107
METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan Juli 2011. Analisis kimia produk komersial susu ibu hamil dan bioavailabilitas kalsium dan zat besi dilakukan di Laboratorium Analisis Kimia dan Pangan Departeman Gizi Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan-bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah empat jenis produk komersil susu ibu hamil . Sampel diberi kode sebagai sampel susu A, B, C dan D. Selain itu, bahan-bahan kimia yang diperlukan adalah bahan untuk analisis kimia yang meliputi analisis kadar protein, total kalsium, total zat besi, bioavailabilitas kalsium dan bioavailabilitas zat besi. Bahan-bahan tersebut adalah air destilata, asam sulfat (H2SO4), asam nitrat, selenium mix, HCl, asam borat (H3BO3), kalium hidroksida (KOH), air bebas ion, enzim pepsin (Merck dari porsin), pankreatin (Sigma P-170), ekstrak empedu (Sigma B-8631), dan larutan natrium bikarbonat (NaHCO3). Alat-alat lain yang digunakan adalah alat untuk analisis kimia yang meliputi kadar protein, total kalsium, total zat besi, bioavailabilitas zat besi dan bioavailabilitas kalsium. Alat-alat tersebut terdiri dari erlenmeyer, labu takar, magnetic stirrer, labu destilasi, labu Kjehdahl, buret, gelas piala, neraca analitik, pH meter, pipet mohr, pipet tetes, pipet volumetrik, tabung reaksi, aspirator (bulb), corong, spatula, botol semprot, plastik, gunting, karet gelang, kertas saring Whatman no.42, kantung dialisis (Spectrapor I, MWCO 6000-8000, dia: 32,8 mm, flat width: 50 mm, vol/length: 8 ml/cm), penangas air bergoyang, Spectrophotometre double beam Optima SP-300, dan AAS (Atomic Absorption Specthrophotometre) Hitachi 170-30. Tahapan Penelitian Penelitian dilaksanakan dalam tiga tahap sebagai berikut : 1. Survei produk komersial susu ibu hamil yang dijual di Hyper market Giant, Supermarket Giant, Indomaret dan Alfa Mart yang terdapat di Bogor. 2. Analisis kadar air, protein, serat pangan, fosfor, seng, total zat besi dan total kalsium pada keempat produk komersial susu ibu hamil. 3. Analisis bioavailabilitas in vitro kalsium dan zat besi pada keempat produk komersial susu ibu hamil.
108
Tahap 1. Survei Produk Komersial Susu Ibu Hamil Sampel dipilih berdasarkan hasil survei pasar yang dilakukan di beberapa tempat perbelanjaan. Tempat perbelanjaan yang dipilih yaitu Hypermarket Giant Botani Square dan Yasmin, Supermarket Giant Sindang Barang serta Alfamart, Alfamidi dan Indomaret yang terdapat di Dramaga Bogor. Tempat perbelanjaan yang dipilih didasarkan pada banyaknya pengunjung dan merek susu ibu hamil yang dijual. Survei pasar dilakukan untuk mendapatkan data mengenai merek produk komersial susu ibu hamil yang dijual serta data mengenai kandungan zat gizi yang tercantum di dalam nutrition fact masing-masing produk. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah empat jenis produk komersil susu ibu hamil yang dipilih secara purposive. Kriteria umum yang digunakan dalam pemilihan sampel yaitu secara komposisi keempat sampel susu uji mengandung kalsium dan zat besi yang tinggi. Secara khusus sampel dipilih dengan kriteria tertentu yaitu: 1) Produk komersial susu ibu hamil yang mencantumkan serat pangan, FOS dan GOS pada nutrition fact; 2) Produk komersial susu ibu hamil yang mencantumkan serat pangan dan FOS pada nutrition fact; 3) Produk komersial susu ibu hamil yang hanya mencantumkan serat pangan pada nutrition fact; 4) Produk komersial susu ibu hamil yang tidak mencantumkan serat pangan, FOS dan GOS pada nutrition fact. Tahap 2. Analisis kadar air, protein, fosfor, total zat besi dan total kalsium pada ketiga produk susu ibu hamil Produk komersial susu ibu hamil dianalisis sifat kimianya meliputi analisis kadar air, kadar abu, protein, fosfor, total kalsium, total zat besi, total seng dan serat pangan. Analisa Fosfor Metode Vanadat-Molibdat (Sulaeman et al. 1994) a. Persiapan pereaksi Vanadat-Molibdat Sebanyak 20 gram ammonium molibdat dilarutkan dalam 400 ml akuades hangat kemudian didinginkan. Ditimbang 1,0 gram vanadat dilarutkan ke dalam 300 ml akuades mendidih. Setelah dingin, ditambahkan asam nitrat pekat sambil diaduk. Larutan molibdat dimasukkan ke dalam larutan vanadat, diaduk lalu diencerkan hingga volume 1 liter. b. Persiapan larutan fosfat standar Sebanyak 3,834 gram potassium dihidrogen fosfat kering dilarutkan di dalam akuades dan diencerkan hingga volume 1 liter. Sebanyak 25 ml larutan
109
tersebut dimasukkan ke dalam labu takar 250 ml dan diencerkan sampai tanda tera ( 1 ml = 0,2 P2O5). c. Pembuatan kurva standar Larutan fosfat standar diambil sebanyak 0; 0,025; 0,050; 0,100; 0,125; 0,150; dan 0,200 ml lalu dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Masing-masing ditambah 25 ml pereaksi vanadat-molibdat kemudian ditera. Larutan didiamkan selama 10 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 400 nm. d. Penetapan sampel Sampel yang telah dipreparasi dipipet 1 ml dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 25 pereaksi vanadat-molibdat pada masingmasing labu takar dan diencerkan sampai tanda tera. Setelah didiamkan sampel diukur panjang absorbannya pada panjang gelombang 400 nm. Konsentrasi fosfor dapat diketahui melalui kurva standar berdasarkan absorbans yang terbaca. Tahap 3. Analisis Bioavailabilitas in vitro kalsium Susu Ibu Hamil metode Dialisis (Roig et al. 1999) a. Bahan dan Alat Semua peralatan gelas dicuci, direndam dalam larutan HNO3 10% (v/v) selama 24 jam dan dibilas dengan air bebas ion sebelum digunakan. Bahan dan alat meliputi : 1. HCl 37% 2. Suspensi Pepsin : Sebanyak 1,6 g pepsin didispersikan ke dalam 0,1 M HCl dan ditepatkan volumenya menjadi 10 ml. Suspensi ini dibuat sewaktu akan digunakan. 3. Campurkan pankreatin : Sebanyak 1 g pankreatin dan 6,25 g ekstrak empedu didispersikan dalam 0,1 M NaHCO3 dan ditepatkan volumenya menjadi 250 ml. Campuran ini dibuat sewaktu akan digunakan. 4. Kantung Dialisis : Kantung dialisis dipotong dengan panjang 20 cm dan kemudian direndam dalam air bebas ion sampai akan digunakan. 5. Botol-botol gelas : Botol-botol gelas dengan ukuran yang sesuai dan mencukupi, digunakan untuk tempat sampel dan kantung dialisis.
110
b. Persiapan sampel Susu ibu hamil disiapkan
Ditimbang setara 2 gram protein
Analisis ketersediaaan kalsium dan zat besi c. Prinsip analisis Kalsium dan zat besi sampel dihirolisis dari ikatannya dengan protein menggunakan enzim-enzim pencernaan yang terdapat di lambung dan usus halus. Kalsium dan zat besi bebas yang terdapat dalam larutan sampel akan berdifusi melalui membran semipermeabel ke dalam kantung dialisis yang berisi buffer NaHCO3. Kalsium dan zat besi dalam dialisat menunjukkan jumlah kalsium dan zat besi yang diserap tubuh.
111
d. Pencernaan in vitro kalsium dan zat besi pada susu ibu hamil (Gambar Sampel 1) Ditambahkan H20 bebas ion 100 ml pH diatur menjadi 2,0 dengan HCl 4N
Gelas piala ditimbang bersama sampel (A)
Ditimbang 20 g (T1)
Ditimbang 20 g (T2)
Ditambahkan suspensi Pepsin 1 ml
1,6 g pepsin dilarutkan dalam 10 ml HCl 0,1 N
0
0
Diinkubasi dalam shaker 37 C 120 mnt skala kec 5 Dimasukkan ke dalam freezer 0
Di-thawing dalam shaker 37 C
Kantung dialisis dimasukkan
Dipotong kantung ± 12 cm, direndam dlm air bebas ion lalu diikat salah satu ujungnya dan diisi dengan 20 ml larutan NaHCO3 hasil perhitungan
0
Di-thawing dalam shaker 37 C
Ditambahkan 5 ml pancreatin bile Dititrasi dgn KOH standar sampai pH 7
0
Pankreatin Bile 0 Diinkubasi 37 C 2 jam kec 5
Diinkubasi dalam shaker 37 C 120 mnt kec 5 Dimasukkan ke dalam freezer
Diinkubasi dalam shaker 37 C 30 menit skala kec 5 Ditambahkan 5 ml pancreatin bile
Ditambahkan suspensi Pepsin 1 ml
1 gr pankreatin (sigma p 170) + 6,23 ekstrak empedu (sigma B-8631) dilarutkan dalam 250 ml NaHCO3 0,1 N
Dihitung kebutuhan NaHCO3
Pankreatin Bile Kantung dialisis diangkat Pankreatin Bile Dicuci dengan air bebas ion Pankreatin Bile Ditimbang dialisatnya Gambar 1 Prosedur pencernaan kalsium dan zat besi secara in vitro dalam analisis ketersediaan biologis (bioavailabilitas) kalsium dan zat besi dengan metode dialisis (Roig et al. 1999)
112
e. Pengabuan basah untuk analisis kandungan kalsium dan zat besi pada dialisat dan Susu ibu hamil
Ditimbang ± 2 gr dialisat Pankreatin Bile Ditambahkan H2SO4 pekat 10 ml Ditambahkan 10 ml HNO3 pekat Pankreatin Bile Didiamkan semalam Pankreatin Bile Ditambahkan H2O bebas ion Dipanaskan sampai jernih
Diencerkan dalam labu 50 ml
Disaring dengan kertas saring whatman 42
Dibaca absorban dengan AAS pada λ = 422,7 dan 248.3 nm Gambar 2 Prosedur pengabuan basah dalam analisis total kalsium dan zat besi dalam dialisat maupun pada susu ibu hamil dengan metode AAS.
f. Perhitungan 1. Berat setara 2 gram protein = {(2/kadar protein sampel) x100}/5 2. Kadar Ca (mg/100g) = (tinggi puncak sampel x fp)- tinggi puncak blanko) -b/a) x (aliquot/1000)x (100/berat sampel) 3. Kadar Fe (mg/100g) = (tinggi puncak sampel x fp)- tinggi puncak blanko) -b/a) x (aliquot/1000)x (100/berat sampel) 4. Kebutuhan NaHCO3
5. Bioavailabilitas kalsium (%)
113
6. Bioavailabilitas zat besi (%) ket; fp = faktor pengenceran (1 dan 10) 7. Total Ca tersedia (mg/100g) = Ca sampel (mg/100 g) x (% Bioavailabilitas) 8. Total Fetersedia (mg/100g) = Fe sampel (mg/100 g) x (% Bioavailabilitas). Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dan 3 kali ulangan. Banyaknya ulangan ditentukan oleh kode produksi masing-masing produk susu yang diuji. Bentuk umum dari rancangan tersebut adalah: Yij=
+ Ai + Aij + ij
Keterangan: Yij
= nilai pengamatan bioavailabilitas kalsium atau zat besi ke-i dari produk komersial susu ibu hamil pada ulangan ke-j. = nilai rata-rata umum bioavailabilitas kalsium atau zat besi
Ai
= Jenis susu ibu hamil ke-i dengan bioavailabilitas kalsium atau zat besi
Aij
= interaksi antara pengaruh perlakuan Ai dan Aj
ij
= Kesalahan penelitian karena pengaruh bioavailabilitas ke-i produk susu ibu hamil dengan pengulangan ke-j
i
= Banyaknya produk susu ibu hamil (W, X, Y dan Z)
j
= banyaknya ulangan (k= 1,2,3) yang ditentukan oleh kode produksi masing-masing produk susu. Pengolahan dan Analisis Data Perhitungan kadar air, kadar abu, protein, fosfor, total kalsium, total zat
besi, total seng, serat pangan, bioavailabilitas kalsium, dan bioavailabilitas zat besi pada penelitian ini dilakukan secara manual menggunakan software Microsoft Excell for
Windows. Analisis data statistik dilakukan menggunakan
software SPSS versi 16 for Windows melalui uji ANOVA dan uji lanjut Duncan. Uji ANOVA dan uji lanjut Duncan dilakukan untuk melihat perbedaan pada setiap sampel uji. Dilanjutkan dengan uji korelasi menggunakan uji Correlation Pearson Bivariat.
