MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ ZAHRADNICKÁ FAKULTA V LEDNICI
Výţiva kvasinek během fermentace moštů révy vinné Bakalářská práce
Vedoucí bakalářské práce: Ing. Mojmír Baroň, Ph.D.
Vypracovala: Petra Šmídová
Lednice 2014
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala panu inţenýrovi Mojmíru Baroňovi, Ph.D. za poskytnutí cenných rad a informací, kterými jako vedoucí, přispěl k vypracování mé bakalářské práce. Děkuji rodině a příteli za jejich trpělivost a povzbuzení.
Abstrakt Výţiva kvasinek během fermentace moštŧ révy vinné je téma, kterým se zabývá tato bakalářská práce. A protoţe kvasinky jsou ţiveny především dusíkem a dusíkatými látkami, v první části práce nalezneme rozdělení dusíkatých látek a popis těch, které jsou pro kvasinky nejdŧleţitější. Nejvíce zmiňovaný bude asimilovatelný dusík. S ním je spojena druhá část práce, která popisuje mechanismus asimilace a veškerou problematiku týkající se výţivy kvasinek. Ve vinařské praxi je dnes běţné stanovovat hodnoty dusíku a dusíkatých látek pro zajištění příznivého prŧběhu fermentace a výroby vína. V bakalářské práci proto dále nalezneme souhrn analytických metod, které se pouţívají ke stanovení dusíku a dusíkatých látek. Podstatná část práce je věnována problematice týkající se fermentace moštŧ révy vinné. Ve třetí části práce jsou popsány příčiny vzniku váznoucí fermentace, vlivy pŧsobící na fermentaci a moţnosti její eliminace. Ve čtvrté a poslední části práce jsou popsány vlivy výţivy na kvasinky a mošt a vyuţití výţivy pro kvasinky v praxi.
Klíčová slova: dusík, kvasinky, výţiva, fermentace
Abstarct Nutrition yeast during fermentation musts of grapes is the theme, which deals with this thesis. And because the yeast is fed primarily nitrogen and nitrogen compounds, in the first part we find the distribution of nitorgen compounds and description of, which are important for yeast. Most mentioned will assimilable nitrogen. It is combined with the second part, which describes the mechanism of assimilation and all the issues relating to nutrition yeast. In the wine practice is now common to set the value of nitrogen and nitrogen compounds to ensure a favorable during fermentation and wine making. In the bachelor thesis therefore further provides a summary of the analytical methods, which are used for determination of nitorgen and nitrogen compounds. A substantial part of the work is paid to problems related to cider fermentation of grapes. In the third part describes the cause of sluggish fermentation, influences on fermentation and possibilities for its elimination. In the fourth and last part describes the effects of nutrition on yeast and cider and use of nutrition for the yeast in practic.
Key words: nitorgen, yeast, nutrition, fermentation
OBSAH 1
ÚVOD ................................................................................................................................. 10
2
CÍL PRÁCE ........................................................................................................................ 11
3
DUSÍKATÉ LÁTKY V HROZNECH................................................................................ 12 Formy dusíku .............................................................................................................. 12
3.1 3.1.1
Organické formy dusíku ...................................................................................... 12
3.1.2
Anorganická forma dusíku .................................................................................. 17 Asimilovatelný dusík .................................................................................................. 17
3.2
4
3.2.1
Amonné ionty ...................................................................................................... 17
3.2.2
Volné aminokyseliny .......................................................................................... 18
KVASINKY A DUSÍK ....................................................................................................... 19 4.1
Vliv dusíku na kvasinky .............................................................................................. 19
4.2
Příjem a vyuţití asimilovatelného dusíku kvasinkami ................................................ 20 Vliv dusíku na víno ............................................................................................. 21
4.2.1
Popis mechanismŧ asimilace....................................................................................... 21
4.3 4.3.1
Transport aminokyselin ....................................................................................... 22
4.3.2
Syntéza aminokyselin.......................................................................................... 23
4.3.3
Katabolismus aminokyselin ................................................................................ 25
4.3.4
Asimilace amonného dusíku ............................................................................... 26 Analytické moţnosti stanovení dusíku ........................................................................ 27
4.4
5
4.4.1
Metoda stanovení veškerého asimilovatelného dusíku ....................................... 27
4.4.2
Metody stanovení volných aminokyselin ............................................................ 27
4.4.3
Metody stanovení amonných iontŧ ..................................................................... 28
FERMENTACE MOŠTŦ ................................................................................................... 30 Vlivy na vznik váznoucí fermentace ........................................................................... 31
5.1 5.1.1
Vliv cukru na fermentaci ..................................................................................... 31
5.1.2
Vliv teploty na fermentaci ................................................................................... 32
5.1.3
Vliv etanolu na fermentaci .................................................................................. 33
5.1.4
Vliv kyslíku na fermentaci .................................................................................. 33
5.1.5
Vlivy ostatních látek ........................................................................................... 34 Moţnosti eliminace váznoucí fermentace ................................................................... 34
5.2 5.2.1
Začínáme ve vinici .............................................................................................. 35
5.2.2
Kontrola kvality sklizených hroznŧ a moštu ....................................................... 36
5.2.3
Kontrola technologických postupŧ při výrobě moštu ......................................... 37
6
KVASINKY V PRAXI ....................................................................................................... 40 6.1
Vliv přidané výţivy na kvasinky a mošt ..................................................................... 40
6.2
Výţiva pro kvasinky ................................................................................................... 41
7
ZÁVĚR ............................................................................................................................... 44
8
SEZNAM TABULEK ......................................................................................................... 45
9
SEZNAM OBRÁZKŦ ........................................................................................................ 46
10 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ................................................................................. 47
1
ÚVOD Nacházíme se v době, kdy se o vinohradnictví a především o vinařství zajímá velká
spousta lidí. Ať uţ se jedná o odborníky, drobno pěstitele, či laickou veřejnost. Všichni si uvědomujeme, ţe réva vinná je historická plodina, která nás doprovází po mnoho tisíciletí a víno z ní vyráběné je nedílnou součástí mnoha kultur a náboţenství. Víno, jako takové, ovšem není jednoduché vyrobit a se stále vyspělejšími technologiemi a náročnějšími konzumenty, je nutné se zaměřit na co nejkvalitnější produkci. V této bakalářské práci se budeme zabývat dusíkatými látkami v révě vinné. Tyto látky jsou nedílnou součástí révy vinné a jejich přítomnost se podílí na mnoha chemických a biochemických procesech. Dusík, jako prvek je potřebný zejména ve vinohradě, kde ovlivňuje rŧst a kvalitu hroznŧ. V moštu jsou následně dusíkaté látky vyuţívány hlavně kvasinkami. Ty je přijímají jako zdroj potravy. Bez těchto látek, a mnoha dalších, by nebyla moţná fermentace a celý proces výroby a vzniku vína by tudíţ nevznikl. Proto je nutné dbát na správné hodnoty dusíku jak v hroznech, tak ve víně. V případě nízkých hodnot mŧţe docházet k fermentaci pomalé, či neúplné a v takovém případě jsou vyrobená vína postihnuta v aroma a v celkové nízké kvalitě.
10
2
CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo prostudovat dostupnou literaturu zabývající se
výţivou kvasinek během fermentace moštŧ, popsat dusíkaté látky v hroznech a především se zaměřit na rozdělení a význam asimilovatelného dusíku jak pro révu vinnou, tak především pro kvasinky. S výţivou kvasinek a fermentací samotnou, jsou spojovány mnohé problémy, např. váznoucí fermentace. Tato problematika byla prostudována a následně popsáno, jak lze váznoucí fermentaci eliminovat a jak jí předcházet pomocí daných technologických procesŧ v běţné praxi.
11
3
DUSÍKATÉ LÁTKY V HROZNECH
3.1
Formy dusíku Dusíkaté látky se v hroznech tvoří dvěma rŧznými syntézami. Tou první, je
syntéza v období tvorby bobulí a ta druhá, v období zaměkání bobulí a konce zrání (Baroň, 2010). V bobulích se dusík mŧţe vyskytovat v organické i anorganické formě. Nezralé bobule obsahují především amonné ionty, které během zaměkání sniţují svŧj obsah, a roste obsah organických dusíkatých látek – aminokyselin. Dusíkaté látky jsou dŧleţitým zdrojem výţivy pro kvasinky během fermentace a přímo ovlivňují kvalitu vína – pomocí nich se tvoří aromatické látky. Hlavní dusíkaté sloučeniny jsou bílkoviny, aminokyseliny a sloučeniny obsahující dusík v amonné formě. Většina dusíku (50 – 90 %) je prezentována jako aminokyseliny volné. Tyto aminokyseliny jsou dŧleţitými prekurzory aromatických látek a v moštu představují zdroj dusíku pro kvasinky. Volné aminokyseliny tvoří 51 – 92 % z celkového asimilovatelného dusíku v bobulích v okamţiku sklizně hroznŧ. Zbytek tvoří bílkoviny, nitráty a amonné ionty. Semena shromaţďují a ukládají většinu bílkovin (více jak 90 %), které slouţí jako zdroj energie, dusíku a síry během klíčení semen. Před zaměkáním bobulí jsou dusíkaté látky importovány pomocí xylému nebo floému. Více neţ polovina veškerého dusíku je importována aţ po zaměkání bobulí a akumulace dusíku probíhá během zrání. Bobule mohou asimilovat také nitráty. (Pavloušek, 2010)
3.1.1 Organické formy dusíku 1. Aminokyseliny – jsou deriváty karboxylových sloučenin, které mohou ve svých molekulách obsahovat jednu a více aminoskupin. Jsou snadno rozpustné v polárních rozpouštědlech, např. voda a etanol. Jejich náboj je odvislý od pH, jsou to amfolity. Aminokyseliny se dělí podle několika kritérií. Mohou se vyskytovat jako kódované, ve vázané nebo volné formě, a jako nekódované, tzv. nestandardní. Dále se mohou dělit z biologického hlediska jako esenciální a neesenciální, podle schopnosti organismu danou aminokyselinu syntetizovat. Přehled aminokyselin viz tabulka číslo 1. 12
2. Oligopeptidy a polypeptidy – vznikají spojením většího mnoţství aminokyselin pomocí peptidických vazeb. Nejdŧleţitější oligopeptidy jsou tripeptidy, mají organoleptické vlastnosti. Peptidy mají příjemné senzorické vlastnosti. 3. Proteiny – makromolekuly vzniklé spojením velkého mnoţství aminokyselin. Jsou to látky, které mohou být nestabilní a zpŧsobovat zákaly bílých vín. Mezi další organické formy dusíku se řadí také amidy, nukleový dusík a pyraziny. (Baroň, 2010)
13
Tabulka 1: Přehled aminokyselin
14
15
3.1.1.1 Důležité aminokyseliny
Arginin a prolin tvoří 60 – 70 % všech aminokyselin ve zralých bobulích, jsou to nejvíce zastoupené aminokyseliny. V hroznech se mŧţe vyskytovat vysoký obsah prolinu v případě dlouhodobého sucha ve vinici. Prolin však nemohou kvasinky v anaerobních podmínkách vyuţívat pro svoji výţivu. Arginin tvoří 6 – 40 % celkového dusíku moštu, tudíţ je dominantní aminokyselinou. Kvasinky ho rády vyuţívají, ale jestliţe mají k dispozici amonný dusík, vyuţívají ho raději neţ arginin. V závislosti na výţivě vinice mŧţe být hlavní aminokyselinou v moště, kterou kvasinky vyuţívají, glutamin. Ten je kvasinkami dobře vyuţitelný, neboť se štěpí na glutamát a amonium. (Pavloušek, 2010) Koncentrace argininu a prolinu se liší v závislosti na odrŧdách, které jsou pěstovány za podobných podmínek. Arginin je akumulován během vývoje ve slupce, duţině a semenech některých odrŧd (např. Charodnnay, Cabernet Sauvignon) a jeho akumulace se zastaví aţ v době zaměkání, zatímco u jiných odrŧd (např. Müller Thurgau) začíná akumulace jiţ od zaměkání. Naopak, většina prolinu je akumulována po zaměkání a akumulace pokračuje během zrání. Prolin často slouţí na ochranu buněk proti osmotickému tlaku. Tudíţ se akumuluje během zrání, ve kterém probíhá ukládání hexóz, coţ zpŧsobuje osmotický tlak. Arginin, další aminokyseliny a bílkovinná rezidua, ale ne prolin, mohou reagovat s cukry v tzv. Maillardově reakaci, která produkuje hnědé polymery - melanomy, které zpŧsobují neoxidační, neenzymatické hnědnutí během zpracování hroznŧ. Ve vysokých koncentracích, prolin a další aminokyseliny (treonin, glycin, serin, alanin, methionin) dávají sladkou chuť, zatímco arginin, lysin, histidin, fenylalanin a valin udávají hořkost. Další aminokyseliny např. glutamin, glutamát, asparagin a asparat mají chuť umami. (Sochor, 2013)
16
3.1.2 Anorganická forma dusíku 3.1.2.1 Minerální dusík
Minerální dusík, tak jak ho popsal Baroň M. (2010), se v duţině bobulí během rŧstové fáze nachází nejčastěji ve formě amonných solí. Prezentuje 80 % celkového dusíku vznikajícího přeměnou dusíkatých látek asimilovatelných kořeny rostlin. Při plné zralosti hroznŧ klesá obsah minerálního dusíku na méně neţ 10 %. Amonné ionty jsou velmi dŧleţitou součástí asimilovatelného dusíku, neboť jsou kvasinkami upřednostňovány jako zdroj výţivy. Obsah amonných iontŧ v moštu je v přímém vztahu k dusíku, který přijímá réva ve vinici. Hnojení dusíkem a přístupnost dusíku, např. z organické hmoty v pŧdě, zvyšuje obsah amonných iontŧ v bobulích. Tato forma dusíku na konci alkoholové fermentace většinou úplně zmizí. (Baroň, 2010)
3.2
Asimilovatelný dusík
Asimilovatelný dusík, tedy dusík, jeţ jsou kvasinky schopny vyuţít je nutný pro jejich rozmnoţování a samotnou činnost. V hroznech se přirozeně vyskytuje v mnoţství od 100 do 500 mg.l-1, optimální hodnota je kolem 200 mg.l-1. Toto mnoţství postačuje k tomu, aby mohla
probíhat úplná fermentace.
Mošt
s
menším
obsahem
asimilovatelného dusíku, tj. méně neţ 150 mg.l-1, vede k pomalému nebo k úplnému zastavení kvašení. Amonné ionty a volné aminokyseliny, jak uţ bylo uvedeno výše, jsou hlavními sloţkami asimilovatelného dusíku. (Pavloušek, 2010)
3.2.1 Amonné ionty
Amonné ionty tvoří 80 % celkového dusíku přijímaného kořeny révy. Jejich význam je spojován především s procesem dozrávání hroznŧ a úzce souvisí s ročníkem, klimatem, odrŧdou, podnoţí a oblastí pěstování. V případě nízkých koncentrací, se nejčastěji jedná o přezrálý materiál a v takových případech je nutné přidat do moštu 17
výţivu v podobě fosfátu nebo sulfátu diamonného. Naopak při přebytku amonných iontŧ dochází ke vzniku neţádoucích produktŧ rŧzného charakteru. Zvýšená tvorba vyšších alkoholŧ, které se dále nepřeměňují na příjemnější estery, zvýšená tvorba sirnatých sloučenin s typickými „sirkovými“ tóny, vyšší tvorba těkavých kyselin. (Baroň, 2010)
3.2.2 Volné aminokyseliny
Volné aminokyseliny tvoří ve zralých hroznech 30 – 40 % celkového dusíku. Jsou velmi výraznými prekurzory tzv. aromatických esterŧ a dokáţou velmi výrazně ovlivnit květinové a ovocné aromatické tóny ve vínech. Výrazně se proto podílí na aromatickém charakteru bílých a rŧţových vín. Jsou součástí bezcukerného extraktu vína. Mezi nejdŧleţitější aminokyseliny se řadí arginin a prolin (viz 3.1.1). Aminokyseliny jsou také stavební součástí bílkovin, které tvoří větší řetězce aminokyselin. Díky této vlastnosti však nemohou kvasinky tyto sloţitější sloučeniny vyuţívat. (Pavloušek, 2013)
18
4
KVASINKY A DUSÍK
4.1
Vliv dusíku na kvasinky Dobrá aktivita kvasinek je základem pro úplné alkoholové kvašení při výrobě
