12
3
3.1
METODOLOGI
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan Mei 2012.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Karakterisasi Bahan Baku Hasil Perairan (preparasi sampel), Laboratorium Biokimia Hasil Perairan (analisis proksimat), Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan (perendaman asam organik dan homogenizer), Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Terpadu Ilmu dan Nutrisi Makanan Ternak (profil total mineral, mineral terlarut, dan protein terlarut kerang darah), Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Penelitian, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
3.2
Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah kerang darah
(Anadara granosa) yang diperoleh dari PPI Muara Angke, Jakarta Utara. Bahan yang digunakan untuk analisis proksimat, yaitu akuades, kjeltab jenis selenium, H3BO3, indikator metilen merah, larutan heksana, HCl, dan AgNO3. Bahan yang digunakan untuk uji profil total mineral adalah HNO3, H2SO4, HClO4, dan kertas saring Whatman no. 42. Bahan yang digunakan untuk analisis kelarutan mineral adalah asam asetat, asam sitrat, dan asam format. Bahan yang digunakan untuk analisis kelarutan protein adalah natrium karbonat dalam NaOH, tembaga sulfat dalam NaK tartarat, pereaksi Folin Ciocalteau yang dilarutkan dengan air 1:1, serta protein standar (BSA). Alat-alat yang digunakan untuk proses preparasi dan uji proksimat meliputi baskom, pisau, talenan, sudip, aluminium foil, cawan porselen, gegep, desikator, coolbox, kompor listrik, tanur pengabuan, kapas bebas lemak, labu lemak, kondensator, tabung soxhlet, penangas air, labu kjeldhal, destilator, labu erlenmeyer, timbangan digital dan pipet volumetrik. Alat-alat yang digunakan untuk proses perendaman serta analisis mineral diantaranya gelas piala, stirrer, pH meter, corong kaca, pipet mikro, labu ukur, sentrifuse merek Beckman Model
13 16 J2-21, dan Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Shimadzu AA 7000. Alat yang dugunakan pada proses analisis kelarutan protein meliputi tabung reaksi, vortex, rak tabung reaksi, serta Spectrophotometer UV VIS merek LW UV-200-RS.
3.3
Tahapan Penelitian Penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan, yaitu pengambilan dan preparasi
sampel, pengukuran rendemen, analisis proksimat, analisis profil total mineral, analisis kelarutan mineral, analisis kelarutan protein, serta proses pengolahan data. Analisis proksimat yang dilakukan meliputi kadar air, protein, abu, lemak, dan karbohidrat (by difference). Sampel kerang darah kemudian dilakukan analisis total mineral untuk mengetahui profil mineral yang terkandung (natrium, kalium, kalsium, magnesium, fosfor, seng, besi, tembaga, timbal, dan kadmium) sebelum mendapat perlakuan perendaman. Pengaruh perendaman asam organik terhadap kelarutan mineral dilakukan dengan cara memasukkan sampel ke dalam asam organik yang telah disiapkan dengan perbandingan sampel dan larutan yaitu 1:4 (b/v). Proses perendaman dilakukan menggunakan tiga jenis larutan asam organik, yaitu asam asetat 2,5%, asam sitrat 2,5% dan asam format 2,5%. Masing-masing larutan asam organik diukur pH awal terlebih dahulu untuk mengetahui perubahan pH yang mungkin terjadi selama proses perendaman. Tahapan analisis mineral terlarut bertujuan untuk mengetahui seberapa besar kandungan mineral makro, mikro, serta logam berat yang ikut terlarut dalam larutan asam organik. Perubahan yang terjadi terhadap kandungan mineral selama proses perendaman juga dapat mempengaruhi kandungan protein pada suatu bahan, sehingga perlu dilakukan analisis kelarutan protein. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 2. 3.3.1 Preparasi sampel Sampel kerang darah diambil dari PPI Muara Angke, Jakarta Utara. Sampel dibawa menggunakan coolbox tanpa tambahan es. Hal ini bertujuan untuk menjaga kelangsungan hidup kerang darah selama proses transportasi ke Laboratorium Karakterisasi Bahan Baku, Departemen Teknologi Hasil Perairan,
14 17
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Kerang darah yang masih berada dalam keadaan segar di bersihkan dan ditimbang untuk mengetahui rendemennya. Daging yang diperoleh kemudian dicacah dengan menggunakan pisau yang selanjutnya digunakan untuk analisis proksimat, analisis profil total mineral, analisis kelarutan mineral, dan analisis kelarutan protein. Sampel Preparasi sampel Perhitungan rendemen
Pencacahan daging Analisis: Proksimat Profil total mineral
Persiapan larutan asam
Daging segar
Larutan asam
Perendaman
Pengukuran pH awal Pengukuran pH akhir
Sentrifugasi
Pengukuran mineral dan logam berat terlarut Gambar 2 Diagram alir tahapan penelitian:
Pengukuran protein terlarut = input;
= proses.
3.3.2 Rendemen Penentuan rendemen kerang darah di lakukan sebelum diberikan perlakuan. Penentuan nilai rendemen dilakukan dengan cara membandingkan bobot akhir dengan bobot awal dari sampel kerang darah yang digunakan.
15 18
Rendemen (%) =
Bobot akhir (g) x 100% Bobot awal (g)
3.3.3 Analisis proksimat Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar lemak, air, abu, dan protein. Analisis proksimat memiliki manfaat sebagai penilaian kualitas suatu bahan pangan terutama pada standar zat makanan yang seharusnya terkandung di dalamnya. 1)
Kadar air (AOAC 1995) Prinsip pengujian kadar air yaitu sampel dikeringkan dalam oven udara pada
suhu 105 oC sampai diperoleh berat konstan. Cawan porselen kosong dikeringkan dalam oven selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 20 menit dan ditimbang. Sebanyak 5 gram sampel disimpan dalam cawan kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC dan tekanan tidak lebih dari 100 mmHg selama 6 jam atau sampai beratnya konstan. Selanjutnya cawan dan isinya didinginkan dalam desikator dan ditimbang kembali. Perhitungan kadar air menggunakan rumus berikut.
Keterangan : A = berat cawan kosong (g) B = berat cawan + sampel awal (g) C = berat cawan + sampel kering (g) 2)
Kadar abu (AOAC 1995) Prinsip pengerjaan kadar abu adalah abu dalam bahan ditetapkan dengan
menimbang residu hasil pembakaran komponen bahan organik pada suhu sekitar 550 ºC. Cawan pengabuan dipersiapkan dengan cara dikeringkan dalam oven selama satu jam pada suhu 105 oC, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dibakar diatas kompor listrik dengan api sedang untuk menguapkan sebanyak mungkin zat organik yang ada atau sampai sampel tidak berasap lagi dan berwarna hitam. Cawan dipindahkan ke dalam tanur dan dipanaskan pada suhu 300 oC, kemudian
16 19 suhu dinaikkan menjadi 600 oC dengan waktu 6 jam. selanjutnya tahur dimatikan dan dapat dibuka setelah suhunya mencapai 250 oC atau kurang. Cawan diambil dengan hati-hati dari dalam tanur kemudian ditimbang. Penentuan kadar abu dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
Keterangan : A = berat cawan kosong (g) B = berat cawan + sampel awal (g) C = berat cawan + sampel kering (g) 3)
Kadar protein (AOAC 1995) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap,
yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 50 ml lalu ditambahkan 0,25 gram kjeltab dan 10 ml H2SO4 pekat. Sampel didestruksi pada suhu 400 oC selama kurang lebih dua jam atau sampai cairan berwarna hijau bening, lalu didinginkan. Labu kjeldahl ditambahkan dengan akuades 50 ml dan NaOH 40%, kemudian dimasukkan ke dalam alat destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 25 ml asam borat (H3BO3) 4% dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red 0,1% yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Dengan metode ini diperoleh kadar nitrogen total yang dihitung. Kadar protein dihitung dengan rumus berikut.
Keterangan: 4)
Protein (%) = N (%) x 6,25
Kadar lemak (AOAC 1995) Sampel seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua
ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke
17 20
dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (heksana). Kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3). Kadar lemak (%) = Keterangan : W1 = Berat sampel (gram) W2 = Berat labu lemak kosong (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 5)
Kadar karbohidrat (Winarno 2008) Perhitungan kadar karbohidrat di lakukan dengan cara by difference, yaitu
pengurangan dari total kandungan gizi dengan presentase kadar lemak, kadar protein, kadar air, dan kadar abu. Perhitungan rumus kadar karbohidrat (by difference) sebagai berikut: Kadar karbohidrat (%) = 100% - (% kadar lemak + % kadar air + % kadar protein + % kadar abu) 3.3.4 Pengujian profil total mineral (Reitz et al. 1987) Prinsip pengujian total mineral yaitu mengetahui nilai absorpsi logam dengan menggunakan metode (AAS). Sebanyak 10 gram sampel daging kerang darah yang sudah dicacah dimasukkan ke dalam erlenmeyer ukuran 125 ml kemudian ditambahkan 5 ml HNO3, didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang di ruang asam. Selanjutnya dipanaskan diatas hot plate dengan suhu 120 oC selama 4 jam. Penambahan asam nitrat ini bertujuan untuk melarutkan kandungan anorganik. Sampel dibiarkan selama semalam dalam keadaan tertutup. Setelah dingin sebanyak 0,4 ml H2SO4 ditambahkan ke dalam erlenmeyer yang bertujuan untuk menguapkan kandungan organik pada sampel, lalu dipanaskan diatas hot plate sampai larutan berkurang atau lebih pekat, biasanya ±1 jam. Sebanyak 2-3 tetes larutan campuran HClO4: HNO3 dengan perbandingan 2:1 kemudian
18 21
ditambahkan ke dalam sampel. Sampel masih tetap diatas hot plate, karena pemanasan terus dilanjutkan sampai ada perubahan warna dari coklat menjadi kuning tua lalu berubah lagi menjadi kuning muda, biasanya memakan waktu ±1 jam. Sampel kemudian dipindahkan, didinginkan, dan ditambahkan 2 ml akuades dan 0,6 ml HCl. Sampel dipanaskan kembali selama ±15 menit agar larut, kemudian dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml. Apabila ada endapan disaring dengan kertas Whatman no.42 sampai didapatkan larutan yang jernih. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Shimadzu 7000 dengan panjang gelombang dari masing-masing jenis mineral, kemudian diukur absorbansi atau tinggi puncak standar, blanko, dan contoh pada panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral. Perhitungan kadar mineral dalam sampel dihitung dengan rumus sebagai berikut. kadar mineral (
g basis basah) =
Keterangan : fp = faktor pengenceran w = bobot sampel 3.3.5 Pengujian kelarutan mineral (Santoso et al. 2006) Sebanyak 20 gram sampel yang sudah dicacah ditambahkan dengan akuades, asam asetat 2,5%, asam sitrat 2,5%, dan asam format 2,5% yang sudah diukur nilai pH nya terlebih dahulu. Sampel kemudian direndam selama 30 menit menggunakan stirrer pada kecepatan 5000 rpm untuk menghasilkan fraksi terlarut. Setelah proses perendaman selesai, dilakukan proses pengukuran pH akhir. Sampel selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm, suhu 2 ºC selama 10 menit. Hasil yang didapatkan disaring dengan kertas Whatman no.42, dan diambil supernatannya untuk dilanjutkan proses analisis mineral terlarut
19 22 dengan menggunakan alat (AAS) merk Shimadzu 7000 dengan panjang gelombang yang sesuai dengan masing-masing jenis mineral. 3.3.6 Pengujian kelarutan protein (Apriyantono et al. 1989) Pengujian kelarutan protein dilakukan menggunakan supernatan yang dihasilkan setelah proses sentrifugasi dengan metode Lowry. Metode ini memiliki prinsip adanya reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupakan residu protein) akan mengahsilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, oleh karena itu warna yang terbentuk tegantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Metode Lowry mempunyai keuntungan karena 100 kali lebih sensitif dari metode Biuret. Cara kerja uji kelarutan protein dilakukan dengan membuat larutan standar bovine serum albumin sebanyak 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 ml di dalam tabung reaksi. Akuades ditambahkan ke dalam masing-masing tabung sampai volume total 4 ml. Untuk mengetahui nilai kelarutan protein yang dihasilkan pada penelitian, supernatan yang dihasilkan pada proses sebelumnya disiapkan sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan akuades hingga volumenya 4 ml. Kedalam masing-masing tabung reaksi ditambahkan pereaksi yang terdiri dari natrium karbonat 2% dalam larutan NaOH 0,1 N dan tembaga sulfat 0,5% dalam larutan NaK tartarat 1% sebanyak 5,5 ml. Larutan dicampur merata dan dibiarkan selama 10-15 menit pada suhu kamar. Pereaksi Folin Ciocalteau selanjutnya ditambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi sebanyak 0,5 ml, dan kocok merata dengan cepat menggunakan vortex. Larutan dibiarkan selama 30 menit hingga warna biru terbentuk. Larutan standar dan contoh lalu dialirkan ke dalam Spektrofotometer UV-VIS merek LW UV-200-RS dengan panjang gelombang 650 nm kemudian diukur absorbansi yang dihasilkan.
3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh perendaman asam terhadap kelarutan mineral dan protein adalah metode rancangan acak lengkap (RAL) dengan satu faktor dan 4 taraf (perendaman akuades, perendaman
20 23 asam asetat, perendaman asam sitrat, dan perendaman asam format). Semua perlakuan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Data dianalisis dengan Analysis Of Variance (ANOVA) atau uji F. Model rancangan analisis ANOVA atau uji F adalah sebagai berikut:
Yij = μ + τi + εij Keterangan :
Yij = Nilai pengamatan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j (j=1,2) μ = Nilai tengah atau rataan umum pengamatan τi = Pengaruh metode pengolahan pada taraf ke-i (i=1,2,3) εij = Galat atau sisa pengamatan taraf ke-i dengan ulangan ke-j Hipotesis terhadap data hasil kelarutan mineral akibat proses perendaman pada berbagai jenis asam organik adalah sebagai berikut: H0= Metode perendaman asam organik tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral. H1= Metode perendaman asam organik memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral. Hipotesis terhadap data hasil kelarutan logam berat akibat proses perendaman pada berbagai jenis asam organik adalah sebagai berikut: H0= Metode perendaman asam organik tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan logam berat. H1= Metode perendaman asam organik memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan logam berat . Hipotesis terhadap data hasil kelarutan protein akibat proses perendaman pada berbagai jenis asam organik adalah sebagai berikut: H0= Metode perendaman asam organik tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan protein. H1= Metode perendaman asam organik memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan protein.
21 24 Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh yang berbeda terhadap kelarutan mineral dan protein maka dilanjutkan dengan uji Duncan, dengan rumus sebagai berikut: Duncan = tα/2; dbs Keterangan : KTS = Kuadrat tengah sisa dbs = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan
