29
3. METODOLOGI UMUM Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dimulai bulan September 2009 - Juli 2011 di Laboratorium Mikrobiologi pangan Seafast Center untuk pengujian isolasi, identifikasi dan pengujian secara in vitro.
Penelitian dengan hewan percobaan dilakukan di
Laboratorium Hewan percobaan Seafast Center IPB, pengujian histologi dan imunologi dikerjakan di Bagian Mikrobiologi Medik Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Pengujian SEM dilakukan di Laboratorium Zoologi LIPI Cibinong Bogor. Bahan dan Alat Bahan penelitian adalah susu kambing jenis Peranakan Ettawa (PE) dan Peranakan Saanen (PESA). Susu kambing diperoleh dari Koperasi Daya Mitra Primata, desa Cikarawang, Bogor. Susu kambing yang digunakan pada penelitian ini merupakan susu segar yang diperoleh dari pemerahan di pagi hari. Susu dikemas dalam plastik HDPE selama pengangkutan dari tempat pemerahan. Identifikasi BAL menggunakan media MRSB, MRSA, HCl 0,1 N, NaOH 0,1 N, aquades steril, kristal violet, iodin, safranin, H2O2, alkohol 96 %, NaCl, Gibson’s semi solid tomato juice, reagen Nessler, bromocresol purple. Pengujian in vitro dilakukan dengan menggunakan HCl 0.1 N, Tryptic Soy Broth, Muller Hinton Agar, garam empedu Oxgall, dan Phosphat Buffer Saline (PBS). Bahan lain adalah usus tikus bagian duodenum, jejunum, ileum dan sekum. Bakteri uji adalah Salmonella Typhimurium (ATCC 14028), Escherichia coli (ATCC 8739), Bacillus cereus (ATCC 13061), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), dan Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027).
Bahan untuk pembuatan keju pada
penelitian ini di antaranya renet komersial dalam bentuk cair, kultur bakteri asam laktat L. rhamnosus TW2 dan L. plantarum TW14. Analisis keju menggunakan akuades, Na2SO3 2%, alkohol 70%, bufer pH 4 dan pH 7, K2SO4, HgO, H2SO4, NaOH-Na2SO3, H3BO3, HCl 0,02 N, indikator merah metil, indikator metil biru, dan heksana. Pengujian secara in vivo dilakukan dengan menggunakan tikus percobaan jenis Sprague Dawley dari Badan POM RI Jakarta, berjenis kelamin jantan dan umur 6 minggu dengan berat badan 120-160 g.
30
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah, autoklaf, sentrifus, vortex, lemari pendingin, timbangan digital, freeze drier, dan seperangkat alat pengujian SEM tipe JSM-5310LV JEOUL Japan, pH meter, obyek gelas dan penutup, bunsen, autoklaf, vortex. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian pembuatan keju ini diantaranya wadah untuk membuat keju dan alat-alat untuk analisis, stomacher, inkubator 37oC, perangkat Kjeldhal, oven vakum, desikator, cawan porselen, perangkat soxhlet, tanur dan textur analyzer tipe TA-XT2i. Metode Penelitian dikerjakan dalam empat tahap dimulai dengan isolasi dan identifikasi BAL susu kambing jenis Peranakan Ettawa (PE) dan Peranakan Saanen (PESA). Tahap selanjutnya adalah seleksi BAL yang berpotensi sebagai probiotik secara in vitro, pembuatan keju dengan sifat probiotik dan pengujian isolat BAL pada hewan percobaan. Rincian tahapan penelitian sebagai berikut : 1. Isolasi dan identifikasi BAL dari susu kambing, meliputi : a. karakteristik morfologi, b. karakteristik fisiologis, dan c. karakteristik biokimiawi 2. Pengujian sifat probiotik BAL secara in vitro, meliputi : a. ketahanan pada pH rendah, b. ketahanan hidup pada kondisi garam empedu saluran pencernaan, c. kemampuan BAL menempel
pada sel mukosa usus dan
d. aktivitas
antibakteri BAL. 3. Pembuatan keju dengan sifat probiotik, meliputi a. proses pembuatan, b. karakteristik keju dengan sifat probiotik (kimia, mikrobiologi, fisik dan sensori). 4. Pengujian sifat fungsional probiotik BAL meliputi : a. profil mikroflora usus, b. potensi imunomodulator dan c. profil morfologi usus. Tahapan pelaksanaan penelitian secara garis besar dapat dilihat dan diikuti pada Gambar 3.1 dan Tabel 3.1 berikut ini.
31
Susu kambing
1. Karakteristik morfologi 2. Karakteristik fisiologi 3. Karakteristik biokimia Isolasi dan identifikasi
Isolat BAL
Pengujian probiotik BAL in vitro
1. Ketahanan pada pH rendah 2. Ketahanan pada garam empedu 3. Aktivitas antibakteri pada bakteri uji 4. Kemampuan menempel pada mukosa usus
BAL probiotik in vitro
Produksi keju dengan sifat probiotik Perlakuan 1. Kultur tunggal L.rhamnosus TW2 2. Kultur tunggal L.plantarum TW14 3. Kultur campuran (L.rhamnosus TW2 +L.plantarum TW14)
Pengujian in vivo
Karakteristik keju 1. Mikrobiologi (jumlah BAL) 2. Kimia (proksimat, pH) 3. Fisik (tekstur) dan sensori (tekstur, aroma dan rasa)
1. Profil mikroflora 2. Potensi imunomodulator 3. Profil morfologi
Gambar 3.1 Diagram alir penelitian.
32
Tabel 3.1 Tahapan, uji dan hasil penelitian Tahapan I. Isolasi dan identifikasi BAL
Uji Karakteristik morfologi
Hasil Karakteristik BAL
Uji pewarnaan Gram Karakteristik fisiologis Uji ketahanan terhadap suhu Uji ketahanan terhadap kadar garam Uji ketahanan terhadap pH
Morfologi Fisiologi Biokimiawi
Karakteristik biokimiawi Uji katalase Uji produksi CO2 dari glukosa Uji produksi dekstran dari sukrosa Uji produksi NH3 dari arginin
Uji dengan API CH 50
Spesies BAL
II. Sifat probiotik BAL in vitro
Uji Ketahanan pada pH rendah Karakteristik BAL probiotik secara in vitro Uji Ketahanan pada garam Ketahanan pada pH empedu saluran pencernaan rendah dan garam Uji penempelan BAL pada empedu mukosa usus Kemampuan Uji aktivitas antimikroba menempel pada dengan metode difusi sumur mukosa usus Aktivitas antibakteri
III. Produksi keju
Uji jumlah BAL keju Uji proksimat dan pH keju Uji tekstur dan tingkat kesukaan keju
Karakteristik keju Mikrobiologi Kimia Fisik dan sensori
IV. Pengujian isolat probiotik BAL in vivo
Uji kuantitatif total BAL Uji kuantitatif Salmonella Typhimurium Uji gambaran histologi usus Uji sel limfosit
Sifat fungsional probiotik BAL :
Uji IgA
Profil mikroflora usus Profil morfologi usus Potensi imunomodulator
33
4. ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) INDIGENUS ASAL SUSU KAMBING (Isolation and Identification of Indigenous Lactic Acid Bacteria (LAB) from Goat Milk)
ABSTRACT Goat milk is a source of various lactic acid bacteria (LAB). The objective of the study was to isolate and identify LAB from milk obtained for Peranakan Ettawa (PE) and Peranakan Saanen (PESA) goat. Isolated LABs were subjected to different tests: morphology, physiology and biochemistry. Morphology test conducted was Gram coloring; physiology test conducted was pH, temperature and salinity; whereas biochemistry test conducted was CO2, dextran and NH3 production. Determination of LAB species was conducted by using Analytical Profile Index (API) test. A total of 16 LAB isolates were obtained from PE goat milk, and 17 LAB isolates were obtained from PESA goat milk. All isolates have general characteristics of LAB, namely catalase negative, Gram positive, and in the form of bacilli or coccus. Three isolates were identified as L. rhamnosus, and five isolates were identified as L. plantarum. Key words: goat milk, isolation, identification, LAB, L. rhamnosus, L. plantarum.
PENDAHULUAN Susu dan produk olahannya merupakan salah satu media untuk tumbuh dan berkembangnya BAL. Studi eksplorasi BAL banyak dilakukan untuk menghasilkan berbagai produk fermentasi atau sebagai pangan fungsional. Eksplorasi BAL probiotik asal susu kambing, dan pemanfaatannya untuk menghasilkan kultur starter maupun produk probiotik saat ini masih jarang dilaporkan dan di Indonesia belum dilakukan. Tujuan isolasi untuk mendapatkan koloni tunggal BAL sedangkan tahapan identifikasi bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat BAL Identifikasi BAL dapat dilakukan dengan metode klasik meliputi pengujian morfologi dan sifat biokimia BAL yang dilakukan secara in vitro. Karakteristik morfologi terdiri dari : pewarnaan Gram; karakteristik fisiologis meliputi uji ketahanan pada suhu, pH dan kadar garam tertentu (Ayad et al. 2006). Karakteristik biokimiawi meliputi uji katalase, uji produksi CO2 dari glukosa, produksi dekstran dari sukrosa, produksi NH3 dari arginin. Pengujian tersebut dapat menentukan genus BAL,
34
sedangkan untuk mengetahui sampai tingkat spesies BAL, dapat menggunakan pola fermentasi pada berbagai jenis gula. Identifikasi BAL telah dilakukan pada produk segar dan produk fermentasi. Tujuan identifikasi adalah untuk mendapatkan kultur baru yang berpotensi sebagai starter atau sebagai probiotik (Ayad et al. 2006). Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi BAL asal susu kambing jenis Peranakan Ettawa dan Peranakan Saanen dan melakukan identifikasi berdasarkan sifat morfologi, fisiologi dan biokimianya. Hasil isolasi dan identifikasi BAL diharapkan akan menghasilkan BAL untuk kultur starter dan probiotik untuk pangan fungsional. METODOLOGI Bahan dan Alat Bahan penelitian ini adalah susu kambing, dari jenis Peranakan Ettawa (PE) dan jenis Peranakan Saanen (PESA). Pengujian yang dilakukan dengan menggunakan MRSB, MRSA, HCl 0,1 N, NaOH 0,1 N, aquades steril, kristal violet, iodin, safranin, H2O2, alkohol 96 %, NaCl, Gibson’s semi solid tomato juice, reagen Nessler, bromocresol purple. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH meter, obyek gelas dan penutup, bunsen, autoklaf, vortex, lemari pendingin, timbangan digital, jarum ose. Metode Isolasi BAL (Sujaya et al. 2008) Sampel susu kambing diambil secara aseptis sebanyak 1 ml diperkaya dalam 100 ml MRS cair (MRSB) kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengenceran bertingkat dilakukan setelah sampel diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, kemudian 0,1 ml disebar pada media MRS agar (MRSA) yang mengandung bromocresol purple dalam cawan petri. Koloni BAL akan nampak sebagai koloni yang dikelilingi oleh zona berwarna kuning, selanjutnya diisolasi dan digoreskan pada media MRSA. Penggoresan dilakukan terus-menerus sehingga didapatkan satu koloni yang seragam.
35
Karakteristik Morfologi untuk Identifikasi BAL (Prescott 2002). Pengujian morfologi sel bertujuan melihat bentuk isolat dengan pewarnaan Gram. Bentuk morfologi sel yang diharapkan adalah Gram positif berbentuk batang atau bulat. Karakteristik Fisiologis
untuk Identifikasi BAL (uji ketahanan terhadap suhu,
garam dan pH) (Harrigan 1998) Uji Ketahanan terhadap Suhu. Kemampuan BAL tumbuh pada suhu yang berbeda diuji secara kualitatif. Satu ose isolat BAL dimasukkan dalam dalam media MRSB. Isolat
diinkubasi pada suhu
10, 37, dan 45oC selama 2-5 hari.