vína. Optimální biologické podmínky pro kvasinku jsou přítomnost kyslíku, vyváţené mnoţství ţivin a odpovídající teplota. Kromě glukózy a fruktózy, které nejsou limitujícími faktory v révovém moštu, potřebují kvasinky snadno metabolizovatelné zdroje dusíku (amonium – NH4, aminokyseliny), rŧstové faktory (vitamíny), mikroţiviny (minerální látky) a faktory přeţití (mastné kyseliny s dlouhým řetězcem a steroly). Výţivové sloţení přírodního révového moštu mŧţe být velmi proměnlivé z roku na rok v závislosti na úrodnosti pŧdy a klimatických podmínkách. Jestliţe je přirozená koncentrace nevyrovnaná musí výrobce vína přidat určité ţiviny, aby optimalizoval výţivu kvasinek a vyhnul se zpomalení kvašení a tvorbě neţádoucích aromatických projevŧ v prŧběhu kvašení. Koncentrace dusíku v hroznech je závislá především na odrŧdě, podnoţi a podmínkách pěstování – hnojení. Obsah dusíku v moště i víně je rovněţ závislý také na technice zpracování, případně technologii kvašení. U přezrálých hroznŧ se mŧţe obsah dusíku zvýšit také v dŧsledku sníţení obsahu vody. (Baroň, 2010) U bílých odrŧd jsou problémy s nízkým obsahem dusíku pravidelné a někdy i velmi výrazné. Technologie zpracování bobulí před lisováním má významný vliv na obsah asimilovatelného dusíku. Nejniţší podíl asimilovatelného dusíku lze očekávat při lisování celých hroznŧ, následovaný odstopkováním bez výraznějšího poškození bobulí, mírným drcením bobulím, hrubším drcením bobulí a macerací bílých bobulí, kde jiţ většinou nebývá problém s obsahem asimilovatelného dusíku. Všeobecně při výrobě vína pak obsah dusíku ovlivňuje délka macerace. Celkový obsah dusíku v červených vínech mŧţe být aţ dvojnásobný v porovnání s bílými víny. To zpŧsobuje fakt, ţe při výrobě červeného vína se hrozny nejprve několik hodin, ale i dní, nechají macerovat a během této macerace se uvolňuje více dusíkatých látek ze slupek a semen. Dusík, který kvasinky nespotřebují, následně zŧstává ve víně a stává se součástí bezcukerného extraktu. V suchém víně se mohou dusíkaté látky nacházet v mnoţství aţ několika desítek procent. V hroznové šťávě se dusík nachází v minerální formě, jako amonné soli a v organické formě, kterou tvoří skupiny aminokyselin, oligopeptidŧ a polypeptidŧ. 19
4.2
Příjem a vyuţití asimilovatelného dusíku kvasinkami
Kvasinky musí nutně přijímat dusík jako svŧj zdroj výţivy pro následný rŧst a rozmnoţování. Jak udává Baroň (2010), směs amonných iontŧ a aminokyselin se ukázal jako nejlepší zdroj dusíku. Amonium – NH4, je nejsnadněji asimilovatelný zdroj dusíku pro kvasinky v prŧběhu kvašení. Dostupnost dusíku na začátku kvašení je zásadní pro tvorbu nových buněčných stěn, tvorbu enzymŧ a také pro tvorbu membránových bílkovin, které se nachází v buněčné membráně a odpovídají za transport cukrŧ a aminokyselin. Proto by měly být amonné ionty přítomné v prŧběhu rozmnoţovací fáze a začátku kvašení. Rŧst těl kvasinek není ale vţdy nutně podmíněn asimilací aminokyselin. Nejlépe transformovatelné, ale ne v hojném počtu, jsou také aminokyseliny v buňkách kvasinek. Samotné sloţení buněčných stěn kvasinek záleţí na kultivačních podmínkách a na sloţení moštu. Kvasinky se snaţí co nejrychleji odjímat dusíkaté látky z moštu a skladovat je ve svých vakuolách pro pozdější pouţití. Předpokládá se, ţe takto uloţené zásoby jsou vyuţity v dalších fázích fermentace, kdy se v moštu nachází jiţ větší mnoţství etanolu, který silně inhibuje transport aminokyselin. Amonné ionty jsou snadno asimilovatelné a nahrazují jakoukoliv potřebu dusíkatých látek. Naproti tomu polypeptidy a bílkoviny neovlivňují rŧst kvasinek, dokud nejsou hydrolyzované. (Baroň, 2010) Pokud dochází k přídavku výţivy, musí být proveden v první polovině kvašení, protoţe pozdější přídavek nemŧţe být přijímaný kvasinkami díky zvyšující se hladině alkoholu. Nadměrné mnoţství amonných iontŧ vede k problémŧm se schopností příjmu aminokyselin, coţ je dŧvod pro to, aby dávky byli stanovené na základě konkrétních nedostatkŧ. Kvasinky jsou schopny aminokyseliny vyuţívat trojím zpŧsobem: a) Přímou integrací bez transformace bílkovin. b) Ziskem aminoskupiny, která je dále pouţita na syntézu jiných amino skupin. Zbylý uhlíkový skelet je vyloučen. c) Molekuly aminokyselin mohou být pouţity jako zdroj uhlíku v metabolických reakcích. Kvasinky jsou zároveň schopny zuţitkovat zbývající amoniakální dusík. 20
4.2.1 Vliv dusíku na víno
Výţiva dusíkem významně pŧsobí na samotnou kvalitu vína. Při jeho nedostatku je v hroznech nízký obsah volných aminokyselin, tedy asimilovatelného dusíku, a zhoršuje se kvalita tvorby aromatických látek ve víně během kvašení. Při výrobě červených vín mŧţe nedostatek dusíku zhoršovat podmínky pro prŧběh jablečno-mléčné fermentace. Při nadbytku dusíku je kvašení bezproblémové, ale zvyšuje se tvorba vyšších alkoholŧ na úkor aromatických esterŧ. Tvoří se také bílkoviny zpŧsobující bílkovinné zákaly. V extrémních případech se mohou tvořit biogenní aminy, které zpŧsobují alergické reakce a negativně ovlivňují zdraví člověka. (Pavloušek P., 2011)
4.3
Popis mechanismů asimilace
Hlavní potřeba dusíku je k syntéze proteinŧ. K této syntéze je vyuţíváno řady metabolických přeměn a cest, které jsou pro všechny organismy stejné. Přijaté formy dusíku mohou být zařazeny do syntézy přímo, nebo mohou být metabolicky transformovány. Transport aminokyselin do těl kvasinek je zajišťován několika procesy. Tím prvním, je penetrace aminokyselin a amonia pomocí aktivace velké skupiny transportních proteinŧ, tzv. permeas. Druhou transportní cestou mŧţe být vyuţití obecné aminokyselinové permeasy (OAP), která transportuje všechny aminokyseliny a je aktivní především v druhé polovině fermentace. Tento transport ovšem inhibují amonné ionty. Další transportní cestou mohou být specifické permeasy, které jiţ nejsou inhibovány amonnými ionty a jsou aktivní od začátku fermentace, tedy v „lag-fázy“. Asimilují velké mnoţství aminokyselin obsaţených v moštu. (Baroň, 2010)
21
4.3.1 Transport aminokyselin
Aminokyseliny potřebují pro svŧj pohyb aktivní transport, coţ je zajišťováno pomocí permeas, které transportují aminokyseliny společně s protony. Takto spojené aminokyseliny s protony prochází stěnou buňky v tzv. symportu. Proton, který pŧsobí jako přenašeč, je zpětně vyloučen proti koncentračnímu gradientu za potřeby vyuţití energie (ATP). (Baroň, 2010) Obrázek 1: Transport aminokyselin přes plazmatickou membránu Plazmatická membrána ↓ Cytosol
Externí medium
Transport aminokyselin mŧţe být mimo jiné, také inhibován etanolem. Ten mění permeabilitu fosfolipidové membrány, která se tak stává více permeabilní. Nastane masivní pronikání vodíkových iontŧ do buněk, čím se výrazně sniţuje, aţ zaniká symport . Kvasinky proto vyuţívají aminokyseliny především v „lag-fázy“, kdy je ukládají do vakuol pro pozdější vyuţití. V této fázi je koncentrace etanolu nízká. (Kumšta, 2012)
22
4.3.2 Syntéza aminokyselin
Kvasinky moho přiajeté aminokyseliny zapojit rovnou do stavby proteinŧ pomocí fixace amonného iontu na uhlíkatý skelet získaný při metabolismu cukrŧ. V tomto procesu mají dŧleţitou roli aminokyseliny glutamát a glutamin. (Baroň, 2010) NADP+ glutamát dehydrogenáza (z genu GDH1) produkuje glutamát z amonného iontu a molekuly kyseliny α-ketoglutarové, která je meziprodukt cyklu kyseliny citronové. Dále kvasinky mají NAD+ glutamát dehydrogenázu (z genu GDH2), která se uplatňuje v katabolismu glutamátŧ. NADP+ GDH bude aktivní, je-li v médiu dostatek amonných iontŧ jako zdroj dusíku. NAD+ GDH bude naopak aktivní, je-li zdroj dusíku glutamát. (Baroň, 2010) Obrázek 2: Fixace amonného iontu na uhlíkatý skelet meziproduktŧ glykolýzy
α-ketoglutarát
glutamát
Obrázek 3: Syntéza glutaminu
glutamát
glutamin
Pokud je N jiţ asimilován ve formě glutamátu (Glu) prostřednictvím aktivity glutamin syntázy (GS) a glutamátsyntázy, mŧţe být poměrně rychle převeden na jiné aminokyseliny prostřednictvím aktivity aminotransferáz (transamináz). Tyto enzymy katalyzují reversibilní reakce, kde je jako koenzym těsně vázaný pyridoxal-5-fosfát 23
(PLP), a jsou přítomny v metabolismu většiny aminokyselin. Pyridoxal fosfát je transaminační kofaktor, který je získáván z pyridoxinu (vitamin B). Syntéza jedné aminokyseliny často vyţaduje degradaci aminokyseliny jiné. Aminotransferázy katalyzují přenos aminoskupiny z druhého uhlíku příslušné aminokyseliny na druhý uhlík příslušné oxokyseliny. Takto vzniká nová aminokyselina a nová oxokyselina. Aminokyseliny mohou být v určitých případech nahrazeny aminy, které poskytují příslušné aminoskupiny. Jako akceptorové molekuly aminoskupin mohou slouţit také aldehydy. Koenzym PLP (pyridoxal-5-fosfát) je přeměněn na pyridoxamin-fosfát prostřednictvím přenosu aminoskupiny ze substrátu. Tato aminokyselina se tedy stává oxokyselinou a následně je uvolněna. Pyridoxamin-fosfát přenáší nově získanou aminoskupinu na oxokyselinu a dává tak vzniknout nové aminokyselině. (Neuberg, 2011) Obrázek 4: Přenašeči aminoskupin
Další
transaminační
reakce
jsou
jednoduché.
Glutamát,
jako
donor
aminoskupiny, se podílí na vzniku asparátu nebo alaninu transaminací glutamátu na oxalacetát nebo pyruvát: Oxalacetát Pyruvát
+ +
glutamát glutamát
→ →
asparát alanin
+
+
24
α-ketoglutarát
α -ketoglutarát
Aminokyseliny jsou rozděleny, podle vzniku aminokyselin, do šesti biosyntetických rodin: Obrázek 5: Biosyntézní cesty aminokyselin 1.
