17
METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan dari bulan Agustus 2011 sampai Maret 2012 di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi pada Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor. Bahan dan Alat Alat yang digunakan adalah tabung analisis, cawan petri, oze, bunsen, kapas, gelas piala, mikrotips, erlenmeyer, neraca analitik, sentrifuge, mikropipet, tabung Eppendorf, thermometer, penangas air, pH meter Jenway 3505, magnetic stirer, hot stirer IKA RH basic 2, shaker incubator TAITEC Bioshaker BR-23FP, laminar air flow Bioclean Bench Sanyo, autoclave Tommy SX-500, spreader, inkubator bakteri SANYO, PCR ASTEC, elektroforesis Nyx Technik MIR-153, UV gel doc Scope WD, Freezer SANYO Ultra low. Bahan yang digunakan adalah sample air laut dengan media untuk proses pengkayaan dan identifikasi kualitatif menggunakan aquades, Artificial Sea Water, agar powder, substrat (Locust bean gum), pepton, ekstrak khamir, (NH4)2.SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CO (NH2)2, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2, HCl, NaOH, NaCl, pewarna congo red. Bahan yang digunakan dalam proses analisis enzim mananase secara kuantitatif adalah Reagen berupa reagen dinitrosalisilat (DNS) yang terdiri atas DNS, NaOH padat, fenol, Na2SO3, dan Kalium Natrium Tartrat (KNa-tartrat). Bahan yang digunakan dalam proses identifikasi gen 16S rRNA dan kloning adalah strain bakteri potensial penyandi mananase, InstaGene
TM
Matrix Biorad, agarosa, TAE (Tris Asetat EDTA), Etidium
bromida, go taq®green master mix, primer 9F, primer 1510R.
Cara Kerja Isolasi Mikroba Laut Mikroba laut yang digunakan dalam penelitian berasal dari Pulau Pari Teluk Jakarta, disampling dengan menggunakan metode sea water direct
18
sampling (sampel berupa air laut). Bakteri penghasil mananase diisolasi dengan teknik pengayaan mengikuti Mandels dan Stemberg (1976) dengan memodifikasi sumber karbon. Komposisi media pengayaan, skrining, purifikasi dan identifikasi secara lengkap seperti berikut: Substrat Locust bean gum 0,5%; Pepton 0,075%; Ekstrak khamir 0,05%; Mineral (NH4)2.SO4 0,14%; KH2PO4 0,2%; MgSO4.7H2O 0,03%; CO (NH2)2 0,03%; CaCl2 0,03%; FeSO4.7H2O 0,0005%; MnSO4.7H2O 0,00016%; ZnSO4.7H2O 0,00014%; CoCl2 0,0002% dan pH media 6.0. Mikroba mannolitik diisolasi dari kultur pengkayaan dengan locust bean gum sebagai sumber substrat (sumber karbon berupa manan). Kultur pengkayaan yang telah diinokulasikan air laut hasil sampling diinkubasi dalam shaker incubator selama satu minggu, kecepatan putar 150 rpm pada suhu ruang. Proses isolasi dilakukan dengan cara menginokulasikan hasil kultur pengayaan sebanyak 20 µL dengan faktor pengenceran 10-4 dan 10-5 pada media padat dengan cara disebar dengan menggunakan spreader kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Proses pemurnian isolat dilakukan dengan cara pick –up koloni tunggal yang telah tumbuh pada media isolasi dan ditumbuhkan pada media padat untuk proses identifikasi (Mandels dan Sternberg, 1976).
Uji Bakteri Manolitik Potensial Identifikasi bakteri potensial penghasil enzim mananase dengan cara uji kualitatif dengan pewarnaan menggunakan metode congo red. Bakteri laut yang telah murni diinokulasikan pada media padat (komposisi media pengayaan dengan konsentrasi agar 1,5%) yang mengandung substrat manan (Locust Bean Gum 0,5%), kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu ditambahkan larutan pewarna congo red dengan konsentrasi 0,2% dan diinkubasi
selama
15-30 menit pada suhu ruang, kemudian dilakukan pencucian sebanyak 3 kali dengan menggunakan larutan NaCl dengan konsentrasi 2%. Bakteri mannolitik potensial yang dapat menghasilkan enzim mananase dapat diketahui secara visual yaitu dengan nampaknya zona bening disekitar zona tumbuh koloni (Yopi et al. 2007).
19
Uji Aktivitas Enzim Mananase Aktivitas enzim mananase diuji dengan memipet sebanyak 0,5 mL substrat locust bean gum 0,5% direaksikan dengan 0,5 mL enzim mananase lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1,5 mL reagen dinitrosalisilat (DNS). Perlakuan kontrol dengan cara substrat direaksikan dengan DNS lalu ditambahkan enzim. Sampel dan kontrol dididihkan selama 15 menit lalu didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks dan diukur absorbansinya pada λ= 540 nm (Miller 1959). Pembuatan kurva standar dilakukan dengan mereaksikan berbagai konsentrasi manosa dari 0-10 mg/ml sebanyak 1 mL dengan 1,5 mL DNS lalu dididihkan selama 15 menit dan didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks dan diukur absorbansinya pada λ= 540 nm. Satu unit aktivitas enzim mananase (U) didefinisikan sebagai sejumlah enzim yang dapat mengkatalisis konversi dari 1 μmol substrat manan menjadi manosa dalam 1 menit (Bintang 2010). Identifikasi Mikroba berdasarkan Analisis Gen 16S-rRNA Isolasi Genom Total Identifikasi bakteri manolitik diawali dengan mengisolasi DNA genom total menggunakan metode dari kit InstaGene
TM
Matrix BioRad. Koloni isolat
murni sebanyak satu ose dengan 250 µL mili Q steril dan disentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 10,000 rpm. Supernatan dibuang sedangkan pelet ditambahkan kit InstaGene
TM
Matrix BioRad sebanyak 50 µL, kemudian
larutan diinkubasi pada suhu 56ºC selama 15-30 menit dan divortex dengan kecepatan 100 rpm selama 10 detik dan selanjutnya dipanaskan pada suhu 100ºC selama 8 menit. Tahap akhir ekstraksi DNA yaitu memisahkan DNA (Supernatan) dari komponen lainnya (pelet) dengan sentrifuge pada kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit. Template DNA siap diamplifikasi dengan PCR, jika template tidak langsung dipergunakan maka harus disimpan pada suhu -20°C.
20
Analisis PCR DNA Template diamplifikasi dengan mengambil 2 µL (60 ng/1µL) template yang dicampur dengan 25 µL “Gotaq”. Gotaq adalah campuran dNTP, primer dan buffer PCR. Selanjutnya ditambahkan masing-masing 1 µL primer forward 9F 50 µLM (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-) dan 1 µL primer reverse 1510R 50 µLM (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-) dan ditambahkan milli-Q steril hingga mencapai volume 50 µL. Amplifikasi dilakukan dalam thermocycler dengan tahap pre denaturasi awal selama 2 menit pada suhu 95ºC, tahap denaturasi selama 30 menit pada suhu 95ºC tahap annealing selama 1 menit pada suhu 55ºC dan tahap extension selama 2 menit pada suhu 72°C. Banyaknya siklus amplifikasi yang digunakan yaitu 30 siklus. Elektroforesis Hasil PCR Proses amplifikasi dengan PCR telah selesai maka dilakukan analisis elektroforesis untuk mendeteksi DNA dan keberhasilan hasil proses amplifikasi. Produk PCR sebanyak 3 µL ditambahkan ke dalam sumur gel agarosa, sedangkan untuk marker sebanyak 0,5 µL ditambahkan 0,5 µL Loading dye Fermentas dan 2 µL milli-Q dan dicampur kemudian dimasukan dalam sumur yang berbeda.Proses elektroforesis dilakukan selama 60 menit dengan voltase 50 V dalam larutan Buffer TAE. DNA hasil amplifikasi yang telah dielektroforesis divisualisaikan dengan perendaman agarosa yang mengandung DNA target ke dalam larutan etidium bromida selama 15 menit, setelah itu dibilas dengan aquades selama 10 menit. Dengan menggunakan UV transluminator, pita DNA akan terlihat dan dapat diketahui ukurannya berdasarkan penanda ukuran molekul yang dinyatakan dengan base pair (bp). Konstruksi Pohon Filogenetika Bakteri manolitik yang telah berhasil diamplifikasi gen 16S rRNA-nya dapat dilihat kekerabatannya dengan prokariota lain yang ada di basis data berdasarkan sekuens gen 16S-rRNA-nya. Sekuen dilakukan di Laboratorium 1st BASE Singapura dan data sekuen parsial yang diperoleh akan melalui proses
21
pengeditan dengan menggunakan program Bioedit. Setelah diperoleh data hasil contiq urutan nukleotida berdasarkan amplifikasi dengan primer universal, maka homologinya akan dibandingkan dengan prokariota lain yang ada pada basis data di Gene Bank. Analisis klaster dilakukan menggunakan data base dari situs web RDP (Ribosomal Database Project) dengan situs (http://www.rdp.com). sedangkan pembuatan pohon filogenetik menggunakan program MEGA 5.
