakukan adisi pada ekstrak blanko melon sebelum dilakukan SPE dalam penelitian ini disebut Adisi B. Selanjutnya untuk menguji kinerja GC-ECD dalam menetapkan difenokonazol dalam matriks ekstrak melon bersih ( setelah melalui clean-up SPE C18) dilakukan adisi standar pada ekstrak bersih pada penelitian ini disebut adisi C. Apabila kedua uji ini memenuhi persyaratan % recovery yang dipersyaratkan dalam CCPR yaitu 70-120%, dilakukan penetapan akurasi pada metode analisis ini. Pada penelitian ini LOQ metode teroptimasi ditetapkan pada konsentrasi terendah yang telah memenuhi kriteria akurasi dan presisi. 1) Adisi C Penambahan standar adisi ekstrak melon setelah clean-up dilakukan dan tepatnya sebelum sampel diinjeksikan ke dalam GC. Adisi jalur C bertujuan untuk menguji kinerja GC-ECD dalam menetapkan difenokonazol dalam matriks ekstrak buah melon.Berdasarkan pada kromatogram hasil injeksi sampel yang diadisi, puncak difenokonazol dapat terpisah secara sempurna dari senyawasenyawa koekstraktan matriks yang mengganggu. Secara kuantitatif melihat presisi dan akurasi dari kinerja GC-ECD pada adisi jalur C, nilai recovery standar yang ditambahkan dan %D dihitung.


88

Tabel XV. Nilai %Recovery dan %D metode adisi C Kadar yang ditmbahkan (ng) 0,158 0,263 0,368 0,526 0,684

Recovery I 66,957 81,126 85,421 85,161 84,574

Recovery II 87,274 73,215 68,960 64,120 66,968

Recovery III 104,076 107,023 119,607 115,857 112,946

Rata-rata Recovery 86,102 87,121 91,329 88,380 88,162

%Kesalahan 13,898 12,879 8,671 11,620 11,838

Tabel XVI. Nilai %D metode adisi C Kadar yang ditambahkan (ng) 0,158 0,263 0,368 0,526 0,684

Replikasi I 8,462 5,890 3,017 2,607 6,082

Replikasi II 17,648 2,365 1,487 6,888 1,486

Replikasi III 13,491 0,152 2,578 5,088 9,857

1) Adisi B Pada adisi jalur B, adisi ekstrak melon dilakukan sebelum clean-up dengan SPE C18. Tujuan dari adisi jalur B adalah untuk menguji kinerja cleanup dengan kolom SPE C18. Kinerja clean-up dengan kolom SPE C18 dapat dievaluasi dengan nilai recovery kadar yang ditambahkan dan %D yang menggambarkan akurasi dan presisi dari adisi jalur B.


89

Tabel XVII. Nilai %Recovery metode adisi B Massa (ng) 0,105 0,158 0,263 0,368 0,526

Recovery I 81,001 69,174 91,151 106,512 114,330

Recovery II 111,599 115,640 112,022 120,759

Recovery III 131,955 131,309 134,959 133,738 130,603


%kesalahan 8,185 5,375 13,055 17,424 21,897

Tabel XVIII. Nilai %D metode adisi B Massa (ng) 0,105 0,158 0,263 0,368 0,526 0,684

Replikasi I 20,261 8,512 8,090 3,478 2,781 3,559

Replikasi II 5,381 0,784 10,569 6,052 8,682

Replikasi III 6,301 2,437 4,029 4,544 3,134 0,749

2) Adisi A Pada adisi jalur A, adisi dilakukan sebelum sampel di clean-up dengan SPE C18. Tujuan dari adisi jalur A adalah untuk menguji keseluruhan proses dari ekstraksi menggunakan QuEChERS dan kinerja clean-up dengan kolom SPE C18. Parameter yang teroptimasi pada adisi jalur adisi A adalah akurasi dan presisi. Berikut ini adalah tabel perolehan kembali atau %recovery dari kadar yang ditambahkan dan % D selama proses ekstraksi berlangsung :


90

Tabel XIX. Nilai %Recovery dan %D metode adisi A Massa (ng) 0,158 0,263 0,368 0,526 0,684

Recovery I 109,398 76,027 79,829 101,006 88,578

Massa (ng) 0,158 0,263 0,368 0,526 0,684

Recovery II 105,163 68,882 82,448 101,476 97,674

Recovery III 95,641 68,881 85,051 95,322 159,756

Replikasi I 28,198 12,010 9,949 11,129 2,921

Replikasi II 25,193 19,238 9,854 5,828 0,557


%Kesalahan 3,401 28,737 17,558 0,732 15,336

Replikasi III 19,320 16,663 3,845 3,871 68,208

Dari metode adisi tahap A, B, dan C dapat disimpulkan kesalahan dari masing-masing tahap. Pada tahap A atau metode adisi untuk melihat kinerja metode analisis sampel blanko yang di fortifikasi memiliki kesalahan ekstraksi sebesar 0,133% pada LLMV.