2.
3. 4.
5.
6.
2-oxoglutarátová → glutamát → glutamin → prolin → arginin → lyzin oxalacetátová → aspartát → asparagin → metionin → treonin → izoleucin → lyzin 3-fosfoglukonátová → serin → glycin → cystein pyruvátová → alanin → valin → leucin fosfoenolpyruvátová + erytróza-4-fosfátová → fenylalanin → tyrozin → tyrozin → tryptofan ribóza-5-fosfátová → histidin
4.3.3 Katabolismus aminokyselin
Aminokyseliny potřebné pro produkci proteinŧ, se neobejdou bez základní sloţky, amonného iontu. Toho není vţdy dostatečné mnoţství v prostředí, kde se kvasinky vyskytují. Ty jsou ale schopny získávat amonium pomocí rŧzných reakcí. Nejčastější reakcí je přenos α-amino skupiny některé z dostupných aminokyselin na αketoglutarovou kyselinu za vzniku glutamátu. Tato reakce je katalyzována aminotransferázou nebo transaminázou, kde je hlavní sloţkou pyridoxal fosfát (PLP). Glutamát je poté deaminován oxidativní cestou za vzniku NH4+. (Baroň, 2010) Obrázek 6: Oxidativní deaminace aminokyselin α-aminokyselina
+
α-ketoglutarát
NADH + NH4
transamináza α-ketokyselina
Glutamát dehydrogenáza +
Glutamát
NAD + H2O
25
Během transformace je pyridoxal fosfát přechodně transformován na pyridoxamin fosfát (PMP). Obrázek 7: Pyridoxal fosfát v transaminačních reakcích Aminotransferáza Aminotransferáza
PLP-aminotransferáza meziprodukt (E-PLP)
PLP-aminotransferáza
Ketokyselina
PMP
4.3.4 Asimilace amonného dusíku
NO3− je redukován a začleněn do metabolismu buňky sérií asimilačních enzymŧ. Ionty NO3− jsou nejprve redukovány na ionty NO2− enzymem nitrátreduktázou (NR). Následná redukce na NH4+ se děje prostřednictvím nitritreduktázy (NiR). NH4+ je následně napojen na uhlíkové skelety pro vytváření aminokyselin v cyklu GS/GOGAT (enzym glutaminsyntetáza (GS) a glutamátsyntáza nebo glutamát-2-oxoglutarát aminotransferáza (GOGAT). Aktivita těchto asimilačních enzymŧ je regulována na mnoha úrovních: transkripčně, translačně nebo post-translačně. (Neuberg, 2011)
26
4.4
Analytické moţnosti stanovení dusíku
4.4.1 Metoda stanovení veškerého asimilovatelného dusíku a) Metoda FAN (free amino nitrogen) vyuţívá jako činidlo ninhydrin, který reaguje s volnou α-aminokyselinou za vzniku CO2, NH3 a příslušného aldehydu. Vzorky jsou měřeny na spektrofotometru. Metoda indikuje všechny α-aminokyselin včetně prolinu, coţ zkresluje mnoţství asimilovatelného dusíku v moštu. Tato ninhydrinová metoda současně detekuje také část amonných iontŧ (30 – 35 %). b) Metoda NOPA – přesnější metoda pouţívající o-ftaldialdehyd, je schopna detekovat dusík přítomný v α-aminokyselinách pomocí derivatizace primární aminoskupiny specifickou látkou o-ftaldialdehydem. Metodou NOPA je detekováno asi 3,5 % amoniových iontŧ, které jsou druhým hlavním zdrojem asimilovatelného dusíku. c) Formaldehydová titrace – metoda nenáročná na poţadovanou aparaturu, kdy hranice detekce je nízká (8,5 mg.l-1). Lze ji provádět přímo v provozu, coţ umoţňuje rychlé stanovení YAN, sniţuje tak náklady na výţivu a zlepšuje kontrolu nad provozem, tudíţ kontrolu nad vínem samotným. Metoda vyuţívá reakce aminokyseliny s formaldehydem, který aminokyselinu blokuje a plnou měrou se mŧţe uplatnit kyselý charakter karboxylové skupiny. Takto modifikované aminokyseliny mŧţeme titrovat hydroxidy podobně jako např. kyselinu octovou.
4.4.2 Metody stanovení volných aminokyselin Abychom byli schopni rozlišit amonné ionty, jednotlivé aminokyseliny a jejich případný vývoj v čase, je potřeba pouţít sloţitější analytické postupy a přístroje. a) Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) – tato metoda pracuje s úzkými kolonami, k jejichţ plnění se pouţívá materiál s malými částicemi (o prŧměru 3 aţ 10 mm). Eluát vytékající z kolony prochází prŧběţně detektorem, který automaticky a kontinuálně měří některou z fyzikálních vlastností eluátu, např. absorpci UV, fluorescenci, vodivost, index lomu, apod. Předností HPLC je 27
rychlost analýzy, vysoká dělící schopnost, moţnost automatické detekce, identifikace a kvantitativní vyhodnocení chromatografu. b) Tenkovrstvá chromatografie (TLC) – v dnešní době nahradila chromatografii papírovou, která je časově náročná. TLC je kombinací metod papírových a sloupcových. Zvolený materiál je rozprostřen na skleněnou, celuloidovou nebo hliníkovou podloţku, kde vytvoří tenkou vrstvu. Následně je vyuţito principu rozdělovací, adsorpční, ionexové i afinitní chromatografie. V praxi je tato metoda velmi oblíbená pro svoji rychlost (10 aţ 30 minut) a jednoduchost provedení. c) Nukleární magnetická rezonance (NMR) – je optická metoda, nedestruktivní a selektivní, schopná simultánní detekce velkého počtu nízkomolekulárních sloţek v komplexních směsích. Výhodou je jednoduchá a časově nenáročná příprava vzorku. Vyuţívá magnetické vlastnosti některých atomŧ, které mohou v magnetickém poli absorbovat elektromagnetické záření, jehoţ vlnová délka odpovídá radiovým vlnám. Na spektru se získají absorpční maxima, ze kterých mŧţeme určit strukturu organických látek i jejich konfiguraci. Signály aminokyselin ve víně jsou NMR spektru překryty signály sloučenin, které jsou ve víně převládající, tj. voda, etanol a glycerol, je tady nutné tyto signály potlačit.
4.4.3 Metody stanovení amonných iontů
Měření
amonných
iontŧ
se
provádí
nejčastěji
enzymatickou
nebo
spektrofotometrickou cestou. a) Spektrofotometrických metod existuje celá řada. Jsou zaloţeny na specifických reakcích k tvorbě barevných sloučenin. Takto lze při rŧzných vlnových délkách určit mnoţství amonných iontŧ v měřeném roztoku. b) Stanovení s Nesslerovým činidlem – je zaloţeno na reakci amoniaku a hydroxidu alkalických kovŧ s tetrajodortuťnatanem sodným nebo draselným za vzniku Millonovy báze.
28
c) Iontově selektivní metody – vyuţívají migrace kladně nabitých amonných iontŧ v elektrickém poli a jejich následné kvantifikace podle kalibrační křivky. Patří sem například izotachoforéza, coţ je moderní analytická separační technika, která umoţňuje analyzovat směsi ionogenních látek v roztocích a získat v krátké době (4 aţ 40 minut) snadno vyhodnotitelné údaje o kvantitativních i kvalitativních sloţeních vzorkŧ.
29
5
FERMENTACE MOŠTŮ Hroznový mošt je velmi rychle zkvasitelné medium, ve kterém kvasinky nacházejí
potřebné látky pro zajištění svých ţivotně dŧleţitých funkcí. Sacharidy (glukosu a fruktosu) vyuţívají jako zdroj uhlíku a energie, etanol dává vínŧm jejich hlavní charakter. Organické kyseliny (vinná a jablečná) a minerální soli (fosforečnany, sulfát, chlorid, draslík, vápník a hořčík) zajišťují vhodné pH. Hroznový mošt také obsahuje látky slouţící jako rŧstové faktory (vitaminy) a faktory přeţití. Ostatní vinné sloţky (fenolové sloučeniny, aroma) přispívají k tvorbě celkového charakteru vína, ale nehrají zásadní roli v procesu kvašení. Existují rŧzné faktory, které mohou narušit rŧst kvasinek a kinetiku kvašení. Některé faktory mají chemickou povahu. Zde se řadí nutriční nedostatky nebo přítomnost inhibitorŧ, které se tvoří v prŧběhu fermentace (etanol, mastné kyselin, atd.), ale také fungicidy, antiseptika a SO2. Ostatní mohou mít fyzikálně – chemickou povahu, např. okysličení, teplota. Konec fermentace mŧţe vést k rozvoji neţádoucích mikroorganismŧ. Ty mohou antagonizovat poţadovaný kmen kvasinek. Úspěšné ukončení kvašení záleţí na všech těchto faktorech. Perfektně zvládnutá fermentace je jedna z hlavních odpovědností vinaře, který musí pouţít nezbytné prostředky k tomu, aby nedošlo k mikrobiálním odchylkám a vést kvašení do jeho konce, tj. prokvašení do sucha. Váznoucí fermentace je závaţný problém. Nejen, ţe jde často obtíţně restartovat, ale mŧţe vést k bakteriálnímu kaţení, jako jsou mléčná onemocnění. (Ribéreau-Gayon et al. 2006)
30
5.1
Vlivy na vznik váznoucí fermentace
Alkoholová fermentace je jedním z nejdŧleţitějších procesŧ při výrobě vína. Problémy, které se mohou vyskytnout během alkoholového kvašení, mají ekonomický a kvalitativní charakter. Nejčastějším případem je předčasné ukončení rŧstu kvasinek a fermentace, coţ má za následek nízký obsah etanolu a vysoký obsah nefermentovaných cukrŧ ve víně. Závaţným problémem je nedostatek dusíku. Není-li ve víně dostatek tohoto prvku, pak dochází k limitovanému rŧstu kvasinek a ke zpomalování alkoholové fermentace. Minimální koncentrace asimilovatelného dusíku pro zdárné dokončení fermentace se odhaduje na 140 – 150 mg.l-1. Ovšem toto rozmezí nebere v potaz vysokou koncentraci cukrŧ v moštu. Dle některých studií je potřeba asimilovatelného dusíku mezi 200 aţ 350 mg.l-1 (21-28˚NM). Kvasinky ke svému rŧstu potřebují i přítomnost kyslíku a jen za jeho přítomnosti mŧţe dojít k největšímu nárŧstu kvasniční hmoty a potencionálnímu prokvašení „do sucha“. Bez počátečního kyslíku mŧţe být fermentace pomalá. Z tohoto dŧvodu se vinné mošty okysličují či provzdušňují a s opatrným přidáním SO2 mohou být oxidativní problémy omezeny. (Bulušek, 2010)
5.1.1 Vliv cukru na fermentaci
Vysoká cukernatost moštu mŧţe zpomalit či dokonce zastavit alkoholovou fermentaci, protoţe pro kvasinky je vyšší obsah cukru inhibitorem. Čím je vyšší cukernatost moštu, tím víc se zvyšuje osmotický tlak na kvasinky. Při 300 g.l-1 moštu dochází ke stresovým podmínkám a při obsahu cukru nad 600 g.l-1 je fermentace zcela nemoţná. Cukr je pro kvasinky zdrojem uhlíku (energie), avšak přidání cukru do kvasícího moštu se nedoporučuje, protoţe by kvasinkám zpŧsobilo šok. Kvasinky kvasí cukry a tato činnost mŧţe být zastavena jedině tehdy, pokud jsou všechny molekuly cukru spotřebovány. Bakterie mléčného kvašení pak výhradně rozkládají molekuly kyseliny jablečné během procesu jablečno-mléčné fermentace. Pokud kvasinky zastaví činnost před úplným vyčerpáním cukru z moštu, mohou se bakterie rozvíjet. Bakteriální rozvoj závisí na několika faktorech, včetně počátečního mnoţství siřičitanŧ v hroznech 31
a moţným přídavkem lysozymu během inokulace jablečno-mléčného kvašení. Kyselina octová se tvoří v případě, jsou-li mléčné bakterie, zejména heterofermentativní Oenococcus, přítomny v médiu obsahující cukr. V těchto případech se obsah těkavých kyselin rychle zvýší na nepřijatelnou úroveň, i kdyţ je relativně malá koncentrace zbytkového cukru. Ve skutečnosti bakterie vytváří kyselinu octovou z cukru po jejich rŧstové fázi, během níţ se kyselina jablečná přizpŧsobí. V dŧsledku toho, pokud nastala váznoucí fermentace, mŧţe vinař nechat jablečno-mléčnou fermentaci pokračovat aţ do jejího konce před inhibicí bakterií. Zbytkový cukr není přijatelný v suchých bílých vínech, ani ve většině vín červených. Váznoucí fermentace proto vyţaduje restartovat činnost kvasinek v nepřátelském prostředí. Je zřejmé, ţe v případě, kdy je obsah alkoholu zvýšený (13 % obj.), jsou šance na restart mizivé. (Ribéreau-Gayon et al. 2006)
5.1.2 Vliv teploty na fermentaci
Dŧleţitou roli hraje i teplota fermentace. Optimální teplota pro vývoj kvasinek je od 20 do 25 °C. Při 29 ºC dochází ke zpomalení fermentace a při teplotách vyšších jak 37 ºC nastává kompletní ukončení fermentace. Vysoká teplota během kvašení zpŧsobuje také vysoké ztráty volatilních látek a nadměrnou tvorbu vyšších alkoholŧ, coţ ve víně zpŧsobuje nepříjemné zápachy organických rozpouštědel. Naopak při niţších teplotách dochází k pozvolnějšímu prŧběhu fermentace, nízkým ztrátám alkoholu a buketních látek. Je zde ale moţnost potlačení odrŧdového charakteru vína. (Baroň, 2013)
32
5.1.3 Vliv etanolu na fermentaci
Etanol, stejně jako teplota a vyšší obsah cukru, je pro kvasinky inhibitorem. Je dŧleţité podotknout, ţe citlivost na tyto inhibiční látky je dána druhem a kmenem kvasinek. Etanol, který je produkován během fermentace, zpomaluje vstřebávání dusíku a paralyzuje kvasinky. Pŧsobí tak, ţe modifikuje aktivní buněčný dopravní systém přes membránu buňky. Mnoţství alkoholu nutného k blokaci fermentace závisí na mnoha faktorech. Teplotě, provzdušňování a jiţ zmíněném kmenu kvasinek. Přítomnost etanolu v době inokulace prodluţuje latentní fázi a sniţuje buněčné násobení. Tento účinek etanolu na rŧst kvasinek a rychlost fermentace dochází při nízkých koncentracích na začátku kvašení. Obtíţnost restartovat váznoucí fermentaci je proto pochopitelné. Přídavek alkoholu do moštu zpomaluje zahájení kvašení a omezuje vstřebávání dusíku a vzniku alkoholu. Kvasinky mohou pokračovat ve své činnosti aţ do výše obsahu alkoholu, kdy mnoţství inhibičního etanolu není příliš mnoho. (Ribéreau-Gayon et al. 2006)
5.1.4 Vliv kyslíku na fermentaci
Pravděpodobně nejúčinnější látkou, která nám mŧţe pomoci při problematickém kvasu je O2 . Kyslík má největší efekt na asimilování dusíku. V tomto ohledu jsou na dusík kladeny větší nároky na jeho přítomnost při začátku kvašení. Provzdušňování moštu, nikoliv fermentujícího, nám příznivě ovlivňuje aroma, ale také evokuje syntézu sterolŧ. Provzdušnění moštu po inokulaci selektovanými kvasinkami podporuje rozvoj kvasného procesu. Samotná oxidace vede k tvorbě počátečních rŧstových ţivin pro kvasinky, jako jsou mastné kyseliny a jiţ zmíněné steroly. Podobně, jako slabé dodání vzduchu (např. díky přečerpání) v polovině alkoholového kvašení, je vyuţitelné pro získání uspokojivého vývoje konečné fáze kvasného procesu.
33
5.1.5 Vlivy ostatních látek
Váznoucí či zastavenou fermentaci mŧţou dále zpŧsobit i residua pesticidŧ, C6, C8 a C10 mastné kyseliny, příliš čisté mošty a botryticin. Nasycené mastné kyseliny (C6-kapronová, C8-kaprilová a C10-kaprová) se zdají být zajímavým prostředkem pro zastavení fermentace, ovšem tyto kyseliny jsou senzoricky aktivní a vínŧm dodávají mýdlovitost. U příliš čistých bílých moštŧ se kvasinky nemusejí dostatečně vyvíjet (sníţení výţivových látek a odejmutí kyslíku uvězněného v nerozpustných tuhých látkách) a dříve hynou (cca 14 dní). Navíc kvasinky v čistých moštech produkují mnohem více mastných kyselin a vyšších alkoholŧ (esterŧ). Kalové částice jsou navíc nositelem rostlinných tónŧ a odstraněním těchto kalových částic mošt ochuzujeme o populaci kvasinek, především těch apikulátních. Také zkvasitelnost čistých moštŧ je mnohem obtíţnější, neţ těch kalných. Zejména ze začátku kvašení spolu s vyšší teplotou (nad 25 ºC) hrozí u těchto moštŧ nebezpečí vysokého obsahu zbytkového cukru. Botryticin je látka, kterou produkuje plíseň Botrytis cinerea. Tento inhibitor kvašení mŧţeme eliminovat pouţitím SO2, popř. vyšší teplotou. Všechny výše zmíněné faktory mohou mít za následek vyšší obsah zbytkového cukru, niţší obsah etanolu, problém se znovu – rozkvašením, vysoké mnoţství volné SO2, bakteriální nákazu (malolaktická fermentace) a dále jsou to nečisté tóny ve víně a vysoká těkavost. Právě u zastavených červených moštŧ se zbytkovým cukrem mŧţe naskočit spontánní malolaktická fermentace, která produkuje kyselinu mléčnou a octovou (zvyšování těkavých látek). Váţným problémem je znovu – rozkvašení moštu, u kterého došlo k zastavení alkoholové fermentace. (Bulušek, 2010)
5.2
Moţnosti eliminace váznoucí fermentace
Častá váznoucí fermentace vyplývá z chyby vinaře. Některá vinařství mají problémy s váznoucí fermentací rok po roku a změna přichází aţ s novým vinařem. V případě, ţe jsou známy potřebné operace k odstranění váznoucí fermentace, nebývají mnohdy provedeny správně. Při výrobě červeného vína váznoucí fermentace často 34
vyplývá z vysoké teploty během zahájení kvašení a špatná kontrola teploty nádrţe v prŧběhu fermentace. Stejně tak mŧţe k váznoucí fermentaci přispět nedostatečně rozpuštěný O2 během čerpání. Hustota moštu, která zŧstává stabilní během 24 aţ 48 hodin potvrdí zablokované kvašení. V tomto případě existují rŧzné postupy, jak restartovat kvašení, aniţ by vzniklo bakteriální kaţení. Je ale nutné, aby veškeré operace vhodné pro fermentaci, byly pouţity od začátku vinařského procesu tak, aby se zabránilo vzniku váznoucí fermentace. Pro celé zahájení kvašení mají velký význam jiţ výše zmíněné aktivátory fermentace, neboli rŧstové a survival faktory. Jedná se většinou o látky, které se v hroznech vyskytují v dostatečném mnoţství (μg.l-1) a není nutné je do moštu přidávat. Jsou to především vitamíny (biotin, thiamin), kyselina pantothenová, steroly a některé vyšší mastné kyseliny, které zajišťují permeabilitu membrány a tím ovlivňují transport hmoty. Mezi další aktivátory fermentace patří látky, které mŧţeme přidat a které zajišťují především utilizaci dusíku. Hydrolyzovaný extrakt z kvasinek obsahuje minerály, dusík a mikroprvky. Vhodné jsou komplexní výţivné směsi pro kvasinky, apod. (Ribéreau-Gayon et al. 2006)
5.2.1 Začínáme ve vinici
Aby mohla být fermentace zahájena, potřebují kvasinky dostatečné mnoţství asimilovatelného dusíku, neboli YAN. Mnoţství tohoto dusíku v hroznech mŧţeme ovlivnit jiţ ve vinici a to několika zpŧsoby. Dŧleţité je ošetřování vinice a snaha o vyváţený poměr listové plochy a násady hroznŧ. Extrémně vysoká násada hroznŧ vede ke stárnutí listové plochy a rychlému opadu listŧ, naopak nízké zatíţení keře zpŧsobuje, ţe asimiláty jsou vedeny do bujících letorostŧ a ne do hroznŧ. Kvalitní listová plocha nám tedy zajišťuje dobrý příjem asimilátŧ a tím optimální obsah asimilovatelného dusíku. Sucho a zpŧsob ošetřování pŧdy ve vinici, jsou dalšími faktory určující mnoţství asimilovatelného dusíku v hroznech. Patrně nejvýznamnější je závislost mezi zpŧsobem ošetřování pŧdy ve vinici, hnojením a obsahem asimilovatelného dusíku v hroznech. Zejména ve vinicích, kde se vyskytují problémy s obsahem asimilovatelného dusíku, je vhodné vyuţívat bylinné směsi s vysokým podílem jetelovin. Tyto 35
jednoduché směsi jsou jiţ praxí prověřené a ukazují se jako velmi prospěšné. Práce s ozeleněním vinic a pŧdou se ukazuje jako velmi úspěšná. Z pohledu obsahu asimilovatelného dusíku je také velice významný zdravotní stav hroznŧ. Napadení hroznŧ hnilobami mŧţe výrazným zpŧsobem sniţovat dusíkaté látky v hroznech. (Pavloušek, 2013)
5.2.2 Kontrola kvality sklizených hroznů a moštu
Kdyţ pomineme vinohradnické práce, které se na kvalitě vína podepisují nejvíce, musíme se zaměřit na kontrolu samotné suroviny, ze které je víno vyráběno. Pokud chceme, aby byla správně zahájena fermentace a aby další vývoj vína byl úspěšný, je vhodné provádět tzv. předsklizňovou analýzu hroznŧ a moštŧ. Základem této předsklizňové analýzy jsou tři hlavní pilíře – pH, celkové kyseliny a cukernatost. Tyto tři informace jsou nejdŧleţitější pro určení přesného termínu sklizně a pro další vývoj vína. U moštu mŧţeme tyto analýzy rozšířit ještě o stanovení amoniakálního dusíku, dusíku vyuţitelného kvasinkami (YAN), zjištění celkového a volného SO2, teploty a mikrobiologické čistoty. Právě hodnoty amoniakálního dusíku a YAN jsou spojeny s přípravou moštu na bezproblémovou alkoholovou fermentaci. Mezi nastavení parametrŧ kvašení patří vyţivení moštŧ, tak aby nedocházelo ke zpomalení nebo zastavení fermentace a s tím spojenou tvorbou senzoricky neţádoucích produktŧ kvašení (H2S, těkavé kyseliny, biogenní aminny, popř. ethylkarbamátu). Mnoţství přirozeného dusíku v moštech závisí na mnoha faktorech, takţe se jednoduše nedá paušalizovat, zda dovyţivovat mošt či ne. Mezi rizikové faktory nedostatku dusíku patří odrŧdy s nízkou koncentrací dusíku (Merlot, Ryzlink rýnský, Chardonnay atd.), na podnoţi, na výţivě pŧdy, stresu z horka a nedostatku vody, na přítomnosti chorob ve vinici, cukernatosti hroznŧ, vyčiření moštŧ a především typu čisté kvasniční mikroflóry. Obecně platí, čím vyšší cukernatost hroznŧ, tím vyšší potřeba dovyţivení moštu pro fermentaci (viz tabulka č. 2). Pozor na negativní efekt předávkování dusíkem, coţ mŧţe mít za následek příliš rychlou fermentaci s příliš vysokou teplotou, která zpŧsobuje odumírání mikroflóry. Mnohem méně ovocného aroma. Zbytkový nevyuţitý dusík 36
pŧsobí negativně senzoricky a mŧţe být také zdrojem dusíku, především arginin, pro rŧst mikrobŧ jako Brettanomyces zpŧsobující vady vína. (Gala, 2012) Tabulka 2: Obecné hodnoty YAN ke zdárnému prŧběhu fermentace 21 °ČNM a méně
200 – 250 ppm YAN
23,5 °ČNM
250 – 300 ppm YAN
25 °ČNM
300 – 350 ppm YAN
5.2.3 Kontrola technologických postupů při výrobě moštu Turbidita, neboli kalnost moštu je také velice dŧleţitým faktorem v přípravě moštu k fermentaci. Je těţké doporučit optimální hodnotu zakalení moštu před fermentací. Obecně je ale vyuţíván rozsah od 100 do 250 NTU, coţ je kompromisem mezi dobrým prŧběhem alkoholové fermentace a finálním aroma. Nedostatečně odkalené mošty při fermentaci vykazují vyšší koncentrace sloučenin obsahující síru a to nejenom sirovodík. Pokud mluvíme o nadměrně odkalených moštech (pod 100 NTU) a jejich vlivu na fermentaci, negativa by se opět projevovala především v senzorické stránce vína. Tato situace zapříčiňuje nedostatečný kvasný povrch pro kvasinky a velmi nízkou hodnotu YAN, coţ má za následek zvýšenou koncentraci těkavých kyselin ve výsledném víně. (Gala, 2012) Při plnění tankŧ bychom neměli zapomínat na jejich naplnění pouze z 90 %, aby nedocházelo k úniku pěny a nikdy nemíchat jiţ kvasící mošt s nekvasícím. V takových případech dochází ke vzniku sirky, stresu kvasinek a moţné váznoucí fermentaci. Pokud se rozhodneme přidat do moštu ASVK (aktivní suché vinné kvasinky), měli bychom dbát na správný výběr kvasinek. Tento přídavek do moštu by měl probíhat při 35 °C v poměru 1 ku 1. ASVK mŧţou ovlivnit budoucí charakter vína a překrýt jeho odrŧdové aroma, čímţ mŧţou vznikat uniformní vína. Eliminují apikulátní kvasinky, zpŧsobují větší výtěţnost alkoholu a zabraňují tvorbě pěny. Na trhu je v současné době velké mnoţství komerčních přípravkŧ s kvasinkami a výţivou pro ně. Tímto tématem se budeme zabývat v kapitole 6. (Baroň, 2013)
37
5.2.3.1 Kontrola teploty během fermentace
Kontrola teploty je naprosto nutná v objemech větších neţ 300 l. Získávání informací o teplotě v nádrţi je nejlepší z několika měřících bodŧ. V dnešní době uţ jsou pouţívány integrované chladící systémy, které kontrolují teplotu automaticky. Teplota moštu a s tím spojená kinetika fermentace záleţí na cukernatosti moštu, počáteční teplotě a rychlosti fermentace, objemu nádoby, materiálu a okolní teplotě. Obecně platí, ţe s teplotou vyšší o 10 °C se zdvojnásobí rychlost fermentace. Pokud je teplota fermentace 12 – 16 °C, jedná se o vína štíhlejší a kratší, se striktně ovocnými tóny a s vyšším mnoţstvím esterŧ. Naopak teplota fermentace 20 – 26 °C nám dává vína širší a plnější a je vhodná pro burgundské odrŧdy. Vína mají vyšší mnoţství vyšších alkoholŧ a jejich esterŧ. Teploty fermentace vyšší neţ 30 °C zpŧsobují únik aromatických látek, vyšší ztráty alkoholu a nízkou ţivotnost kvasinek ve fázi dokvášení. (Baroň, 2013)
5.2.3.2 Možnosti znovu-rozkvašení moštu
Proces znovu-rozkvašení moštŧ či vín nabývá stále většího významu, a protoţe „nakaţené“ kvasinky a bakterie bují v kalech, je potřeba mošty a vína stočit dříve, neţ proběhne pokus o znovu-rozkvašení. Jednou z moţností, jak opět nastartovat fermentaci, je pouţití jiţ fermentujícího moštu. Je ale třeba mít na zřeteli obsah alkoholu ve fermentujícím moštu a moštu, kde došlo k zastavení fermentace. Příliš velký rozdíl mezi obsahy alkoholu by mohl zpŧsobit šok pro kvasinky, coţ by mohlo mít za následek „sladší“ zastavenou fermentaci. Vysoký obsah alkoholu spolu s vysokou koncentrací SO2 mŧţe být jednou z největších překáţek pro znovu-rozkvašení moštu. (Bisson, Butzke, 2000) Podle Bissona a Butzkeho (2000), mŧţeme k opětovnému nastartování fermentace pouţít například techniku filtrace zastaveného vína s přidáním 30 mg.l-1 SO2 a upravením teploty na 20 aţ 22 ºC. Medium pro 1000 l je připraveno smícháním 15 l vody při teplotě 20 – 22 ºC s přibliţně 3000 g hroznového moštu o cukernatosti (65ºNM) a s 30 g diammonium fosfátu. Kvasinky (1 kg Saccharomyces bayanus) jsou 38
rehydratovány v 5 l vody při teplotě 38 – 41 ºC po dobu 15 – 20 minut. Medium je postupně přidáváno do zákvasu po dobu 30 minut a je mu umoţněno fermentovat dokud se polovina cukru nemetabolizuje. V tu chvíli je objem media zdvojnásoben přidáním stejného objemu zastaveného vína. Směs by měla být vysoce provzdušňována. Fermentace by měla probíhat, dokud není polovina cukru metabolizována a v tu chvíli se opět přidá stejné mnoţství zastaveného vína. Toto přidávání zastaveného vína se opakuje, dokud se nedosáhne objemu přibliţně 160 l (tato procedura si mŧţe vyţádat 12 hodin aţ 3dny). Poté se fermentující medium (160 l) smíchá se zbývajícím zastaveným vínem (860 l) spolu s 20g diammonium fosfátu. (Bisson, Butzke, 2000)
39
6
KVASINKY V PRAXI Technologickými procesy, kterými se dá eliminovat váznoucí fermentace, jsme se
zabývali v předchozích kapitolách. Nyní se zaměříme na samotné kvasinky, kterým je věnována velká část této bakalářské práce. Kvasinky v moštu jsou, jak uţ víme, nepostradatelné. Zajišťují nám fermentaci moštŧ a tím přeměnu cukrŧ na potřebný alkohol. Také víme, ţe k jejich rozvoji, rozmnoţování a biologickým pochodŧm potřebují dusík, v tomto případě především dusík asimilovatelný. Ten ovšem nemusí být pokaţdé přítomný v potřebném mnoţství, coţ má za následek mnoho negativních faktorŧ pro mošt – váznoucí fermentaci. V dnešní době lze těmto negativŧm předcházet pomocí komerčních přípravkŧ pro výţivu kvasinek. Ačkoliv hrozny z přiměřených sklizní, z řádně ošetřovaného vinohradu, by měly obsahovat optimální mnoţství výţivných látek pro kvasinky. Nesmíme tedy zapomínat, ţe nadměrná výţiva mŧţe zpŧsobit např. zasolení vína a menší tvorbu buketních látek. Stejně tak nedostatečná výţiva s sebou přináší úskalí v podobě nebezpečí vzniku sirky a obtíţného dokvašování.
6.1
Vliv přidané výţivy na kvasinky a mošt Externí dodání vysokého mnoţství asimilovatelných dusíkatých látek do moštu
mŧţe mít negativní dopady na kvalitu vína. Vysoký obsah mŧţe stimulovat zvýšenou tvorbu vyšších alkoholŧ, případně těkavých kyselin. Kvasinky nemusí vţdy vyuţít celý podíl dodané výţivy a zbytková výţiva ve víně mŧţe podporovat rozvoj negativně pŧsobících mikroorganismŧ. Při pravidelném nedostatku asimilovatelného dusíku na daném stanovišti je moţné ovlivnit efektivitu kvašení výběrem kvasinek. Mezi kmeny kvasinek existují rozdíly z pohledu poţadavkŧ na výţivu. Ne-sacharomycetní kvasinky vyuţívají vyšší mnoţství asimilovatelného dusíku. Při pouţití kombinované inokulace kvasinek, tzn. kmen ne-sacharomycetních kvasinek s kmenem Saccharomyces cerevisiae, mohou vznikat problémy s kvašením. Nově se zjistilo, ţe je nevhodné dodávat výţivu pouze v anorganické formě před začátkem kvašení. Kvasinky tento dusík velmi rychle vyuţívají pro svoje rozmnoţování. Dojde tím k vytvoření velké 40
biomasy kvasinek, ohřívání kvasícího média a často k tvorbě neţádoucích aromatických látek. Velké biomase kvasinek budou navíc po čase chybět faktory pro přeţití. (Pavloušek, 2013) Jako vhodné se ukazuje, u moštŧ s obsahem asimilovatelného dusíku vyšším neţ 200 mg.l-1, ponechat kvasinky na počátku vyuţívat vlastní zdroje v moštu a následně přibliţně v 1/3 kvašení dodávat pouze výţivu v organické formě. U moštŧ s obsahem asimilovatelného dusíku niţším neţ 200 mg.l-1, je vhodné dodávat komplexní organickou výţivu společně s anorganickým diamoniumfosfátem pro rozmnoţování kvasinek. Vhodné je tuto kombinovanou výţivu dodat před začátkem kvašení a v 1/3 kvasného procesu (kdy je prokvašená 1/3 cukrŧ). Dávka diamoniumfosfátu by ani u silně deficitních moštŧ, s obsahem pod 100 mg.l-1 asimilovatelného dusíku, neměla překročit 20 g.hl-1. Extrémně vysoká dávka diamoniumfosfátu mŧţe vést k vyšší tvorbě sirnatých sloučenin, těkavých kyselin a projevu slané chuti ve víně. Slanost pak často mŧţe připomínat senzorický dojem minerality ve víně. (Pavloušek, 2013)
6.2
Výţiva pro kvasinky
Buněčné stěny kvasinek Jednou z moţných cest, jak zásobovat kvasinky na začátku a v prŧběhu kvašení je přídavek buněčných stěn kvasinek. Tento preparát se skládá z přirozených součástí kvasinek, které se vytváří při rozkladu buněk kvasinek a extrakcí rozpustných částí. Výsledkem je roztok čistých buněčných stěn, které nejsou skutečnou výţivou, ale mohou podporovat kvasinku v dalších funkcích. Buněčné stěny jsou dŧleţitým zdrojem sterolŧ, které nejsou vyuţité jako zdroj energie, ale začleňují se do nových buněčných stěn rozmnoţujících se kvasinek. Silná buněčná stěna je dŧleţitá, při zvyšujícím se obsahu alkoholu, protoţe tvorba sterolŧ samotnými kvasinkami probíhá pouze za přítomnosti kyslíku a nikoliv v anaerobních podmínkách kvašení. Dodané buněčné stěny kvasinek mohou mít absorpční vliv na sloučeniny, které jsou toxické pro kvasinky, ať uţ pocházejí z vinice nebo jsou vytvořené mikroorganismy. Tyto buněčné stěny mají dŧleţitý podíl pro optimalizaci alkoholového kvašení, ale nemohou zcela nahradit dusík. Neposkytují kvasinkám čisté amonné ionty. 41
Neaktivní kvasinky Neaktivní kvasinky jsou neţivotaschopné buňky přirozených kvasinek, ačkoliv sloţení ţivin v jejich buňkách je srovnatelné s kulturou aktivních suchých kvasinek. Neaktivní kvasinky představují komplexní přirozený zdroj rŧzných ţivin, jako jsou mikroprvky, které jsou přístupné ve snadno asimilovatelné formě k aktivní kvasince. Neaktivní kvasinky nemohou být vyuţité jako hlavní zdroj dusíku, protoţe neobsahují čisté amonium, jako v případě amonných solí. Kaţdý výrobek mŧţe mít lehce odlišný vliv na kvašení v závislosti na dŧkladném tepelném ošetření buněk kvasinek, praskání buněčných stěn a uvolňování rozpustných ţivin z nitra buňky. Některé výrobky disponují dodatečným vlivem, jako jsou antioxidační nebo zjemňující vlastnosti. Tyto výrobky mají také společné, ţe jsou zdrojem vyuţitelných ţivin, včetně aminokyselin, mikroprvkŧ a vitamínŧ. Aktivní suché vinné kvasinky (ASVK) Aktivní suché vinné kvasinky jsou selektované kmeny vinných kvasinek, které jsou fermentovány na několikastupňovém fermentačním zařízení. Jejich ţivný základ je obohacený o vitamíny a ţiviny potřebné k jejich aktivnímu rozmnoţování. Takto získaná biomasa se odstřeďuje, promývá a filtruje na rotačním vakuovém filtru. Získaný filtrát obsahuje cca 40 % sušiny. Granuluje se a následně suší při teplotě 35 – 37 °C. Před pouţitím se ASVK aktivují v teplé vodě 35 – 37 °C (tedy stejné teplotě při které byly "uspané") po dobu asi pŧl hodiny, potom se zákvas vlije do připraveného moštu. Dŧleţité je, aby rozdíl teplot zákvasu a zakvášeného moštu nebyl větší neţ 10 °C.
Thiamin Přídavek vitaminu thiaminu se doporučuje pro révové mošty, které byly tepelně ošetřené nebo které pochází z hroznŧ napadených botrytidou, případně se pouţívají pro výrobu speciálních vín. Tyto faktory významně sniţují přirozenou koncentraci tohoto vitaminu. Thiamin hraje velmi dŧleţitou úlohu ve vztahu k potřebě oxidu siřičitého v hotovém víně. Přes reakci koenzymu odvozeného od pyruvátdekarboxylázy, který je zapojený v degradaci uhlíkatých sloučenin (které se váţí na SO2), se podílí na posledních fázích spotřebovávání cukrŧ. Kromě toho má celkově pozitivní vliv na
42
prŧběh kvašení za obtíţných podmínek. Přídavek thiaminu má nastat buď jako thiamin (hydro) chlorid, nebo v kombinaci s přídavkem amonných solí. Vícesložková výživa kvasinek Tato výţiva se skládá hlavně z inaktivovaných kvasinek a amonných solí, např. diamoniumfosfátu (DAP) a sulfidu amonného, dále mŧţe být obohacena o vitamíny a minerální látky. Přítomný ve směsi mŧţe být také kvasinkový extrakt, který obsahuje organický dusík. Ten je v podobě aminokyselin ve velkém mnoţství.
43
7
ZÁVĚR Náplní této bakalářské práce bylo objasnění výţivy kvasinek během fermentace
moštŧ révy vinné a s tím spojená problematika kvašení moštŧ. V první části bakalářské práce byly popsány dusíkaté látky, které kvasinky vyuţívají jako zdroj potravy. Tyto látky si s sebou berou hrozny jiţ z vinice, a proto je dŧleţité věnovat vinici velkou část energie a péče. Správně ošetřený vinohrad a pozitivní přístup k révě vinné se následně projeví právě na kvalitě moštu a na vyrobeném víně. Nesmíme ale zapomínat na kontrolu kvality hroznŧ, které dopravíme ke zpracování a na kvalitu vylisované šťávy. Všechny zjištěné informace, které mŧţeme získat ať uţ s pomocí vlastní (měření cukru, pH, apod.), nebo díky odborným laboratořím, nám mŧţou usnadnit výrobu vína. Právě výsledky měření obsahu asimilovatelného dusíku v hroznové šťávě nám mohou pomoci zajistit hladký prŧběh fermentace moštu. Při zjištění nízkého obsahu asimilovatelného dusíku se mŧţeme včasným dodáním dusíkaté výţivy kvasinkám vyhnout nepříjemnostem spojených s tímto jevem, jako jsou nízká tvorba aromatických látek nebo zhoršený prŧběh jablečno-mléčné fermentace u červených vín. Podstatná část práce byla věnována váznoucí fermentaci. Ta je jedním z hlavních problémŧ spojovaných s dusíkem a jeho případným nedostatkem. Při nedostatku dusíku jsou kvasinky omezovány v rŧstu a začne se zpomalovat alkoholová fermentace. Ale nejen dusík mŧţe zpŧsobit váznoucí fermentaci. Mezi další faktory, které se na tomto jevu podílí, patří obsah cukru a etanolu v moštu, teplota fermentace a přítomnost kyslíku. Všechny tyto faktory pŧsobí na kvasinky inhibičně, a to jak v nízkých, tak ve vysokých koncentracích. Optimální mnoţství všech těchto látek v moštu je moţno ovlivnit externím zásahem. Vţdy se ale bude jednat o zásah do přirozeného vývoje moštu a vína, který nemusí být vţdy ideální a s přirozeným vývojem moštu a vína v souladu.
44
8
SEZNAM TABULEK
Tabulka 1: Přehled aminokyselin Tabulka 2: Obecné hodnoty YAN ke zdárnému prŧběhu fermentace
45
9
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1: Transport aminokyselin přes plazmatickou membránu Obrázek 2: Fixace amonného iontu na uhlíkatý skelet meziproduktŧ glykolýzy Obrázek 3: Syntéza glutaminu Obrázek 4: Přenašeči aminoskupin Obrázek 5: Biosyntézní cesty aminokyselin Obrázek 6: Oxidativní deaminace aminokyselin Obrázek 7: Pyridoxal fosfát v transaminačních reakcích
46
10 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY BAROŇ, M., Asimilovatelný dusík v moštech révy vinné aneb sypat či nesypat. Vinařský obzor. 2009, sv. 12, č. 1, s. 561-562. ISSN 1212-7884. BAROŇ, M., Asimilovatelný dusík a jeho vliv na kvalitu vína [online]. Lednice. Mendelova Univerzita v Brně, Zahradnická fakulta, Ústav vinohradnictví a vinařství, [cit. 2013-10-23]. Dostupný z WWW:
. BAROŇ, M., Vliv asimilovatelného dusíku na prŧběh fermentace moštu révy vinné: disertační práce, Lednice, ČR: Mendelova Univerzita, Zahradnická fakulta, Ústav vinohradnictví a vinařství, 2010, 135 l. Vedoucí disertační práce Marie Kyseláková. BISSON, R. M., BUTZKE, C., Diagnosis of rectification of stuck and sluggish fermentations, 2000, American Journal of Enology and Viticulture, 51, s. 168 – 177 BULUŠEK, M., Váznoucí fermentace[online]. c2010, poslední revize 7. 4. 2010 [cit. 2014-04-01]. Dostupný z WWW: . Ekovín: Výživa pro kvasinky a její různé funkce [online]. c2014. [cit. 2014-04-01]. Dostupný z WWW: . GALA, A., Příprava moštů na bezproblémovou fermentaci okem technologa [online]. c2012, poslední revize 11. 8. 2012 [cit. 2014-03-07]. Dostupný z WWW: . JACKSON, Ron S., POLO, M., Wine science: principles, practice, perception, 2. vyd. San Diego: Academic Press, 2000. 648 str. ISBN 978-0-12-379062-0. KUMŠTA, M., Biochemie dusíkatých látek při výrobě vína [online]. Lednice. Mendelova Univerzita, Zahradnická fakulta, Ústav vinohradnictví a vinařství, 2013 [cit. 2013-11-26]. Dostupný z WWW: . LOURENS, K., REID, G., Stuck fermentation Management, 2003, The Australian & New Zealand Grapegrower & Winemaker, February. 72 – 74. LOURENS, K., REID, G., Yeast nutrient management in winemaking, 2002, The Australian and New Zeland Grapegrower & Winemaker. 50 – 54 str. MORENO-ARRIBAS, M., POLO, M., Wine chemistry and biochemistry, 2. vyd. New York:Springer, 2008. 735 str. ISBN 978-0-387-74118-5. 47
MAŤAS, J., Výţiva kvasiniek v priebehu fermentácie muštu vinnej révy: bakalářská práce, Lednice, ČR: Mendelova Univerzita, Zahradnická fakulta, 2012, 48 l. Vedoucí bakalářské práce Mojmír Baroň. NEUBERG, M., Vliv příjmu a vyuţití dusíku v metabolismu vyšších rostlin: disertační práce, Praha, ČR: Česká Zemědělská Univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojŧ, Katedra agroenviromentální chemie a výţivy rostlin, 2011, 43 l. Školitel Daniela Pavlíková. PAVLOUŠEK, P., Asimilovatelný dusík – další významný parametr kvality [online]. c2013. poslední revize 10. 7. 2013. [cit. 2014-02-05]. Dostupný z WWW: . PAULOUŠEK, P., Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví. Grada Publishing a. s. 2011. s. 69-70. ISBN 978-80-247-3314-2. PAVLOUŠEK, P., Výroba vína u malovinařů, 2. vyd. Praha: Grada Publishing a. s. 2010. 128 s. ISBN 978-80-247-3487-3. POLO, C. M. – MORENO-ARRIBAS, V. M., Wine chemistry and biochemistry. 1. vyd. New York: Springer, 2008. 735 s. ISBN 978-0-387-74116-1. RIBÉREAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONECHE, B., LONVAUD, A. Handbook of Enology, Volume I: The Microbiology of Wine and Vinification . 2006 John Wiley & Sons, Ltd ISBN 0-470-01037-1. RIBÉREAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONECHE, B., LONVAUD, A. Handbook of Enology, Volume II: The Chemistry of Wine and Stabilization and Treatments. 2006 John Wiley & Sons, Ltd ISBN 0-470-01037-1. SOCHOR, J., Vinařství: Chemické složení bobule [online]. c2013. poslední revize 14. 8. 2013. [cit. 2014-03-12]. Dostupný z WWW: . STEIDL, R., Sklepní hospodářství, 1. vyd.: Rychnov nad Kněţnou: Uniprint s. r. o., 2002. 307 s. ISBN 80-903201-0-4.
48
