MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelititan Penelitian dilakukan di laboratorium Imunologi Departemen Kitwan Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor , Laboratorium Uji Hewan PT Biofarma Bandung, dan Klinik Hewan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, berlangsung selama 27 bulan, dari bulan Januari 2004 sampai Maret 2006
Materi Hewan Percobaan Penelitian ini menggunakan ayam layer pulet (siap telur) jenis Isa brown berumur 34 minggu untuk produksi IgY antitetanus, dan mencit (Mus mu scculus L) strain DDY umur 4 sampai 5 minggu dengan kisaran berat badan 15 sampai 17 gram untuk uji potensi antitetanus dan uji tantang (in vivo). Pakan yang diberikan pada ayam adalah pakan komersial produksi PT Charoen Pokhpand jenis CP 324 sebanyak 60 gram/ekor/hari. Sedangkan untuk mencit diberikan pakan berbentuk pelet standar untuk pakan hewan laboratorium PT Biofarma Bandung, diberikan sebanyak 6 gram/ekor/hari dan air minum diberikan secara ad libitum. Ayam dipelihara pada kandang individual, dibuat dari besi dengan sistem baterai 40 x 30 x 60 cm. Kandang mencit dibuat dari kotak plastik berukuran 30 x 60 x 15 cm untuk enam ekor mencit. Pemeliharaan mencit dilakukan dalam ruang tertutup dengan suhu 25 o C sampai 26 oC dan kelembaban 54% sampai 60%, dengan penerangan selama 10 jam/hari.
Toksoid Tetanus Toksoid tetanus dibuat dari toksin tetanus yang diisolasi dari mikrob C. tetani strain Massachuset, diproduksi oleh PT. Biofarma Bandung. Mikrob itu ditanam pada medium Pitmann, kemudian dibiakkan dala m fermentor yang diisi medium sintetik. Fermentasi dilakukan selama 8 hari pada suhu 34 o C sampai 35 o
C. Setelah diproduksi toksin dengan limit flocciculi (Lf) cukup tinggi kultur
37 dipanen, disaring dan filtrat yang mengandung toksin ditampung dalam vessel. Detoksifikasi dilakukan dengan penambahan formalin sedemikian sehingga didapatkan konsentrasi 0.5%, dieramkan selama 4 minggu pada suhu 37 oC. sekali-sekali dihomogenkan. Setelah lolos dari uji toksisitas, cairan toksoid diultrafiltrasi dalam Amicon hollow fibre menghasilkan toksoid pekat. Pemurnian dilakukan dengan pengendapan amonium sulfat (Nasution et al. 1987).
Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah bahan untuk uji imunodifusi yaitu : Agarose (Serva, Jerman), Polyethylene glikol 6000 (Merck, Jerman), Phosphate Buffer Saline (Merck, Jerman) pH 7.2, Aquadest, NaCl fisiologis (Merck, Jerman), NaN3 (Merck, Jerman). Bahan untuk pemurnian protein yaitu : Chloroform (Merck, Jerman), Phosphate Buffer Saline (Merck, Jerman) 100 mM dengan pH 7.6, Polyethy lene glikol 6000 (Merck, Jerman), NaCl fisiologis (Merck, Jerman), kantong dialisis (SIGMA), kolom Hi-trap IgY (Amersham Bioscience) spesifik untuk IgY , Potassium sulfat (K2SO4 ) (Merck, Jerman), NaH2PO4 (Merck, Jerman), propanol (Merck, Jerman), etanol, dan air bebas ion. Bahan untuk uji Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) menggunakan Tetra Methyl Etilen Diamin
(TEMED) (Merck, Jerman),
Acrylamide (Merck, Jerman), Bisacrylamide (Merck, Jerman), Sodium Dodecyl sulfat (SDS) (Merck, Jerman), Tris HCl dan ammonium ferosulfat dan alkohol 70%. Serta bahan-bahan untuk enzyme linkage immunosorbent assay (ELISA) yaitu NA2 CO 3 (Merck, Jerman), NaHCO (Merck, Jerman), air deionisasi, NaCl (Merck, Jerman), KCl (Merck, Jerman), NaHPO4 (Merck, Jerman), KH 2PO4 (Merck, Jerman), Tween 20 (SIGMA), citrate phosphate buffer (C6H 8O7H2O) (SIGMA), ABTS (2.2-azino-di 3 ethylbenzothiazoline -6-sulphonic acid) (SIGMA), Bovine Serum Albumin (BSA) (SIGMA), H2O2 (Merck, Jerman).