Pada metode tahap B, sampel blanko yang

difortifikasi sebelum clean-up memiliki kesalahan sebesar 8,753%, dan pada tahap C memiliki kesalahan sebesar 8,670%. a) Linearitas Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas kurva baku adisi menghubungkan antara rasio


91

respon luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB) sebagai sumbu y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x. Hasil plot kurva baku adisi pada kisaran linearitas 0,105-0,684 ng tersebut diperoleh

slope

koefisien korelasi (r) sebesar 0,974. Menurut

Association of Official Analytical Chemist (AOAC, 2005 ) dari suatu metode dikatakan linear apabila >0.9900. Berdasarkan pada kriteria tersebut nilai koefisien korelasi yang didapat tidak mencapai spesifikasi persyaratan yang telah ditetapkan oleh AOAC, hal ini karena konsentrasi pada penelitian ini sangat kecil mencapai kadar ppb.

0.800 y = 1.0133x - 0.0034 R² = 0.9743

rasio AUC/DCB

0.700

0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.000

0.200

0.400 massa (ng)

0.600

Gambar 9. Linearitas kurva adisi

0.800


92

b) Selektivitas Selektivitas merupakan kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain di dalam matriks sampel. Selektivitas dilakukan untuk matriks yang kompleks dalam hal ini matriks melon dikategorikan sebagai matriks yang kompleks, karena di dalam matriks tersebut tidak hanya terdapat analit target. Optimasi clean-up dengan SPE C18 dapat meningkatkan selektivitas. Dengan optimasi clean-up, senyawasenyawa koekstraktan dalam matriks yang mengganggu dapat diminimalisir sehingga difenokonazol dapat terpisah sempurna dari senyawa-senyawa tersebut. Gambar 10 merupakan

kromatogram

sampel setelah di clean-up dengan SPE C18. Terlihat bahwa pada kromatogram sebelum clean-up puncak yang terdeteksi sangat rimbun sedangkan

pada

kromatogram

koekstraktan matriks berkurang.

setelah

clean-up

puncak-pucak


D C B

93

d i f e n o k o n a z o l

Gambar 10.kromatogram kurva adisi

Adanya pemisahan yang baik puncak difenokonazol dengan impurities lain dibuktikan dengan nilai Rs, TF, N, dan keajegan tR yang ada dalam Tabel berikut ini :

Tabel XX. Nilai N, Rs, dan tR dari kurva adisi A Replikasi

N

Rs awal

Rs akhir

Tr

1 2 3 4 5 6

358888,330 123879,864 79651,139 80304,476 63957,803 68941,955

1,732 1.436 3,252 1,211 1,809 1,236

5,636 4,543 5,312 4,186 1,710 4,224

29,342 28,064 27,396 27,506 29,459 30,193


94

c) Akurasi Ketelitian suatu metode analisis terhadap nilai yang terukur dengan nilai yang diperoleh atau nilai sebenarnya dapat dilihat dengan menghitung akurasi.Standar internal DCB ditambahkan sebagai faktor koreksi analit yang hilang. Akurasi diekspresikan dalam %recovery atau persen perolehan kembali. Tabel XXI di bawah menunjukan hasil %recovery pada kisaran 0,263-0,789 ng yang diperoleh dalam penelitian ini : Tabel XXI. Hasil % recovery pada kisaran 0,263-0,684 ng Massa (ng) 0,158 0,263 0,368 0,526 0,684

Recovery I 109,398 76,027 79,829 101,006 88,578

Recovery II 105,163 68,882 82,448 101,476 97,674

Recovery III 95,641 68,881 85,051 95,322 159,756


%Kesalahan 3,401 28,737 17,558 0,732 15,336

Persen perolehan kembali (%recovery) yang di persyaratkan menurut CCPR yaitu 70-120%.Tabel menunjukan bahwa dari 3 replikasi diatas %perolehan kembali senyawa residu difenokonazol memenuhi persyaratan sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini akurat. d) Presisi Presisi merupakan ukuran kedekatan anta serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran sampel dengan