Hasil positif
pertumbuhan ditandai adanya kekeruhan pada media tersebut. Uji Ketahanan terhadap Garam.
Bakteri
asam
laktat
memiliki
kemampuan
tumbuh yang berbeda pada media garam. Ketahanan BAL pada media garam diuji dengan menambahkan garam NaCl dalam tabung yang berisi MRSB dengan konsentrasi 4,0 dan 6,5 % serta satu tabung tanpa penambahan garam NaCl sebagai kontrol.
Sebanyak 1 tetes kultur BAL dimasukkan media tersebut kemudian
diinkubasi suhu 37oC selama 7-14 hari. Hasil positif pertumbuhan ditandai adanya kekeruhan pada media tersebut. Uji Ketahanan terhadap pH. Ketahanan isolat BAL pada lingkungan asam, netral dan alkali diuji pada berbagai pH. Sebanyak satu tetes kultur BAL ditumbuhkan pada media MRSB dengan pH 4,4; 7,0 dan 9,6. Media tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 7-14 hari. Hasil positif pertumbuhan ditandai adanya kekeruhan pada media tersebut. Karakteristik Biokimiawi untuk Identifikasi BAL (uji katalase, uji produksi CO2 dari glukosa, dekstran dari sukrosa, NH3 dari Arginin) (Harrigan 1998). Uji Katalase. Uji katalase dilakukan menggunakan hidrogen peroksida (H2O2). Prosedur uji dikerjakan sebagai berikut : satu ose isolat diambil dari media pertumbuhan MRSA, kemudian diletakkan pada obyek gelas dan diteteskan pereaksi
36
H2O2 3% pada permukaan obyek gelas serta dibiarkan beberapa saat. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung. Uji Produksi CO2 dari Glukosa. Pengujian dilakukan pada isolat BAL terhadap produksi gas CO2 dari glukosa. Isolat BAL sebanyak 0,5 ml ditumbuhkan pada media MRSB suhu 37oC selama 24 jam, kemudian isolat tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi berisi medium Gibson’s semi solid tomato juice cair. Agar cair dituang diatas tabung untuk menciptakan kondisi anaerobik, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 2–5 hari. Bakteri asam laktat heterofermentatif membentuk gas yang ditandai dengan pecahnya agar, sedangkan BAL homofermentatif tidak membentuk gas sehingga agar tetap utuh. Uji Produksi Dekstran dari Sukrosa. Satu lup kultur digoreskan pada media sukrosa agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Bakteri asam laktat dari genus Leuconostoc menghasilkan dekstran dengan terbentuknya lendir (mukoid). Uji Produksi NH3 dari Arginin. Isolat BAL sebanyak 0,5 ml ditumbuhkan dalam 10 ml media MRSB yang mengandung arginin, kemudian reagen Nessler ditambahkan dua tetes dan diikubasi pada suhu 37oC selama 2-5 hari.
Pembentukan amonia
ditandai dengan munculnya warna oranye kecoklatan setelah penambahan reagen Nessler. Hasil amonia positif dihasilkan oleh genus Streptococcus. Identifikasi BAL dengan API CH 50 Kultur isolat sebanyak satu ose dimasukkan ke dalam 10 ml media MRSB, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kultur BAL disentrifus 9800 x g selama 10 menit. Pelet yang telah dipisah dimasukkan dalam media API 50 CH dengan pipet steril dan dihomogenkan dengan vortek.
Tahap selanjutnya kultur
dimasukkan dalam 50 sumuran API 50 CH strips. Semua sumuran ditutup dengan minyak parafin untuk memberikan lingkungan anaerobik dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Parameter uji adalah perubahan warna setelah inkubasi selama 24 jam karena terbentuknya asam dan terdeteksi oleh perubahan pH dalam medium yang terpilih. Hasil pengamatan diolah menggunakan software Apiweb™.