Peralatan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah syringe volume 3 ml, 1 ml dan 10 ml (Terumo®), tabung reaksi, tabung sentrifus, pipet 1 ml, 5 ml. 10 ml, mikropipet (efendorf ®), mikrotip, gelas obyek, kandang ayam dan mencit
38 beserta kelengkapannya, refrigrator (Sa nyo Medicool), tabung Eppendorf, botol volume 3 ml, sentrifus (Himac and Kokusan H-1500 DR), penangas air (Eyela NTS – 1300), petridish, gel puncher, inkubator, timbangan, dan gelas ukur.
Metode Produksi IgY pada Telur Ayam Produksi IgY menggunakan 5 ekor ayam betina dewasa siap bertelur ya ng dipelihara dalam kandang baterai dan diberi pakan komersial standar CP 324 dan air minum secara ad libitum. Ayam diimunisasi dengan toksoid dosis bertingkat (Guidolin et al. 1998; Matos et al. 2002). Imunisasi perta ma secara intra vena dengan dosis 15 Lf tanpa adjuvan kemudian dilanjutkan secara intra muskular dengan interval satu minggu. Pada minggu pertama secara intra muskular ayam diimunisasi dengan toksoid tetanus dosis 100 Lf dan dilakukan pengulangan pada minggu kedua dengan dosis toksoid 200 Lf serta minggu ketiga dengan dosis toksoid 300 Lf. Penyuntikan pertama, toksoid dicampur dengan Freund adjuvant complete dan penyuntikan selanjutnya dengan Freund adjuvant incomplete . Semua ayam diambil darahnya melalui arteri daerah sayap sebanyak 2 ml, dengan menggunakan spuite setiap minggu. Darah dalam spuite diinkubasikan dalam suhu 37 0C atau suhu kamar selama 1 jam kemudian diinkubasikan dalam suhu 4 0
C selama 24 jam. Serum dipisahkan dari bekuan sel-sel darah, kemudian
dilakukan deteksi antibodi spesifik dengan uji AGP terhadap toksoid dan titernya. Bila antibodi dalam darah sudah terdeteksi, maka telur yang dihasilkan dikoleksi.
Ekstraksi IgY dari Kuning Telur Metode PEG – kloroform Kuning telur dipisahkan dari bagian putih telur, dan dicuci dengan air deionisasi. Kuning telur diletakkan di atas kertas saring untuk menghilangkan putih telur yang masih melekat. Membran kuning telur dilubangi dengan cara diangkat dengan pinset dan cairan kuning telur ditampung pada tabung dengan volume 50 ml. Tambahkan 25 ml sodium phosphat buffer (100 mM, pH 7.6) dan campurkan secara perlahan. Selanjutnya tambahkan 20 ml kloroform dan campur secara perlahan sampai terlihat bentukan semisolid. Larutan itu disentrifus dengan
39 kecepatan 1200 g selama 30 menit. Supernatan diambil dan tambahkan PEG 6000 sehingga didapat konsentrasi akhir 12% (w/v). Larutan itu kemudian disentrifus dengan kecepatan
15 700 g selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet
diresuspensikan dengan 2 ml PBS. Selanjutnya dilakukan dialisis selama 24 jam dalam larutan PBS pH 8. Tampung larutan hasil dialisis dan tambahkan dua tetes 0.1% Na azide, dan simpan pada suhu – 80 oC (Comenisch et al. 1999).
Purifikasi Ig Y Purifikasi dilakukan dengan fast protein liquid chromatography (FPLC) mengunakan alat Hi-trap IgY (Amersham Bioscience). Semua selang pada alat FPLC dicuci dengan etanol 20% selanjutnya dengan air bebas ion untuk menghilangkan sisa -sisa protein dan zat lainnya supaya tidak mengkontaminasi bahan yang akan dipurifikasi. Matriks dalam kolom dibilas dengan buffer K 2 SO4 0.5 M dalam larutan NaH2PO4 20 mM dengan pH 7.5. Sampel IgY hasil ekstraksi dilarutkan dengan buffer K2SO4 0.5 M kemudian dimasukkan ke dalam kolom Hi Trap IgY Purification Hp 5 ml yang telah terpasang pada alat sebanyak 2 ml. Alirkan larutan binding (K2 SO4 0.5 M dalam larutan NaH 2PO4 20 mM pH 7.5) ke dalam kolom untuk memberikan kesempatan matriks dalam kolom mengikat IgY dan protein-protein selain IgY akan lolos dan dibuang. Selanjutnya dilakukan elusi terhadap IgY yang telah terikat pada matriks dengan larutan NaH2PO4 20 mM pH 7.5. Imunoglobulin Y yang terelusi akan terdeteksi oleh monitor absorban yang ditandai dengan naiknya garis sampai terbentuk garis puncak. Setiap fraksi dari larutan itu ditampung pada tabung di alat fraksimeter. Fraksi yang berisi larutan konsentrasi puncak diambil, dipekatkan kembali ke volume awal dan didialisis selama 24 jam dalam larutan PBS pH 8 untuk menghilangkan garamgaram yang ikut terlarut. Matriks dicuci dengan larutan propanol 30% (Cleaning buffer) dalam larutan NaH 2PO4 20 mM pH 7.5.
Identifikasi Kemurnian Ig Y Identifikasi kemurnian Ig Y ditentukan secara colorimetri (λ = 595 nm), uji Agar Gel Presipitation (AGP) dan analisis pita protein dengan Sodium
40 Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) (Wibawan et al. 2003).
Metode Bradford Metode ini berdasarkan pengikatan protein pada larutan dye coomassie brilliant blue. Pada pH rendah larutan dye yang bebas diabsor psi secara bebas pada panjang gelombang 470 dan 650 nm, tetapi setelah berikatan dengan protein diabsor psi secara maksimum pada panjang gelombang 595 nm (Wilson dan Walker 2000). Larutan Bradford dibuat dengan cara : sebanyak 100 mg comassie brilliant blue dicampur dengan 50 ml ethanol 95%, dan asam orto fosfat 85% kemudian diencerkan dengan akuades sampai satu liter. Campuran larutan itu disaring dengan kertas saring. Larutan itu merupakan larutan stok lima kali dan disimpan pada suhu 4 oC. Jika mau digunakan, encerkan satu bagian larutan stok dengan empat bagian akuades. Pemeriksaan sampel dilakukan dengan cara : 100 µl sampel dilarutkan dengan satu ml larutan Bradford, diinkubasikan selama 10 menit, kemudian diperiksa pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm. Kurva standar dibuat dari pengenceran BSA (bovine serum albumin ) kemudian dibuat persamaan regresinya yaitu : Y = ax + b, Y adalah besarnya absorpsi, a adalah koefisien regresi, x adalah konsentrasi sampel dan b adalah suatu konstanta .
Uji Imunodifusi Uji ini disebut uji AGP (agar gel presipitation). Medium dibuat dari campuran 0.4 g agarose (Serva, Jerman), 1.2 g PEG 6000 (Merck, Jerman), 20 ml aqudes dan 20 ml PBS dengan pH 7.2 (Merck). Campuran tersebut ditangas pada air mendidih sampai jernih. Dengan menggunakan pipet 10 ml, agar cair tersebut dituang di atas petridis atau cetakkannya dan dibiarkan sampai mengeras. Setelah mengeras dibuat lubang-lubang untuk tempat antigen dan antiserum dengan menggunakan alat gel puncher. Ke dalam lubang-lubang tersebut diisikan antigen (lubang tengah) dan antiserum dilubang sekitarnya. Sediaan kemudian diletakkan di tempat yang lembab, kemudian diamati terjadinya presipitasi setelah disimpan
41 selama 24 jam. Adanya garis presipitasi menunjukkan antara antiserum dan antigen tersebut terjadi reaksi homolog. Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Untuk mengetahui pola protein dari IgY yang terbentuk dilakukan karakterisasi dengan elektroforesis SDS-PAGE terhadap IgY yang telah dimurnikan. Prosedur elektroforesis sebagai berikut : Pembuatan gel pemisah (running gel) konsentrasi 10% terdiri dari : 14 ml akrilamid stock 30% ditambah 10 ml aquades; 5 ml larutan 3 M Tris HCl pH 8.9; 0.4 ml larutan Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) 10%; 0.02 ml TEMED; 14.4 ml aquades dan 0.4 ml larutan amonium persulfat (0.5 g dalam 4.5 ml aquades, harus selalu dalam keadaan baru dilarutkan). Setelah gel pemisah mengeras disiapkan gel pengumpul (stacking gel) yang terdiri dari: 1 ml akrilamid stock 30%; 7.54 ml aquades; 1.25 ml larutan 0.5 M Tris HCl, pH 7; 0.1 ml larutan SDS 10%; 0.005 ml TEMED dan 0.1 ml larutan amonium persulfat (0.5 g dalam 4.5 ml aquades, harus selalu dalam keadaan baru dilarutkan). Untuk preparasi gel pengumpul dicetak dengan bantuan “sisir” (comb) untuk membuat sumur-sumur tempat memasukkan contoh yang akan dipisahkan. Ketebalan gel yang dibuat adalah 4 mm. Setelah gel mengeras, sisir diangkat. Preparasi sampel menggunakan bufer disosiasi (Dissociation Buffer) yang terdiri dari 10 ml SDS 10%; 5 ml gliserin ; 5 ml Tris HCl 0.5 M pH 8.8; 0.5 ml bromphenol blue; 0.5 ml 2-Mercaptoethanol; 10 ml aquades. Sebanyak 100 µl sampel dicampur dengan 100 µl buffer disosiasi atau 25 µl sampel dicampur dengan 200 µl buffer disosiasi (disesuaikan dengan kandungan protein sampel). Untuk sampel dengan konsentrasi protein rendah digunakan buffer disosiasi yang dipekatkan lima kali konsentrasi awal, yang terdiri dari : 1.25 ml Tris 2 M pH 8.8 didalam 10% SDS; 0.4 ml Bromphenol blue 5%; 0.5 ml 2-Mercaptoethanol dan 5 ml glycerin. Sebanyak 200 µl sampel dicampur dengan 25 µl buffer contoh. Sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel, sampel dipanaskan selama 2 menit kemudian ditambahkan 2 tetes 2-Mercaptoethanol dan divortek. Dipanaskan kembali selama 5 menit (sampel siap untuk di lalukan). Sebanyak 20 µl sampel dimasukkan ke sumur-sumur yang telah tersedia pada gel.
42 Proses pemisahan protein menggunakan buffer pemisah (running buffer) yang terdiri dari Tris HCl 0.025 M/l; glycine 0,192 M/l dan SDS 0.1% pH 8.8. Pemisahan dilakukan pada kekuatan arus 30 sampai 40 mA
dengan voltage
maksimum untuk setiap gel dalam kodisi dingin (ke dalam alat elektrophoresis dialirkan air es) selama 4 jam atau jika zat warna contoh telah hampir sampai (jangan sampai melewati) ujung bawah gel pemisah. Setelah elektroforesis selesai, gel difiksasi dengan larutan Tricloroacetic acid (TCA) konsentrasi 12% selama 24 jam. Gel diwarnai dengan larutan 0.25% biru komasi yang dilarutkan dalam 55 ml methanol dan 7.5% asam cuka dalam 1 liter akuades. Pewarnaan dilakukan selama 24 jam (digoyang di atas titertek), setelah itu, gel dipucatkan dengan larutan yang terdiri dari campuran metanol, asam cuka dan akuades dengan perbandingan 5 : 4 : 1 sambil digoyang-goyang selama 24 jam (diamati setiap 1jam)
Teknik ELISA Teknik enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) digunakan untuk mengetahui aktivitas IgY, terutama untuk mengetahui antibodi yang aktif dari keseluruhan fraksi IgY. Prinsip dari ELISA adalah antigen ditutupi bagian permukaannya. Antibodi sampel diikatkan pada antigen. Ikatan dari sampel antibodi itu dideteksi dengan antibodi yang telah diberi label. Jumlah ikatan dari antibodi itu di hitung dari ikatan antibodi yang telah diberi label. Teknik ELISA yang digunakan sesuai dengan Carlander (2002) dengan beberapa modifikasi, Secara lebih detail adalah sebagai berikut: Mikrotiter plate (dasar cembung) dilapisi dengan 50 uL antigen. Konsentrasi larutan yang diinginkan adalah 2 sampai 10 µg/ml dalam 0.1 M NaHCO3, pH 9.5. Plate kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 4oC. Plate kemudian dicuci sebanyak empat kali dengan 0.15 M NaCl, 0.02 M NaHPO4 , 0.01% Tween 20, pH 7.2 (PBS-T) yang khusus digunakan sebagai larutan pencuci dalam ELISA. Plate kemudian diblok dengan 100 µL Bovine serum albumin 1% dalam 0.1 M NaHCO3 , pH 9.5 selama 90 menit pada suhu 37 o
C. Pemblokan dilakukan untuk mencegah antibodi berikatan dengan tempat yang
berada diluar tempat ikatan. Kemudian plate dicuci sebanyak empat kali dengan
43 PBS-T dan 50 µL sampel yang telah dilarutkan dalam PBS-T ditambahkan ke setiap lubang dari plate yang dibuat duplikat atau triplikat. Plate diinkubasikan selama satu jam dalam suhu 37 oC, setelah itu dicuci lagi sebanyak empat kali dengan PBS-T. Selanjutnya 50 µL antibodi yang telah dilabel di masukkan ke dalam lubang plate dan diinkubasikan selama satu jam pada suhu 37 oC, kemudian ditambahkan substrat peroksidase sebanyak 100 µL. Plate dibaca setelah 30 menit dengan spectraMax panjang gelombang 415 nm .
Aktivitas Biologis IgY. Aktivitas biologis IgY diuji terhadap pengaruh pH, panas dan enzim pencernaan seperti pepsin, tripsin, dan protease. Setelah perlakuan dengan pH, panas, dan enzim aktivitas biologis dari IgY diuji dengan ELISA dan SDS-PAGE. Pengujian ini perlu dilakukan berkaitan dengan kemungkinan aplikasi pencegahan secara oral .
Uji Aktivitas IgY Setelah perlakuan pH Masing-masing larutan IgY dilakukan perlakuan pH 2, pH 3, pH 7,dan pH 9. Pada pH 2 ditambah dengan 10 µl HCL 25%, pH 3 ditambah dengan 5 µl HCL 25%, pH 7 tanpa penambahan apapun, dan pH 9 ditambah dengan 12 µl NaOH. Diinkubasi selama 15, 30, 45, 60, dan 120 menit pada suhu 37 ºC, setelah inkubasi pH larutan perlakuan dikembalikan ke pH 7. Aktivitas IgY setelah perlakuan diuji dengan metode enzym linked imunosorbent assay ( ELISA).
Uji Aktivitas IgY Setelah Perlakuan Suhu Masing-masing larutan IgY dilakukan perlakuan suhu.
Tiap botol
dipanaskan di waterbath selama 5, 10,15, dan 20 menit pada suhu 50 ºC, 60 ºC, 70 ºC, 72.5 ºC, 75 ºC, 80 ºC, 90 ºC dan 100 ºC. Setelah habis waktu pengamatan, sampel diambil dan langsung dicelupkan pada icebath untuk menghentikan reaksinya. Sampel diuji aktivitasnya dengan metode Elisa.
44 Uji Aktivitas IgY Setelah Perlakuan Enzim Pepsin, Tripsin, dan Protease Masing-masing larutan IgY dengan dosis 15 µg/ml diberi perlakuan enzim pepsin. Tiap botol ditambahkan dengan 45 µl enzim pepsin dan untuk mengaktifkan kerja enzim ditambahkan dengan 10 µl HCL 25% sehingga larutan pH 2. Larutan tersebut kemudian divorte k dilanjutkan dengan inkubasi pada 37 ºC selama 30, 60, dan 120 menit.
Setelah inkubasi masing-masing sampel
dinetralkan dengan 5 µl NaOH 30%. Sedangkan untuk perlakuan enzim tripsin dan protease , masing-masing sampel ditambahkan dengan 45 µl enzim trips in dan protease untuk mengaktifkan kerja enzimnya ditambahkan dengan 12 µl NaOH 0.1% sehingga pH menjadi 8. Kemudian sampel divortek dan diinkubasi pada 37 ºC selama 30, 60, dan 120 menit.
Setelah inkubasi masing-masing sampel
dinetralkan dengan menambahkan 2 µl HCL 25% sehingga pH menjadi 7.
Uji Potensi IgY Potensi IgY antitetanus ditentukan dari : perbandingan jumlah yang diperlukan antara IgY antitetanus dengan ATS standar untuk melindungi mencit (berat badan berkisar 17 g sampai 22 g) dari efek dos is paralitik (Lp/10) dari toksin (Brit 2002). Dalam penelitian ini digunakan standar toksin tetanus dari WHO (PT Biofarma 2003).
Penentuan potensi IgY anti tetanus Sediaan antitoksin tetanus standar diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis sehingga kandungan antitoksin tetanus standar dalam larutan adalah 1 IU/ml. Sediaan sampel uji (IgY antitetanus) diencerkan dengan NaCl fisiologis sampai diperoleh konsentrasi larutan sekitar 1 IU/ml. Toksin tetanus standar dilarutkan dengan PBS sehingga kandungan toksin tetanus dalam larutan 0.4 IU/ml. Siapkan sepuluh buah tabung reaksi volume 10 ml, masing – masing lima tabung untuk mencapur larutan toksin tetanus dengan IgY antitetanus yang akan diuji dan lima buah tabung untuk sediaan antitoksin tetanus standar untuk kontrol. Dibuat lima seri pengenceran dari standar antitoksin tetanus dan IgY antitetanus dengan faktor pengenceran 1.10 sedemikian sehingga volume akhir setelah ditambah 2 ml larutan toksin 0.4 IU/ml menjadi 4 ml setiap tabung. Ditambahkan
45 sebanyak 2 ml toksin tetanus standar pada setiap tabung reaksi, kemudian vortek dalam beberapa detik. Campuran dibiarkan dalam posisi tegak, dalam suhu ruang, dan terlindungi dari sinar selama selama 60 menit. Masing– masing campuran larutan tiu diinjeksikan sebanyak 0.5 ml secara subkutan pada mencit. Setiap campuran larutan itu memerlukan 6 ekor mencit untuk pengujian. Amati dan catat jumlah mencit yang hidup selama lima hari masa observasi. Penghitungan potensi IgY antitetanus dilakukan dengan metode Spearman-Karber berdasarkan jumlah mencit yang bertahan hidup hingga akhir masa observasi dan dinyatakan dalam satuan internasional unit (IU) per mililiter. Rumus perhitungan PD50 adalah sebagai berikut : Log PD50 = - [Xo – (0.5)d + d (Ri/Ni)] Xo = Negatif Log10 dari pengenceran terendah, semua hewan uji pada kelompok tersebut memiliki respon positif. d = Log10 faktor pengenceran atau beda log10 antar pengenceran. Ri = jumlah hewan uji yang menunjukan respon positif . Ni = jumlah hewan uji setiap pengenceran. Bila uji valid maka potensi IgY antitetanus dihitung dengan kalkulasi statistik sebagai berikut : Pot ATS Uji =
PD50 ATS Standar X Faktor Pengenceran ATS Uji X Pot ATS Std ( IU/ml) PD50 ATS Uji
Potensi yang baik adalah tidak kurang dari 100 IU antitoksin tetanus setiap ml larutan. Batas dasar kesalahan (P= 0.95) pada perkiraan potensi berkisar antara 80% sampai 125% (Brit 2002).
Uji Tantang pada Hewan Coba Uji tantang pada hewan coba dilakukan untuk melihat perbedaan daya netralisasi IgY terhadap toksin tetanus pada berbagai dosis secara in vivo menggunakan hewan model. Uji dilakukan dengan cara mencit diberi antitoxin (IgY) lewat suntikan subcutan (0.5 ml) dan secara per oral. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap, dengan 4 perlakuan, yaitu pemberian dengan IgY dosis 0.2, 0.4, 0.8, dan 1 IU/0.5 ml/ekor , masing-masing
46 dos is disuntikkan pada 6 ekor mencit. Masing-masing perlakuan ditantang dengan toksin tetanus dosis 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 IU/0.5ml/ekor . Perlakuan secara per oral, mencit dibagi ke dalam tiga kelompok, masing-masing diberikan telur matang 0.5 ml sebanyak satu, dua , dan tiga hari (sekali sehari), kemudian ditantang dengan toksin tetanus seperti perlakuan secara subkutan. Peubah yang diamati yaitu angka kesakitan dan angka kematian dari mencit, gejala klinis tetanus yaitu gemetar, punggung bengkok, kaki pincang, dan lock jaw, berat badan, feed intake, refleks dan laju respirasi. Pengamatan dilakukan selama lima hari. Berat badan diperoleh dengan menimbang mencit setiap hari dengan timbangan analitik. Feed intake dihitung dari selisih antara jumlah pakan yang diberikan pada hari ke (n) dan jumlah pakan yang tersisa pada hari ke (n-1) dibagi dengan jumlah mencit yang hidup. Refleks diamati pada hari kelima dari kemampuan mencit bertahan di air untuk berenang. Kemampuan berenang diukur dari saat mencit diletakan di air sampai mencit berhenti menggerakan kaki. Laju respirasi diamati pada hari ke -0, hari ke-3 dan hari ke-5. Laju respirasi diukur dengan alat respirometer Scholander untuk mamalia kecil dengan indikator penunjuk adalah larutan Brodie. Data yang diperoleh dianalisis dengan program SPPS 10.0 for window.