95

konsentrasi yang sama. Parameter presisi diekspresikan dengan %D. Spesifikasi persyaratan %D dapat diterima apabila <20%. Hasil dari %D yang diperoleh dalam penelitian ini disajikan dalam tabel .Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa metode hasil modifikasi QUEChERS memiliki presisi yang baik. Tabel XXII. Hasil %D Massa (ng) 0,158 0,263 0,368 0,526 0,684

Replikasi I 28,198 12,010 9,949 11,129 2,921

Replikasi II 25,193 19,238 9,854 5,828 0,557

Replikasi III 19,320 16,663 3,845 3,871

e) Sensitivitas Limit of Quantification (LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat dideteksi. LOQ menunjukan sensitivitas dari suatu sistem GC-ECD. Semakin kecil LOQ maka dapat dikatakan bahwa GC-ECD memiliki sensitivitas yang semakin tinggi. Konsentrasi difenokonazol yang harus terdeteksi dalam penelitian ini adalah

setengah

difenokonazol

dari

nilai

Batas

Minimum

Residu

(BMR)

yang diketahui yaitu 0,035mg/kg (Codex,2014),


96

sehingga LOQ sistem GC-ECD harus lebih rendah dari konsentrasi tersebut. LOQ yang didapat dalam penelitian ini adalah 0,002 µg/g.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Asetonitril mampu menjadi pelarut organik dalam proses ekstraksi difenokonazol dalam buah melon, dengan kesalahan ekstraksi 0,133 pada LLMV 7,364 ng/g. 2. SPE C18 merupakan metode clean-up yang baik dalam memisahkan difenokonazol pada matriks buah melon. Recovery fortifikasi sebelum cleanup dengan kolom SPE C18 113-121%

dengan kesalahan 8,753% pada

LLMV. 3. Validasi metode analisis yang dilakukan pada sampel blanko dan sampel yang di fortifikasi dilakukan pada instrument yang teroptimasi. a. Kinerja kuantitasi GC teroptimasi adalah rata-rata %D<20%, linearitas 0,890-0,999 pada kisaran 0,053-0,526 ng, dengan IDL 0,01– 0,07ng/mL dan IQL 1,06 ng/g. b. Kinerja GC pada ekstrak blanko yang di fortifikasi pada kadarr 0,1580,684 ng sebelum diinjeksikan menghasilkan recovery sebesar 86-91%, dengan kesalahan 8,670% pada LLMV. c. Kinerja metode analisis sampel blanko yang difortifikasi 0,158-0,684 ng memberikan recovery

pada kisaran 71-115% dan LOQ 0,002 g/g.

Dengan demikian validasi metode analisis ini memenuhi spesifikasi

97


98

persyaratan untuk memantau kadar residu difenokonazol dalam buah melon dibawah Batas Minimum Residu (BMR) yang diperbolehkan yaitu 0,7 mg/kg. B. Saran 1. Perlu membandingkan hasil proses ekstraksi jika menggunakan PSA.


DAFTAR PUSTAKA Anastassiades,

Michelangelo.,

Informationand

2006,

Recent

QuEChERS

Developments,

Method

Background

Community

Reference

LaboratoryPesticide Residuesusing Single Residue Methods, Stuttgart, p.50,66. AOAC, 2007, Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulfate Gas Chromatography/Mass Spectrometry and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry, AOAC International, diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014. AOAC International, 2012,Appendix F: Guidelines for Standard Method Perfomance Requirements, AOAC International, P.9. Cajka,Thomas, et all, 2007, Rapid analysis of Multiple Pesticide Residues in FruitBased Baby Food Using Programmed Temperature Vaporiser Injection-LowPressure

Gas

Chromatography-High-Resolution

Time-of-Flight

mass

Spectrometry, Eselvier, p.290. CCPR,2003, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, Codex Alimentarius Commission, Twenty-Fifth Session, Fao-Who, Italy, P 1-106. CCPR,2014, Joint FAO/WHO Food Standards Programme Codex Alimentarius Commission: Report Of The 46th Session Of The Codex Committee On Pesticide Residues, Switzerland.

99


100

Czichos Horst, Tetsuy Saito, and Leslie Smith, 2006, Handbook of Material Measurement Methods,CRC Press, New York.pp.160-163. European Food Safety Authorithy (EFSA),2011,Conclusion on the Peer Review of the Pesticide Risk Assesment of the Active Substance Difenoconazole,EFSA, Journal.9 (1),22-23. Ermer, J., and Miller, J. H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA, Qeinheim, pp.3,21,63,80. Fessenden, R.j dan Fessenden, J.S., 1986, Kimia Organik, Jilid 2, Edisi Ketiga Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka Ph.D., Erlangga, Jakarta. pp.113137. Gandjar,I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal.46,53-55,323-324,378-379,460,463-464,468. Grob, L.R., 1995, Modern Practice of Gas Chromatography, John Wiley and Sons Inc., New York. P.291-295. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungan, Majalah Ilmu Farmasi, Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta, pp.117-128. Horwitz, W., 1984, Official Methods of Analysis of AOAC Interational, 13rd Edition, AOAC International, USA, p.16. Jennings, E. L., Mittlehldt, E., & Stremple, P., 1987, Analytical Gas Chromatography, 2nd Edition, California, Academic Press, pp 37-61.


101

Johanes,Oei, 2014, Pengembangan Metode Analisis Deltametrin dalam Matriks Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Dan Aplikasinya Pada Asesmen Resiko Deltametrin Melalui Asupan Ikan Nila, Usd, Yogyakarta, Hal 36-42. McNair, H. M. & Miller, J. M., 1998, Basic Gas Chromatography, New York, John Willey & Sons. Nollet, Leo., et all., 2005,Chromatographic Analysis of the Environment, Third Edition, Volume 93, CRC Press (Taylor & Francis Group), New York, p. 4649. RAM 305/03, 2004, Standard Operating Procedure “Residue Analytical Method for the Determination of Residue of Difenokonazol (ICI5504) and R230310 in Crop Samples Final Determination by LC-MS/MS”, Syngenta, p.6. Roe,M., Church,S., Pinchen,H.,Finglas, P., 2013, Nutrient Analysis of Fruit and Vegetables; Analytical Report,Institute of Food Research, UK,pp.65. Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, pp.217-230. Samadi, Budi., 2007, Melon Usaha Tani Dan Penanganan Pasca Panen, kanisius, yogyakarta, hal. 12,18, 85. Sanco, 2013, Guidance Document on Analytical Quality Control and Validation Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, European, pp 3-36.


102

Sigma-Aldrich,1998, Guide to Solid Phase Extraction, Supelco Bulletin 910,12. Sigma

Aldrich,

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-

preparation/spe/tube-configuration-guide.html. Skoog, D.A., West, D.M., Holler F.J., and Crouch S.R., 2004, Fundamental ofAnalytical Chemistry, 8th edition, Thomson learning, Inc., USA, pp. 948-950, 959. Soeryadi, I., 1997, Kromatografi, Warta Insinyur Kimia, 17-19. Sudarmo, Subiyakto., 1991, Pestisida, Kanisius, Yogyakarta, hal 5-10. UCT, Pesticide Residue Analysis: QuEChERS Informational Booklet, Enviro, USA, diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014. Sueki H. Leung, Monika M. Kansal, Carl Sanchez, Art Dixon, and Erica Pike Phenomenex, Inc., 411 Madrid Ave., Torrance, CA 90501 USA, Analyzing Pesticide Residues in Lettuce by the EN 15662 Method using Phenomenex roQ™ QuEChERS Kits Followed by LC/MS/MS and GC/MS Analysis, TN0052, APPLICATIONS, p. 1. USDA/AMS PDP, 2015, United States Department of AgricultureAgricultural Marketing Service, Science & Technology, Pesticide Data Program, US, pp 229.


103

Watson, D. G., 1999, Pharmaceutical Analysis : A Textbook for Pharmaceutical Students and Pharmaceutical Chemist, Churcill Livingstone, London,p. 238239,320. Wilson, Keith and John Walker, 2001, Principles and Techniques of Practical Biochemistry, fifth edition, United Kingdom, Cambridge, p 262-264. Wittkowski, R., & Matissek, R., ,1990, Cappilary Gas Chromatography in Food Control and Research, Pennsylvania: Technomic Publishing.


LAMPIRAN

104


105

Lampiran 1. Perhitungan Resolusi (Rs)

d i f e n k o n a z z o l l

P e n g o t o r 1

P e n g o t o r 2 2

Rs=

Rs awal merupakan tR antara puncak pengotor 1 dengan tR difenokonazol 1= =12,277

Rs awal merupakan tR antara puncak pengotor 1 dengan tR difenokonazol 1= =6,437

Lampiran 2. Perhitungan LOQ dan LOD koefisien korelasi (r) Persamaan F(x) = -0.05393 + 0.92972 1.23509 x

ng

ng/ul

ng/g

LOQ ug/g

Sa0

B

0.04824

1.23509 0.117175 0.058587 2.343492 0.002343


LOQ=

= 10 X

106

= 0,117 ng

LOQ= 0,117 ng/ 2µL= 0,058 ng/µL LOQ= 0,058 ng/µL X

Kode

Senyawa

5 7 11

LOD=

= 2,343 ng/g= 0,002 µg/g

FX F(x) = 0.15707 + 3.03655 x F(x) = 0.02169 + 2.06485 x F(x) = -0.07459 + 3.78718 x

= 3,3 X

sy/x

a0

a1

2.98E-02

1.05E-01

b

Ng

3.03655 0.029396 0.014698

0.013201 0.046498 2.06485 0.019179 0.183007

= 0,02 ng

LOD=0,02ng/2µL= 0,01 ng/µL.

0.86621

LOD ng/ul

3.78718

0.00959

0.144968 0.072484


107

Lampiran 3. Certificate of Analysis DCB

3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103 USA Email USA: [email protected] Outside USA: [email protected]

Certificate of Analysis Product Name: Product Number: Batch Number: Brand: CAS Number: Formula: Formula Weight: Quality Release Date: TEST APPEARANCE (COLOR) APPEARANCE (FORM) MELTING POINT FLASH POINT            

DECACHLOROBIPHENYL purum p.a., >= 99.0 % T 442537 WEBC0771Q Sigma-Aldrich 2051-24-3 C12Cl10 498,66 23 OCT 2013 SPECIFICATION

RESULT

COLORLESS SOLID >290,0°C >100,0 °C

WHITE SOLID >290,0 °C >100,0 °C

Dr. Claudia Geitner Manager Quality Control Buchs, Switzerland Sigma-Aldrich warrants that at the time of the quality release or subsequent retest date this product conformed to the information contained in this publication. The currentspecification sheet may be available at Sigma-Aldrich.com. For further inquiries, please contact Technical Service.Purchaser must determine the suitability of the productfor its particular use. See reverse side of invoice or packing slip for additional terms and conditions of sale.

Sigma-Aldrich Page 1 of 1

Certificate of Analysis - Product 71635 Lot BCBM0371V


Lampiran 4. Certificate of Analysis Asetonitril

108


Lampiran 5. Certificate of Analysis Heksan

109


Lampiran 6. Certificate of Analysis Metanol

110


111


Lampiran 7. Certificate of Analysis Magnesium Sulfat

112


Lampiran 8. Certificate of Analysis Na2Hsitrat

113


Lampiran 9. Certificate of Analysis Na3Sitrat

114


Lampiran 10. Certificate of Analysis NaCl

115


116


117

Lampiran 11 . Certificate Of Analysis Formulasi Difenokonazol Donasi dari PT Syngenta


118

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol Pada Buah Melon (Cucumis melo L.)” memiliki nama lengkap Florentina Silviana Devi. Penulis dilahirkan di Pajar mataram Lampung pada tanggal 26 Juni1992 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Lukas Sumari dan Katarina Katrin. Pendidikan formal yang pernah ditempuh oleh penulis yaitu di TK Fransiskus Xaverius Pajar Mataram Lampung Tengah (1997-1999), SD Negeri 3 Pajar Mataram Lampung Tengah (1999-2005), SMP Negeri 2 Qurnia Mataram Lampung Tengah (2005-2008), SMA Xaverius

Pringsewu

Lampung

(2008-2011).

Penulis

melanjutkan

pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2011. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain Pelepasan Wisuda Fakultas Farmasi „‟ Membuka Langkah Untuk Menggapai Impian‟‟, Guest Lecture On Medicinal Chemistry By Dr. Rob Leurs (Vrije Universeit, The Netherlands), Seminar Nasional „‟ Pemberdayaan Pasien Self Management Diabetes Melitus Untuk Meningkatkan Kualitas Hidup‟‟. Hari Aids Sedunia „‟ Kubangun Dan Kujaga Generasiku Bebas HIV AIDS‟‟ Pelaksanaan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents