MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta
ANTIMUTAGENNÍ AKTIVITA OBSAHOVÝCH LÁTEK V ZELENINĚ A V OVOCI
Disertační práce
Školitel disertační práce:
Vypracovala:
RNDr. Jiří Totušek, CSc.
Mgr. Lucie Mandelová Brno 2006
Poděkování: Děkuji RNDr. J. Totuškovi, CSc. za odborné vedení, ochotu, vstřícnost, konzultace a
cenné rady při vypracování této disertační práce. Dále děkuji pracovníkům farmakologického ústavu za pomoc při práci s experimentálními zvířaty.
Mgr. Lucie Mandelová
OBSAH 1
Úvod .....................................................................................................................5
1.1
Nutričně významné složky zeleniny a ovoce............................................7
1.2 Polyfenoly ..................................................................................................12 1.2.1 Dělení polyfenolů...................................................................................12 1.2.1.1 Fenolové kyseliny ..........................................................................13 1.2.1.2 Flavonoidy......................................................................................14 1.2.1.2.1 Dělení flavonoidů ......................................................................15 1.2.1.2.1.1 Flavonoly.............................................................................15 1.2.1.2.1.2 Flavony................................................................................16 1.2.1.2.1.3 Isoflavony............................................................................17 1.2.1.2.1.4 Flavanony ...........................................................................18 1.2.1.2.1.5 Anthokyanidiny ...................................................................19 1.2.1.2.1.6 Flavanoly.............................................................................20 1.2.1.3 Stilbeny...........................................................................................21 1.2.1.4 Lignany ...........................................................................................22 1.2.2 Obsah polyfenolů ve stravě..................................................................22 1.2.3 Příjem polyfenolů...................................................................................25 1.2.4 Metabolismus polyfenolů......................................................................26 1.2.4.1 Absorpce ........................................................................................26 1.2.4.2 Metabolizace..................................................................................29 1.2.4.3 Biologická využitelnost..................................................................30 1.2.4.4 Eliminace........................................................................................32 1.2.5 Biologické účinky polyfenolů ................................................................33 1.2.5.1 Antioxidační účinky........................................................................34 1.2.5.2 Estrogenní účinky..........................................................................37 1.2.5.3 Vliv na endoteliální funkce............................................................39 1.2.5.4 Angiogenní účinky .........................................................................40 1.2.5.5 Protizánětlivé účinky .....................................................................40 1.2.5.6 Imunomodulační účinky ................................................................41 1.2.5.7 Antimutagenní a antikarcinogenní účinky ...................................42 1.2.5.7.1 Indukce detoxikačních enzymů ...............................................44 1.2.5.8 Negativní vlastnosti polyfenolů.....................................................49
1.3 Glukosinoláty .............................................................................................50 1.3.1 Biosyntéza glukosinolátů......................................................................50 1.3.2 Struktura glukosinolátů .........................................................................51 1.3.3 Dělení glukosinolátů..............................................................................53 1.3.4 Výskyt glukosinolátů .............................................................................54 1.3.5 Enzymatické změny glukosinolátů.......................................................57 1.3.6 Vliv vnějších podmínek na přeměnu glukosinolátů............................59 1.3.7 Příjem glukosinolátů..............................................................................61 1.3.8 Metabolismus isothiokyanátů...............................................................62 1.3.9 Biologické účinky glukosinolátů a jejich rozkladných produktů.........64 1.3.9.1 Antibakteriální účinky ....................................................................64 1.3.9.2 Antioxidační účinky........................................................................64 1.3.9.3 Chemopreventivní účinky .............................................................65 1.3.9.3.1 Vliv na metabolismus detoxikačních enzymů ........................66
1.3.9.3.2 Inhibice buněčného růstu a indukce apoptózy.......................69 1.3.9.4 Estrogenní účinky..........................................................................71 1.3.9.5 Negativní vlastnosti .......................................................................72
2 3
1.4 Výběr mutagenů........................................................................................74 1.4.1 Heterocyklické aminy............................................................................74 1.4.2 Nitrososloučeniny..................................................................................75
Cíle práce ...........................................................................................................77
2.1
Dílčí úkoly ..................................................................................................77
Materiál a metody .............................................................................................78
3.1 Mikronukleus test in vivo .........................................................................78 3.1.1 Roztoky, činidla a média .....................................................................79 3.1.2 Uspořádání pokusů...............................................................................80 3.1.2.1 Experiment č. 1..............................................................................81 3.1.2.2 Experiment č. 2..............................................................................82 3.1.2.3 Experiment č. 3..............................................................................84 3.1.3 Zpracování a statistické vyhodnocení dat...........................................87
3.2 Chemiluminometrické měření fagocytární aktivity myších leukocytů...89 3.2.1 Roztoky, činidla a média .....................................................................89 3.2.2 Uspořádání pokusů...............................................................................90 3.2.3 Zpracování a statistické vyhodnocení dat .........................................90
4
3.3 Stanovení počtu leukocytů a diferenciálního krevního obrazu myší....92 3.3.1 Uspořádání pokusů...............................................................................92 Výsledky.............................................................................................................93
4.1 Hodnocení antimutagenního účinku sulforafanu a jeho vlivu na imunitní odpověď u myší ....................................................................................................93
4.2 Hodnocení antimutagenního účinku indol-3-karbinolu a jeho vlivu na imunitní odpověď u myší......................................................................................98
5
4.3 Hodnocení antimutagenní aktivity brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem .......................................................................................................................107
6
Diskuze.............................................................................................................110
Závěr ................................................................................................................125
7
Souhrn..............................................................................................................127
8
Seznam použité literatury ............................................................................... 131
9
10 11
Summary..........................................................................................................129
Seznam publikovaných prací a prací přijatých k publikaci ..........................162 Seznam použitých zkratek..........................................................................164
Přílohy..........................................................................................................166
1 Úvod Rakovina je obecný pojem pro multifaktoriálně podmíněné onemocnění.
V ekonomicky vyspělých zemích představuje druhou nejčastější příčinu smrti.
Příčinami nádorového onemocnění jsou genetické faktory, kterým lze však přisuzovat pouze malý podíl na vznik tohoto onemocnění. Rozhodující jsou většinou faktory zevního prostředí, kterým je organismus člověka vystaven. Strava a životní styl jedince
jsou jedny z nejvýznamnějších zevních činitelů, které se podílí až z 90 % na vzniku nádorového onemocnění. Strava představuje jednu z nejsložitějších komplexních směsí
prostředí. Odhaduje se, že přibližně 35 % všech případů nádorového onemocnění může být ovlivněno stravou a ta tak hraje důležitou roli v etiologii a v prevenci vzniku
nádorů. Nejvíce, až z 90 % lze stravou zabránit především nádorům trávicího traktu (jícen, žaludek, tlusté střevo a rektum). Otázkou zůstává, které z faktorů stravy jsou nejvíce vztaženy k prevenci rakovinného onemocnění, jakými mechanismy tyto faktory působí, jak mohou interferovat s procesem karcinogeneze a jaké preventivní kroky by
měly být podstoupeny k minimalizaci nežádoucích účinků těchto faktorů, které naopak riziko vzniku nádorového onemocnění zvyšují.
Vznik nádorů podporují zejména životní prostředí, životní styl, výživa,
technologická resp. kulinární úprava stravy. Toto všechno může negativně ovlivňovat proces karcinogeneze. Negativně působí nadměrný přívod energie, tuků, soli, alkoholu a naopak nedostatečný příjem ochranných faktorů, které jsou zastoupeny především v ovoci a zelenině.
Výsledky mnoha studií prokazují, že ovoce a zelenina obsahuje velké množství
biologicky aktivních látek, které jsou schopné snižovat riziko vzniku nádorového onemocnění a dalších tzv. civilizačních chorob. Je prokázáno, že v zemích s nízkou spotřebou ovoce a zeleniny
je úmrtnost na rakovinu daleko vyšší ve srovnání se
zeměmi, kde je spotřeba ovoce a zeleniny vyšší. Tyto látky se také zapojují do
biochemických procesů a jsou účinnými pomocníky imunitního systému. Bojují
s reaktivními formami kyslíku, jejichž tvorbu v organismu podporuje mimo jiné
kouření, nadměrná konzumace alkoholu, znečištěné životní prostředí a mnoho dalších faktorů. Většinou se jedná o působení komplexní směsi látek, mezi kterými dochází ke vzájemným interakcím, čímž je ovlivněn jejich účinek. Často je velmi obtížné či
nemožné posoudit toxické resp. genotoxické působení směsi chemických sloučenin na základě znalostí o toxicitě jednotlivých látek. 5
Ve stravě se kromě látek s protektivními účinky nacházejí také cizorodé látky, které
naopak riziko vzniku rakoviny zvyšují. Záleží pak na mnoha dalších podmínkách (např. na příjmu protektivních látek ze stravy), jak se příjem těchto látek uplatní ve výsledném účinku.
Výzkumy
se
v několika posledních desetiletích zaměřují
na
identifikace
jednotlivých obsahových složek především v ovoci a zelenině a na jejich roli ve
fyziologických a patologických procesech. Výzkumy jsou rovněž směřovány na získávání informací o biologické využitelnosti a farmakokinetice, bez jejichž pochopení jsou doposud získané teoretické poznatky nedostačující.
Předmětem této disertační práce je výzkum antimutagenních účinků vybraných
obsahových látek ze zeleniny rodu Brassicaceae a také působení komplexní směsi těchto látek.
6
1.1 Nutričně významné složky zeleniny a ovoce Výživa hraje velmi podstatnou roli v etiologii a v prevenci nádorového onemocnění
(Greenwald et al., 2001). V rostlinné stravě (ořechy, obiloviny, luštěniny, zelenina a
ovoce) bylo identifikováno tisíce biologicky aktivních sloučenin. Zelenina a ovoce jsou botanicky nejrozmanitější a mají velký potenciál přispívat svoji rozličností a komplexností k prevenci řady onemocnění (Lampe, 1999).
Ovoce a zelenina obsahují škálu chemicky různorodých látek, které vstupují
rozličnými mechanismy do procesu karcinogeneze, inhibují jej nebo v ideálním případě
zastavují. Často tyto látky působí příznivě i proti vývoji kardiovaskulárních nemocí a dalších tzv. civilizačních chorob (Weisburger, 2000; Kalač, 2001). Ve většině studií je
zvýšený příjem zeleniny a ovoce spojen s nižším rizikem nádorového onemocnění.
Jedná se především o nádory plic, dutiny ústní, jícnu, žaludku a tlustého střeva (Park a Pezzuto, 2002). Méně jednoznačné výsledky platí pro hormonálně ovlivněné nádory (prs, prostata) (Fiala, 2004).
Výsledky studií vedly vědce ke snaze izolovat nutričně významné složky, které se
nacházejí v zelenině a ovoci a ty poté aplikovat ve farmakologických dávkách. Podávání izolovaných látek však může v některých případech, zejména ve vyšších
dávkách vést k nepříznivým účinkům. To může poukazovat na fakt, že aplikace izolované látky může představovat pouze prostředníka nebo může poukazovat na jinou živinu nebo kombinaci živin, které jsou účinné.
V současnosti není zcela jasné, které z nutričně významných látek působí nejvíce
protektivně proti nádorovému onemocnění, neboť zelenina a ovoce představují
komplexní směs, která obsahuje velké množství potencionálně prospěšných látek, zahrnující vitaminy, minerální látky, vlákninu a biologicky aktivní složky (karotenoidy,
flavonoidy, steroly, fenoly, isothiokyanáty, indoly aj.) (viz tab.1.) (Kim, 2001; Fiala, 2004).
Mechanismy, kterými obsahové látky zeleniny a ovoce mohou snižovat výskyt
rakoviny jsou složité a komplexní a většinou představují inhibici některé z fází procesu karcinogeneze (Park a Pezzuto, 2002). Mohou zahrnovat indukci detoxikačních
enzymů, inhibici tvorby nitrosaminů, zabezpečení složek pro tvorbu protinádorových
látek, zředění a vazbu karcinogenních látek v trávicím traktu na vlákninu, alteraci metabolismu hormonálních látek, antioxidační, protizánětlivé, imunomodulační a jiné účinky (Kim, 2001).
7
Tab. 1. Možné antikarcinogenní látky obsažené v ovoci a zelenině (Kim, 2001) Karotenoidy
Glukosinoláty/indoly
Tokoferoly
Sloučeniny allia (allicin a allyldisulfidy)
Askorbát Selén
Isothiokyanáty/thiokyanáty
Rostlinné steroly
Kyselina listová
Isoflavony
Dithiothiony
Kumariny
Vláknina
Inhibitory proteáz
Dosavadní poznatky o roli ovoce a zeleniny vyústily v doporučení jíst alespoň pět
porcí ovoce (2 porce) a zeleniny (3 porce) denně, což odpovídá doporučení dle Světové zdravotnické organizace (WHO) – 400 gramů denně (s výjimkou brambor). Je třeba si
uvědomit, že preventivní působení složek ovoce a zeleniny je zřejmě komplexní a
vzájemně se prolíná a těžko může být nahrazeno aplikací izolovaných látek (Kalač, 2001).
Běžně konzumovaná strava, především však zelenina a ovoce jsou zdrojem mnoha
mikronutrientů. Některé z nich, např. β-karoten (prekurzor vitaminu A), vitamin E, vitamin C a selen, vykazují antioxidační vlastnosti, a také vápník, vitamin D a kyselina
listová jsou předmětem experimentálních a epidemiologických výzkumů sloužících ke
zjištění jejich vlivu na riziko nádorového onemocnění. Např. strava bohatá na ovoce a zeleninu, tedy na příjem β-karotenu vykazuje inverzní vztah k rakovině plic. Nicméně
izolované podávání β-karotenu může vést naopak ke zvýšenému riziku rakoviny plic.
Zdá se tedy, že β-karoten je pouze jakýmsi markerem pro jiné sloučeniny obsažené
v zelenině a ovoci, které mohou inhibovat proces karcinogeneze (Greenwald et al., 2001).
Podobně nekonzistentní důkazy platí i pro vitamin E. V některých studiích vede
jejich podávání ke sníženému riziku rakoviny plic a děložního hrdla, v jiných naopak vůbec nesnižuje riziko rakoviny plic. Nicméně existují studie, které zkoumají vztah
vitaminu E k riziku vzniku rakoviny prostaty u kuřáků a výsledky naznačují, že derivát vitaminu E, vitamin E sukcinát může fungovat jako spouštěč buněčné apoptózy u lidských prostatických buněk v pokusech in vitro (Israel et al., 2000).
Strava bohatá na vitamin C, opět tedy na ovoce a zeleninu, pravděpodobně snižuje
riziko rakoviny žaludku a snad i rakoviny dutiny ústní, hltanu, jícnu, plic, slinivky břišní 8
a děložního hrdla. Toto bylo prokázáno v pokusech s vysokým a nízkým příjmem vitaminu C (Greenwald et al., 2001).
Epidemiologické a experimentální studie naznačují, že vitamin D a vápník může
ovlivňovat riziko kolorektálního karcinomu a rakoviny prostaty. Nicméně mnohé z nich naznačují slabý vztah mezi příjmem vápníku a kolorektálním karcinomem a výsledky nejsou přesvědčivé (Greenwald et al., 2002).
Vláknina a strava bohatá na vlákninu (ovoce, zelenina, cereálie, obilniny) by mohla
dle epidemiologických studií také snižovat riziko vzniku rakoviny tlustého střeva a prsu. Výsledky studií však také nejsou zcela jednoznačné. Vláknina může ovlivňovat rakovinu tlustého střeva několika mechanismy, které zahrnují zvýšení obsahu stolice a
tím naředění karcinogenních látek, prodloužení tranzitního času tlustým střevem, což
vede ke snížení interakcí karcinogenů se sliznicí střeva, přímou vazbu karcinogenních látek, změny enzymatické aktivity intestinální mikrobiální flóry a tím snížení
koncentrace sekundárních žlučových kyselin, produkci mastných kyselin s krátkým
řetězcem pomocí fermentace, které mohou inhibovat proces karcinogeneze změnou pH tlustého střeva a zvýšenou dostupností butyrátu. Butyrát je zodpovědný za zastavení růstu (indukcí cyklin dependentních inhibitorů kinázy), dělení a apoptózu nádorových buněk tlustého střeva a prsu (Greenwald et al., 2001; Kim, 2001).
Výsledky in vitro studií potvrzují, že některé mikronutrienty, vykazující
antioxidační vlastnosti, a tedy ochranu proti oxidačnímu poškození biomolekul, jako jsou lipidy, lipoproteiny a DNA, také ovlivňují proces karcinogeneze. Selén je součástí
selenoproteinů (např. glutathion peroxidázy, thioredoxin reduktázy), které fungují jako enzymy, které mohou ovlivňovat riziko rakoviny. Některé kohortové studie poukazují
na inverzní vztah mezi konzumací selenu a rakovinou plic a prostaty. Experimenty na zvířecích modelech demonstrují, že selén může proces karcinogeneze inhibovat. Antioxidační
mikronutrienty mohou ovlivňovat tento proces také jinými
mechanismy. Např. vitamin E inhibuje buněčnou proliferaci, karotenoidy buněčnou
transformaci a dělení, zlepšují buněčnou komunikaci a imunitní odpověď. Vápník a vitamin D snižují buněčnou proliferaci (Greenwald et al., 2001).
Dále existuje velká skupina látek, označována v zahraniční literatuře jako
fytochemikálie. Jedná se o širokou skupinu biologicky aktivních látek, zahrnujících
tisíce chemicky rozličných sloučenin. Mnohé z nich jsou zkoumány v laboratorních experimentech pro jejich potenciální schopnosti ovlivnit proces karcinogeneze a ve snaze odhalit
mechanismu
tohoto
účinku. 9
Nicméně
aplikovatelnost
výsledků
experimentálních studií ze zvířat na člověka není přímočará, neboť lidé konzumují
stravu jako komplexní směs mnoha biologicky aktivních sloučenin a dalších látek,
které na sebe navzájem působí. Kvantifikovat příjem těchto látek ve stravě je také značný problém. Neznáme přesné složení všech dostupných potraviny ani podíl jednotlivých biologicky aktivních látek. Nejsou ani známé spolehlivé biomarkery jejich
příjmu. Proto jsou někdy výsledky studií zkoumajících vztah nádorového onemocnění a
příjmu biologicky aktivních látek obtížně interpretovatelné (Greenwald et al., 2001).
Existují také problémy se srovnáváním účinné expozice v experimentálních studiích a příjmem těchto látek u lidí (Dragsted et al., 1997; Lampe, 1999).
V tab. 2. uvádím vybrané biologicky aktivní sloučeniny s příklady nejčastěji
zastoupených látek, potravními zdroji a jejich možnými chemopreventivními vlastnostmi.
Vzhledem k širokému zastoupení biologicky aktivních látek v zelenině a ovoci není
možné uvést zde jejich podrobný popis, a tak bych se ráda v dalších částech disertační
práce zaměřila na dvě významné skupiny látek, kterým je v posledních letech věnováno mnoho pozornosti ze strany vědců. Jedná se o skupinu látek sekundárního metabolismu rostlin - polyfenoly a glukosinoláty.
10
Tab.2. Vybrané biologicky aktivní sloučeniny ve vztahu k prevenci nádorového
onemocnění (Greenwald et al., 2001) Třída
Nejčastější
Karotenoidy
α-karoten
Zdroje
Mechanismus prevence
žluto-červená
antioxidační aktivita
zástupci
v potravě
β-karoten
a tmavě zelená
Lykopen
β-kryptoxantin Astaxantin
zelenina a
ovoce
nádorového onemocnění modulace metabolismu karcinogenů
inhibice buněčné proliferace
inhibice exprese onkogenů
prospěšné účinky na imunitní systém
prospěšné účinky na buněčnou transformaci a diferenciaci
Organo-siřičité sloučeniny
Diallyl sulfid
česnek, cibule,
Allyl methyl trisulfid
zelenina
Diallyl disulfid Dithiothiony
brukvovitá
zlepšení mezibuněčné komunikace
zvýšení aktivity detoxikačních enzymů II. fáze
inhibice buněčné proliferace
indukce buněčné diferenciace
alterace metabolismu steroidních hormonů
Polyfenoly
Fenolové kyseliny
zelenina a
Hydroxyskořicové
ovoce,
Flavanoly
červené víno
kyseliny
Flavanony
zelený čaj,
Katechniny Fytoestrogeny
Isoflavony, Lignany
inhibice aktivity ornithin dekarboxylázy snížení tvorby DNA adduktů
inhibice buněčné proliferace
indukce zastavení buněčného cyklu a apoptózy
inhibice signální transdukce
zlepšení mezibuněčné komunikace
zlepšení imunitních funkcí sójové boby,
alterace metabolismu estrogenů
žito
indukce zastavení buněčného cyklu a
zelenina,
snížení aktivity tyrosin kinázy apoptózy
ovlivnění DNA-zlomů vyvolaných topoisomerázou II
Glukosinoláty,
Glukobrassicin
indoly
Indol-3-karbinol
isothiokyanáty,
Terpeny
Sulforafan
Monoterpeny
Seskviterpeny
brukvovitá
zelenina
zvýšení aktivity detoxikačních enzymů II. fáze
indukce zastavení buněčného cyklu a apoptózy
zelenina a
ovoce
(např. citrusové)
11
inhibice buněčné adheze a invaze
zvýšení aktivity detoxikačních enzymů II. fáze
ovlivnění buněčné progrese indukce apoptózy
1.2 Polyfenoly Polyfenoly tvoří jednu z nejpočetnějších a nejvíce zastoupených skupin rostlinných
metabolitů a tvoří tedy nedílnou součást potravy lidí i zvířat (Bravo, 1998).
Zpočátku byly studovány pro jejich esenciální funkci ve fyziologii rostlin (růst,
reprodukce, ochrana před patogeny a predátory). Až donedávna byly také u těchto látek objevovány většinou jen škodlivé a nepříznivé účinky, neboť polyfenoly jsou schopné se vázat na makromolekuly (bílkoviny, sacharidy, trávicí enzymy) a tím se snižuje
nutriční hodnota potravy. Postupně však docházelo k poznání jejich antioxidačních vlastností a využitelnosti v lidském organismu, jejich možné role v prevenci nemocí
spojených s oxidačním stresem (kardiovaskulární, nádorové a neurodegenerativní nemoci) (Bravo, 1998; Manach et al., 2004).
Výzkumy se dnes zaměřují především na určení přesných mechanismů vedoucích
k protektivním
účinkům
a
na
identifikaci
pravděpodobně
nejprospěšnějších
polyfenolických látek. Tyto výsledky pak mohou pomoci v určení optimálního příjmu polyfenolů stravou (Manach et al., 2004).
1.2.1 Dělení polyfenolů
Polyfenoly představují širokou skupiny sloučenin s více než osmi tisíci fenolickými
látkami
známými
v současné
době.
Polyfenoly
jsou
produkty
sekundárního
metabolismu rostlin. Vznikají biogeneticky ze dvou hlavních syntetických cest:
šikimátové acetátové
Vzniká tak extrémně široká a komplexní skupina látek. Přírodní polyfenoly zahrnují
látky od jednoduchých fenolových molekul, jako je kyselina fenolová, až k vysoce
polymerizovaným sloučeninám s molekulární hmotností větší než 30 kDa, jako jsou tanniny. Primárně se vyskytují v konjugované formě, s jednou či více sacharidovými jednotkami (monosacharidy, disacharidy či oligosacharidy) β-glykosidicky vázanými k hydroxylovým skupinám. Glukóza je nejběžnější připojený sacharid. Vazby s jinými
sloučeninami (karboxylové a organické kyseliny, aminy, lipidy a vazby s jinými fenoly) jsou rovněž běžné (Bravo, 1998).
Polyfenolické sloučeniny mohou být rozděleny do několika skupin v závislosti na
počtu aromatických kruhů a způsobu vazby mezi jednotlivými aromatickými kruhy. 12
Jsou rozlišovány čtyři skupiny: 1. Fenolové kyseliny
2. Flavonoidy
3. Stilbeny
4. Lignany (Manach et al., 2004). 1.2.1.1 Fenolové kyseliny
Rozlišujeme dvě třídy fenolových kyselin:
deriváty kyseliny benzoové (kys. ellagová, gallová, hydrolyzované tanniny)
deriváty kyseliny skořicové (kys. p-kumarová, kávová, chlorogenová, ferulová, sinapová) (viz obr.1.).
Tyto kyseliny se nacházejí jak ve volné, tak v esterifikované formě. Dvě hlavní
hydroxybenzoové kyseliny představuje
kyselina gallová a ellagová. Nalézají se
převážně v bobulích (maliny, jahody, ostružiny) a ořeších (King a Young, 1999).
Celkově hydroxybenzoové kyseliny bývají zastoupeny v běžné stravě ve velmi malých
koncentracích s výjimkou některých druhů červeného ovoce, černé ředkve a cibule. Zde jsou zastoupeny řádově v desítkách mg.kg-1 čerstvé hmotnosti.
R1 = R2 = OH, R3 = H : K. protokatechuová R1 = R2 = R3 = OH : K. gallová
R1 = OH : K. kumarová R1 = R2 = OH : K. kávová R1 = R2 = OH : K. ferulová
Obr. 1. Chemická struktura hydroxybenzoových a hydroxyskořicových kyselin
(Manach et al., 2004)
Významný zdroj kyseliny gallové představuje čaj (Camelia sinensis). Čajové lístky
mohou obsahovat až 4,5 g.kg-1 čerstvé hmotnosti. Mimo jiné jsou hydroxybenzoové
13
kyseliny součástí komplexních struktur – hydrolyzovaných tanninů (gallotanninů a ellagotanninů).
Hydroxyskořicové kyseliny jsou v naší stravě běžnější. Výjimečně se nalézají ve
volné formě, vyjma zpracované potravy (zmrazení, sterilizace či fermentace). Většinou je nacházíme glykosylované či ve formě esterů kyseliny chininové, šikimátové a vinné.
Hydroxyskořicové kyseliny se nacházejí především ve vnějších vrstvách zralého ovoce a jejich koncentrace se během zrání snižuje, nicméně s růstem plodu se celkový obsah
zvyšuje. Nejrozšířenější je kyselina kávová, jak volná tak esterifikovaná a představuje 75 % a 100 % z celkového obsahu hydroxyskořicových kyselin obsažených v ovoci. Její
ester kyselina chlorogenová je přítomna v mnoha druzích ovoce, zeleniny a v kávě.
Jeden šálek kávy (200 ml) obsahuje 50 – 350 mg této kyseliny. Borůvky, kiwi, švestky,
třešně a jablka poskytují asi 0,5 – 2 g hydroxyskořicových kyselin v 1 kg čerstvého ovoce. Kilogram čerstvých brambor poskytuje asi 100 – 200 mg této kyseliny. Vařené brambory pouze 35 % původního obsahu, a pečením se chlorogenová kyselina
degraduje zcela. Kyselina ferulová je zastoupena nejvíce v obilovinách (0,8 – 2 g.kg-1 sušiny) a to především
ve vnějších vrstvách zrna. Obiloviny tak představují její
nejvýznamnější zdroj (Manach et al., 2004).
Fenolové kyseliny a jejich deriváty vykazují účinky primárních antioxidantů
(Velíšek, 2002).
1.2.1.2 Flavonoidy
Flavonoidy, které představují nejvýznamnější samostatnou skupinu polyfenolů,
obsahují v molekule dvě benzenová jádra spojená tříuhlíkovým řetězcem. Jedná se o uspořádání C6-C3-C6. Svými vlastnostmi se liší od ostatních polyfenolických sloučeniny
a proto jsou uváděny jako samostatná skupina rostlinných látek. Dodnes je známo více jak 4000 flavonoidních látek a stále jsou objevovány nové (Velíšek, 2002).
U většiny flavonoidů je C3 řetězec součástí heterocyklického kruhu a flavonoidy
jsou tak odvozeny od heterocyklické sloučeniny 2H-chromenu, substituovaného
v poloze C-2 fenylovou skupinou, který se nazývá flavan. Jeho kostra se skládá ze dvou benzenových jader (A a B) a kruhu odvozeno od 2H pyranu (C) (viz obr. 2.). Běžně jsou
všechny 3 kruhy substituované methoxy- či hydroxyskupinami , jejich deriváty se pak liší stupněm oxidace či substituce. Flavonoidy se nejčastěji vyskytují jako glykosidy nebo méně běžně jako volné látky. (Bravo, 1998; Velíšek, 2002 ).
14
Obr. 2. Flavan – základní struktura flavonoidů (Velíšek, 2002) 1.2.1.2.1 Dělení flavonoidů Podle stupně oxidace kyslíkového heterocyklu (kruh C) rozeznáváme šest podtříd
flavonoidů:
a. Flavonoly b. Flavony
c. Isoflavony d. Flavanony
e. Anthokyanidiny f.
Flavanoly (katechiny a proanthokyanidiny) (Manach et al., 2004)
1.2.1.2.1.1 Flavonoly
Hlavním zástupcem početné skupiny flavonoidů jsou flavonoly (viz obr. 3.). Jsou
zastoupeny v relativně nízkých koncentracích 15 – 30 mg.kg-1 čerstvé hmotnosti.
Nejbohatšími zdroji jsou česnek (až 1,2 g.kg-1 čerstvé hmotnosti), pór, brokolice a borůvky (Manach et al., 2004) a jablka (Lachman et al., 2000). Nejznámějšími
aglykony jsou kvercetin, kemferol a myricetin. Kvercetin je všudypřítomný v ovoci a
zelenině a je kvantitativně nejvíce zastoupen v rostlinné stravě (Scalbert a Williamson,
2000). Kemferol se nachází převážně v listové zelenině a ovoci, také v bobulích, bylinách, luštěninách a kořenové zelenině. Isorhamnetin nalezneme v cibuli a hruškách a další flavonol myricetin v bobulích, kukuřici a čaji.
Aglykony se vyskytují v poměrně malém množství, hlavní formou flavonolů jsou
glykosidy. Nejčastější cukernou složkou představuje glukóza či rhamnóza. V ovoci tak rozeznáváme mezi 5 – 10 různými flavonolovými glykosidy. Běžným glykosidem
rostlin je rutin. Ten a některé další glykosidy vykazují antioxidační vlastnosti, mají vliv na pružnost a permeabilitu krevních kapilár.
15
R2 = OH, R1 = R3 = H : Kemferol R1 = R2 = OH, R3 = H : Kvercetin R1 = R2 = R3 = OH : Myricetin
Obr. 3. Chemická struktura flavonolů (Manach et al., 2004) Ve větším množství se flavonoly a jejich glykosidy nachází v čaji a tím významně
přispívají k trpké chuti čaje. Nalézají se rovněž ve víně, kde jejich koncentrace dosahuje až 45 mg flavonolů.l-1.
Flavonoly se akumulují ve vnějších částech rostlinných tkání (slupka, listy), neboť
jejich syntéza je stimulována světlem.
V závislosti na expozici slunečnímu světlu
existují znatelné rozdíly v jejich obsahu. V listové zelenině (hlávkový salát, zelí) bývá
koncentrace glykosidů 10 a vícekrát vyšší ve vnějších listech než ve světlejších vnitřních částech (Manach et al., 2004). 1.2.1.2.1.2 Flavony
Flavony jsou společně s flavonoly žlutými pigmenty rostlin. Chemická struktura
flavonů je zobrazena na obr. 4. Jsou mnohem méně běžné než flavonoly. Hlavními zástupci této skupiny jsou glykosidy apigenin a luteolin, obsažené hlavně v bylinách (petržel), červených paprikách a celeru.
Pokud jsou přítomné ve vyšších koncentracích, přispívají k barvě rostlinných tkání.
C-glykosidy (vitexin a orientin) se nacházejí především v pšenici a jáhlech (Manach et al., 2004). Ve fících se např. nachází C-glykosid schaftosid, sloužící k identifikaci
fíkové šťávy v jiných ovocných šťávách (Velíšek, 2002). Citrusové ovoce obsahuje
polymethoxylované flavony – nobiletin, sinensetin a tangeretin, které se podílejí na chuti ovoce díky přítomnosti senzoricky významných látek (Manach et al., 2004).
16
R1 = H, R2 = OH : Apigenin R1 = R2 = OH : Luteolin
Obr. 4. Chemická struktura flavonů (Manach et al., 2004) 1.2.1.2.1.3 Isoflavony
Podrobně zkoumanou skupinou jsou isoflavony, které jsou stavebně podobné
estrogenům (viz obr. 5.). Ačkoliv se nejedná o steroidy, obsahují hydroxylové skupiny v poloze 7 a 4´, které jsou analogní s hydroxyly v estradiolové molekule. Jsou schopné
vázat se k estrogenovým receptorům a v důsledku toho jsou nazývány fytoestrogeny (Manach et al., 2004).
R1 = H : Daidzein R1 = OH : Genistein
Obr. 5. Obecná struktura isoflavonů (Manach et al., 2004) Tyto látky vykazují
různé biologické účinky (antioxidativní, antikarcinogenní,
kardioprotektivní, estrogenní/antiestrogenní, antibakteriální a další) a výsledky studií
naznačují, že by mohly chránit či zpomalit vývoj hormonálně závislých nádorů (prs, prostata) a nemocí (osteoporóza) (Mazur, 1998). Pravděpodobně se uplatňují v iniciační
a promoční fázi karcinogeneze a inhibují proliferaci endoteliálních buněk (Adlercreutz,
1999).
Isoflavony a některé jejich deriváty však vykazují toxické účinky spojené s jejich
estrogenní aktivitou (Velíšek, 2002).
17
Je jich známo přes 200. Vyskytují se především v luštěninách (čeleď bobovitá,
Fabaceae). Sója (Glycine max) a sójové výrobky jsou jejich hlavním zástupcem.
Obsahují tři hlavní sloučeniny: genistein, daidzein a glycitein, v poměru 1:1:0,2. Obsah
isoflavonů v sóji se však liší podle oblasti, podmínek pěstování a zpracováním. Sójové
boby obsahují v 1 kg mezi 580 – 3800 mg isoflavonů. Sójové mléko pak v 1 litru 30 – 175 mg. (Manach et al., 2004). 1.2.1.2.1.4 Flavanony
Flavanony jsou nalézány ve vysokých koncentracích pouze v citrusovém ovoci,
méně již v rajčatech a některých aromatických rostlinách (máta, lékořice). Přispívají k typické chuti citrusového ovoce. Chemická struktura je zobrazena na
obr. 6.
Hlavními aglykony jsou hesperetin (pomeranče), naringenin (grapefruity) a eriodictyol (citróny).
R1 = H, R2 = OH : Naringenin R1 = R2 = OH : Eriodictyol R1 = OH, R2 = OCH3 : Hesperetin
Obr. 6. Chemická struktura flavanonů (Manach et al., 2004) Flavanony jsou obecně glykosylovány disacharidy v pozici 7 a to buď
neohesperidózou, zodpovědnou za hořkou chuť či rutinózou, která je bezbarvá.
V 1 litru pomerančového džusu je obsaženo okolo 200 – 600 mg hesperidinu a
15 – 85 mg narirutinu, takže jedna sklenice džusu představuje 40 – 140 mg glykosidů flavanonů. A protože se tyto látky nalézají nejvíce pod slupkou a v tkáních mezi
jednotlivými segmenty, obsah flavanonů je až pětkrát vyšší v celém ovoci než ve sklenici džusu (Manach et al., 2004).
18
1.2.1.2.1.5 Anthokyanidiny
Anthokyany jsou glykosidy různých aglykonů, které se nazývají anthokyanidiny
(viz obr. 7.). Anthokyany, též nazývané anthokyaniny jsou nejrozšířenější skupinou rostlinných barviv nalézajících se v buněčných vakuolách. Jsou nositeli
růžové,
červené, modré a nachové barvy. Dosud bylo identifikováno kolem 300 různých
anthokyanů. Podle pH existují barevné i nebarevné formy. Anthokyany jsou značně nestabilní. Aby se zabránilo jejich degradaci, dochází ke glykosylaci, převážně glukózou v pozici 3 a esterifikaci s různými organickými a fenolovými kyselinami (Manach et al., 2004). Tvorbou komplexů se slinnými proteiny, jsou tyto látky
zodpovědné za trpkou chuť ovoce a nápojů (čaj, pivo, víno, jablečný mošt) (Rasmussen et al., 2005).
Anthokyaniny se nalézají především v ovoci, bobulích hrozna modrých odrůd révy
vinné, v cereáliích, a v některých druzích listové a kořenové zeleniny (červené zelí, fazole, lilek baklažán, cibule a ředkvička)
R1 = R2 = H : Pelargonidin R1 = OH, R2 = H : Kyanidin R1 = R2 = OH : Delfinidin
R1 = OCH 3, R2 = OH : Petunidin R1 = R2 = OCH3 : Malvidin
Obr. 7. Chemická struktura anthokyanidinů (Manach et al., 2004) Nejznámější zástupci této skupiny jsou kyanidin, dále pelargonidin, peonidin,
delfinidin, petunidin a malvidin. Počet anthokyanů v rostlinách je různý a pohybuje se
od několika málo (ostružiny, jahody) až po více než deset různých pigmentů (borůvky, réva vinná).
19
Nalézají se hlavně ve slupkách, ale i v dužině (jahody, třešně). Barva obvykle
odpovídá obsahu anthokyanů. U černého rybízu a ostružin dosahuje 2 – 4 g.kg-1. Víno
obsahuje v 1 litru 200 – 350 mg anthokyanů, jeho složení se mění se stupněm zrání vína
(klesají původní anthokyany a stoupají stabilnější červené pigmenty) (Velíšek, 2002;
Manach et al., 2004).
Anthokyanová barviva byla povolena v potravinářském průmyslu k barvení
potravin. Jejich toxicita a mutagenita nebyl prokázána nebo byla velmi nízká (Velíšek, 2002). Naopak u anthokyaninů byly prokázány antioxidační vlastnosti (Prior, 2003). 1.2.1.2.1.6 Flavanoly
Flavanoly existují jako monomery (katechiny) (viz obr. 8.) a polymery
(proanthokyanidiny). Katechiny se nalézají v mnoha druzích ovoce, ale jsou také zastoupeny v révovém víně. Zelený čaj a čokoláda však představují zdaleka jejich
nejbohatší zdroj. Šálek odvaru ze zeleného čaje obsahuje až 200 mg katechinů. Černý čaj obsahuje díky procesu fermentace méně monomerů flavanolů, neboť ty podléhají
oxidaci za vzniku komplexnějších kondenzovaných polyfenolů známých jako teaflaviny a tearubigeny.
R1 = R2 = OH, R3 = H : Katechiny R1 = R2 = R3 = OH : Gallokatechin
Obr. 8. Chemická struktura flavanolů (Manach et al., 2004) Nejznámějšími flavanoly jsou již výše zmíněné katechiny a epikatechiny, které se
nalézají
především
v ovoci,
zatímco
gallokatechiny,
epigallokatechiny
a
epigallokatechin gallát nalezneme zejména v luštěninách, hroznech a významněji jsou zastoupeny v čaji.
20
Proanthokyanidiny, také známé jako kondenzované tanniny, jsou dimery, oligomery
a polymery katechinů. Tanniny jsou vysoce hydroxylované molekuly a mohou tvořit nerozpustné komplexy se sacharidy a proteiny. Kondenzované tanniny jsou díky tvorbě
komplexů se slinnými proteiny zodpovědné za svíravou chuť ovoce (vinná réva,
broskve, bobule, jablka, hrušky), nápojů (víno, čaj, pivo, jablečný mošt) a za hořkost čokolády. Svíravost se (Manach et al., 2004).
mění i během procesu zrání a s dosažením zralosti mizí
1.2.1.3 Stilbeny
Stilbeny (viz obr. 9.), strukturně podobné flavonoidům, jsou v lidské výživě
zastoupeny pouze v malém množství. Vyskytují se ve volné formě nebo vázané jako glykosidy. Některé z nich prokazují antimikrobní vlastnosti a proto se řadí mezi
fytoalexiny, což jsou sekundární metabolity rostlin, které se tvoří jako odpověď na stres (Šmidrkal et al., 2001).
Resveratrol
Obr. 9. Chemická struktura stilbenů (Manach et al., 2004) Do této skupiny patří známý resveratrol a jeho glukosid piceol. Resveratrolu se
připisuje
významná
úloha
v prevenci
kardiovaskulárních
nemocí,
vykazuje
antiaterogenní, protizánětlivé a antioxidační účinky, v posledních letech jsou zkoumány
jeho možné antikarcinogenní účinky (Fremont, 2000; Ignatowitz a Baer-Dubowska, 2001). Nalézá se především ve slupkách bobulí modrých odrůd révy vinné. Zráním se jeho obsah zvyšuje (až do 20 mg.kg-1) (Kopec, 2000). V menším množství se nalézá
také ve vínech. V jednom litru je obsaženo přibližně 0,3 – 2 mg resveratrolu, více v červeném než bílém (Scalbert a Williamson, 2000).
21
1.2.1.4 Lignany
Pro svoji estrogenní aktivitu bývají lignany také řazeny do skupiny fytoestrogenů.
Lignany se nacházejí především v různých druzích semen, v celých zrnech, luscích
zeleniny a také v ovoci. Při technologickém zpracování však dochází k odstranění lignanů se slupkami společně s vlákninou a proto je lidská strava na tyto látky celkem chudá.
Nejbohatším zdrojem lignanů tak zůstává lněné semínko, lněný olej a celozrnné
žitné pečivo. Lněné semínko obsahuje sekoisolariciresinol (SECO) (až 3,7 g.kg-1 sušiny) (viz obr. 10) a malé množství matairesinolu. Lignany jsou metabolizovány střevní mikroflórou na enterodiol a enterolakton (Manach et al., 2004).
Sekoisolariciresinol
Obr. 10. Chemická struktura lignanů (Manach et al., 2004)
1.2.2 Obsah polyfenolů ve stravě
Dnes existuje široké množství literárních údajů o složení polyfenolů a jejich obsahu
v rostlinné stravě a nápojích. Jejich množství v potravinách se pohybuje v širokém rozmezí od 1 mg.kg-1 do 3000 mg.kg-1.
Obsah polyfenolů v rostlinné stravě může být ovlivněn řadou faktorů, zejména
odrůdou a podmínkami pěstování rostliny, zralostí v době sklizně, zpracováním, skladováním či kulinární úpravou. Navíc nejsou polyfenoly v rostlinách rozloženy rovnoměrně a proto může mít následné zpracování podstatný vliv na jejich konečné
množství. Například tvorba glykosidů flavonu a flavonolu vysoce závisí na světle, proto jsou nejvyšší koncentrace těchto sloučenin nalézány v listech a zevních částech 22
rostlin, s pouze stopovým množstvím v podzemních částech rostlin.
Množství
kvercetinu v jablečné slupce je asi 1 mg.g-1 čerstvé váhy, po oloupání však jablko neobsahuje žádné další flavonoly (Burda et al., 1990).
Podobné je to s obsahem
polyfenolů v obilovinách před a po zpracování na mouku. Tepelné zpracování vede také
ke snížení obsahu polyfenolů. U rajčat a cibule se vařením ztrácí 75 – 80 % z původního
obsahu kvercetinu, při přípravě v mikrovlnné troubě 65 % a smažením 30 %. Při tepelné úpravě v páře se ztrácí nejméně polyfenolů. Podobná situace je s bramborami, zde se polyfenoly ztrácejí jak loupáním, tak vařením.
Na druhé straně může být technologickým procesem obsah polyfenolů zvýšen, jako
je tomu např. při výrobě ovocných džusů nebo vín. Při lisování ovocné šťávy dojde
k uvolnění fenolových látek (narušením buněčné struktury), které jsou za syrového stavu nedostupné.
Ovoce je obvykle bohatší na polyfenoly než zelenina. Celkový obsah polyfenolů
bývá okolo 10 – 20 g.kg-1 čerstvého ovoce. Jsou zastoupeny hlavně proanthokyanidiny
(jablka, švestky, hrozny) a anthokyaniny (třešně a další červené ovoce), které se běžně
nenacházejí v zelenině. Konzumace výrobků z obilovin pak přispívá k příjmu
fenolových kyselin pouze pokud jsou pro výrobu použita celá zrna. Čokoláda je také bohatá na polyfenoly, zvláště na katechiny a proanthokyanidiny a může tak významně přispívat k jejich celkovému příjmu. Neméně důležitým zdrojem polyfenolů v lidské
výživě jsou nápoje. Lidem, kteří konzumují pravidelně čaj, kávu, víno a ovocné džusy, poskytují tyto nápoje hlavní přísun polyfenolů (Scalbert a Williamson, 2000).
V hroznech révy vinné (Vitis vinifera L., V. labrusca, V. rotundifolia) a také v bílých
a červených vínech se vyskytuje resveratrol, který patří do skupiny stilbenů. Převážně
se nachází ve slupkách. Během zrání bobulí se jeho obsah postupně zvyšuje. Obsah
resveratrolu se liší dle druhu a odrůdy (vyšší obsah v hroznech V. rotundifolia než ve
V. vinifera L.). Jeho obsah je ovlivněn i zeměpisnou šířkou a nadmořskou výškou
(chladnější oblasti - vyšší obsah resveratrolu). Kontaminace a stresory během růstu
rovněž zvyšují jeho koncentraci. Nesporný vliv má i technologie zpracování. Červená
vína mají asi šestkrát vyšší koncentraci resveratrolu než vína bílá (Kopec, 1999).
Faitová et al. (2004) porovnávali obsah resveratrolu v Ryzlinku rýnském z různých
vinařských oblastí ČR. Nejvyšší obsah byl nalezen u vín z roudnické oblasti (0,262
mg.l-1), nejnižší ve vínech ze žernosecké oblasti (0,051mg.l-1). Podobně Totušek et al.
(1994) stanovovali obsah resveratrolu v červených vínech z jihomoravských vinařských
oblastí, z roku 1999. Přičemž nejvyšší obsah byl nalezen ve vínech jakostního stupně 23
jakostní z velkopavlovické oblasti (3,73 – 7,83 mg.l-1), Absolutně nejvyšší hodnotu vykazovala Frankovka (7,83 mg.l-1). Zajímavé bylo, že kvalitnější vína z této oblasti vykazovala nižší hodnoty (0,051mg.l-1).
Tab. 3. Obsah polyfenolů v jedné porci běžně konzumovaných potravin a nápojů
Anthokyaniny
Flavanony
(flavonoly)
Proanthokyanidiny
(flavonoly)
Katechiny
Flavonoly
kyseliny
Potraviny
Fenolové
(mg) (Scalbert a Williamson, 2000)
Zelenina Brambory 200 g
28
Hlávkový salát 100 g
8
Rajčata 100 g Cibule 20 g
8
0,5 1
7
Ovoce
Jablka 200 g Třešně 50 g
11
7
21
200
37
1
3
35
16
86
200
Další potraviny Pšeničné otruby 10 g
50
Tmavá čokoláda 20 g Nápoje
22
Pomerančový džus 100 ml Červené víno 125 ml Káva 200 ml
Černý čaj 200 ml
12
2
34
8
130
45
4
150
Polyfenoly jsou částečně zodpovědné za senzorické a nutriční vlastnosti rostlinné
stravy. Podílejí se na svíravé a hořké chuti. Oxidace polyfenolů během zpracování či
skladování tak bude ovlivňovat prospěšné či nežádoucí charakteristiky v potravních produktech. Oxidativní změny, např. hnědnutí kakaa během zpracování či oxidativní polymerace polyfenolů čaje během výroby černého čaje má za následek vývoj 24
význačných a žádoucích organoleptických vlastností. Naproti tomu, enzymatické
hnědnutí polyfenolických sloučenin a neenzymové hnědnutí jsou zodpovědné za tvorbu nežádoucí barvy a chuti ovoce a zeleniny (Bravo, 1998).
Průměrný obsah polyfenolů v jedné porci konzumovaných potravin a nápojů se
snaží přiblížit tabulka 3. Od roku 2003 je také na stránkách ministerstva zahraničí USA
dostupná databáze 225 vybraných potravin s obsahem flavonoidů (US Department of Agriculture, 2003).
V příloze 2 – 5 jsou uvedeny tabulky s obsahem polyfenolů dle Kinga a Younga
(1999). Nejprve dle jednotlivých zastoupených polyfenolů (příloha 2) a posléze tytéž
údaje dle zdrojů jednotlivých polyfenolů ve stravě a nápojích (příloha 3 – 5).V příloze 6
jsou zobrazeny obsahy celkových polyfenolů dle Brava (1998). Aktuální obsah polyfenolů je často podhodnocen z důvodu nedostatečné analýzy nerozpustných
polyfenolů, které mohou představovat důležitější zdroj polyfenolů než samotné flavonoidy (Bravo, 1998).
1.2.3 Příjem polyfenolů
Díky obrovské rozmanitosti ve struktuře jednotlivých polyfenolů (rozdíly ve stavbě,
oxidačním stavu, hydroxylaci fenolového kruhu, glykosylaci většiny flavonoidů apod.) je velmi obtížné odhadnou jejich množství ve stravě a také zůstává mnoho polyfenolů stále neidentifikovaných. Mimoto je obtížné srovnávat získaná data s literárními údaji a
to především pro nedostatek srovnatelných analytických metod a výskytu různých druhů polyfenolických sloučenin (King a Young, 1999).
Kühnau v roce 1976 spočítal, že celkový denní příjem glykosidů flavonoidů na 1
obyvatele USA byl přibližně 1g, s následujícím složením: 16 % flavonoly, flavony a flavanony, 17 % anthokyaniny, 20 % katechiny a 45 % „biflavony“ (Kühnau, 1976).
Současné studie ukazují, že příjem fenolových kyselin představuje přibližně 1/3
z celkových polyfenolů, flavonoidy pak zbylé 2/3. Vždy ale záleží na poměru konzumovaných druhů potravin a nápojů. V běžné západní stravě se konzumuje asi jen
2 – 4 % genisteinu a kvercetinu z celkových polyfenolů. V Japonsku je situace opačná. Vysoká konzumace sóji a sójových výrobků (10 – 35 g/den) přináší mnohem vyšší příjem isoflavonů (30 – 40 mg/den) (Kimira et al., 1998; Wakai et al., 1999).
V ČR jsou hlavními zdroji polyfenolů především ovoce a nápoje. V menší míře
přispívají obiloviny a zelenina. Takže lidé konzumující během dne rozmanitou stravu a
25
nápoje by měli přijmout více než 1g flavonoidů a fenolových kyselin denně (Velíšek,
2002).
Ve studii vedené v Nizozemí se čtyřmi tisíci dospělými lidmi byl průměrný denní
příjem flavonoidů kvercetinu, kemferolu, myricetinu, apigeninu a luteolinu celkově 23
mg, z toho 16 mg kvercetinu. Zdroje flavonoidů byly: čaj (48%), cibule (29%) a jablka (7%) (Hertog et al., 1993). Průměrný denní příjem flavonů a flavonolů ve studii s
12.763 dobrovolníky ze sedmi zemí (od roku 1958 do roku 1964) se pohyboval od 2,6 mg/den ve Finsku až k 68,2 mg/den v Japonsku (Hertog et al., 1995). Jiná studie
ukazuje, že příjem flavonolů a flavonů pro jeden subjekt z každé ze 14 zemí se pohyboval od 3,6 mg/den pro osobu z Mexika až k 77 mg/den pro osobu z Finska; průměrně 27,6 mg/den. Američané, kteří dodržují makrobiotickou stravu, konzumují průměrně 15,7 mg/den (De Vries et al., 1997). Ve Španělsku je průměrný příjem
polyfenolů asi 18 – 31 mg/den. Jejich hlavní zdroje představuje víno a jablka (Shoji et
al., 2004). Ve Velké Británii dosahuje příjme flavonoidů dle Pierpointa (1990) až 900 mg denně, a to především díky vysoké konzumaci čaje.
Rozdíly v příjmu flavonoidů mezi jednotlivými zeměmi nejsou však dány ani tak
odlišností v jejich příjmu jako spíše rozdílnými metodikami ve shromažďování dat a designem jednotlivých studií.
Příjem flavonoidů tvoří ale jen část z celkového příjmu polyfenolických sloučenin a
neexistují studie, které by odhadovaly jejich celkový příjem. Jestliže by byly zahrnuty anthokyany, flavonoly, isoflavony, fenolové kyseliny a tanniny, celkový příjem
polyfenolických sloučenin by mohl být vysoký, zvláště v zemích, kde je konzumováno hojně červené víno a sójové produkty. Informace o celkovém příjmu polyfenolických sloučenin by byly užitečné, neboť většina polyfenolů vykazuje řadu biologických
účinků a ovlivňují tak fyziologické a patofyziologické procesy v organismu (King a Young, 1999).
1.2.4 Metabolismus polyfenolů 1.2.4.1 Absorpce
Je nezbytné si uvědomit, že polyfenolické sloučeniny, které se nejčastěji vyskytují
ve stravě, nemusí být nutně nejaktivnější uvnitř lidského těla. Existuje několik důvodů, které
tento
fakt
potvrzují.
Může
se
26
jednat
o
nedostatečnou
absorpci
z gastrointestinálního traktu, rychlou metabolizaci, nízkou či odlišnou biologickou aktivitou v cílových tkáních či urychlenou eliminaci z organismu (Hollman, 1997a).
Ve stravě jsou flavonoidy, kromě flavanolů přítomny v glykosidické formě, která
ovlivňuje chemické, fyzikální a biologické vlastnosti polyfenolů Williamson, 2000). O osudu glykosidů
(Scalbert a
v žaludku neexistuje mnoho přesvědčivých
důkazů. Experimenty ukazují, že vstřebávání v žaludku je možné u některých flavonoidů, např. u
kvercetinu a daidzeinu, ale ne pro jejich glykosidy. Většina
glykosidů pravděpodobně odolává kyselé hydrolýze v žaludku a tak přichází intaktní do duodena (Manach et al., 2004). V tenkém střevě však mohou být absorbovány pouze
volné flavonoidy, tzv. aglykony a některé glukosidy. Nicméně polyfenoly se převážně
vyskytuje ve formě esterů, glykosidů či polymerů, které vykazují hydrofobní vlastnosti
a není umožněna jejich pasivní difúze střevní stěnou (Scalbert a Williamson, 2000). Polyfenoly nemohou být absorbovány ve své původní formě. Před vlastní absorpcí
dochází k hydrolýze enzymy (β-glukosidázami) nebo působením mikroflóry tlustého střeva (Kroon et al., 2004; Walle, 2004). Po hydrolýze derivátů polyfenolů na volné
aglykony je umožněn jejich vstup do enterocytů, kde dochází pomocí enzymu UDP-
glukuronyltransferázy ke tvorbě konjugátů s kyselinou glukuronovou (Silberberg et al., 2005). Další osud je podobný
jako u léčiv a mnoho informací dostupných o
metabolismu přírodních polyfenolů pochází právě ze srovnávání s metabolismem léčiv.
Tvorba konjugátů může dramaticky změnit biologické vlastnosti cirkulujících metabolitů. Nicméně existují významné rozdíly mezi administrací léků (obvykle ve stovkách mg v jedné dávce) a konzumací polyfenolů stravou (obvykle < 100 mg na
dávku). Tyto rozdíly naznačují, že léky mohou lehce saturovat metabolické cesty, které se spoléhají
na dodávku kofaktorů jako je např.
UDP- glukuronová kyselina.
V důsledku toho se často v krvi nacházejí nekonjugované léky. Na druhou stranu, u
polyfenolů přicházejících ze stravy není očekáváno, že nasytí metabolické cesty a proto by mohly být konjugovány. Pokud jsou však polyfenoly podávány ve farmakologických dávkách, nalézají se v krvi ve volné formě (Hackett et al., 1983). Kupř. po příjmu
velkých dávek (2g) (+)-katechinu, lze po 30ti minutách detekovat v krvi volný (+)katechin. Po dvou hodinách jsou detekovány stopy methyl-katechinu a po 8 hodinách je
40% katechinu v moči v podobě konjugátů s kyselinou glukuronovou, se sulfátem nebo je katechin methylován. Nicméně konzumace několika mg (+)- katechinů normálně
přítomných v červeném víně vede ke konjugaci všech cirkulujících katechinů a žádné
volné polyfenoly nebyly detekovány (Bell et al., 2000). Piskula a Terao (1998) 27
prokázali u potkanů po orální dávce 10 mg (-)-epikatechinu, že jsou polyfenoly nejprve glukuronidovány během intestinální absorpce, následovala methylace a konjugace se sulfátem v játrech, s následnou methylací v ledvinách před jejich vyloučením. Množství zkonzumovaných polyfenolů je tedy určující pro jejich následný metabolismus.
Jiná situace nastává u volných forem polyfenolů. Flavanoly jako (-)-epikatechin
jsou často acylované, zvláště kyselinou gallovou. To má za následek, že není ovlivněna biologická využitelnost tak jako u glykosylace. Zdá se, že flavanoly prostupují přes biologickou membránu a jsou absorbovány bez dekonjugace či hydrolýzy.
Deriváty kyseliny hydroxyskořicové, jako kyselina ferulová a kávová jsou běžně
esterifikovány
cukry,
organickými
kyselinami
a
lipidy.
Například
kyselina
chlorogenová je esterem kyseliny kávové navázaná ke kyselině chinové, a tato sloučenina se nalézá ve velmi vysokém množství v kávě. Tyto substituenty mají značný
vliv na chemické, fyzikální a biologické vlastnosti polyfenolů. V lidském těle nejsou žádné esterázy, které by byly schopny uvolnit kyselinu kávovou z kyseliny chlorogenové. Pro metabolismus kyseliny chlorogenové je tedy významná střevní
mikroflóra. Podobně kyselina ferulová či jiné deriváty kyseliny hydroxyskořicové vázané na buněčnou stěnu rostlin jsou také uvolněny savčími endogenními enzymy, ale vyžadují uvolnění enzymů střevní mikroflóry.
Ellagotanniny jsou také hydrolyzovány. Kyselina ellagová byla nalezena v moči a
plicích myší krmených ellagotanniny z malin a granátových jablek. Nicméně není jisté, zda jde o hydrolýzu v žaludku či působením střevní mikroflóry.
Vstřebávání polyfenolů záleží na jejich molekulové hmotnosti. Z důvodu velké
molekulové hmotnosti proanthokyanidinů nejsou tyto látky štěpeny v žaludku člověka a nejsou ani vstřebávány v tenkém střevě.
Údaje o jejich absorpci jsou však stále
nedostatečné. Experimenty in vitro ukazují, že dimery a trimery prokyanidinů jsou
absorbovány, na rozdíl od polymerů prokyanidinů, které mají průměrný stupeň
polymerizace 7. Dimery a trimery jsou absorbovány v podobné míře jako (+)-katechiny,
nicméně to bylo potvrzeno také in vivo studiemi (Scalbert a Williamson, 2000). Proanthokyanidiny procházejí do tlustého střeva, kde mohou být hydrolyzovány
působením střevní mikroflóry na metabolity, které mohou vykazovat různé biologické
účinky (snižování oxidačního stresu, možná účast v prevenci nádorového onemocnění střev) (Rios et al., 2002; Gonthier et al., 2003).
Polyfenoly, které nemohou být vstřebány v žaludku či v tenkém střevě, přecházejí
do tlustého střeva, kde dochází k hydrolýze působením mikroflóry tlustého střeva na 28
aglykony a ty jsou metabolizovány na různé aromatické kyseliny (Kühnau, 1978).
Tlusté střevo obsahuje asi 10-12 mikroorganismů/cm3 a má obrovské katalytické a
hydrolytické schopnosti. K dekonjugačním reakcím dochází snadno. Např. kvercetin-3O-rhamnoglukosid endogenními
a
enzymy,
kvercetin-3-O-rhamnosid ale
jsou
snadněji
nejsou
hydrolyzovány
hydrolyzovány
(Bacteroides distasonis, B. uniformit a B. ovatus)
střevní
lidskými
mikroflórou
na kvercetin. Enterococcus
casseliflavus využívá zbytky cukru kvercetin-3-O-glukosidu a tvoří acetát a laktát, ale
už dále nemetabolizuje aglykony. Účinkem mikrobiálního metabolismu dochází
k rozkladu polyfenolů na jednodušší fenolové sloučeniny, které jsou běžné pro mnoho různých polyfenolů. Navíc tyto metabolity mohou mít zcela jiné biologické účinky
(Williamson a Manach, 2005). Mikrobiální metabolity jsou pak absorbovány a
konjugovány s glycinem, kyselinou glukuronovou či sulfátem.
Protože vstřebávání je hlavní dominantou tenkého střeva, je absorpce v tlustém
střevě méně účinná a pomalejší. Tento jev je prokázán při absorpci kvercetinu, který se
vstřebává po 0.5 – 0.7 hodiny po aplikaci a rutinu, který je maximálně absorbován po 6 – 9 hodinách. Následná biologická využitelnost rutinu je pouze 15 – 20 % ve srovnání s kvercetinem. Podobně je ovlivněna absorpce, pokud konzumujeme potraviny
s převahou glukosidů, např. česnek, oproti potravinám se zastoupením jak glukosidů, tak glykosidů, např. jablko (Manach et al., 2004). 1.2.4.2 Metabolizace
Polyfenoly, které se vstřebají, jsou následně metabolizovány v játrech a vyloučeny
do žluče či přímo z enterocytů zpět do tenkého střeva a také přijdou do tlustého střeva, ale v různých chemických formách, jako např. glukuronidy, sulfáty či konjugáty s
methylem (viz obr. 11.) (Silberberg et al., 2005). Chen et al. (2005) prokázali, že 35 % kvercetinu bylo opět získáno ze žluče v podobě konjugátů.
Metabolismus většiny polyfenolů lze shrnout do několika základních bodů:
1. Glykosidy v plasmě se nevyskytují ve stejné podobě jako v potravinách.
2. Hlavní formou nalézající se v plasmě a moči jsou konjugáty sulfátů a glukuronátů původních aglykonů.
3. Polyfenoly, které ve své chemické struktuře obsahují o-hydroxy skupiny, mohou být methylovány.
29
funkční
4. Aglykony chybí nebo představují velmi malou část celkového množství přítomných polyfenolů, kromě katechinů zeleného čaje, jehož aglykony představují podstatné množství z jejich celkového objemu v plasmě (Kroon et al., 2004).
Nicméně existují další výjimky. Isoflavony jsou ve stravě obvykle v glykosylované
formě. Malé, ale významném množství (asi 7 %) existuje v podobě aglykonů (Kroon et al., 2004).
Z hlediska biologických účinků je důležité dozvědět se co nejvíce o metabolitech
polyfenolů. Biologové by se tak měli dívat méně na původní zkonzumované sloučeniny
a více na metabolity přítomné v našich tkáních, zvláště v konjugované podobě, s ohledem na jejich biologické účinky (Scalbert a Williamson, 2000).
Polyfenoly
Tenké střevo
Tkáně
Játra žluč
Ledviny
Tlusté střevo
Moč
Stolice
Obr. 11. Absorpce, metabolismus a vylučování polyfenolů (Scalbert a Williamson,
2000)
1.2.4.3 Biologická využitelnost
Informace o biologické využitelnosti jsou nezbytné pro
porozumění účinků
jednotlivých polyfenolů. Biologická využitelnost se však liší od jednoho polyfenolu ke 30
druhému.
Chemická stavba polyfenolů předurčuje míru a rozsah jejich střevní absorpce a
následné metabolity cirkulující v plasmě (Manach et al., 2004). Nejlépe absorbovatelné polyfenoly jsou kyselina gallová a isoflavony, následují katechiny, flavanony a
glukosidy kvercetinu. Nejhůře absorbovatelné polyfenoly jsou proanthokyanidy, gallokatechiny čaje a anthokyaniny. Údaje o absorpci hydroxyskořicových kyselin a jiných polyfenolů jsou stále limitovány (Manach et al., 2005b). Metabolity polyfenolů
se v krvi vyskytují převážně ve vázané formě na plasmatické proteiny, jak bylo dokázáno v in vitro pokusech s kvercetinem. Nevýznamná část se váže na VLDL částice (very low density lipoproteins) (Boulton et al., 1998).
Intervenční studie u lidí poskytují důkazy o alespoň částečné absorpci polyfenolů a
tedy i o schopnosti určitých biologických účinků. Polyfenoly jsou v organismu přítomné v podobě konjugátů glukuronátů či sulfátů. Tyto konjugáty však vykazují různé
biologické účinky a distribuci v tkáních a buňkách. Například flavonoly jsou nalézány
ve stravě především jako konjugáty glykosidů. Nicméně konjugáty glykosidů nalezené v plasmě nejsou totožné s těmi vyskytujícími se v potravinách bohatých na kvercetin (Kroon et al., 2004). Flavonoid kvercetin,
ze skupiny flavonolů,
je jedním
z nejpodrobněji studovaných polyfenolů. Jeho biologická využitelnost záleží na
chemické stabilitě, degradaci střevní mikroflórou a mechanismu absorpce. Studie
zabývající se farmakokinetikou kvercetinu po intravenózní aplikaci u dobrovolníku
naznačují, že kvercetin je rychle eliminován s poločasem kratším než 2 hodiny. To znamená, že příjem kvercetinu ve stravě jednou denně není dostatečný pro dosažení
účinné hladiny kvercetinu. Kvercetin se pravděpodobně vstřebává v horní části tenkého
střeva. Glykosidy kvercetinu mohou vstupovat do enterocytů pomocí transportu závislého na glukóze a následně jsou hydrolyzovány před vstupem do portální krve (Graefe et al., 1999).
Glukuronidy isoflavonů a epikatechin například
prokazují mnohem slabší
estrogenní aktivitu a neposkytují ochranu proti oxidačnímu stresu v buňkách in vitro.
Tyto výsledky naznačují, že mnoho studií in vitro dodnes publikovaných musí být
přehodnoceno ve světle nových informací o využitelnosti polyfenolů (Scalbert et al., 2005).
Hollman (1997a) ve své studii o biologické využitelnosti prokázal, že koncentrace
nezměněných (intaktních) flavonoidů v lidské plasmě výjimečně překračuje 1 µM, pokud množství zkonzumovaných
polyfenolů 31
nepřesahovalo běžně konzumovaná
množství v naší stravě. Maximální koncentrace se dosahuje 1 - 2 hodiny po jejich
konzumaci, až na polyfenoly, které se absorbují pouze po částečné degradaci střevní
mikroflórou. Pro většinu flavonoidů vstřebaných v tenkém střevě platí, že koncentrace v plasmě se rychle snižuje (poločas eliminace je 1 – 2 hodiny). Toto rychlé vyloučení je
usnadněno konjugací aglykonu k sulfátovým a glukuronidovým skupinám. Poločas eliminace pro kvercetin je mnohem vyšší, až 24 hodin. Toto pomalé vylučování
kvercetinu je možné vysvětlit jeho částečnou afinitou k albuminu v plasmě (Hollman et al., 1997b). Udržení
vysokých koncentrací v plasmě vyžaduje opakovanou konzumaci
polyfenolů, jak bylo zjištěno u dobrovolníků konzumujících čaj každé dvě hodiny.
Nicméně poločas tvorby metabolitů střevní mikroflórou je delší díky dlouhému
setrvávání polyfenolů ve střevě. Více než dva dny jsou potřebné pro metabolity fytoestrogenů, enterodiol a enterolakton k dosažení základní koncentrace v plasmě a moči po konzumaci sójového mléka a lněných semínek (Scalbert a Williamson, 2000).
Vysoce polymerizované sloučeniny např. tanniny, nejsou v lidském organismu ani
absorbovány, ani degradovány, což vede k tvorbě komplexů s proteiny (Ursini et al., 1999). Existují také in vitro studie prokazující prostup některých polyfenolů
(epigallokatechin gallát, naringenin, hesperetin) přes hematoencefalickou bariéru do
mozku, kde mohou uplatňovat svoje účinky a mohly by snad působit neuroprotektivně (Youdim et al., 2004).
Do budoucnosti bude nutná lepší znalost o konzumaci a biologické využitelnosti
polyfenolů ze stravy, zejména pro určení jejich role v prevenci onemocnění. Po konzumaci určité dávky polyfenolů bychom měli být schopni odhadnout jejich
příspěvek k prevenci oxidativního stresu s ohledem na jiné antioxidanty přítomné ve stravě. Také bychom měli být schopni předpovědět množství specifických metabolitů
v tkáních, které se mohou vázat na specifické receptory a spouštět reakce prospěšné pro naše zdraví. To by mělo vést k doporučením s ohledem na zvláštní populační skupiny a
na tvorbu nových funkčních potravin, které budou uspokojovat naše budoucí potřeby (Scalbert a Williamson, 2000). 1.2.4.4 Eliminace
Polyfenoly a jejich deriváty jsou eliminovány z organismu močí a žlučí. Nicméně
přítomnost polyfenolů ve žluči může vést k reabsorpci enterohepatálním oběhem a prodloužení jejich přítomnosti v organismu. Při průchodu tlustým střevem však dochází 32
ke značné degradaci střevní mikroflórou, která štěpí jejich heterocyklus. Uvolňují se tak různé fenolové kyseliny nebo jejich laktony, které jsou náchylné k sekundární demethylaci, dehydroxylaci či β-oxidaci. Fenolové kyseliny jsou následně absorbovány a poté vyloučeny močí (Hollman, 1997a).
Několik studií o biologické dostupnosti u lidí ukazuje, že se velké množství
polyfenolů nalezených v nezměněné formě v moči se liší od jedné fenolické sloučeniny
ke druhé. Množství jsou částečně nízká pro kvercetin a rutin, glykosid kvercetinu (0,3 1,4 %), ale bohatší pro katechiny v zeleném čaji, isoflavony ze sóji, flavanony z citrusového ovoce či anthokyanidiny z červeného vína (3 - 26 %).
Velká část zkonzumovaných polyfenolů (75 – 99 %) se v moči nenalézá. To
znamená, že se buď neabsorbují střevní stěnou nebo se vstřebají a vyloučí se žlučí či
jsou metabolizovány střevní mikroflórou nebo našimi vlastními tkáněmi. Doposud se však řídce provádělo měření střevní absorpce polyfenolů u lidí (Manach et al., 2005b).
1.2.5 Biologické účinky polyfenolů
Polyfenoly mohou vykazovat antikarcinogenní a antiaterogenní vlastnosti, které
zahrnují genovou expresi, apoptózu, shlukování krevních destiček, dilataci krevních cév, mezibuněčnou signalizaci, aktivaci P-glykoproteinů a modulaci aktivity enzymů
zahrnutých v aktivaci a detoxikaci karcinogenů. Nicméně většina pozornosti je stále obracena na polyfenoly jako na antioxidanty (Duthie et al., 2003).
Polyfenoly tak mohou hrát určitou roli v prevenci kardiovaskulárních nemocí,
nádorového onemocnění, osteoporózy a snad i v prevenci neurodegenerativních nemocí a diabetu mellitu. Doposud získané znalosti o polyfenolech se zdají být pro formulaci obecných doporučení pro populaci nebo pro ohroženou skupinu lidí stále nedostatečné.
Mnoho důkazů o prevenci onemocnění polyfenoly je však založeno na výsledcích
studií in vitro či na experimentech na zvířatech, při kterých jsou polyfenoly obvykle
aplikovány v mnohem vyšších koncentracích než je možné získat přirozeně stravou. Jedním z dalších problémů při zjišťování prospěšných účinků polyfenolů je obrovské
množství polyfenolických látek nalézajících se ve stravě, připouštějící různé biologické účinky (Scalbert et al., 2005). Mnoho in vitro studií ale také naznačují, že rostlinné
polyfenoly mohou ovlivňovat potencionálně nežádoucí procesy probíhající také v savčích buňkách in vivo (Duthie et al., 2003).
33
1.2.5.1 Antioxidační účinky
Reaktivní formy kyslíku se v organismu účastní uvolňování a přeměny energie
nezbytné pro životní pochody, jsou součástí enzymových mechanismů. Škodí pouze tehdy, vymknou-li se velmi přísné kontrole nastolené v organismu (Štípek et al., 2000).
Reaktivní formy kyslíku jsou látky velmi pohotově reagující s různými biologickými
strukturami. Jedná se o atomy nebo skupiny atomů s lichým počtem elektronů: superoxid O2*, hydroxylový radikál HO*, peroxid vodíku H2O2, singletový kyslík 1O2 a kyselina chlorná HOCl. Vedle reaktivních forem kyslíku vznikají i reaktivní formy dusíku (oxid dusnatý NO*, oxid dusičitý NO2*) (Štípek et al., 2000).
Zvýšená produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) a dusíku (RNS) vede ke vzniku
oxidačního stresu, který poškozuje tkáně. Důsledkem oxidačního stresu dochází k peroxidaci lipidů, oxidativnímu poškození nukleových kyselin, sacharidů a proteinů.
Tím je podporován vznik některých onemocnění (ateroskleróza, cévní mozková příhoda, infarkt myokardu, artritida, ischemické poškození, neurologická onemocnění a také rakovina). Oxidační stres urychluje stárnutí a vznik mnoha chronických nemocí.
Obranu proti oxidačnímu stresu představuje antioxidační systém. V tkáních se
nacházejí enzymatické i neenzymatické systémy zahrnují: superoxiddismutázu,
obranné systémy. Enzymatické obranné
glutathionperoxidázu, glutathionreduktázu a
katalázu. Neenzymatické systémy jsou méně specifické
a mohou být lipofilní
(ubichinony, vitamin E, karotenoidy, retinoidy) či hydrofilní (vitamin C). Vitaminy a
polyfenoly jsou látkami, které představují exogenní antioxidanty, neboť jsou přijímány stravou. Tyto látky jsou potencionální vychytávače reaktivních forem kyslíku, dusíku a
jiných radikálů nebo látky inhibující jejich tvorbu (Ziegler a Filer, 1996; Middleton et al., 2000). Polyfenoly pravděpodobně působí jako přímé antioxidanty, interakcí se
superoxidem O2* a jinými reaktivními formami kyslíku (Cao et al., 1997; Stoclet et al.,
2004). Podstatným znakem flavonoidů vedoucí k inhibici tvorby ROS se zdá být přítomnost hydroxy skupiny v B kruhu molekuly flavonoidu (Middleton et al., 2000).
Struktura flavonoidů je pravděpodobně vhodná pro tvorbu chinoidních struktur a
tedy pro jednoelektronové oxidoredukce. Jako antioxidanty působí protizánětlivě,
antikarcinogenně a zasahují do buněčného signálního přenosu. Flavonoidy jsou schopné chelatovat železo a tímto mechanismem tlumit oxidační stres, neboť železo a také měď
patří mezi přechodné prvky. Nemají poslední elektronovou vrstvu zaplněnou elektrony a pohotově tak reagují s volnými radikály (Štípek et al., 2000). 34
Fagocytóza je důležitý fyziologický proces, spojený s produkcí superoxidu O2*. Ten
produkují aktivované fagocytující buňky – monocyty, neutrofily, eosinofily a
makrofágy. Produkce radikálů je důležitá vzhledem k jejich baktericidním a tumoricidním schopnostem. Fagocytóza je spojena s dramatickým zvýšením
konzumace kyslíku (oxidační vzplanutí), a s následnou produkcí O2*, katalyzované NADPH systémem. Zatímco ROS produkované fagocyty hrají důležité fyziologické
funkce, mohou také způsobit buněčné poškození. Vysoce reaktivní metabolity kyslíku mohou podporovat vznik zánětu a poškození tkání. Flavonoidy inhibují uvolňování
ROS prostřednictvím neutrofilů. Kvercetin a jiné flavonoidy jsou účinnými inhibitory produkce O2* buňkami. ´T Hart et al. (1990) popsal inhibiční účinky flavonoidů na produkci ROS pomocí chemiluminiscenčního testu.
Kromě proteinů a DNA může oxidační stres vést k poškození lipidů buněčných
membrán. Peroxidace lipidů významně přispívá k rozvoji aterosklerózy, mozkové
mrtvice, infarktu myokardu a také k poškození mozkových funkcí. Je také zahrnuta v dalších patologických procesech, včetně stárnutí, hepatotoxicitě, hemolýze, promoce nádorů, zánětu, toxicitě železa (Middleton et al., 2000). Oxidací LDL (low density
lipoproteins) vznikají produkty, které využívají makrofágy ve stěně cév. Ty pak vytváří
pěnu, která obsahuje cholesterol a zaplňuje cévy. Tímto způsobem vzniká aterogenní plát v tepnách (Čopíková, 2001).
Autooxidace uhlíkového řetězce mastných kyselin představuje radikálovou
řetězovou reakci, která probíhá ve třech fázích (viz obr. 12.) Propagační fáze se může několikrát opakovat. Pokud je koncentrace radikálů v reakčním systému dost vysoká, je
pravděpodobné, že se spolu spojí dva radikály za vzniku stabilního produktu a tím reakce končí. Při omezeném přístupu kyslíku jsou hlavními radikály v systému radikály
mastné kyseliny. Hlavní terminační reakcí je pak jejich rekombinace (Čopíková, 2001).
Bylo identifikováno několik flavonoidů, které jsou schopny inhibovat enzymatickou i
neenzymatickou peroxidaci lipidů. V modelových systémech se jedná o kvercetin, dále některé studie uvádí katechin, a jiné flavonoidy. Flavonoidy účinkují jako vychytávače
a zhášedla O2*. Lipidové peroxidaci může být zabráněno v iniciační fázi za pomoci
vychytávačů radikálů, zatímco během řetězové reakce reagují flavonoidní látky s radikály hydroperoxidů nebo s alkoxylovými radikály, poskytují atom vodíku a tím ukončují řetězovou reakci (Čopíková, 2001).
Existuje poměrně mnoho studií dokazujících antioxidační působení polyfenolů. Čaj
vykazuje antioxidační vlastnosti, přičemž zelený čaj je účinnější než čaj černý. 35
Antioxidační účinek čaje spočívá ve zvýšení aktivity glutathionperoxidázy a katalázy
(Černá, 2002). Tyto vlastnosti jsou přisuzovány zejména (-)-epigallokatechin-3-gallátu
(EGCG),
(-)-epigallokatechinu
(EGC),
(-)-epikatechin-3-gallátu
(ECG)
a
(-)-
epikatechinu (EC). Nicméně Roedig-Penman a Gordon (1997) se domnívají, že za antioxidační účinky čaje mohou být zodpovědné i jiné sloučeniny, které se v něm
nalézají (glykosidy flavonolu, dimery či jiné antioxidační produkty vytvořené z EGCG, myricetin).
1.
2.
Iniciační fáze
R-H
Lipid
→
R*
+ H*
volný radikál lipidu
Propagační fáze
Tvorba peroxylového radikálu R* + O2 → ROO*
Tvorba hydroperoxidu
3.
ROO* +
R-H
Terminační fáze
→
ROOH + R*
2 R* → R-R
R* + ROO* → ROOR
2ROO* → ROOR + O2 Obr. 12. Autooxidační řetězová reakce lipidů (Čopíková, 2001) Silné antioxidační účinky byly objevené také u rostlinných potravin bohatých na
proanthokyanidiny (tzv. kondenzované tanniny), např. zelený čaj, luštěniny, semena
řepky či semena hroznů vinné révy (Troszynska a Ciska, 2002). Tepelnou úpravou nebyly jejich antioxidační schopnosti téměř změněny. Pokud byly srovnávány různé druhy zeleniny, pak cibule vykazovala nejlepší vlastnosti (Vinson et al., 1998).
Také konzumace vína je spojována se zlepšením antioxidační kapacity plasmy a
redukcí oxidovatelných LDL částic a snížením reaktivních sloučenin kyseliny
thiobarbiturové (TBARS) (Fuhrman et al. 1995; Kerry a Abbey, 1997; Soleas et al., 1997; Nigdikar et al., 1998; Stoclet et al., 2004). Polyfenoly obsažené v červeném víně vykazují in vitro silné antioxidační účinky, silnější než víno bílé, vzhledem k jejich 36
vyšším obsahům (Vinson et al., 1995). Jsou pravděpodobně také podporovány obsahem
dalších antioxidantů ve víně přítomných (vitamin E, C a β-karoten) (Simonetti et al.,
1997). Resveratrol jako hlavní zástupce polyfenolů ve víně je schopen tvořit cheláty s mědí, která jinak stimulují peroxidaci lipidů. Tímto způsobem resveratrol snižuje
oxidaci polynenasycených mastných kyselin (PUFA) (Fremont, 2000). Kromě toho resveratrol in vitro inhibuje produkci peroxidu vodíku a aktivitu myeloperoxidázy. Také
inhibuje v buňkách maligních nádorů O-acetyltransferázu a sulfotransferázu (Kundu a Surh, 2004).
Isoflavony mohou ovlivňovat stabilitu LDL lipoproteinů před oxidací, rovněž snižují
hladinu lipidů a lipoproteinů v plasmě (Moravcová a Kleinová, 2002). Genistein i daidzein jsou silnými antioxidanty in vitro proti LDL oxidaci a chrání endoteliální
buňky proti cytotoxickému účinku oxidovaného LDL. Tento účinek je způsoben pravděpodobně inhibicí tyrosin kinázy (Kapiotis et al., 1997).
Polyfenoly mohou také působit nepřímo, aktivací endogenního antioxidačního
systému (Masella et al., 2005).
1.2.5.2 Estrogenní účinky
Některé polyfenolické látky vykazují estrogenní aktivitu. Mezi hlavní zástupce patří
především genistein a daidzein ze skupiny isoflavonů a sekoisolariciresinol a
matairesinol ze skupiny lignanů (Safe a McDougal, 1997; Brownson et al., 2002; Heber, 2004). Nicméně u těchto látek byly popsány i antiestrogenní účinky (Morton et
al., 1996).
Existuje prokazatelně nižší výskyt nádorového onemocnění prsu, vaječníků, dělohy
a prostaty v asijských zemích ve srovnání s populací západních států. Tento rozdíl je
dán spíše životním stylem než genetickými předpoklady. Východní kuchyně je bohatá především na sóju. Sója obsahuje tzv. fytoestrogeny, zahrnující isoflavony, lignany a pterokarpany. Tyto látky vykazují estrogenní i antiestrogenní účinky, v závislosti na
řadě faktorů. Fytoestrogeny jsou slabé estrogeny, které mají in vivo aktivitu 100 až
1000 krát nižší než endogenní estradiol. Nicméně mohou být v těle přítomny
v koncentracích až 100 krát vyšších. Endogenní receptory existují ve dvou subtypech:
ERa a ERb. Estrogenní afinita je pro oba typy různá. Fytoestrogeny nemusí ovlivňovat pouze estrogenní receptory (ER), ale i různé enzymy, syntézu proteinů, oxidaci lipidů, diferenciaci buněk nebo růstové faktory (Moravcová a Kleinová, 2002).
37
Závěry epidemiologických studií a experimentů na zvířatech nejsou jednoznačně
podpořeny výzkumy s buněčnými kulturami. Většina prací sice popisuje inhibiční efekt fytoestrogenů, ale v řadě prací je tohoto účinku dosaženo při velmi vysokých
koncentracích, přesahujících fyziologické hladiny a naopak při nižších dávkách růst nádorových buněk stimulovaly. Vazbou na ER mohou totiž působit jako endogenní
estrogeny či jako antiestrogeny, tzn. blokují účinek estrogenů. Tyto látky se v nízkých dávkách váží na ER, ale jejich aktivita je minimální a v dávkách vysokých se chovají jako hormony, které nahradily (Klein, 1998).
Fytoestrogeny také inhibují enzymy, které jsou spojeny s růstem buněk
(ornithindekarboxyláza, tyrosinkináza, DNA-topoisomeráza) nebo enzymy řídící
produkci estronu z androgenů. Při popisování vlivu fytoestrogenů by nemělo být opomenuto, že se jedná o slabé estrogeny, které mohou za jistých podmínek stimulovat proliferaci buněk a genovou expresi (Moravcová a Kleinová, 2002).
V současné době je nutná určitá obezřetnost, protože nikdo neví, jaký může mít
účinek sója v kombinaci se západní stravou. Na druhé straně, lignany mají tak malou estrogenní aktivitu, že nemohou vyvolat žádné negativní estrogenní účinky u lidí. Nicméně příjem stravy s vysokým obsahem lignanů může redukovat endogenní hladiny estrogenů, které mohou mít negativní vliv na kostní metabolismus (Adlercreutz, 1999).
Estrogeny jsou pravděpodobně zahrnuty jak v iniciaci, tak také částečně v promoci
nádoru prsu. Je proto překvapující, že mohou mít fytoestrogeny preventivní úlohu u rakoviny prsu. Genistein blokuje buněčný cyklus v G2/M fázi a zvyšuje expresi p21 a apoptózu a inhibice buněčné proliferace je nezávislá na p53 (Adlercreutz, 1999).
Role genisteinu jako estrogenů je kontroverzní. Při celkové absenci estrogenů,
genistein přispívá v nanomolární koncentraci ke slabým estrogenním účinkům a může stimulovat buněčný růst (Barnes, 2004). Nicméně, při použití vyšších koncentrací, genistein inhibuje proliferaci MCF-7 a T47D nádorových buněk prsu. Navíc genistein
jako inhibiční růstový faktor stimuluje růst nádorových buněk bez ohledu na přítomnost ER. Genistein je současně silným inhibitorem tyrosinkinázy a tak může mít prospěšný vliv při léčbě nádorového onemocnění (Barnes, 1998).
Účinek fytoestrogenů je závislý také na čase, hladině estrogenů v krvi a na stravě.
Zatím neexistují důkazy o tom, že by fytoestrogeny přítomné přirozeně v lidské stravě
vyvolávaly vznik nádorového onemocnění. Vysoké hladiny fytoestrogenů v plasmě u
žen a mužů v Asijských zemích, spojené s nízkou incidencí nádoru prsu, prostaty a
tlustého střeva mohou naznačovat, že sója nepředstavuje pro člověka žádné riziko. 38
Nicméně v Japonsku je tradičně konzumována strava velmi chudá na tuk a jejich
endogenní hladiny estrogenů jsou velmi nízké ve srovnání se západní kulturou. Kombinace stravy bohaté na fytoestrogeny a typické západní stravy nemusí být nutně prospěšná. Na druhé straně, fytoestrogeny působí jako antiestrogeny, pokud je jejich hladina vysoká a jako estrogeny pokud je nízká (Adlercreutz a Mazur, 1997). Stále je velmi diskutováno, jak je možné, že
fytoestrogeny mohou působit
agonisticky i antagonisticky. Lamartiniere et al. (1998) prokázali ochranný potenciál
genisteinu proti chemicky vyvolané rakovině mléčné žlázy u hlodavců. Podobné výsledky nalezl i Murrill et al. (1996) a Lamartinierre et. al. (1998). Podávání
genisteinu v neonatálním a prepubertálním věku měnilo ontogenezi prsní žlázy a
dospělá zvířata se stávala méně vnímavá na chemicky vyvolanou rakovinu mléčné žlázy. Nicméně velmi vysoké koncentrace genisteinu během neonatálního období měly
negativní účinky na vývoj folikulů ve vaječnících, ale prepubertální podávání genisteinu
se nejevilo toxické na samičí pohlavní ústrojí či endokrinní systém potkanů. Na druhé
straně je známo, že japonské děti mají při porodu relativně vysoké koncentrace fytoestrogenů v pupečníkové krvi a amniové tekutině a tak je výskyt rakoviny prsu nízký ve srovnání se zeměmi západního světa (Adlercreutz, 1999).
Resveratrol vykazuje také estrogenní aktivitu (Brownson et al., 2002), neboť
existuje
podobnost
mezi
trans-resveratrolem
a
syntetickým
estrogenem
diethylstilbestrolem. Experimenty s použitím nádorových buněk prsu člověka (MCF-7) prokázaly, že resveratrol soutěží s estradiolem o vazbu na ER. Resveratrol zvyšuje
expresi regulačních genů a stimuluje proliferaci estrogen-dependentních nádorových
buněk prsu. V těchto pokusech ale záleží na linii použitých nádorových buněk, zda jsou estrogen senzivitní či nikoliv. Nicméně v jiné studii při použití vyšší koncentrace na stejné buněčné linii, resveratrol inhiboval buněčnou proliferaci (Fremont, 2000). 1.2.5.3 Vliv na endoteliální funkce
Rostlinné polyfenoly indukují relaxaci cévní stěny za pomoci zvýšené tvorby oxidu
dusného (NO). NO je tvořen pomocí endoteliální NO syntázy (eNOS) . Aktivace eNOS
je způsobena pravděpodobně dvěmi mechanismy: a) zvýšením intracelulárního Ca2+ a b) fosforylací eNOS pomocí PI3-protein kinázy. Kromě toho, rostlinné polyfenoly
způsobují relaxaxi isolovaných cév pomocí hyperpolarizačního faktoru (EDHF), který
je produkován endotelem, dále lokalizaci a kontrolu tvorby superoxidu. Tyto mechanismy vedou k aktivaci PI3 kinázy. Polyfenoly rovněž zvyšují uvolnění 39
endoteliálního prostacyklinu a inhibují syntézu a účinky endotelinu-1. Všechny tyto mechanismy mohou přispívat k vasodilataci, vasoprotektivním a antihypertensivním účinkům polyfenolů in vivo.
Dlouhodobá inkubace endoteliálních buněk červeným vínem zvyšuje expresi eNOS.
Podobně i resveratrol, který se nalézá v hroznech révy vinné, rovněž stimuluje eNOS expresi (Stoclet et al., 2004). Nicméně červené víno vedle resveratrolu obsahuje také
anthokyanidiny, katechiny, proanthokyanidiny a jiné fenolické látky, které mohou také přispívat k příznivým účinkům na endoteliální stěnu a přispívat tak k prevenci
aterosklerózy (Dell´Agli et al., 2004). Resveratrol působí v několika směrech – inhibuje
agregaci destiček, snižuje tvorbu prostanoidů a snižuje tendenci ke srážení krve. Resveratrol také příznivě ovlivňuje metabolismus lipidů, neboť zvyšuje podíl HDL cholesterolu (Kvasnička, 1999).
1.2.5.4 Angiogenní účinky
Angiogeneze je komplexní proces charakterizovaný časnou degradací extracelulární
matrix, převážně matrix metaloproteinů, následovanou migrací a proliferací
endoteliálních buněk a zráním nových krevních cév jako odpověď na místní proangiogenní faktory, jako je vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF). Jedná se o proces zapojený do reparace poškozené tkáně.
Polyfenoly mohou inhibovat aktivaci metaloproteinázy (MMP-2), což je jeden
z faktorů přispívajících k tvorbě aterosklerotického plátu. Exprese a uvolnění VEGF,
který je hlavním pro-angiogenním faktorem, byla potlačena polyfenoly červeného vína, převážně účinkem anthokyaninů (delfinidin a kyanidin) a polyfenoly zeleného čaje (epigallokatechin gallát) (Stoclet et al., 2004). Genistein je
schopen také potlačit
angiogenezi, která se projevuje abnormálním bujením krevních cév (Moravcová a
Kleinová, 2002). Resveratrol potlačuje aktivitu některých transkripčních faktorů (NF-
κB, AP-1, Egr-1), inhibuje protein kinázy a kasein kinázu II, potlačuje genovou expresi
VEGF, COX-2, IL-1, IL-6, IL-8, AR a PSA a tím potlačuje proces angiogeneze (Aggarwal et al., 2004). Kvercetin, kemferol, genistein a resorcinol také inhibují
aktivitu COX-2 (Gee a Johnson, 2001). 1.2.5.5 Protizánětlivé účinky
Zánět je obranným mechanismem, kterým se tělo brání infekci či poškození
bakteriemi, viry či jinými patogeny (Yoon a Back, 2005). Při zánětlivém procesu se 40
uvolňuje kyselina arachidonová. V zánětu jsou také zahrnuty eikosanoidy a prostaglandiny. Syntéza prostaglandinů je regulována genovou expresí cyklooxygenázy COX (Ignatowitz a Baer-Dubowska, 2001). Resveratrol je schopen potlačit aktivaci
COX-2, inhibicí protein kinázy C (Kvasnička, 1999; Fremont, 2000).
Polyfenoly vykazují řadu protizánětlivých účinků, které mohou ovlivnit proces
aterosklerózy. Například suplementace polyfenoly černého či zeleného čaje ovlivňuje parametry krve, které se vztahují k zánětu (Manach et al., 2005a). 1.2.5.6 Imunomodulační účinky
Imunitní systém představuje centrální roli v ochraně organismu před napadením
patogenními mikroorganismy či proti maligním buňkám. Pokud dojde k vychýlení jeho
rovnováhy, může dojít k nadměrné produkci reaktivních forem kyslíku, které vedou ke vzniku zánětu (Čopíková, 2001).
Imunofarmakologické vlastnosti flavonoidů jsou komplexní a nejsou doposud zcela
pochopeny. Nálezy in vitro studií nejsou vždy v souladu s in vivo studiemi. Navíc
mohou být účinky různých flavonoidů antagonistické, v některých případech mohou působit imunosupresivně a v jiných imunomodulačně. Mnoho flavonoidů může
ovlivňovat funkci enzymů, které jsou zahrnuty v imunitní odpovědi a ve tvorbě zánětu (Ielpo et al., 2000).
Resveratrol je schopen blokovat aktivaci NF-κB. Tento transkripční faktor je
spojován se zánětlivo-imunitní odpovědí organismu.
NF-κB je také důležitý pro
regulaci buněčné proliferace a apoptózy, buněčné transformace, vývoj nádorů či vznik
aterosklerotických lézí. Mechanismus působení NF-κB spočívá ve vazbě na inhibiční
protein Iκ-B, který je fosforylován a proteolyticky degradován. Tento proces aktivuje
NF-κB, který je následně translokován do jádra, kde může iniciovat či regulovat genovou transkripci (Kundu a Surh, 2004). Existuje
několik
studií
prokazující
imunomodulační
vlastnosti
některých
polyfenolických látek. Např. zvýšená konzumace česneku vede k signifikantnímu zvýšení přirozených zabíječů (NK). Za tyto účinky může být zodpovědný allicin či jiné
složky obsažené v česneku (Lampe, 1999). Lignany mohou hrát také důležitou roli
v boji proti patogenním mikroorganismům. Např. u lignanu arctigeninu, se strukturou
podobnou matairesinolu, byly nalezeny imunomodulační účinky. Genistein obsažený v sóji inhibuje tvorbu NO v myších makrofázích a působí tak imunomodulačním
41
efektem. Genistein také inhibuje syntézu IL2 a leukotrienu B (Adlercreutz a Mazur,
1997).
1.2.5.7 Antimutagenní a antikarcinogenní účinky
Karcinogeneze je mnohastupňový proces, při kterém dochází ke kumulaci mutací
určitých genů a jiných poruch. To vede k narušení normálních funkcí jimi kódovaných proteinů, které se především podílejí na regulaci buněčného dělení a diferenciace buněk
a stabilitě genomu. Pro karcinogenezi jsou významné už poruchy několika málo genů. Nejvýznamnější jsou poruchy genů pro proteiny. Vznik poruch v několika kritických
genech pak může vést k maligní transformaci buňky. Čím většímu počtu karcinogenů a jejich množství je člověk exponován, tím více a tím dříve vznikají poruchy DNA a
znásobuje se tak riziko vzniku nádorového onemocnění. Vznik těchto genových poruch může být významně ovlivněn právě ochrannými látkami obsaženými v rostlinné stravě (Stratil a Kubáň, 2005). Doposud byly v mnoha in vitro studiích prokázány
antimutagenní účinky polyfenolických sloučenin, zejména proti chemickým mutagenům
(Edenharder et al., 1993; Edenharder et al.1995; Malaveille et al., 1996; Edenharder et
al., 1998; Yamagishi et al., 2000; De Boer, 2001; Ferguson et al., 2003).
Existují také vrozené genetické poruchy (porucha Rb genu, p53 genu, apod.), ale
výskyt nádorového onemocnění u takto vrozeně specifikovaných poruch byl prokázán doposud jen u malého počtu nádorů. Navíc tato vrozená porucha genu se sklonem
k malignizaci buněk není obvykle dostatečným předpokladem pro rozvinutí nádorů, ale
teprve poruchou dalších genů dojde ke vzniku nádoru. Pokud tedy budeme přijímat dostatečné množství ochranných faktorů z rostlinné stravy, dojde ke zpomalení rozvoje
či oddálení do pozdějšího věku nebo až k zamezení vzniku nádoru, díky sníženému působení
rizikových faktorů.
A to především chemických mutagenních a
karcinogenních látek, zánětlivých procesů a volných kyslíkových radikálů (Stratil a
Kubáň, 2005). Rostlinná strava obsahuje mnoho sloučenin, které při experimentech na
zvířatech podávané ve vysokých dávkách mohou
působit karcinogenně a naopak
v nízkých dávkách incidenci nádorů snižují (Stratil a Kubáň, 2005).
Rakovině příbuzné geny mohou být klasifikovány jako proonkogeny a tumor-
supresorové geny. Proonkogeny jsou normálními geny regulující buněčný růst, replikaci
a diferenciaci. Přispívají však do procesu karcinogeneze, pokud jsou mutovány a vedou k nekontrolovatelné genové expresi a buněčné proliferaci. Tumor-supresorové geny
42
také regulují normální buněčný růst, replikaci a diferenciaci a v procesu karcinogeneze se uplatní, pokud mutace vede ke ztrátě funkce.
Byly identifikovány také další geny, které se podílejí na procesu karcinogeneze.
Jsou označovány jako „caretaker“, gatekeeper“ a „landscaper“ geny. Caretaker geny
jsou odpovědné za udržení integrity genomu (např. DNA opravy, metabolická aktivace
a detoxikace). Pokud jsou mutovány, zvyšují pravděpodobnost mutace jiných genů. Gatekeeper geny jsou zodpovědné za kontrolu buněčného cyklu, signální transdukci a
replikaci. Pokud jsou zmutovány, dojde k výběrové klonální expanzi. Landscaper geny
jsou zodpovědné za poskytování signálů sousedním buňkám (Goldman a Shields, 2003).
Existují genotoxické sloučeniny způsobující genetické poškození vedoucí k rozvoji
procesu karcinogeneze a sloučeniny vyvolávající promoci tumoru. Genotoxické sloučeniny jsou definovány jako látky způsobující poškození DNA. Následkem jejich
účinku vznikají genové mutace (bodové, delece, inserce, rekombinace, přeskupení a
amplifikace) a chromozomální aberace. Promotory pocházející ze stravy způsobují buněčnou proliferaci s a nebo bez chronického poškození buňky (Sugimura, 2000).
Nepřímý mechanismus genotoxicity pak může být definován jako interakce
mutagenů s nepřímo působícími genotoxickými látkami (non-DNA) vedoucí ke
genotoxickým účinkům. To pokrývá v podstatě lipidová peroxidace a tvorba adduktů proteinů. Poslední výzkumy se zaměřují na studium inhibice reparačních enzymů, na kontrolní proteiny buněčného cyklu, na obranné proteiny proti oxidativnímu poškození, na metabolizační enzymy a další (viz obr. 13.) (Kirsch-Volders et al., 2003).
Rozvoj nádorového onemocnění je dlouhodobý proces, který zahrnuje tři hlavní
stádia: iniciaci, promoci a progresi. Mnoho chemopreventivních látek je schopných
zasahovat do iniciační fáze jako blokující látky buď inhibicí tvorby karcinogenu nebo zabráněním tvorby elektrofilních a karcinogenních látek. Nebo působí tyto látky supresivně a zastavují promoci a progresi procesu karcinogeneze ovlivněním či narušením klíčových faktorů, které kontrolují
buněčnou proliferaci, diferenciaci,
stárnutí či apoptózu. Mnoho polyfenolických látek běžně zastoupených v naší stravě, jako je např. resveratrol obsažený v hroznech révy vinné, genistein obsažený v sóji, epigallokatechin gallát nalezený v čaji apod. mohou působit právě jako blokující či
supresivní látky a některé vykazují oba mechanismy účinku. (Ahmad a Mukhtar, 1999; Surh, 1999; Chen a Kong, 2005).
43
Genotoxické látky Přímé (DNA)
Léze
Nepřímé (non-DNA)
Methylace
DNA reparační enzymy
Addukty
Zlomy
Poškození
Ostatní
Mitogeny
Mitotické vlákno
Cytotoxicita
Buněčný cyklus
...
Apoptóza
Mutace
Genové
Chromozomové
Genomové
Buněčná proliferace
Proces karcinogeneze Obr. 13. Přehled mechanismu přímého a nepřímého působení genotoxických látek
a jiných molekul v procesu karcinogeneze (Kirsch-Volders et al., 2003)
1.2.5.7.1 Indukce detoxikačních enzymů Polyfenoly jsou v organismu metabolizovány stejnou cestou jako xenobiotika.
Enzymatické systémy podílející se na jejich přeměně jsou lokalizovány převážně v játrech, nicméně se vyskytují téměř ve všech orgánech a tkáních a podílejí se také na metabolismu látek tělu vlastních (Turek et al., 1994).
Xenobiotika po vstupu do lidského organismu podstupují metabolickou aktivaci a
detoxikaci endogenními enzymy, jejichž funkcí je zbavení těla cizích sloučenin. Enzymatické systémy organismu lze dle funkce rozdělit na dvě fáze:
Fáze I – oxidační
44
Oxidace - epoxidace, hydroxylace, dealkylace, N-, S-oxidace, oxidativní deaminace a
další → navázání či modifikace některých z funkčních skupin → zvýšení hydrofility metabolitů a usnadnění dalších procesů
Redukce - azo-, nitro-, N-hydroxyl-skupiny, redukce arenoxidů a chinonů
Hydrolýza - hydrolýza esterů, amidů, epoxidů a dalších látek vzniklých oxidací
Fáze II – konjugační
Konjugace – glukuronidace, konjugace se sulfátem, glutathionem, glykosidy, acetylace,
methylace apod.
Většina produktů biotransformace fáze I a hlavně konjugační produkty fáze II jsou
dostatečně hydrofilní a mohou být proto vyloučeny z organismu. Ne vždy však vznikají
produkty netoxické, naopak výsledkem transformace mohou být látky s genotoxickými,
karcinogenními či jinými toxickými účinky. Jedno z nejdůležitějších míst zaujímají v I. fázi monooxidační enzymy závislé na cytochromu P450 a oxidázy flavoproteinové povahy. Tento enzym je vázán na membrány endoplasmatického retikula hlavně
jaterních buněk, dále střevní sliznice i jiných tkání. Nicméně tento extrahepatální
metabolismus vykazuje asi 10 – 10000 krát nižší aktivitu než jaterní. Pro látky, které procházejí gastrointestinálním traktem je významná biotransformační kapacita
slizničních enzymů. V žaludku je tato aktivita velmi nízká, ale v tenkém střevě se tato činnost zesiluje. Převážně je zde zastoupena činnost konjugační a v tlustém střevě pak redukční (Turek et al., 1994).
Indukční schopnost monooxigenačních enzymů je v organismu kontrolována Ah
receptorem (Aromatic hydrocarbons). Nejrůznější chemické látky pak mohou fungovat
jako induktory tohoto systému. Modifikují způsob a rychlost přeměny xenobiotik a také svůj vlastní metabolismus. Indukční schopnost se projevuje dvěmi základními mechanismy:
induktory barbiturátového typu – zvyšují aktivitu cytochromu P450
induktory typu 3-methylcholantrenu – zvyšují syntézu izoenzymu P448 – podílí se na metabolické aktivaci promutagenů a prokarcinogenů.
Mnoho látek, které jsou schopné indukovat enzymy I. fáze jsou schopny indukovat
také enzymy fáze II. Nicméně indukce enzymů I. fáze je vyšší a lze zde předpokládat
určitou nerovnováhu vniku reaktivních meziproduktů a rychlostí jejich inaktivace ve II. fázi.
45
Jeden z nejvýznamnějších enzymových systémů ovlivňující průběh II. fáze
představuje glutathion-S-transferáza. Jedná se o komplex minimálně 7 isoenzymů schopných vázat reaktivní metabolity a katalyzovat jejich vazbu s glutathionem.
Vzhledem ke schopnosti konjugovat především epoxidy, je považován za významného účastníka v antikarcinogenních procesech probíhajících v organismu. Další velmi
významný konjugační enzym je UDP-glukuronyltransferáza, sulfotransferáza a acetyltransferáza, které konjugací vytváří metabolity, které se z organismu snadno vylučují.
Neznamená, že pokud se dokončí fáze II biotransformace, že vzniknou látky tělu
neškodné, někdy se produkt metabolismu může vyznačovat výraznou mutagenní aktivitou. Může dojít k dekonjugaci působením enzymových systémů
mikrobů. Zde převažují procesy povahy redukční, hydrolytické a degradační.
střevních
Je dobré si uvědomit, že za mutagenní a karcinogenní aktivitu xenobiotik není ve
většině případů odpovědná látka původně vstupující do organismu, ale její metabolity. Tyto metabolity, které jsou schopné se kovalentně vázat na DNA a RNA a tvořit s nimi
addukty, narušují další přenos genetické informace a představují tak klíčový moment iniciační fáze procesu karcinogeneze. Tyto látky jsou schopné vyvolat poškození genů či chromozomů.
Ne vždy, když dojde k mutačnímu poškození DNA, se výsledek projeví v narušení
dalšího průběhu replikace a exprese. Většinu primárně navozených změn organismus
dokáže prostřednictvím reparačních enzymových pochodů opravit úplně či s určitou chybou (excisní reparační procesy, poreplikační rekombinační replikace, SOSreparace). Pokud je však poškození buňky závažnější či jsou reparační procesy málo funkční, dojde k zániku buňky- apoptóze.
Někdy je tento proces pro organismus
výhodný, neboť odpadá riziko přenosu chybné informace. Reparační enzymové systémy jsou geneticky dány a mají výraznou schopnost indukce. Působením xenobiotik může být jejich činnost stimulována (indukce) či snižována (inhibice).
Iniciované buňky mohou v organismu přetrvávat po různě dlouhou dobu, dokud
nedojde v důsledku expozice faktorům s promočním účinkem k rozvinutí další fáze
procesu karcinogeneze – promoci. V této fázi dojde k narušení genetické informace a
následně k proliferaci buněk, vedoucí k poruše diferenciace a ztrátou mezibuněčné komunikace. Mezi látky schopné vyvolat tuto fázi patří chemické látky, ale i komplexní
faktory, např. kouření, nevhodné složení stravy, apod. Tyto látky mohou zvyšovat proliferaci buněk na základě např. dráždivého působení přes modulaci dějů na povrchu 46
buňky, tvorbou volných radikálů či
ovlivněním imunitních pochodů. Dále mohou
některé látky působit jako kompletní karcinogeny, které indukují jak iniciační tak promoční fázi procesu karcinogeneze.
Promoční fáze narozdíl od iniciační je považována v počátku za reverzibilní. Nestačí
jednorázová aplikace k jejímu vyvolání, ale opakovaná, dlouhodobá expozice nadprahovým dávkám (Turek et al., 1994).
Někdy jsou chemicky modifikované mutageny, které jsou reaktivnější (elektrofilní),
navázány na DNA a ne na molekuly vylučující je z organismu. Tato vazba může poté způsobit chyby v kódování v době replikace DNA. Nicméně existují reparační
mechanismy, které mohou opravit vzniklé DNA addukty. Pokud však nedojde k jejich opravě, mohou následně způsobit bodové mutace, delece, inserce či větší
chromozomální poškození. Ne všechny vzniklé addukty jsou promutagenní, ale některé sekvence jsou náchylnější k jejich tvorbě či k mutaci. Pokud se objeví velké
chromozomální poškození, pak existují DNA reparační enzymy (rekombinační opravy).
Pokud však poškození přetrvává, buňka podléhá přirozenému zániku – apoptóze
(Goldman a Shields, 2003).
Polyfenolické látky jsou schopné indukovat detoxikační enzymy. Ty, které indukují
pouze detoxikační enzymy I. fáze, se nazývají monofunkčními induktory, ty které jsou schopné indukovat obě fáze se pak nazývají bifunkčními induktory. Bifunkční
induktory jsou potencionálně schopné aktivovat karcinogeny indukcí CYP enzymů, zdá se tedy, že ne všechny bifunkční induktory jsou vhodné jako chemopreventivní látky. Nicméně některé z nich dokáží silněji indukovat enzymy II. fáze, což má za následek detoxikaci a ochranu proti karcinogenním látkám (Chen a Kong, 2005).
Čaj kromě antioxidačních účinků vykazuje také schopnost modulovat detoxikační
enzymy I. a II. fáze a podporuje tak detoxikační procesy. Rovněž inhibuje arylhydrokarbon hydroxylázu a enzymy závislé na cytochromu P450 (1A1, 1A2, 2B1), které aktivují prokarcinogeny na karcinogeny. Vede tak ke snížení mutagenity významných karcinogenů (AFB1, HA, benzo(a)pyren). Rovněž
dochází k redukci
tvorby adduktů, které vznikají vazbou aktivních metabolitů na DNA a k indukci enzymu
UDP-glukuronyltransferázy, který podporuje detoxikaci a urychlené vylučování toxických látek z organismu (Černá, 2002).
Velká pozornost se v posledních letech věnuje výzkumu antikarcinogenních účinků
resveratrolu,
obsaženého
především
v červeném
víně.
Jako
potencionální
chemopreventivní látka byl resveratrol poprvé označen v roce 1997, kdy bylo zjištěno, 47
že inhibuje tvorbu preneoplastických lézí v kultuře buněk mléčné žlázy vyvolanou
aplikací 7,12-dimethylbenz[a]antracenu (DMBA) (Ignatowicz a Baer-Dubowska, 2001). Resveratrol pravděpodobně
inhibuje proces karcinogeneze indukcí buněčné
diferenciace (Fremont, 2000), ovlivněním exprese cytochromu P450 či inhibicí
CYP1A1, který je zahrnut v metabolické přeměně prokarcinogenů na karcinogeny.
Resveratrol rovněž indukuje detoxikační enzymy II. fáze – NADPH, chinon oxidoreduktázu (Ignatowicz a Baer-Dubowska, 2001). In vivo, resveratrol inhibuje
proces karcinogeneze v několika stádiích: blokuje
aktivaci karcinogenů inhibicí Ah receptoru a potlačuje iniciaci, promoci i progresi nádorů. Vedle chemopreventivních účinků vykazuje resveratrol také terapeutické
účinky proti rakovině, nicméně nedostatek studií na lidech omezuje jeho farmakologické využití (Aggarwal et al., 2004).
Resveratrol v buňkách indukuje apoptózu. Jedná se o geneticky programovaný
proces, vedoucí k aktivaci nitrobuněčných enzymů (kaspáz) a k následné fragmentaci hmoty jádra nádorových buněk vedoucí k její smrti. Resveratrol má schopnost uvolnit
ligand (CD 95L), který se pak na povrchu nádorové buňky spojí s receptorem pro apoptózu (CD 95-Fas/APO-1), která poté nastane. Účinek resveratrolu je nádorově selektivní. U zdravých buněk apoptózu nevyvolává (Kvasnička, 1999).
Analog
resveratrolu piceatannol indukuje apoptózu v in vitro studiích s buňkami melanomu (Larrosa et al., 2004).
Mechanismus zodpovědný za inhibici procesu karcinogeneze u zvířat zůstává stále
nejasný. Jedním z problémů je extrapolace výsledků a také používané koncentrace testovaných látek, které v in vitro studiích obvykle přesahují ty, které jsou obvykle
dosahovány v plasmě nebo v cílových tkáních po konzumaci polyfenolů přirozenou
cestou, s výjimkou genisteinu.
Zdá se, že v inhibici procesu karcinogeneze působením polyfenolů je zahrnut
mnohočetný a složitý mechanismus. Relativní důležitost tohoto mechanismu závisí na použitých modelových systémech. Například polyfenoly čaje a kurkumin inhibují
klíčové signální transdukční protein kinázy. Tato akce vede k inhibici buněčného růstu a transformaci, k indukci apoptózy a inhibici procesu angiogeneze. Tyto látky rovněž
inhibují metabolismus kyseliny arachidonové, což může přispívat k inhibici procesu
karcinogeneze. Jiné mechanismy, jako je inhibice topoisomerázy je nutné ověřit v in
vivo studiích (Lambert a Yang, 2003; Lambert et al., 2005). 48
1.2.5.8 Negativní vlastnosti polyfenolů
Navzdory zřejmým zdravotně prospěšným účinkům polyfenolů, existují studie, které
přinášejí výsledky o jejich negativních vlastnostech. Např. v Chille byla analyzována
domácí i komerčně vyráběná červená i bílá vína. Výsledky byly překvapivé, neboť u
některých byly v Amesově testu prokázány mutagenní účinky. Nicméně tento test hodnotí pouze mutagenitu směsi nikoli jednotlivých sloučenin. Vědci poukazovali, že
za mutagenní účinky může být zodpovědný kvercetin, který je obsažen ve slupkách
hroznů červeného vína. Je zajímavé, že výskyt rakoviny žaludku je nejvyšší v části Chille s největšími vinohrady (Bull et al., 1987). Podobné výsledky na bakteriálním
kmenu Salmonella typhimurium (Ara test) nalezl i tým vědců ze Španělska (Ariza et al.,
1992), přičemž červená vína vykazovala vyšší mutagenitu, než vína bílá.
Další studie přinášejí důkazy o mutagenních a karcinogenních účincích kvercetinu,
doložené krátkodobými testy mutagenity a testy na zvířatech. Za mutagenní vlastnosti je
pravděpodobně zodpovědná chemická struktura s volnou hydroxylovou skupinou v poloze 3, dvojnou vazbou v poloze 2,3 a keto skupinou v poloze 4. Pokud není
přítomná hydroxylová skupina v kruhu B, je pro vznik mutagenní sloučeniny nezbytná
metabolická aktivace. Mutagenita a genotoxicita kvercetinu byla sledována v testech in
vitro. Tyto vlastnosti mohou být zapříčiněny jejich pro-oxidačním působením, tvorbou
reaktivních forem kyslíku a poškozením DNA. Poškození DNA může vést ke vzniku
DNA zlomů či mutací, které mohou vést ke vzniku ireverzibilních preneoplastických
lézí. Výsledky potvrzující mutagenitu flavonoidů jsou získávány v testech in vitro, nicméně v in vivo testech na zvířatech za použití vysokých dávek čistých látek nebyly
pozorovány karcinogenní účinky (Rietjens et al., 2005).
Je zřejmé, že strava bohatá na flavonoidy přináší ochranu před mnohými
onemocněními, nicméně stále zůstává otazné, za jakých podmínek a v jakých dávkách
je příjem jednotlivých flavonoidů bezpečný, aniž by představoval zdravotní riziko. Množství flavonoidů, které by mohlo působit mutagenně či cytotoxicky, by nemělo být
dosažitelné z běžné stravy, nicméně tyto účinky by se mohly projevit, pokud budeme přijímat flavonoidy ve vysokých dávkách v doplňcích stravy. Nicméně doposud nebyly
provedeny žádné dlouhodobé studie zabývající se příjmem flavonoidů ze suplement (Skibola a Smith, 2000).
49
1.3 Glukosinoláty Glukosinoláty, dříve nazývané thioglukosidy či glykosidy hořčičných olejů, tvoří
významnou skupinu látek sekundárního metabolismu rostlin (Fahey et al., 2001). Je pro ně typické štiplavé aróma - kupř. u hořčice, křenu, ředkve a dalších druhů zeleniny
(Drewnowski a Gomez-Carneros, 2000). První zmínky o jedinečných vlastnostech
glukosinolátů a isothiokyanátů či hořčičných olejů, tak jak jsou dnes běžně známé, se
datují na počátek 17. století jako výsledek snahy porozumět chemickému původu látek štiplavé chuti obsažených v hořčičných semenech. Objev a brzká historie glukosinolátů a účast enzymu myrosinázy na jejich konverzi na isothiokyanáty byly předmětem zájmu a studia prof. Challengera z Velké Británie. Glukosinoláty známé pod triviálními jmény
sinigrin a sinalbin byly poprvé izolovány v roce 1830 z černých (Brassica nigra) a
bílých (Sinapis alba) hořčičných semen (Fahey et al., 2001). Struktura glukosinolátů
byla objasněna v 50. letech minulého století.
Ještě nedávno se ke glukosinolátům přistupovalo jako k látkám nežádoucím, které
interferují s využitím jodu. Již od počátku 90. let minulého století se na základě
výzkumu na zvířatech začaly objevovat i jejich prospěšné účinky (antioxidační,
antimutagenní, antimikrobní, antikarcinogenní). Současný výzkum se spíše soustředí na degradační produkty glukosinolátů a hodnocení jejich pozitivního i negativního vlivu na zdraví člověka (Prugar a Zukalová, 2002; Velíšek, 2002).
1.3.1 Biosyntéza glukosinolátů
Biosyntéza glukosinolátů začíná elongací vedlejšího řetězce aminokyselin. Ta se
objevuje před S-glykosylací, zatímco modifikace vedlejšího řetězce (např. desaturace, hydroxylace) se zpravidla vyskytuje až po připojení glykonu. Počáteční krok biosyntézy
pokračuje jako kyanogenní glukosid za pomoci N-hydroxylace aminokyseliny a
následuje dekarboxylace k vytvoření aldoximu. Biosyntéza glukosinolátů zahrnuje tři hlavní kroky:
elongaci postranního řetězce
biosyntézu glukonu
modifikaci postranního řetězce
Biosyntéza glykonu je iniciována konverzí aminokyselin (např. alanin, methionin,
valin, leucin či isoleucin pro alifatické glukosinoláty, fenylalanin či tyrosin pro 50
aromatické glukosinoláty a tryptofan pro indolové glukosinoláty) nebo elongací
aminokyselin na aldoximy (Fahey et al., 2001). Nedávno bylo zjištěno, že cytochrom
P450 katalyzuje konverzi aminokyselin na aldoximy. Další krok zahrnuje konverzi
aldoximu na kyselinu thiohydroximovou, přenos síry z cysteinu a S-glykosylaci UDP-
glukózou. Posledním krokem je sulfatace dusíku pomocí PAPS (3´-fosfoadenosin-5´-
fosfosulfát): desulfoglukosinolát sulfotransferázy za vzniku glukosinolátu. (viz obr. 14.).
Obr. 14. Biosyntéza glukosinolátů (Fahey et al., 2001)
1.3.2 Struktura glukosinolátů
První, ale nesprávná struktura byla navržena již v roce 1897. Navzdory některým
problémům se stavbou byla jejich struktura přijata až v roce 1956. V posledních 40
letech bylo popsáno mnoho informací v odborném tisku o glukosinolátech, nicméně podrobněji s důrazem na indolové glukosinoláty či glukosinoláty přítomné v brukvovité zelenině se vědci zabývají až v posledních dvaceti letech (Fahey et al., 2001).
Molekula glukosinolátu je tvořena cukernou složkou, většinou β-D-glukózou, která
může být esterifikována kyselinou sinapovou či jinou karboxylovou kyselinou aglykonem,
který
představuje
sulfonovaný
oxim
v poloze
trans
a
vzhledem
k postrannímu řetězci a cis k thioglykosidovému zbytku (viz obr. 15.) (Verhoeven et al., 1997; Velíšek, 2002).
51
Obr. 15. Obecná struktura glukosinolátů Nyní
známe v rostlinné říši více jak 100 různých glukosinolátů a to díky
rozmanitosti postranního řetězce. V brukvovité zelenině pak rozlišujeme asi 10 – 30
různých glukosinolátů (Stoewsand, 1995; Park a Pezzuto, 2002). Přehled těch nejznámějších uvádí tab. 4.
Tab. 4. Přehled nejznámějších glukosinolátů (Velíšek, 2002) Číslo
Triviální název
2
sinigrin
1 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16
Substituent R
glukokapparin
methyl
pro-3-en-1-yl (allyl)
glukoputranjivin
isopropyl
glukochlearin
sek-butyl
glukonapin
but-3-en-1-yl
glukobrassikanapin
pent-4-en-1-yl
epiprogoitrin
(S)-2-hydroxybut-3-en-1-yl
progoitrin
(R)-2-hydroxybut-3-en-1-yl
glukonapoleiferin
2-hydroxypent-4-en-1-yl
glukoibervirin
3-methylthiopropyl
glukoerucin
4-methylthiobutyl
glukoiberin
3-methylsulfinylpropyl
glukorafanin
4-methylsulfinylbutyl
glukorafasatin
4-methylthiobut-3-en-1-yl
glukoberteroin
5-methylthiopentyl
glukorafenin
4-methylsulfinylbut-3-en-1-yl
52
Tab. 4. Přehled nejznámějších glukosinolátů (Velíšek, 2002) – pokračování Číslo 17 18 19
Triviální název
Substituent R
glukoalyssin
5-methylsulfinylpentyl
glukocheirolin
3-methylsulfonylpropyl
glukotropeolin
benzyl
glukoerysolin
20 21
4-methylsulfonylbutyl
sinalbin
22 23
4-hydroxybenzyl
glukolimnantin
3-methoxybenzyl
glukonasturtiin
2-fenylethyl
glukoaubrietin
24 25 26
4-methoxybenzyl
glukobarbarin
(R)-2-hydroxy-2-fenylethyl
glukobrassicin
3-indolylmethyl
neoglukobrassicin
1-methoxy-3-indolylmethyl
glukosibarin (epiglukobarbarin)
27 28
4-hydroxyglukobrassicin
29 30
(S)- 2-hydroxy-2-fenylethyl 4-hydroxy-3-indolylmethyl
4-methoxyglukobrassicin
4-methoxy-3-indolylmethyl
Semisystematické názvy glukosinolátů jsou tvořeny chemickými názvy variabilní
části molekuly a příponou glukosinolát. Častěji se však používají názvy triviální, které byly odvozeny od latinského názvu rostliny, ze které byly poprvé izolovány.
1.3.3 Dělení glukosinolátů
Dle struktury postranního řetězce (R) lze glukosinoláty dělit do čtyř skupin.
Postranní řetězec určuje chemické, fyzikální a biologické vlastnosti jednotlivých glukosinolátů a jejich degradačních produktů. Rozeznáváme glukosinoláty:
Alifatické, alk(en)ylové (č. 1 - 6, viz. tab. 4.), případně alifatické substituované
Sirné, obsahující v postranním řetězci methylthioskupinu (č. 10 - 13), případně
hydroxyskupinou (č. 7 - 9)
jejich oxidované formy (č. 14 - 19)
Aromatické, s nesubstituovaným nebo substituovaným benzenovým jádrem (č.
Indolové, se substituovaným indolem (č. 27 - 30) (Velíšek, 2002).
20 - 26)
53
Dle Prugara a Zukalové (2002) lze dělit glukosinoláty podle fyziologie rostlin do tří
skupin:
Látky, z nichž hydrolýzou vznikají bioaktivní isothiokyanáty. Ty jsou známé
jak pozitivními (antimikrobiální, antibakteriální, fungicidní) tak negativními účinky (vazba jodu).
Hydroxidy-glukosinoláty. Tato skupina je oproti první zastoupena daleko méně,
na druhé straně však vyniká antinutričními vlastnostmi. Rozkladný produkt goitrin je silně strumigenní. Jeho vysoký obsah v semenech řepky vedl ke
snahám o minimalizování jeho obsahu . V řepkovém semeni je obsaženo přes 70 % progoitrinu z celkového množství glukosinolátů.
Glukosinoláty s indolovou skupinou, jejichž hydrolýzou vznikají thiokyanáty.
Ve větším množství se nachází v semenech nízkoglukosinolátových řepek. Vykazují jak antinutriční vlastnosti tak antikarcinogenní, které se v posledních letech zkoumají.
1.3.4 Výskyt glukosinolátů
Glukosinoláty se nacházejí v dvouděložných rostlinách (Dicotyledonae), které náleží
do 11 čeledí.
Dominantní postavení zaujímá čeleď brukvovitých (Brassicaceae)
(Velíšek, 2002), která samotná obsahuje více než 350 rodů a 3000 druhů.
Byly
studovány stovky druhů a všechny byly schopné syntetizovat glukosinoláty (Fahey et al., 2001).
Glukosinoláty jsou považovány za přirozené pesticidy, které jsou produkovány
vyššími rostlinami za účelem zvýšení odolnosti vůči nepříznivým vlivům (parazité, konkurenti, predátoři). Vykazují toxické či odpudivé účinky (Prugar a Zukalová, 2002).
Přehled nejznámějších glukosinolátů ve vybraných zeleninách a olejninách uvádí
tab. 5. a 6. Přestože se v zelenině čeledě brukvovitých běžně vyskytuje okolo 10 – 30 glukosinolátů, ve významném množství je zastoupeno jen několik. Tato čeleď představuje pro člověka nejvýznamnější zdroj glukosinolátů (Park a Pezzuto, 2002).
Kromě čeledě brukvovitých konzumujeme také některé části rostlin, které náleží do
jiných čeledí, např. kapary (Capparidaceae), obsahující glukokapparin či semena papáji
(Caricaceae), obsahující glukotropeolin.
Průměrný obsah ve vegetativních částech rostlin se pohybuje v rozmezí 100 – 2500
mg.kg-1, v semenech až 60 000 mg.kg-1 (Velíšek, 2002). Obsah glukosinolátů v brukvovité zelenině je v některých částech asi 1 % suché váhy, nicméně jejich obsah 54
je značně variabilní a může se blížit i 10 % v semenech některých rostlin, kde mohou glukosinoláty představovat polovinu z celkového obsahu síry v semenech. Dle Stoewsanda (1995) a Rhodese (1996) je nejvíce glukosinolátů obsaženo v růžičkové
kapustě a to v rozmezí 600 – 3900 mg.kg-1.
Tab. 5. Přehled nejznámějších glukosinolátů ve vybraných druzích zeleniny a olejninách (Velíšek, 2002) Název
Latinský název
zelí
Brassica oleracea var. capitata
růžičková kapusta
Brassica oleracea var. gemmifera
květák
kadeřavá kapusta kedluben
brokolice
čínské zelí vodnice
řepka olejná
hořčice hnědá hořčice černá hořčice bílá ředkvička
křen selský
řeřicha setá
Typické glukosinoláty (čísla sloučenin dle tab.4.)
2, 14, 26, 28
Brassica oleracea var. botrytis
2, 14, 26, 28, 29
Brassica oleracea var. acephala
2, 7, 26
2, 4, 7, 18, 26, 27, 29
Brassica oleracea var. gongyloides
2, 14, 26, 28
Brassica chinensis var. chinensis
23, 26
Brassica oleracea var. italica Brassica rapa var. rapa
Brassica napus var. napus Brassica juncea
16, 26, 27, 28, 29 2, 4, 7, 24, 26, 27 4, 6, 7, 9, 27 2, 4 2
Brassica nigra Sinapis alba
21
Raphanus sativus var. radicula
11, 16, 15, 24, 28
Lepidium sativum
20
Armoracia rusticana
2, 21
Mnoho druhů obsahuje pouze omezené množství glukosinolů. Jejich distribuce se
kvantitativně i kvalitativně liší mezi jednotlivými částmi rostlin (kořeny, listy, stonky a semena). Složení je nejvíce určováno genetickými vlastnostmi rostlin. Jejich celkový
obsah je ovlivněn také celou řadou vnějších faktorů uplatňujících se během pěstování a sklizně (hnojení, další agrotechnické zásahy během vegetace, termíny sklizně, posklizňové skladování atd.).
55
Tab. 6. Poměr alifatických, sirných, aromatických a indolových glukosinolátů
v brukvovitých zeleninách v mg.kg-1 čerstvé hmoty (Velíšek, 1996)
Zelenina
Alifatické
Sirné
Aromatické
Indolové
zelí čínské
0
0
2
171
71
0
154
zelí hlávkové kapusta růžičková květák
brokolice kedluben vodnice
ředkev černá ředkvička křen
43
0
1
546
37
3
71
0
144
115
9
28
52
397
0
27
140 80 0
0
1433
26
858 0
8
39
6
0
113
211
79
70
55
Obsah glukosinolátů v rostlině stoupá s klesající průměrnou denní teplotou
v průběhu vegetačního období a částečně v závislosti na druhu, stoupá také s intenzitou slunečního záření. Hnojení sírou se projevuje u některých glukosinolátů. Obsah
sulforafanu, degradačního produktu glukorafaninu lze také ovlivnit používáním dusíkatého hnojiva při různém stupni a termínech zavlažování. Za použití vyšších dávek
hnojení se obsah sulforafanu snižoval a vliv závlahy se nijak neprojevil (Prugar a
Zukalová, 2002). Jiné podmínky, jako zásobení vody či hustota sadby se nejeví jako
významná. Starší brokolice (počátek nasazování do květů) vykazují 20 – 50 krát nižší obsahy glukosinolátů než mladé výhonky brokolice (Shapiro et al., 2001; Prugar a Zukalová, 2002). Semena či mladé výhonky brokolice mohou obsahovat množství
glukosinolátů od 70 do 100 µmol.g-1 čerstvé hmoty, s méně jak 1 % indolových
glukosinolátů a vyváženým množstvím alifatických glukosinolátů, glukorafaninu (16,6
µmol.g-1 čerstvé hmotnosti), glukoerucinu (5,41 µmol.g-1 čerstvé hmotnosti),
glukoiberinu a 4-hydroxyglukobrassicinu (0,71 µmol.g-1 čerstvé hmotnosti). Později se
obsah glukosinolátů snižuje na 1 – 4 µmol.g-1 čerstvé hmoty s téměř rovnoměrným rozložením alifatických (glukorafanin 1,08 µmol.g-1 čerstvé hmotnosti) a indolových glukosinolátů (glukobrassicin 1,67 µmol.g-1 čerstvé hmotnosti a neoglukobrassicin 0,62 µmol.g-1 čerstvé hmotnosti). Ačkoli se zastoupení jednotlivých indolů mezi různými
odrůdami brokolice liší, zpravidla 67 % celkového obsahu glukosinolátů u zralé 56
brokolice představují právě indoly, zatímco u mladých výhonků brokolice se jedná pouze o méně než 10 % (Fahey et al., 1997).
Celkový obsah glukosinolátů představuje 22,7 a 3,37 µmol.g-1 čerstvé hmotnosti u
mladých výhonků a u zralé brokolice. Stogramová porce zralé brokolice tak poskytuje
108 µmol methylsulfinylalkyl glukosinolátů a 229 µmol indolových glukosinolátů (Fahey et al., 1997), což odpovídá zhruba 50 – 100 mg glukosinolátů ve 100 g porci.
Glukosinoláty představují asi 0,05 – 0,1 % čerstvé hmotnosti brokolice. Stáří rostliny se zdá být tedy velmi důležitým ukazatelem složení glukosinolátů v rostlinách (Fahey et
al., 2001).
Doposud neexistuje databáze potravin s obsahem glukosinolátů tak, jak je tomu u
polyfenolů či isoflavonů. Nicméně byly zaznamenány první pokusy o vytvoření
databáze pro odhadnutí příjmu glukosinolátů z brukvovité zeleniny. McNaugton a Marks (2003) se snažili porovnat 18 studií se 140 odhadnutými obsahy pro 42 položek.
Nejvyšší obsah byl zaznamenán u řeřichy (3,89 g.kg -1) a nejnižší u čínského zelí (0,2
mg.kg-1). Nicméně v různých studiích existují podstatné rozdíly v obsahu glukosinolátů
pro stejný druh zeleniny, s 5 – 8 násobným průměrným rozdílem mezi minimálním a
maximálním obsahem. Údaje o analýzách obsahu glukosinolátů ve vařené brukvovité
zelenině jsou nedostatečně, nicméně průměrná ztráta během vaření se pohybuje okolo 36 %. Bylo také prokázáno, že nejen stáří rostliny, ale i různé odrůdy brukvovité zeleniny mají značný vliv na poměr a množství jednotlivých glukosinolátů, nicméně rozdíly mezi indolovými glukosinoláty byly minimální (Schonhof et al., 2004).
1.3.5 Enzymatické změny glukosinolátů
Glukosinoláty se vyskytují v rostlinném pletivu spolu s enzymem myrosinázou
(thioglukosidglukohydroláza), která katalyzuje jejich rozpad (Verhoeven et al., 1997; Hecht, 1999). Myrosináza je globulární glykoprotein s relativní molekulovou hmotností
140 kDa a skládá se z několika isoenzymů. Myrosináza je uložena v neporušeném
pletivu odděleně od glukosinolátů. Při mechanickém narušení buněk rostlinného pletiva
dojde poměrně rychle k enzymové hydrolýze. Mechanické narušení může představovat například kousání, krájení, pomrznutí, napadaní škůdci a jiné. Rychlost enzymatické
hydrolýzy je ovlivněna řadou faktorů – teplota, pH prostředí, druh a část rostliny, přítomnost látek působících jako inhibitory či aktivátory.
Enzymatická hydrolýza (viz obr. 16.) je zahájena myrosinázou katalyzovaným
štěpením
thioglukosidové vazby glukosinolátu. Kromě glukózy vzniká aglykon 57
(nestabilní meziprodukt), který podléhá spontánní degradaci, která zahrnuje odštěpení
hydrogensíranu a stabilizaci zbytku molekuly na některý ze stálejších produktů. Rozkladnými produkty glukosinolátů jsou isothiokynáty (ITC), nitrily, thiokyanáty aj. Nicméně v závislosti na vnějších podmínkách mohou vznikat další produkty (Velíšek,
2002). Právě vzniklé isothiokyanáty a nitrily (organické kyanidy) jsou zodpovědné za štiplavou chuť
brukvovité zeleniny. Konzumací průměrné porce patřičného druhu
zeleniny se uvolňují desítky miligramů isothiokyanátů (Hecht, 1999). ITC vzniklé z 2-hydroxyalkenylových
glukosinolátů
jsou
nestálé, spontánně
cyklizují. Z progoitrinu vzniká goitrin ((R)-5-vinyl-1,3-oxazolidin-2-thion), který je toxikologicky závažný.
Glukóza - S – C – R ║
N – O – SO3-
Glukosinolát
↓ myrosináza
S–C –R ║
N – O – SO3-
→
S═C–R
↔
D-glukóza
║
N-– O – SO3-
Thiohydroxamát-O-sulfonát ↓ HSO4-
───────────────────────────── ↓
R–N=C=S
Isothiokyanát
↓
↓
R–C≡N
R–S–C ≡N
Nitril
Thiokyanát
↓
Jiný produkt
Obr. 16. Obecné schéma enzymového rozkladu glukosinolátů (Velíšek, 1996) Glukobrassicin a zřejmě také další substituované glukobrassiciny
dávají kromě
nitrilu, 3-indolylisothiokyanát. Z něj se snadno odštěpuje thiokyanátový anion a ve vodném prostředí vzniká 3-hydroxymethylindol, který reaguje s kyselinou L-
askorbovou přítomnou v rostlinném pletivu za vzniku vázané formy vitaminu C, tzv. 58
askorbigenu. Zelenina bohatá na vitamin C pak
poskytuje askorbigen jako hlavní
degradační produkt glukobrassicinu. V závislosti na vnějších podmínkách se mění asi
20 – 50 % glukobrassicinu na askorbigen. Obsah askorbigenu se v brukvovité zelenině
pohybuje v rozmezí 5 - 60 mg.kg1. Stabilita askorbigenu a 3-indolylisothiokyanátu je
za vyšších teplot omezená a vzniká tak celá řada transformačních produktů. Tepelnou degradací glukobrassicinu vzniká
jako hlavní produkt: 3-indolylacetonitril, 3-
indolyloctová kyselina, 3-indolylacetamid, 3-formylindol, 3-methylindol a další sloučeniny (Velíšek, 2002).
Z glukorafaninu se hydrolýzou uvolňuje sulforafan vykazující chemoprotektivní
vlastnosti. Kromě sulforafanu se může z glukorafaninu hydrolýzou uvolnit i sulforafan-
nitril, který však nevykazuje výrazné chemoprotektivní vlastnosti (Matusheski a Jeffery, 2001) a jeho tvorba je závislá na teplotě při technologické úpravě (Matusheski et al., 2004).
Vedle rostlinného enzymu myrosinázy existuje také houbová a bakteriální
myrosináza. Myrosináza je také přítomná v mnoha bakteriích běžně přítomných
v gastrointestinálním traktu lidí a zvířat (Verhoeven et al., 1997; Fahey et al., 2001). Myrosináza je aktivována na různém stupni kyselinou L-askorbovou a v určitých případech za její nepřítomnosti je enzym neaktivní (Fahey et al., 2001).
1.3.6 Vliv vnějších podmínek na přeměnu glukosinolátů
Z podmínek vnějšího prostředí ovlivňuje hydrolýzu pH, teplota a koncentrace
kovových iontů. Tyto podmínky bychom měli zvažovat při hodnocení pozitivních, ale i toxických účinků glukosinolátů.
Hodnota pH ovlivňuje rychlost enzymatické přeměny. Optimální hodnota pH se
pohybuje v rozmezí 5 - 8. Dále pH ovlivňuje degradaci nestabilního aglykonu. Při vyšším pH vznikají isothiokyanáty, zatímco při pH nižším (< 4) nitrily.
Tepelným zpracováním (vaření, pečení, blanšírování, zavařování) zeleniny dochází
k inaktivaci enzymových systémů. V závislosti na délce tepelného působení a výši
teploty dochází k rozkladu glukosinolátů a jiných termolabilních produktů (např. askorbigen). Také dojde k vytěkání některých látek, čímž dochází ke změně aróma.
Tepelné ošetření, především vaření a blanšírování vede k vyluhování glukosinolátů.
Průměrně se jedná asi o 30 – 40 %. Nejnižší ztráty bývají u sinigrinu (asi 30 %), nejvyšší u glukobrassicinu (asi 60 %). Přibližně třetina až polovina glukosinolátů se
vařením či tepelným ošetřením nemění. Pokud dojde k porušení rostlinného pletiva až 59
po dostatečně účinném tepelném zásahu, nedojde již k hydrolýze glukosinolátů a ty jsou přijímány nerozložené potravou (Velíšek, 2002) (viz tab. 7.)
Tab. 7. Obsah glukosinolátů v čerstvých a vařených brukvovitých zeleninách (Velíšek, 2002)
Zelenina
zelí
syrové vařené
květák
syrový vařený
Celkový obsah
v mg.kg-1
Obsah jednotlivých glukosinolátů v mg.kg-1 čerstvé hmoty (čísla sloučenin dle tab. 4.)
čerstvé hmoty Rozsah 360-
2754 315-
1651 138-
2083 94-
1111
Průměr
2
4
6
7
9
12
13
14
24
26
28
1089
263
18
-
38
-
-
-
450
-
295
25
786
202
13
-
27
-
-
-
300
-
174
11
620
142
7
-
23
-
-
-
173
-
227
48
420
100
3
-
14
-
-
-
122
-
151
30
2260
445
252
-
478
-
-
-
353
-
624
110
1237
264
148
-
299
-
-
-
195
-
298
33
560
-
42
37
371
42
46
71
-
97
48
96
291
-
24
26
206
23
23
39
-
58
23
38
růžičková kapusta syrová
1455-
vařená
597-
tuřín
syrový vařený
3939
2452 392-
1657 205944
U lidí byl zkoumán vliv konzumace vařeného zelí na produkci isothiokyanátů. Zelí
obsahuje nejvíce glukosinolátu sinigrinu, který se působením myrosinázy hydrolyzuje na allyl isothiokyanáty. Po konzumaci vařeného zelí byla v moči podstatně nižší hladina allyl isothiokyanátů ve srovnání se zelím syrovým a exkrece byla pomalejší. Nicméně
hladina isothiokyanátů stále stoupala, což naznačuje účast střevní mikroflóry na konverzi glukosinolátů na isothiokyanáty (Rouzaud et al., 2004). Podobné výsledky byly dosaženy ve studii s dobrovolníky, kteří konzumovali řeřichu. 60
Po konzumaci tepelně upravené zeleniny došlo k výraznému poklesu přeměny
glukosinolátů na isothiokyanáty, neboť močí bylo vyloučeno pouze 1,2 – 7,3 % z celkového požitého množství ve srovnání s 17,2 – 77,7 % po konzumaci syrové zeleniny. Pokud však byly za anaerobních podmínek
inkubovány šťáva z vařené
řeřichy a čerstvá stolice, došlo působením střevní mikroflóry k 18 % hydrolýze glukosinolátů na isothiokyanáty (Getahun a Chung, 1999).
Zmrazováním zeleniny dojde v důsledku aktivity myrosinázy v poškozeném
rostlinném pletivu k rozkladu asi 50 % glukosinolátů.
Kvašením zelí dojde k téměř úplnému rozkladu glukosinolátů během jednoho týdne.
Přítomnost kyseliny L-askorbové je další faktor ovlivňující míru hydrolýzy. Vede
k vyšší přeměně glukosinolátů, neboť aktivuje enzym myrosinázu a tím urychluje celý
proces. Její obsah v brukvovité zelenině se pohybuje v rozmezí 100 – 1200 mg. kg-1
(Velíšek, 2002).
Houška et al. (2004) prokázal, že s ohledem na obsah sulforafanu v brukvovité
zelenině se při výrobě brokolicové šťávy jeví jako vhodná surovina brokolice čerstvá či
chlazená. S klesající hodnotou pH se obsah sulforafanu zvyšoval a ošetření vysokým tlakem v rozsahu 350 – 500 MPa po dobu 3 – 10 minut nemělo vliv na jeho obsah. A
časová prodleva po vylisování šťávy dokonce zvýšila obsah sulforafanu na průměrnou hodnotu 16, 19 mg.l-1.
1.3.7 Příjem glukosinolátů
Doposud vědecké práce věnovaly jen malou pozornost celkové konzumaci
glukosinolátů, nicméně některé odhady se blíží až 300 mg za den, což odpovídá množství zhruba 660 µmol na den (Talalay a Fahey, 2001). Pokud bychom počítali
příjem isothiokyanátů, konkrétně sulforafanu a fenethylisothiokyanátů, pak by se jejich příjem ze 100 g porce brokolice či řeřichy mohl pohybovat v rozmezí 50 – 200 µmol (Chung et al., 2000).
Průměrný denní příjem se v České republice pohybuje kolem 10 mg glukosinolátů
na osobu a den. Vegetariáni a osoby konzumující ve vyšším množství brukvovitou zeleninu mohou mít příjem vyšší a dosahovat několik stovek mg na osobu a den (Velíšek, 2002).
Průměrná konzumace glukosinolátů ve Velké Británii, Německu a Kanadě byla
odhadnuta na 46, 43 a 8 mg na den a osobu. Maximální míra konverze glukosinolátů na
61
ITC je asi 67 %, takže celkové množství ITC konzumovaných ve Velké Británii, Německu a Kanadě je 31, 29 a 5 mg na den a osobu (Kassie a Knasmüller, 2000).
Průměrná konzumace brukvovité zeleniny se liší dle geografických oblastí po celém
světě. Například v Japonsku je konzumováno 20 kg ředkviček (Raphanus sativus) ročně
na jednu osobu. To znamená 55 g ředkviček denně na jednu osobu. V Japonsku se jedná o nejpopulárnější druh zeleniny (Talalay a Fahey, 2001) V Singapuru je průměrná
denní spotřeba brukvovité zeleniny 40 gramů, přibližně třikrát vyšší než ve Spojených státech amerických. (Park a Pezzuto, 2002).
V České republice zaznamenala brokolice v poslední době zvýšenou spotřebu.
Zatímco v roce 1980 byla její spotřeba zanedbatelná, v roce 1998 činila 0,8 kg na osobu a rok. (Malý, 2001)
1.3.8 Metabolismus isothiokyanátů
Metabolismus a absorpce ITC tkáněmi jsou důležité pro pochopení jejich
biologických účinků, ať už prospěšných chemopreventivních, tak také možných
toxických účinků. Studie zabývající se biotransformací přirozeně se vyskytujících ITC prokazují, že jejich metabolismus jde přes cestu merkapturové kyseliny a konjugaci
elektrofilních ITC s glutathionem (GSH) (Conaway et al., 2002). Dle Zhanga (2001)
jsou isothiokyanáty akumulovány
hlavně jako dithiokarbamáty, vzniklé konjugací
s GSH. Stupeň akumulace souvisí s intracelulární hladinou glutathionu. To naznačuje, že buněčný GSH může být zodpovědný za průnik isothiokyanátů do buněk.
Petri et al. (2003) prokázali, že se sulforafan absorbuje pasivní difúzí do enterocytů
a významné množství aplikovaného sulforafanu se vylučuje zpět do lumen střeva ve
formě konjugátu sulforafanu s glutathionem. Tyto výsledky naznačují, že exkrece konjugátů sulforafanu by mohla ovlivnit míru absorpce isothiokyanátů, a že biologická
využitelnost může být podstatně nižší. Ve studiích na zvířatech bylo prokázáno, že se sulforafan vyskytuje ve žluči odebrané do 4 hodin po aplikaci sulforafanu. Bylo zde
detekováno pět metabolitů, dva z nich byly identifikovány jako konjugáty sulforafanu a erucinu s glutathionem, dále analoga sulfidu. Další dva metabolity byli identifikovány jako sulforafan a erucin konjugáty NAC. Nebyly identifikovány metabolity ve stolici. Metabolity v moči, které byly sledovány během 24 hodin po aplikaci sulforafanu byly
identifikovány jako NAC konjugáty sulforafanu a erucinu v množství 60 a 12 % z aplikované dávky sulforafanu.
Z těchto výsledků je patrné, že metabolismus
sulforafanu se uskutečňuje cestou I. fáze, oxido-redukcí a dehydrogenací a že konjugace 62
s glutathionem je hlavní cestou, kterou je sulforafan a metabolity I. fáze eliminovány z organismu (Kassahun et al., 1997).
Indol-3-karbinol (I3C) je u myší rapidně absorbován a distribuován do mnoha tkání.
Velmi rychle je eliminován z plasmy a tkání. Limit detekce je menší než 1 hodina.
Nejvyšší koncentrace I3C lze nalézt v játrech, a ty jsou 6 krát vyšší než v plasmě. Hladiny jeho kondenzačních produktů jsou podstatně nižší, ale na druhé straně zůstávaly v plasmě po delší dobu (Anderton et al., 2004).
Byli provedeny i studie na lidských dobrovolnících. Zjistilo se, že glukorafanin
představuje přibližně 44 – 56 % z celkového obsahu glukosinolátů. Po zkonzumování
brokolice jsou v moči detekována přiměřená množství dithiokarbamátů. V pokusech s konzumací obvyklé porce brokolice čerstvé a následně také uvařené v páře bylo zjištěno, že exkrece metabolitů v moči byla 32% resp. 10 %. Tyto výsledky naznačují,
že ačkoli čerstvá brokolice i upravená v páře obsahují stejné množství glukosinolátů, vařením dochází k podstatnému snížení absorpce díky inaktivaci myrosinázy (Conaway
et al., 2000). Malé množství ITC nalezené v moči po konzumaci vařené brokolice bylo
připisováno hydrolytické aktivitě mikroflóry gastrointestinálního traktu (Conaway et
al., 2002). Shapiro et al. (1998) provedli studii, ve které čtyři dobrovolníci konzumovali
brokolici v dávce 25 – 250 g s obsahem 2,01 µmol.g-1 glukosinolátů (zhruba 44 – 56 %
ve formě glukorafaninu). Byla analyzována exkrece dithiokarbamátů, která byla přiměřená konzumované dávce. Maximální exkrece byla dosažena v prvních osmi hodinách
po
zkonzumování
brokolice,
nicméně
detekovatelné
množství
cyklokondensačních produktů bylo možné i 72 hodin po konzumaci. Opět po konzumaci vařené brokolice došlo k inaktivaci myrosinázy a ke snížení detekce
konjugátů v moči na 10 – 20 %. Další studie stejných autorů potvrdila důležitost žvýkání na aktivaci myrosinázy a zvýšení množství dithiokarbamátů v moči (Shapiro et
al., 2001).
Metabolismus isothiokyanátů byl sledován u lidských dobrovolníků
také po
injekční aplikaci sulforafanu a phenethylisothiokyanátu (PEITC). Studie potvrdily roli
mikroflóry gastrointestinálního traktu na hydrolýzu glukosinolátů na isothiokyanáty (Fahey et al., 2001).
Mnoho isothiokyanátů je rychle akumulováno ve velmi vysokých koncentracích
(několik set násobně oproti extracelulárním koncentracím) v buňkách různého druhu a
mohou dosahovat milimolárních hladin. Většina ITC se v krvi nachází ve formě konjugátů spíše než ve volné formě. Konjugáty jsou absorbovány do buněk velmi 63
pozvolna, zatímco ITC vstupují do buněk rychleji. Míra akumulace může být rozhodující pro antikarcinogenní aktivitu těchto sloučenin (Zhang, 2001).
1.3.9 Biologické účinky glukosinolátů a jejich rozkladných produktů
Glukosinoláty jsou sloučeniny indiferentní. Biologické účinky vykazují
pouze
degradační produkty glukosinolátů. Ty se liší podle skladby vznikajících látek. Měly
bychom proto vědět, které glukosinoláty jsou zastoupeny v zelenině, v jakém množství,
které produkty vznikají jejich rozkladem, v jakém množství a s jakou biologickou aktivitou (Velíšek, 2002).
Zdá se, že biologicky aktivní sloučeniny brukvovité zeleniny ovlivňují především
iniciační a promoční fázi procesu karcinogeneze (Murillo a Mehta, 2001) a také alterují
estrogenní metabolismus či nás chrání proti reaktivním formám kyslíku (Keck a Finley,
2004).
1.3.9.1 Antibakteriální účinky
Již po desetiletí jsou studovány antibakteriální vlastnosti glukosinolátů a
isothiokyanátů. Aktivita isothiokyanátů, jako např. sulforafanu proti mnoha lidským
patogenů, (např. Escherichia Coli, Salmonella typhimurium, Candida sp.) může přispět
k léčivým vlastnostem připisovaným brukvovité zelenině, např. zelí a hořčice, které byly používané k obkladům. Antagonistické interakce nejsou omezené pouze na
mikroby, ale byly popsány účinky např. i proti škrkavkám. Po dlouhou dobu jsou sledovány pozitivní účinky i proti škůdcům a predátorům (Fahey et al., 2001). Některé experimenty prokazují pozitivní vliv sulforafanu na inhibici
infekce
způsobené Helicobacter pylori a také na zablokování následného vzniku rakoviny
žaludku (Fahey et al., 2002). Nicméně jiná studie tuto myšlenku nepotvrzuje (Sato et
al., 2004).
1.3.9.2 Antioxidační účinky
Oxidační stres, který je výsledkem nadměrné expozice znečištěnému životnímu
prostředí, ultrafialovému či ionizačnímu záření může překonat antioxidační systém lidského těla s následným oxidativním poškozením proteinů a nukleových kyselin (Keck a Finley, 2004).
64
Glukosinoláty pravděpodobněji vykazují nepřímé antioxidační účinky aktivací
antioxidačních enzymů (Williamson et al., 1998; Nho a Jeffery, 2004; Vang et al., 2004).
Plumb et al. (1996, 1997) prokázal, že glukosinoláty samotné vykazují jen slabé
přímé antioxidační účinky a představují tak pravděpodobně minoritní roli, zatímco glykosidy kvercetinu a estery čtyř hydroxyskořicových kyselin nalezené v brokolici
jsou silnými inhibitory peroxidace lipidů a extrakty z brukvovité zeleniny mohou působit jako přímé antioxidanty. Dle Barillari et al. (2005) vykazuje glukoerucin přímé
i nepřímé antioxidační účinky, narozdíl od ostatních glukosinolátů (např. glukorafanin), které vykazují pouze nepřímé antioxidační účinky. Glukoerucin a jeho metabolit erucin
je schopen vychytávat ROS (peroxid vodíku a alkyl hydroperoxidy). K podobnému závěru dospěl i Shertzer a Senft (2000) při studiu indol-3-karbinolu, který kromě
schopnosti indukce antioxidačních enzymů prokázal i schopnost vychytávat ROS a jiné
elektrofilní sloučeniny. V tomto ohledu by mohly významně přispět konjugáty I3C s askorbátem (askorbigen).
1.3.9.3 Chemopreventivní účinky
V poslední době přibývá studií jak na laboratorních zvířatech, tak studií
epidemiologických (Steinmetz a Potter, 1996; Shapiro et al., 2001), jejichž výsledky potvrzují, že zvýšený příjem brukvovité zeleniny snižuje riziko tvorby chemicky
(příjmem karcinogenů) indukované rakoviny. Tato zelenina tak působí antimutagenně a antikarcinogenně. Vysoká konzumace brukvovité zeleniny je spojována především se sníženým výskytem rakoviny tlustého střeva, rekta, žaludku, ale i plic. Méně
jednoznačné jsou výsledky pro rakovinu prostaty, endometria či vaječníků (Graham et
al., 1978; Verhoeven et al., 1996; Van Poppel et al., 1999; Giovannucci et al., 2003).
Tyto chemopreventivní účinky jsou přisuzovány hlavně isothiokyanátům a to především
sirným a aromatickým, ale také indolovým. Ty se vyskytují téměř ve všech druzích brukvovité zeleniny. Kromě rozkladných produktů glukosinolátů však nesmíme
opomenout přítomnost mnoha dalších látek - kyseliny L-askorbové, α-tokoferolu, βkarotenu, vlákniny a polyfenolických látek, které se mohou také podílet na prospěšných účincích brukvovité zeleniny (Nestle, 1997; Velíšek, 2002).
Za pravděpodobně nejaktivnější sloučeninu ze skupiny glukosinolátů byl označen
glukorafanin, který se hydrolyzuje na 4-methylsulfinylbutylisothiokyanát – sulforafan.
Nejvíce je zastoupen v brokolici, ředkvi či ředkvičce. Další látky poutající pozornost 65
jsou rozkladné produkty indolových glukosinolátů, z nichž nejvýznamnější je 3-
hydroxymethylindol, který reaguje s kyselinou L-askorbovou za vzniku askorbigenu. Po perorálním příjmu se část kyseliny L-askorbové v žaludku odštěpí a dochází k celé
řadě reakcí vedoucích ke vzniku sloučenin s antikarcinogenními a antimutagenními vlastnostmi (Velíšek, 2002).
1.3.9.3.1 Vliv na metabolismus detoxikačních enzymů Předpokládaný mechanismus antikarcinogenního účinku brukvovité zeleniny bohaté
na glukosinoláty spočívá v ovlivnění metabolické aktivace karcinogenní či mutagenní látky.
Jedná se především o inhibici aktivace promutagenů a prokarcinogenů a
v indukci biotransformačních mechanismů spojených s detoxikací těchto látek (Rambousková, 2002).
Přesný mechanismus antikarcinogenního působení látek je málo znám, nicméně
většina cizích látek je v organismu metabolizována ve dvou fázích (viz kapitola 2.2.5.7.1) (Velíšek, 1996).
Dle mechanismu působení lze tyto látky rozdělit do 3 skupin:
Sloučeniny
inhibující
prokarcinogenů.
enzymy
podílející
se
na
metabolické
aktivaci
o Jsou neúčinné u přímých karcinogenů, které tuto aktivaci nevyžadují.
Látky převádějící karcinogeny na neškodné sloučeniny – látky aktivující enzymové
detoxikační systémy (např. glutathion-S-transferáza, některé
isothiokyanáty – 2-fenylethylisothiokyanát, benzylisothiokyanát (BITC), 4methylsulfinylbutylisothiokyanát
(sulforafan)
vznikající
glukosinolátů – glukonasturtiin, glukotropeolin, glukorafanin).
z následujících
Látky převádějící karcinogeny na neškodné sloučeniny – látky snižující riziko poškození DNA tím, že reagují se vzniklými elektrofily nebo brání jejich reakci s DNA.
Indoly a isothiokyanáty jsou schopné indukovat detoxikační i antioxidační enzymy
u lidských rakovinných buněk tlustého střeva. Účinek těchto dvou skupin je ale odlišný.
Indoly transkripčně aktivují genovou expresi přes XRE enzymy (xenobiotic responsive element), zahrnující NADPH: chinon reduktázu, glutathion-S-transferázu, glukuronosyl
transferázu, CYP1A1/2, CYP1B1, cytochrom P450 C, superoxiddismutázu či xanthin 66
oxidázu, zatímco isothiokyanáty aktivují geny přes ARE enzymy
(antioxidant
responsive element), které zahrnují NADPH: chinon reduktázu, glutathion-S-transferázu
– Ya, A2, Pi, glukuronosyl transferázu, γ-glutamylcystein transferázu a další (Bonnesen
et al., 2001; Finley, 2003; Meskin et al., 2004). Regulace detoxikačních enzymů hydrolyzačními produkty glukosinolátů lze klasifikovat
podle toho, zda daná
sloučenina aktivuje detoxikační enzymy jedné či obou fází. Monofunkční induktory regulují především mnoho enzymů II. fáze, zatímco bifunkční induktory regulují fázi I i
II. Některé isothiokyanáty jsou tedy účinnými inhibitory cytochromu P450, jiné jsou induktory detoxikačních enzymů II. fáze, např. glutathion-S-transferázy, NADPH: oxidoreduktázy či ovlivňují obě fáze (Hecht, 1999).
U sulforafanu (event. dalších isothiokyanátů – allylisothiokyanáty, erucin, iberverin,
iberin) je tedy prokázáno, že je silným monofunkčním induktorem
(Munday R. a
Munday C.M., 2004) a tato aktivita je závislá na ARE. Je regulátorem především chinon reduktázy v buněčných kulturách. Indukce chinon reduktázy je spojena s indukcí
mnoha dalších detoxikačních enzymů, včetně glutathion-S-transferázy, UDP-
glukuronosyl transferázy a γ-glutamyl-cystein syntetázy (Zhang et al., 1992). Může tak
být významnou složkou antikarcinogenního potenciálu brokolice. Dále snižuje výskyt, zpomaluje příznaky a redukuje velikost nádorů u krysích modelů. Působí
pravděpodobně jako nepřímý antioxidant, vykazuje určité cytotoxické a cytostatické účinky na lidské rakovinné buňky tlustého střeva, inhibuje cytochrom P450, zvláště
CYP2E1 (Levi et al., 2001) a indukuje zastavení buněčného cyklu a stimuluje apoptózu
taktéž u lidských rakovinných buněk tlustého střeva. Sulforafan je schopen indukovat enzymy II. fáze již po dvoudenním aplikaci vařených výhonků brokolice potkanům (Wortelboer et al., 1992).
Nicméně bylo prokázáno, že sulforafan je schopen inhibovat enzymy cytochromu
P450, především isoenzymů CYP2E1 či CYP1A, které jsou zodpovědné za aktivaci
některých prokarcinogenů (např. dialkylnitrosaminy) (Barcelo et al., 1996; Maheo et al., 1997).
PEITC inhibuje indukci rakoviny plic a esofagu u potkanů i myší. Tyto účinky
korelují s redukcí tvorby karcinogenních DNA-adduktů a silnou inhibicí cytochromu
P450. Podobné účinky byly sledovány u kuřáků, kteří konzumovali řeřichu jako zdroje fenylethylisothiokyanátů, jako i významné zvýšení glukuronidace metabolitů nikotinu, což naznačuje indukci enzymů II. fáze – UDPglukuronyltransferázy (Stoewsand, 1995). 67
Dle Chiao et al. (2004), PEITC-NAC (PEITC-N-acetylcystein) a některé jiné
thiolové konjugáty ITC působí jako silné chemopreventivní sloučeniny v mnoha
experimentech na savčích modelech. Indukují ochranu buněk v procesu karcinogeneze blokováním enzymů fáze I (např. cytochromu P450), které metabolizují prokarcinogeny
na karcinogeny a indukují enzymy II. fáze (např. glutathion-S-transferáza), které urychlují eliminaci elektrofilních metabolitů. PEITC-NAC dále významně inhibuje růst prostatických buněk s paralelní indukcí inhibitorů cyklin dependentní kinázy.
Bifunkční induktory regulují především cytochrom P450 monooxigenázy, ale také
mnoho enzymů II. fáze. Metabolismus některých bifunkčních induktorů pomocí cytochromu P450 má za následek tvorbu produktů, které se stávají monofunkčními induktory a tak ovlivňují enzymy II. fáze (Meskin et al., 2004).
Indolové deriváty, zahrnující indol-3-karbinol (I3C) a indol-3-acetonitril (3-ICN),
které jsou rozkladnými produkty glukobrassicinu, mohou působit jako bifunkční
induktory detoxikačních enzymů. V kyselém prostředí (např. při pH < 4) může I3C
tvořit mnoho kondensačních produktů včetně dimeru 3,3´- diindolylmethan (DIM), který vykazoval 72 hodin po aplikaci do plátků jater z potkana značnou indukci aktivity
na cytochromu dependentních enzymů (CYP1A, CYP2B a CYP3A) a současně k nepatrnému zvýšení aktivity GSH a glutathion-S-transferázy (Renwick et al., 1999).
Dle Fahey et al. (1997) existuje několik omezení pro použití indolů jako
chemopreventivní sloučeniny:
jsou slabými induktory enzymů II. fáze
jsou bifunkčními induktory, které aktivují enzymy I. fáze mohou vykazovat estrogenní aktivitu
jsou potencionálními promotory v procesu karcinogeneze
Zdá se, že indol-3-karbinol aplikovaný ve studiích na zvířatech, inhibuje iniciaci
chemicky vyvolávané rakoviny, ale funguje také jako promotor po aplikaci aflatoxinu B1 či 1,2-dimethylhydrazinu (Stoewsand, 1995).
I3C indukuje detoxikační enzymy právě přes XRE, produkující bifunkční induktory.
Ačkoli sám je jen velmi slabým ligandem Ah receptoru, za kyselých podmínek v žaludku tvoří mnoho kondenzačních produktů, které jsou mocnými ligandy Ah
receptoru a aktivují transkripci přes XRE. Byly isolovány dva produkty diindolyl
methan a indol-3-karbazol, které jsou silnými agonisty XRE na CYP1A genů. Nicméně
CYP1A je zodpovědný za aktivaci mnoha polycyklických prokarcinogenů. Zdá se však, 68
že
bifunkční induktory mohou inhibovat proces karcinogeneze, pravděpodobně
soutěživým působením jako antagonisté XRE agonistů. Tato myšlenka je podporována posledními výsledky s I3C v boji proti rakovině prsu, kde vede k rozvoji terapeuticky
působících XRE antagonistů, také nazvaných Ah receptor modulátory (Meskin et al., 2004).
Zajímavé výsledky přináší aplikace směsi hydrolyzačních produktů glukosinolátů,
po které dojde ke čtyř až pětinásobnému zvýšení aktivity chinon reduktázy ve srovnání
s aplikací individuálních sloučenin. Dochází zde k určitému synergickému působení
enzymů II. fáze (Meskin et al., 2004). K podobným výsledkům dospěl i Keck et al. (2003), který krmil potkany různými směsmi brokolice s obsahem glukosinolátů či
samotným sulforafanem. Oba typy diety zvyšovaly aktivitu chinon reduktázy stejným dílem.
Sulforafan (Yoxall et al., 2005), PEITC a BITC (Sticha et al., 2002) jsou schopny
ovlivnit proces karcinogeneze i v iniciační fázi. Tohoto účinku je dosaženo sníženou
tvorbou DNA adduktů modulací metabolismu chemických karcinogenů a také sníženou dostupností genotoxických metabolitů.
Kromě sulforafanu vědci začali zkoumat analog sulforafanu - sulforamát, se
strukturální
podobností
k sulforafanu.
Sulforamát
vykazuje
velmi
podobné
chemopreventivní účinky a ukazuje se být také slibnou chemopreventivní sloučeninou (Gerhauser et al., 1997).
Výsledky mnoha studií naznačují, že brukvovitá zelenina působí ochranně proti
různým třídám DNA-reaktivních karcinogenů a že tyto vlastnosti jsou způsobeny
modulací detoxikačních enzymů. Ze získaných výsledků však není jasné, zda mohou být ochranné účinky brukvovité zeleniny připisovány samostatným sloučeninám jako jsou indoly a isothiokyanáty, na které se doposud soustřeďuje výzkum nebo celému
komplexu bioaktivních látek obsažených v brukvovité zelenině (Steinkellner et al., 2001).
1.3.9.3.2 Inhibice buněčného růstu a indukce apoptózy Isothiokyanáty mohou zpomalovat proliferaci a stimulovat apoptózu rakovinných
buněk. Tento jev má za následek zpomalení růstu nádorů (Thornalley, 2002; Keck a Finley, 2004; Wang et al., 2004).
Sulforafan není pouze silným induktorem detoxikačních enzymů, ale také inhibuje
proliferaci kultury nádorových buněk prostaty (PC-3) indukcí apoptózy prostřednictvím 69
exprese pro-apoptických (Bax) a anti-apoptických proteinů (Bcl-2, Bcl-XL) a indukcí
specifických proteáz (kaspáz) (Singh A.V. et al., 2004). Podobné výsledky nalezl i Pham et al. (2004) s kulturou nádorových buněk pankreatu. V dalším výzkumu Singh S.V. et al. (2004) potvrdili roli sulforafanu na zastavení buněčného cyklu v G2/M fázi
buněčného dělení, které bylo spojeno s významným snížením hladiny proteinu cyklin B1 a dalších specifických proteinů.
Účinek sulforafanu na progresi buněčného cyklu a apoptózu je však závislý na čase
a na dávce. Koncentrace větší než 3 µM byly nutné k ovlivnění buněčného cyklu
s maximální akumulací v G2/M fázi sledované při dávce 30 µM a následující 48 hod.
po expozici sulforafanu. Apoptóza pak byla sledována
při nejvyšších dávkách
sulforafanu (30 µM), v čase 24 a 48 hodin po jeho aplikaci. Buňky ošetřované
nejvyššími dávkami sulforafanu vykazovaly zvýšenou expresi p53, což může být důležitým krokem v indukci apoptózy (Fimognari et al., 2004).
Antiproliferační účinky byly prokázány i u rakoviny mléčné žlázy BALB/C myší a u
buněčných kultur po aplikaci sulforafanu. Pravděpodobný mechanismus účinku spočívá
v narušení dělících mikrotubulů a zablokování M-fáze buněčného dělení spojeného s aktivací cdc2 kinázy, naznačující zastavení buněčného cyklu před dokončením
metafáze (Jackson a Singletary, 2004). Dle Zhanga et al. (2003) mohou některé isothiokyanáty iniciovat inhibici růstu rakovinných buněk souběžnou modulací
buněčných cílů. Jejich antiproliferativní aktivita může být do značné míry neovlivněna jejich metabolismem a dispozicí in vivo.
Dle Sarkara a Li. (2004) vykazuje I3C a DIM protirakovinné účinky prostřednictvím
regulace buněčného cyklu, buněčné proliferace, apoptózy, onkogeneze, transkripce a buněčné signální transdukce u modelu nádorových buněk prostaty i I3C a DIM.
Vědci (Chiao et al., 2004; Conaway et al., 2005; Yang a Woodside, 2005) v in vivo
pokusech rovněž prokázali, že PEITC, PEITC-NAC a sulforafan by mohly být
účinnými chemopreventivními látkami u kuřáků, neboť aplikace těchto látek vedla v experimentech na zvířatech k významnému snížení proliferace buněk a k inhibici růstu nádorů plic, stimulací apoptózy a indukcí aktivačního proteinu-1 (AP-1). Většina
testovaných isothiokyanátů
inhibuje proces karcinogeneze pokud je
podávána před a během aplikace karcinogenu, ale ne pokud jsou aplikovány po podání karcinogenu. Nicméně existují výjimky. BITC inhibuje proces karcinogeneze u potkanů, pokud je aplikován následně po DMBA (Hecht, 1999). 70
I3C funguje jako promotor a zvyšuje incidenci rakoviny střeva, pokud je aplikován
po nebo během a po expozici karcinogenu 1,2-dimethylhydrazinu (DMH). Pokud je
však I3C podán po aplikaci 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]chinolinu (IQ), inhibuje tvorbu kolon aberantních krypt. Je tedy možné, že I3C funguje jako tumor promotor
nebo naopak antikarcinogenně v závislosti na testovaných látkách, iniciačních činidlech a době expozice (Xu et al., 2001).
1.3.9.4 Estrogenní účinky
Zdá se, že indolové glukosinoláty obsažené v brukvovité zeleniny mohou být
zodpovědné za změny v metabolismu estrogenů. Při zvýšené konzumaci brukvovité
zeleniny dochází k posunu poměru 16α-hydroxyestron (16HE), který funguje jako promotor rakoviny prsu a 2-hydroxyestronu (2HE), který nevykazuje estrogenní
vlastnosti prsní tkáně. Snížení poměru hladiny 2-hydroxyestronu:16α-hydroxyestronu v moči může být považován za endokrinní biomarker pro zvýšené riziko rakoviny prsu.
Indolové glukosinoláty jsou degradovány enzymem myrosinázou na I3C, DIM,
indol-3-acetonitril či další indolové deriváty a chemicky či enzymaticky jsou v těle
konvertovány na indol[3,2-b]karbazol, mírný agonista Ah receptoru. Aktivovaný Ah
receptor se váže na DNA a vyvolává expresi CYP1. CYP1 hydroxyluje estron (E1) na
druhém uhlíku a vede ke zvýšené produkci 2HE a ke snížení E1 dostupného pro konverzi 16HE. Indolové glukosinoláty by tak mohly být zodpovědné za posun v estrogenním metabolismu, který je ve shodě se snížením rizika rakoviny prsu (Fowke
et al., 2000).
Na závěr lze poznamenat, že isothiokyanáty narušují několik kroků v procesu
karcinogeneze:
Blokují poškození DNA
Inhibicí enzymů I. fáze (hlavně cytochrom P 450)
Detoxikací reaktivních karcinogenů indukcí enzymů II. fáze (např.
glutathion-S-transferáza)
Inhibují buněčný růst zastavením buněčného cyklu
Odstraňují premaligní a maligní buňky aktivací apoptózy (Zhang, 2001).
71
1.3.9.5 Negativní vlastnosti
Rozkladem alifatických glukosinolátů vznikají slabé strumigenní isothiokyanáty.
Některé vykazují antimikrobní a insekticidní účinky. Jiné produkty, které vznikají, jsou nitrily kyanoepithioalkany a ty naopak působí hepatotoxicky a nefrotoxicky (Velíšek, 1996).
Alkylglukosinoláty s hydroxylovou skupinou se vyskytují jak v zelenině, tak
v řepce. Jejich nejznámějším zástupcem je progoitrin. Vyskytuje se ve dvou izomerech. Epiprogoitrin byl nalezen v brokolici, nicméně oproti progoitrinu je méně stabilní
během vaření a zmrazování. Hydrolýzou progoitrinu vzniká silně strumigenní goitrin, mocně inhibující produkci hormonů štítné žlázy a přenos jodu ve štítné žláze (Velíšek,
1996; Velíšek, 2002). Goitrin byl také nalezen v mléce krav krmených semeny řepky
olejné a to v koncentracích okolo 0,1 %. Goitrin vstupující do trávicího traktu je
v žaludku nitrosován dusitany za tvorby mutagenu N-nitroso-oxazolidonu (Stoewsand, 1995).
Z nestabilních aromatických a indolových glukosinolátů vzniká středně silný
strumigenní thiokyanátový (rhodanidový) anion, působící jako inhibitor přenosu jodu ve
štítné žláze, a tak působí kompetetivně ve vztahu k jodu. Tyto účinky mohou vést ke zvětšení štítné žlázy, strumě a dalším poruchám její funkce. Vzhledem k běžně
konzumovaným množstvím glukosinolátů se těchto účinků však nemusíme obávat. (Velíšek, 2002)
Allylisothiokyanáty (AITC), PEITC (Kassie a Knasmüller, 2000) a BITC (Kassie et
al., 1999) vykazují v krátkodobých testech mutagenity (Amesův test, DNA reparační
test, mikronukleus test) genotoxické účinky. Nicméně jiní autoři u výše zmiňovaných
sloučenin nenalezli žádné genotoxické účinky, nebo tyto látky dokonce snižovaly
výskyt nádorů u hlodavců (Musk a Johnson, 1993; Musk et al., 1995; Knasmüller et al., 1996; Hecht 1999; Hecht et al., 2002). Dodnes není znám přesně mechanismus, kterým
mohou isothiokyanáty uplatňovat svoje genotoxické účinky. AITC jsou pravděpodobně
enzymaticky štěpeny za vzniku látek schopných vyvolat bakteriální mutace, lipidovou peroxidaci či buněčnou smrt. Potvrzuje se, že v genotoxických účincích může být zahrnuta také účast volných kyslíkových radikálů (Kassie a Knasmüller, 2000).
V roce 1996 potvrdil Kassie et al. v Amesově testu bez metabolické aktivace
genotoxické účinky u šťáv vytvořených ze syrové brukvovité zeleniny a to
v následujícím pořadí:
růžičková kapusta > zelí bílé 72
> květák > zelí červené >
kedluben > brokolice > tuřín > černá ředkev. V experimentech se savčími buňkami šest druhů šťáv vyvolávalo aberace chromozomů (Kassie et al., 1996).
ITC vytvořené z indolových glukosinolátů jsou nestabilní a spontánně se rozkládají
na I3C, 3-ICN, thiokyanátové ionty a 3,3´-diindolylmethan. I3C může spontánně
kondenzovat v kyselém prostředí v žaludku za tvorby sloučenin blízkých struktuře, toxicitě a karcinogenitě 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxinu (TCDD či dioxin). Navzdory této toxicitě
je indol-3-karbinol vědci zkoumán pro jeho potencionální
chemopreventivní vlastnosti (Fahey et al., 2001).
Ze studií vyplývá, že konzumace glukosinolátů a produktů jejich hydrolýzy může
prokazovat toxické účinky, nicméně v pokusech na lidských dobrovolnících tyto účinky
prokázány nebyly a navíc v pokusech na zvířatech testované dávky mnohokrát překračují hodnoty běžně konzumované u člověka (Rambousková, 2002).
73
1.4 Výběr mutagenů Jako modelové mutageny byly vybrány dvě látky. Nepřímý mutagen, vyžadující
metabolickou aktivaci v organismu - 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-chinolin
(IQ) a přímý mutagen - N-nitroso-N-methylurea (MNU). Obě tyto sloučeniny, jak IQ ze
skupiny heterocyklických aminů, tak MNU patřící do skupiny N-nitrososloučenin vznikají během tepelného zpracování typické tzv. západní stravy s vysokým obsahem červeného masa a živočišného tuku.
1.4.1 Heterocyklické aminy
IQ patří do skupiny heterocyklických aminů (HA), které vznikají v průběhu tepelné
úpravy pokrmů s vysokým obsahem živočišné bílkoviny na základě reakcí
aminokyselin, kreatinu a sacharidů. HA jsou obsaženy v povrchových vrstvách pokrmu, podobně jako polycyklické aromatické uhlovodíky, ale také v parách ovzduší, ve kterém
se pokrm připravuje, což zvyšuje celkový mutagenní potenciál (Turek et al., 1994).
Současně jsou obsaženy i v cigaretovém kouři, takže u kuřáků se jejich příjem zvyšuje (Stratil a Kubáň, 2005).
Dle Stratila a Kubáně (2005) a Sugimury (2000) lze rozdělit HA do dvou skupin: 1. imidazochinoliny (IQ deriváty) – aminoimidazolové deriváty
► aminoimidazol vzniká z kreatinu, zbývající části (chinolin, chinoxalin a
fenylpyridin) vznikají jako produkty Millardovy reakce aminokyselin a cukrů.
2. aminokarbonové deriváty – pyrolyzáty aminokyselin (kys. glutamová, tryptofan) ► vznikají pyrolýzou aminokyselin a proteinů
► jsou produkovány za vyšších teplot než IQ deriváty Vzhledem k tomu, že HA patří mezi tzv. promutageny, jejich mutagenní účinek se
může projevit až po metabolické přeměně (Turek et al., 1994; Schut a Snyderwine, 1999). Tato přeměna je zajištěna prostaglandin H syntázou a biotransfomací přes
systém monooxigenačních enzymů závislých na cytochromu P450 CYP1A2. Touto cestou vzniká hydroxylaminový derivát, který je vysoce reaktivní a může vytvářet DNA
addukty. Další krok pak zvyšuje možnost vázat se na nukleové kyseliny či proteiny.
Konečným reaktivním produktem je pravděpodobně vysoce elektrofilní nitreniový iont
74
(Turek et al., 1994; Schut a Snyderwine, 1999; Goldman a Shields, 2003; Stratil a
Kubáň, 2005).
HA vykazují u hlodavců genotoxické, mutagenní i karcinogenní účinky. Vyvolávají
u nich především nádory mléčné žlázy, tlustého střeva a prostaty (Sugimura, 2002).
Nejsilnějšími mutageny z HA jsou 2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]chinoxalin
(MeIQ),
2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-chinolin
(IQ)
a
2-amino-3,4,8-
trimethylimidazo [4,5-f]chinoxalin (DiMeIQx). Vytvářejí se při pečení ryb a hovězího masa a vzniká zhruba 1 – 3 ng.g-1 pyrolyzátu. Jejich mutagenní působení je 17 – 100 x větší než u Aflatoxinu B1.
Příjem HA u člověka závisí na stravovacích zvyklostech a úpravě pokrmu.
Průměrný denní příjem se může v ekonomicky vyspělých zemích pohybovat od 0,5 – 5 µg na osobu. Bezpečné množství pro člověka vypočtené z pokusů na zvířatech činí asi
15 ng.kg-1.den-1, to znamená pro 70 kg muže zhruba 1,1 µg na den, což odpovídá
hladině rizika 1 nádor na milion obyvatel. Nicméně TD50 (dávka vyvolávající nádory u 50 % pokusných zvířat) se pohybuje okolo 8 mg.kg-1 a nelze tedy předpokládat výrazný
vliv na incidenci nádorů u člověka (Turek et al., 1994; Stratil a Kubáň, 2005). Pokud však přijímáme současně více HA, riziko vzniku nádoru se zvyšuje. Navíc příjem u jednotlivců oproti průměrné hodnotě může být vyšší a riziko se tím také zvyšuje.
Ovoce a zelenina i z těchto surovin vyrobené produkty jsou schopné blokovat účinek
HA. Na tomto efektu se podílí řada mikronutrientů - kyselina askorbová, β-karoten, polyfenolické látky, chlorofyl, peroxidáza. Zároveň se mohou HA adsorbovat na současně přijímanou vlákninu. Tyto látky působí jako antioxidanty nebo ovlivňují enzymatické pochody během procesu detoxikace (Turek et al., 1994).
1.4.2 Nitrososloučeniny
Nitrososloučeniny představují velkou skupinu chemických sloučenin přítomných
v mnoha složkách životního prostředí (Stephanou et al., 1996). Vykazují genotoxické účinky s karcinogenním potenciálem (Turek et al., 1994).
Mohou vznikat z různých organických sloučenin působením nitrosačních činidel
(dusitany, dusičnany jako aditiva při technologickém zpracování či dusičnany jako kontaminanty nebo sušením potravin v kouři s obsahem oxidů dusíku) (Velíšek, 2002). Všechny
Nejběžnějšími
nitrososloučeniny
obsahují
nitrososloučeninami
v molekule
nitrososkupinu
jsou N-nitrososloučeniny. Ty
-
N═O.
zahrnují
N-
nitrosaminy a N-nitrosamidy. Kromě N-nitrososloučenin vznikají v potravinách také S-, 75
O- a C-nitrososloučeniny. Reakcí dusitanů se sulfhydrylovou skupinou volného cysteinu a cysteinu vázaného v bílkovinách vzniká např. mutagenní S-nitrosocystein (Velíšek, 2002).
N-nitrosaminy vznikají nitrosací sekundárních aminů. Aminosloučeniny, prekurzory
nitrosaminů, obsahující sekundární aminoskupinu jsou běžnými složkami potravin (aminokyseliny,
aminocukry,
vitaminy
apod.).
Sekundární
aminy
vznikají
dekarboxylací katalyzovanou enzymy a termickým rozkladem při teplotách nad 180 oC. Sekundární aminy představují také produkty Maillardovy reakce. Nitrosační činidla
nezbytná pro tvorbu nitrosaminů ze sekundárních aminů vznikají v kyselém prostředí z kyseliny dusité, resp. z dusitanů přítomných v potravinách jako aditiva či
kontaminanty. Nitrosační reakce může být v přítomnosti jiných látek katalyzována (thiokyanátové a halidové anionty) či naopak inhibována (kyselina askorbová a tokoferoly) (Velíšek, 2002). N-nitrosaminy
vykazují
mutagenní,
teratogenní
a
karcinogenní
účinky.
Karcinogenní účinky byly prokázány u řady živočichů na různých orgánech. Byla také prokázán synergický efekt při podávání N-nitrosaminů s jinými karcinogenními látkami (Velíšek, 2002).
Nitrosamidy jsou přímé mutageny nevyžadující metabolickou aktivaci a mohou tak
působit přímo na sliznici žaludku a iniciovat proces karcinogeneze (Luthy et al., 1984; Thorgeirsson et al., 1994; Turek et al., 1994).
Mezi známé představitele N-nitrososloučenin patří i silný mutagen N-nitroso-N-
methylurea (MNU) (Stephanou et al., 1996). Jedná se o přímý mutagen, způsobující
nádory mléčné žlázy u potkanů, převážně estrogen-dependentní adenokarcinomy (Kang
et al., 2001).
Zelenina, čaj a sója blokují tvorbu N-nitrososloučenin a jsou tak spojovány
s ochranou proti vzniku kolorektálního karcinomu (Hughes et al., 2002). Dle Turka et al. (1994) mohou nitrosaci inhibovat např. kys. askorbová, tokoferoly, polyfenoly a
další látky. Tvorbu
nitrososloučenin
v potravinách
lze
úspěšně
regulovat
snižováním
koncentrací přidávaných dusitanů, sušením potravin nepřímým ohřevem či využíváním
látek inhibujících nitrosaci a zvolením vhodných technologických postupů. Obsah nitrosaminů je v potravinách s ohledem na jejich toxicitu regulován a jsou stanovena nejvyšší přípustná množství celkových i jednotlivých nitrosaminů (Velíšek, 2002). 76
2 Cíle práce
Cílem práce je posouzení antimutagenního potenciálu sulforafanu a indol-3-
karbinolu a následně brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem ve vztahu k modelovým mutagenům.
Součástí výzkumu je zavedení nového krátkodobého testu mutagenity a
chemiluminiscenčního testu v laboratoři Ústavu preventivního lékařství Lékařské fakulty Masarykovy univerzity.
2.1 Dílčí úkoly 1. Sledovat inhibici klastogenního účinku modelových mutagenů pomocí aktivních látek obsažených v brokolici (indol-3-karbinol, sulforafan)
2. Vliv vybraných aktivních látek obsažených v brokolici na počty
imunokompetentních krevních buněk a na fagocytární aktivitu leukocytů
3. Sledovat antimutagenní aktivitu brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem 4. Zavedení krátkodobého testu mutagenity „Mikronukleus test in vivo“ v laboratoři ÚPL LF MU
5. Zavedení chemiluminiscenčního testu (chemiluminometrické měření fagocytární aktivity myších leukocytů) v laboratoři ÚPL LF MU
77
3 Materiál a metody 3.1 Mikronukleus test in vivo Stanovení frekvence mikrojader v polychromatických erytrocytech kostní dřeně je
metoda navržená primárně pro detekci chemikálií s klastogenním účinkem. Mikrojádra
vznikají buď v důsledku chromozomových zlomů (pak jsou tvořeny acentrickým
fragmentem chromozomu) nebo poruchou dělícího vřeténka (mikrojádro je pak tvořeno celým chromozomem). Když se erytroblasty vyvinou do erytrocytů, hlavní jádro je
z buňky vyloučeno a v cytoplasmě může zůstat mikrojádro. Vizualizace mikrojádra je v těchto buňkách díky chybění jádra usnadněna. Mikrojádra se tvoří i za normálních podmínek.
Metoda je založena na detekci zvýšeného počtu mikrojader v polychromatických
erytrocytech kostní dřeně. Testované substance jsou podávány subakutně malým
savcům a účinek je hodnocen v nátěrech z kostní dřeně. Tato metoda vyvinuta Schmidem v roce 1975 je ve srovnání s analýzou chromozomů ve stejném materiálu daleko jednodušší a rychlejší, niko-li však na úkor přesnosti (Schmid, 1975).
Mikrojádra jsou malé částice acentrických či celých chromozomů, které se opozdily
při anafázi buněčného dělení. Po telofázi nepoškozené chromozomy a také centrické
fragmenty způsobí vznik dceřiného jádra. Opožděné elementy jsou také začleněny do dceřiných buněk, ale značná část je přeměněna do jednoho či několika druhotných
jader, která jsou mnohem menší, než hlavní základní jádro a proto jsou nazývána mikrojádra. V nátěrech z kostní dřeně ze savců, kterým byla aplikována látka
způsobující chromozomální zlomy, jsou mikrojádra nalézána v mnoha typech buněk.
Mikrojádra mohou být nalézána např. v myeloblastech, myelocytech či erytroblastech. Analýza je omezena na mladší erytrocyty, kde je přítomna většina mikrojader a jsou zde dobře rozpoznatelná. Několik hodin po ukončení poslední mitózy erytroblasty vyloučí
z dosud neznámých příčin svoje jádra, ale mikrojádra zůstávají v cytoplasmě mladých
erytrocytů a tím jsou snadno rozpoznatelná. Další výhodou mikronukleus testu je, že mladé erytrocyty se obarví rozdílně oproti starším erytrocytům. V době dospívání,
trvající přibližně 24 hodin, nezůstávají červené, nýbrž namodralé – polychromatické
(mnohobarevné). Pokud je počítání mikrojader omezeno pouze na uvedený typ buněk,
78
pak je známo, že anomálie vznikají nejvíce během období bezprostředně předcházející dělení a pod vlivem časově limitovaného účinku mutagenu. Mikrojádra
v polychromatických
erytrocytech
jsou
elementy,
které
jsou
v hematologii dlouho známá jako Howell-Jolly tělíska. Mikrojádra jsou běžně kulatého tvaru s velikostí okolo 1/20 - 1/5 průměru polychromatického erytrocytu. Většinou buňka obsahuje pouze jedno mikrojádro, a to i po vysokých dávkách mutagenů. Existují také buňky, které obsahují dvě i více mikrojader. Některá mohou mít i ledvinovitý tvar. Mikrojádra
se
vyskytují
běžně a
to v rozsahu 3
mikrojader
na tisíc
polychromatických erytrocytů. Mikronukleus test reaguje pozitivně již na velmi nízké
dávky standardních mutagenů vyvolávajících chromozomální zlomy. Jediná věc, kterou nelze v testu prokázat, je přesný původ narušeného jádra, který vedl k pozitivním výsledkům.
3.1.1 Roztoky, činidla a média
Fetální bovinní sérum (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, ČR) – používáno k inkubaci
kostní dřeně, uchováváno při teplotě – 20 oC. Před pokusem
inkubováno na teplotu 37oC
May-Grünwald (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, ČR) – používán pro barvení
nátěrů
Giemsa Romanowski (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, ČR) – používán pro
Methanol (Lachema a.s., Brno, ČR) – používán k očištění sklíček
barvení nátěrů
Brokolicová šťáva ošetřená vysokým tlakem (VÚPP, Praha, ČR) – testovaná
látka, příprava viz kapitola 3.2.1.2.1
D,L-Sulforafan (MP Biomedicals, LLC, Ohio, USA) – testovaná substance.
Biologicky aktivní látka bohatě zastoupená v brukvovité zelenině. Vykazuje antimutagenní účinky
Indol-3-karbinol (I3C) (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, ČR) – testovaná
substance. Biologicky aktivní látka obsažená v brukvovité zelenině. Vykazuje antimutagenní účinky
2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-chinolin (IQ) (MP Biomedicals, LLC,
Ohio, USA) – nepřímý mutagen ze skupiny heterocyklických aminů, pozitivní kontrola
79
N-nitroso-N-methylurea (MNU) (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, ČR) – přímý
Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, ČR) – používán pro
mutagen ze skupiny N-nitrososloučenin, pozitivní kontrola ředění a rozpouštění mutagenů a testovaných substancí
3.1.2 Uspořádání pokusů
V experimentech byly použiti samci BALB/C inbredních myší (Chovné a
dodavatelské zařízení LF MU), o průměrné hmotnosti 18 – 20 gramů a stáří 7 - 10
týdnů. K dosažení dobré kvality preparátů jsou mladá zvířata vhodnější, neboť tuková tkáň kostní dřeně má u starších zvířat nežádoucí účinky na nátěru. U velmi mladých
zvířat je počet polychromatických erytrocytů vyšší, odrážející tak vyšší tělesný obrat. Rozdíly mezi pohlavím nebyly pozorovány, přesto je doporučeno použít jak samce tak samice. V našem pokusu jsme zvolili vzhledem k technickým možnostem pouze samce, a to i po konzultaci s jinými pracovišti v ČR. Zvířata byla randomizovaně rozdělena do skupin po 5 - 8 subjektech a byla ustájena ve standardních polypropylenových klecích
(šířka 20,5 cm, délka 36 cm, výška 15,5 cm, plocha podlážky 783 cm2) (Velaz, Praha, ČR) (viz obr. 17.). Zvířata byla udržována za standardních laboratorních podmínek při 12ti hodinovém cyklu světlo/tma, při teplotě 22 ± 2 oC. Zvířata byla krmena kompletní
laboratorní směsí pro laboratorní myši a potkany v SPF chovech, voda byla podávána
ad libitum. Zvířata byla jeden týden před experimentem ponechána v klidu pro aklimatizaci.
80
Obr. 17. Ustájení myší ve standardních polypropylenových klecích Vybraným pokusným skupinám byly perorálně aplikovány vybrané testované látky
dle jednotlivých pokusů, vždy 1 x denně, ráno v 9 hodin. 3.1.2.1 Experiment č. 1
Antimutagenní účinek sulforafanu a jeho vliv na imunitní odpověď u myší V prvním pokusu jsme sledovali antimutagenní vlastnosti sulforafanu. Jedná se o
isothiokyanát, který se uvolňuje hydrolýzou glukorafaninu (4-methylsulfinylbutyl). V pokusu jsme použili jeho DL formu, neboť doposud není zcela jasné, která z forem se vyskytuje přirozeně v brukvovité zelenině, pravděpodobně však L-sulforafan.
Antimutagenní aktivitu jsme posuzovali vůči nepřímému mutagenu - 2-amino-3-
methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-chinolinu (IQ) (náležejícího do skupiny heterocyklických aminů), v druhé etapě vůči přímému mutagenu ze skupiny N-nitrososloučenin - N-
nitroso-N-methylurey (MNU). Dávky mutagenů byly zvolené jednak dle zkušeností
pracoviště Oddělení obecné biologie a genetiky, 3.LF UK Praha a jednak také pro porovnání dosažených výsledků s výsledky jejich studií (Bárta et al., 2003).
81
Aplikace testovaných substancí 8.
Zvířata byla rozdělena do 6 skupin po 5 myších, dle schématu znázorněného v tab.
Tab. 8. Schéma aplikace testovaných substancí v 1. pokusu Skupina I.
Aplikace testovaných substancí
Sulforafan
II.
Sulforafan + IQ
III.
Sulforafan + MNU
V.
MNU
IV. VI.
Období aplikace
Dávka (množství)
3 dny
3 µmol (0,53 mg)
3 dny + MNU poslední den
3 µmol + MNU 50 mg.kg-1
3 dny + IQ poslední den
IQ
poslední den
7% DMSO
poslední den
poslední den
3 µmol + IQ 20 mg.kg-1
20 mg.kg-1
50 mg.kg-1
0,1 ml.10 g-1
Všechny skupiny byly krmeny kompletní laboratorní směsí pro laboratorní myši a
potkany v SPF chovech, voda byla podávána ad libitum. Sulforafan byl aplikován per
os sondou v dávce 3 µmol (což odpovídá 0,53 mg) na myš po dobu 3 dnů I., II. a III.
skupině.
Třetí den byl hodinu po podání sulforafanu II. skupině aplikován jednorázově
mutagen IQ v dávce 20 mg.kg-1 živé hmotnosti. Ve stejný čas byl IQ rovněž aplikován IV. skupině, která představovala pozitivní kontrolu a.
III. skupině byl třetí den hodinu po podání sulforafanu aplikován mutagen MNU. V.
skupině, pozitivní kontrole b, byl rovněž ve stejný čas podán mutagen MNU v dávce 50 mg.kg1 živé hmotnosti.
VI. skupině (negativní kontrole) byl perorálně aplikován 7 % DMSO, který byl
používán pro rozpouštění všech substancí.
Všechny látky byly aplikovány v objemu 0,1 ml.10 g-1 hmotnosti myši. 3.1.2.2 Experiment č. 2
Antimutagenní účinek indol-3-karbinolu a jeho vliv na imunitní odpověď u myší V druhém pokusu jsme hodnotili antimutagenní aktivitu indol-3-karbinolu vůči
vybraným mutagenům – IQ a MNU.
82
Z důvodu aplikace rozdílných dávek indol-3-karbinolu byl pokus rozdělen do dvou
etap.
1. etapa 2. etapa
I3C 250 mg.kg-1
I3C 125 mg.kg-1
1. etapa
Aplikace testovaných substancí
Testovaná zvířata byla rozdělena do 6 skupin po 7 myších. Schéma aplikace je
zobrazeno v tab. 9. Všechny skupiny byly krmeny kompletní laboratorní směsí pro laboratorní myši a potkany v SPF chovech, voda byla podávána ad libitum.
I3C byl podáván po dobu 3 dnů, per os sondou, v dávce 250 mg.kg-1, I., II. a III.
skupině. Třetí den, hodinu po aplikaci I3C byl II. skupině aplikován mutagen IQ
v dávce 20 mg.kg-1. Ve stejný čas byla provedena administrace IQ ve stejné dávce také
IV.skupině, pozitivní kontrole a. Třetí den byl rovněž hodinu po aplikaci I3C III. skupině podán mutagen MNU v dávce 50 mg.kg-1. V. skupině, pozitivní kontrole b, byl rovněž aplikován mutagen MNU ve stejné dávce.
Tab. 9. Schéma aplikace testovaných substancí v 1. etapě 2. pokusu Skupina I.
II.
Aplikace testovaných substancí I3C
I3C + IQ
Období aplikace
Dávka (množství)
3 dny
250 mg.kg-1
250 mg.kg-1 + MNU 50 mg.kg-1
3 dny + IQ poslední den
III.
I3C + MNU
3 dny + MNU poslední den
V.
MNU
poslední den
IV. VI.
IQ
7% DMSO
poslední den
poslední den
250 mg.kg-1 + IQ 20 mg.kg-1
20 mg.kg-1
50 mg.kg-1
0,1 ml.10 g-1
VI. skupině, negativní kontrole, byl třetí den aplikován 7 % DMSO, který byl
používán pro rozpouštění všech substancí. Všechny látky byly aplikovány v objemu 0,1 ml.10 g-1 hmotnosti myši.
83
2. etapa
Aplikace testovaných substancí
Testovaná zvířata byla opět rozdělena do 6 skupin po 7 myších. Schéma aplikace je
zobrazeno v tab. 10. Všechny skupiny byly krmeny kompletní laboratorní směsí pro laboratorní myši a potkany v SPF chovech, voda byla podávána ad libitum. Tab. 10. Schéma aplikace testovaných substancí v 2. etapě 2. pokusu Skupina I.
II.
Aplikace testovaných substancí I3C
I3C + IQ
Období aplikace
Dávka (množství)
3 dny
125 mg.kg-1
125 mg.kg-1 + MNU 50 mg.kg-1
3 dny + IQ poslední den
III.
I3C + MNU
3 dny + MNU poslední den
V.
MNU
poslední den
IV. VI.
IQ
7% DMSO
poslední den
poslední den
125 mg.kg-1 + IQ 20 mg.kg-1
20 mg.kg-1
50 mg.kg-1
0,1 ml.10 g-1
I3C byl podáván I., II. a III.skupině po dobu 3 dnů, per os sondou, v dávce 125
mg.kg-1. Třetí den, hodinu po administraci I3C byl II. skupině aplikován mutagen IQ
v dávce 20 mg.kg-1. Ve stejný čas byl podán IQ ve stejné dávce také IV.skupině,
pozitivní kontrole a. Třetí den byl rovněž hodinu po aplikaci I3C, III. skupině, podán mutagen MNU v dávce 50 mg.kg-1. V. skupině, pozitivní kontrole b, byl rovněž aplikován mutagen MNU ve stejné dávce.
VI. skupině, negativní kontrole, byl třetí den aplikován 7 % DMSO, který byl
používán pro rozpouštění všech substancí.
Všechny látky byly aplikovány v objemu 0,1 ml.10 g-1 hmotnosti myši. 3.1.2.3 Experiment č. 3
Antimutagenní aktivita brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem Třetí pokus byl z důvody aplikace dvou mutagenů rozdělen do dvou etap. V 1. etapě
jsme hodnotili antimutagenní aktivitu brokolicové šťávy vůči nepřímému mutagenu IQ, v 2. etapě vůči přímému mutagenu MNU.
84
Příprava brokolicové šťávy pro testování antimutagenních účinků (VÚPP, Praha, ČR)
Brokolice byla zakoupena z maloobchodní sítě. Brokolice byla očištěna, omyta a
porcována. Šťáva byla získána vylisováním na odšťavňovači Green power (USA). Po vylisování byla šťáva ponechána po dobu 100 minut v klidu. Mechanickým rozrušením dochází ke kontaktu enzymu myrosinázy a
inaktivních glukosinolátů za tvorby
biologicky účinných isothiokyanátů, konkrétně sulforafanu. Po odstátí byla šťáva
přecezena přes hrubé síto (otvory v průměru 0,5 mm). Poté byla šťáva naplněna do PET lahví 1,5 l a ošetřena tlakem 250 MPa po dobu 2 minut za účelem odstranění vzduchu. Následně byla šťáva okyselena na pH 4 (kyselinou citrónovou) a naplněna do lahviček
PET 100 ml. Naplněné lahvičky byly podrobeny ve vysokotlakém lisu CYX 6/0103 (ČR – ŽĎAS A.S.) tlaku 500 MPa po dobu 10 minut. Brokolicová šťáva měla před ošetřením teplotu 21 oC, počáteční teplota v komoře byla 10 oC, teplota po odtlakování 12 oC (teplota místnosti 17 oC). Po označení štítkem byly vzorky uloženy do chladničky
a 5. den přepraveny v termoboxu do laboratoře k dalšímu testování, kde byly uloženy v chladnici při teplotě 4 - 6 oC. 1.etapa
V pokusu č. 3, v 1. etapě jsme hodnotili účinek brokolicové šťávy ošetřené vysokým
tlakem na inhibici mutagenity IQ. Aplikace testovaných substancí
Zvířata byla rozdělena do 4 skupin po 8 myších. Všechny skupiny byly krmeny
kompletní laboratorní směsí pro laboratorní myši a potkany v SPF chovech, voda byla podávána ad libitum. Schéma aplikace testovaných substancí je zobrazeno v tab. 11. Tab. 11. Schéma aplikace testovaných substancí v 1. etapě 3. pokusu Skupina
Aplikace testovaných substancí
I.
Brokolicová šťáva + IQ
II.
Brokolicová šťáva
III.
IV.
Období aplikace
14 dní
0,2 ml.10g-1
14 dní
0,2 ml.10g-1
IQ – poslední den
IQ
poslední den
7 % DMSO
poslední den
85
Dávka (množství)
+ IQ 20 mg.kg-1 50 mg.kg-1
0,2 ml.10g-1
Brokolicová šťáva byla aplikována per os sondou po dobu 14 dnů v množství 0,2
ml.10 g-1 hmotnosti myši, každé ráno v 9 hodin, I. a II. skupině.
Čtrnáctý den byl I. skupině jednu hodinu po aplikaci brokolicové šťávy podán
jednorázově, mutagen IQ v dávce 20 mg.kg-1 živé hmotnosti. Ve stejný čas byla totožná dávka mutagenu aplikována i III. skupině, sloužící jako pozitivní kontrola.
IV. skupině byl čtrnáctý den podán 7 % DMSO. Tato skupina sloužila jako
negativní kontrola. 7 % DMSO byl také používán pro rozpouštění mutagenu.
Všechny látky byly aplikovány v množství 0,2 ml.10 g-1 hmotnosti myši a nikdy
nepřesáhlo celkový objem 0,5 ml.
V první skupině došlo po dvanácti dnech aplikace brokolicové šťávy z neznámých
příčin k úhynu jednoho zvířete. 2. etapa
V pokusu č. 3, ve 2. etapě jsme hodnotili účinek brokolicové šťávy ošetřené
vysokým tlakem na inhibici mutagenity MNU. Příprava brokolicové šťávy byla stejná jako v 1. etapě pokusu.
Aplikace testovaných substancí
Zvířata byla rozdělena do 4 skupin po 8 myších, s následujícím schématem aplikace
testovaných substancí (viz tab. 12.).
Tab. 12. Schéma aplikace testovaných substancí v 2. etapě 3. pokusu Skupina
Aplikace testovaných substancí
I.
Brokolicová šťáva + MNU
II.
Brokolicová šťáva
III.
IV.
Období aplikace
14 dní
0,2 ml.10g-1
14 dní
0,2 ml.10g-1
MNU – poslední den
MNU
poslední den
7 % DMSO
Dávka (množství)
poslední den
+ MNU 50 mg.kg-1 50 mg.kg-1
0,2 ml.10g-1
Všechny skupiny byly krmeny kompletní laboratorní směsí pro laboratorní myši a
potkany v SPF chovech, voda byla podávána ad libitum. Brokolicová šťáva byla
aplikována per os sondou po dobu 14 dnů v množství 0,2 ml.10 g-1 hmotnosti myši,
každé ráno v 9 hodin, I. a II. skupině.
86
Čtrnáctý den byl I. skupině jednu hodinu po aplikaci brokolicové šťávy podán
jednorázově mutagen MNU v dávce 50 mg.kg-1 živé hmotnosti. Ve stejný čas byla
totožná dávka mutagenu aplikována i III. skupině, sloužící jako pozitivní kontrola.
IV. skupině, negativní kontrole byl čtrnáctý den podán 7 % DMSO. 7 % DMSO byl
opět používán i pro rozpouštění mutagenu.
Všechny látky byly aplikovány v množství 0,2 ml.10 g-1 hmotnosti myši a nikdy
nepřesáhlo celkový objem 0,5 ml.
3.1.3 Zpracování a statistické vyhodnocení dat
24 hodin po aplikaci poslední dávky byl každý subjekt usmrcen v celkové éterové
anestézii. Následně byly extrahovány oba femury. Kosti byly očištěny gázou od svaloviny. Proximální konce femuru byly opatrně ustřiženy nůžkami až do otevření kanálku s kostní dření. Za pomocí jehly přiměřené velikosti bylo ze zkumavky
obsahující 2 ml bovinního séra inkubovaného v termostatu při teplotě 37 ºC nasáto 0,2 ml séra do jednorázové injekční stříkačky. Poté byla jehla vložena do proximální části
kanálku, který je stále uzavřen u distálního konce. Pak byla kostní dřen opakovaným nasáváním a vysáváním séra vypláchnuta z kanálku femuru. To celé se opakovalo na
distálním konci femuru. Kostní dřeň by měla být v séru v podobě jemné suspenze, niko-li větších částí. Následně byly zkumavky s výplachy kostní dřeně centrifugovány
při 1000 ot.min-1 po dobu 5 minut. Po centrifugaci byl supernatant jemně odsát. Sediment s krevními buňkami byl opatrně promíchán na třepačce, tak aby ho bylo
možné nasát do Pasteurovy pipety. Na konec podložního sklíčka byla pipetou nanesena
malá kapka sedimentu. Rychlým tahem krycího sklíčka, pod úhlem 45o, byl supernatant opatrně rozetřen. Velikost kapky je taková, aby byl veškerý materiál rozetřen asi do 2/3 sklíčka. Pro snadné odečítání polychromatických erytrocytů
je nutno provést co
nejtenčí vrstvu nátěru. Pokud by byla vrstva silnější, erytrocyty se budou překrývat a pod mikroskopem bychom nerozlišili jednotlivé buňky.
Od každého testovaného zvířete byly provedeny tři preparáty. Pro hodnocení byly
použity dva a hodnotilo se 500 buněk od každého, celkem tedy 1000 polychromatických erytrocytů.
Po 24 hodinách byly nátěry obarveny, neboť nejlepší výsledky jsou získávány,
pokud jsou preparáty jeden den volně sušeny na vzduchu. Preparáty byly barveny ve
standardních nádobách na barvení. Nejprve byly preparáty barveny v nádobách
roztokem May-Grünwald po dobu 3 minut, poté byly přeloženy do nádoby s roztokem 87
May-Grünwald a destilovanou vodou v poměru 1:1 po dobu 2 minut. Následně byly
preparáty vloženy do nádoby s roztokem Giemsa Romanovski s destilovanou vodou v poměru 1:10 a to po dobu 10 minut. Nakonec byly z preparátů velmi důkladně
opláchnuty zbytky barviva malým proudem pitné vody. Po oschnutí preparátů byla spodní strana sklíček očištěna methanolem.
Obarvené preparáty byly následně hodnoceny ve světelném mikroskopu (Docuval,
Firma Carl Zeiss Jena) pomocí imerze při zvětšení 1000x. Při odečítání jsme nejdříve lokalizovali oblast rovnoměrně rozmístěných, nepoškozených a dobře rozpoznatelných
polychromatických erytrocytů při středním zvětšení. Tyto oblasti obvykle nalézáme u konců nátěru.
Na dobře obarvených preparátech jsou zralé erytrocyty (anulocyty) jasně červené až
červenofialové, zatímco modrofialové
nezralé polychromatické erytrocyty jsou bledě modré,
až šedé buňky. Typická mikrojádra se pak vyskytují v erytrocytech
nejčastěji jednotlivě, mají kulatý či ledvinovitý tvar o velikosti 1/20 až 1/5 průměru erytrocytu.
Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí statistického programu Statistika 7
a za pomoci neparametrického Mann-Whitney U testu.
88
3.2 Chemiluminometrické měření fagocytární aktivity myších leukocytů Fagocytóza, nebo-li pohlcování korpuskulárních částic, která byla objevena v roce
1882 Mečnikovem, umožňuje u nízkých fylogenetických organismů výživu. Tento stejný děj se u vyšších organismů specializuje pomocí tzv. „profesionálních fagocytů“ – buněk
monocyto-makrofágového
systému
a
buněk
polymorfonukleárních
na
odstraňování cizorodých struktur antigenů zevního i vnitřního prostředí (Šterzl, 1993).
Během fagocytózy cizorodého materiálu dochází k aktivaci fagocytujících buněk,
tzv. respiračnímu vzplanutí. Jde o řadu biochemických reakcí, při nichž jsou produkovány molekuly s vysokou baktericidní schopností (O2, H2O2, OH). Vznik produktů nebo meziproduktů takových oxidačních reakcí v elektronově excitovaném
stavu je provázen vyzařováním energie ve formě světelných kvant => vznik viditelného světla. Tento jev se nazývá chemiluminiscence.
Množství světla emitovaného během respiračního vzplanutí je relativně nízké, tzv.
„nativní chemiluminiscence“. Lze ji potencovat přidáním jiných sloučenin, např. luminolu. Přidání standardizovaných částic (např. zymosanu) umožní lépe hodnotit míru
metabolických pochodů v průběhu fagocytózy a chemiluminiscenci kvantifikovat. Chemiluminometrické stanovení fagocytární aktivity leukocytů je jednou z rutinně užívaných laboratorních technik klinické imunologie.
3.2.1 Roztoky, činidla a média
Hanksův solný roztok (HSR) – byl použit k ředění krevních vzorků, pro přípravu
opsonizovaného zymosanu a k chemiluminiscenčnímu měření.
Luminol – hydrazit kyseliny 3-aminoftalové (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, Česká
Republika) v borátovém pufru (pH 9.0), koncentrace 1,7 mg.ml-1, uchováván při
teplotě – 20 oC.
Zymosan (Sigma-Aldrich, s.r.o, Praha, Česká Republika) suspendovaný v HSR na koncentraci 20 mg.ml-1 a vařený 20 minut. Suspenze byla následovně
centrifugována 10 minut při 2000 otáčkách a dvakrát proprána v HSR. Sediment byl resuspendován v myším séru na koncentraci 20 mg.ml-1 a inkubován 45
minut za mírného protřepávání
při teplotě 37 oC. Po další centrifugaci a
89
promývání v HSR byl opsonizovaný zymosan v koncentraci uchováván při teplotě – 20 oC.
20 mg.ml-1
3.2.2 Uspořádání pokusů
Chemiluminometrické měření fagocytární aktivity myších leukocytů bylo provedeno
v prvním experimentu „Antimutagenní účinek sulforafanu a jeho vliv na imunitní
odpověď u myší“ a rovněž ve druhém experimentu „Antimutagenní účinek indol-3karbinolu a jeho vliv na imunitní odpověď u myší“.
Uspořádání pokusů je popsáno v kapitole 2.2.1 Mikronuklus test in vivo.
3.2.3 Zpracování a statistické vyhodnocení dat
24 hodin po aplikaci poslední dávky bylo každému subjektu v celkové éterové
anestezii odebráno 20 µl plné krve z plexus retrobulbaris, která byla ředěna v HSR.
Suspenzi 20 µl krve v 500 µl HSR jsme inkubovali při teplotě 37 oC. Reakci jsme
startovali přidáním 40 µl luminolu k 200 µl vzorku, po 5 minutovém měření pozadí jsme chemiluminiscenci stimulovali přidáním 40 µl opsonizovaného zymosanu. Vzorky
jsme měřili jednotlivě za sebou každou 5 minutu po dobu 1 hodiny při teplotě 37 oC na
přístroji Biolumat LB 9500C, Berthold Co., SRN (viz obr. 18.).
Obr. 18. Biolumat LB 9500C, Berthold Co., SRN 90
Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí Tukeyho testu (statistický balík
STATGRAPHICS 5.0) – „Multiple range test“, který zobrazuje vícenásobnou analýzu pro střední hodnotu s využitím „range“ testu a hodnotami „confidence level“, zadanými ve vstupním panelu procedury (Tukey, 1977).
91
3.3 Stanovení počtu leukocytů a diferenciálního krevního obrazu myší Celkový počet leukocytů.mm-3 byl stanoven za pomocí hematologického
analyzátoru MEK-5208K firmy Nihon Kohden (viz obr. 19.).
Pro měření bylo k 20 µl krve přidáno 10 ml unisolu (Lachema Brno, ČR) a 3 kapky
ekoglobinu (Hemax s.r.o.). Preparáty byly barveny podle Giemsa-Romanowski a krevní nátěry byly hodnoceny na mikroskopu Nikon Labophot 2a. Statistické vyhodnocení
Whitneyova nepárového testu.
bylo provedeno pomocí
neparametrického Mann-
Obr. 19. Hematologický analyzátor MEK-5208K firmy Nihon Kohden
3.3.1 Uspořádání pokusů
Celkový počet leukocytů a diferenciální krevní obraz byl stanoven u prvního
experimentu „Antimutagenní účinek sulforafanu a jeho vliv na imunitní odpověď u
myší“ a rovněž u druhého experimentu „Antimutagenní účinek indol-3-karbinolu a jeho
vliv na imunitní odpověď u myší“.
Podrobnější uspořádání pokusů je popsáno v kapitole 2.2.1 Mikronuklus test in vivo. 92
4 Výsledky
4.1 Hodnocení antimutagenního účinku sulforafanu a jeho vlivu na imunitní odpověď u myší Antimutagenní aktivita sulforafanu byla hodnocena mikronukleus testem in vivo.
Průměrné počty mikrojader na 1000 polychromatických erytrocytů
u jednotlivých
skupin jsou zobrazeny v tab. 13. Podávání sulforafanu v dávce 3 µmol na testované zvíře po dobu 3 dnů nevedlo ke statisticky významným rozdílům (p > 0,05) ve srovnání
se negativní kontrolou (sk. VI.), kdy byl aplikován 7 % DMSO. Tento výsledek naznačuje, že v dané dávce nevyvolává aplikace sulforafanu mutagenní změny v polychromatických erytrocytech kostní dřeně myší.
Aplikace sulforafanu v dávce 3 µmol na testované zvíře, po dobu 3 dnů v kombinaci
s mutageny (IQ 20 mg.kg-1 a MNU 50 mg.kg-1) inhibovala počty mikrojader u II. a III. skupiny ve srovnání s pozitivními kontrolami a i b (IV. sk. a V. sk.). Výsledky byly
statisticky signifikantní, na hladině významnosti p < 0,05.
Tab. 13. Počet mikrojader na 1000 polychromatických erytrocytů po aplikaci sulforafanu a vybraných mutagenů (IQ, MNU) Skupina Aplikované látky Sulforafan I. Sulforafan + IQ II. Sulforafan + MNU III. IQ IV. MNU V. 7 % DMSO VI.
MNPCE/1000 PCE
2,3,3,0,2
2,5,2,4,5
12,15,10,15,12 8,7,7,7,6
23,20,25,20,20 3,2,2,2,4
n 5 5 5 5
5
5
MNPCE – počet mikrojader v polychromatických erytrocytech PCE – polychromatické erytrocyty n – počet zvířat
SD – směrodatná odchylka
* p < 0,05 – signifikantně nižší počet mikrojader ve vztahu k IQ a MNU
** p < 0,05 – signifikantně vyšší počet mikrojader ve vztahu ke kontrole (7% DMSO)
93
Průměr ± SD 2,00 ± 1,23 3,60 ± 1,52*
12,80 ± 2,17* 7,00 ± 0,71**
21,60 ± 2,30** 2,60 ± 0,89
Rovněž byl nalezen statisticky signifikantní rozdíl mezi pozitivními kontrolami (IV.
a V. sk.) a negativní kontrolou (VI. sk.), který potvrzuje mutagenní účinky aplikovaných mutagenů.
Obr. 20. představuje krabicový graf, který vyjadřuje hodnotu mediánu, rozsah
hodnot (25 - 75 %) a odlehlé či extrémní hodnoty.
Dosažené výsledky v tomto experimentu prokazují supresivní úlohu sulforafanu na
účinek aplikovaných mutagenů.
7 % DMSO
MNU 50 mg/kg
IQ 20 mg/kg
S 3 µmol + MNU 50 mg/kg
M ed i án; B ox: 25%-75 %; Whi sker: Rozsa h neodl eh.
S 3 µmol + IQ 20 mg/kg
26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2
S 3 µmol
Počet mikrojader/1000 polychromatických erytrocytů
K rabi cový graf Su l forafan 3 µm ol
M e di án 25% -75% Rozsa h neodl e h. O dl ehl é E xtrém y
Obr. 20. Vliv sulforafanu na mutagenitu IQ a MNU v mikronukleus testu Výsledky chemiluminiscenčního testu jsou zobrazeny pro lepší přehlednost po
aplikaci mutagenů ve dvou grafech na obr. 21. a 22. Výsledky zobrazují průběh chemiluminiscenční křivky po dobu jedné hodiny a jsou vyjádřeny jako podíl chemiluminiscence na 1000 leukocytů.
Tyto výsledky naznačují, že aplikace samotného sulforafanu po dobu 3 dnů v dávce
3 µmol nevedla ke statisticky signifikantnímu rozdílu fagocytární aktivity myších leukocytů ve vztahu k negativní kontrole (7 % DMSO). 94
Aplikace sulforafanu v kombinaci s mutagenem IQ (20 mg.kg-1) nevykazovala
statisticky významný rozdíl fagocytární aktivity myších leukocytů ve vztahu k aplikaci samotného mutagenu IQ ve stejné dávce (viz obr. 21.). Aplikace sulforafanu v kombinaci
s mutagenem MNU (50 mg.kg-1) vedla ke
statisticky významnému zvýšení chemiluminiscenční křivky a tedy ke zvýšené tvorbě reaktivních forem kyslíku (ROS) (p < 0,05). (viz obr. 22.)
medián chemiluminiscence/1000 leu
Sulforafan + IQ 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
-10 -5
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 t (min)
Sulforafan
S + IQ
IQ
DMSO
Obr. 21. Chemiluminiscenční křivka myších leukocytů (Sulforafan 3 µmol + IQ)
medián chemiluminiscence/1000 leu
Sulforafan + MNU 12000 10000 8000 6000 4000 2000
0
-10 -5
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Sulforafan
t (min)
S + MNU
MNU
DMSO
Obr. 22. Chemiluminiscenční křivka myších leukocytů (Sulforafan 3 µmol + MNU)
95
Výsledky chemiluminiscenčního testu naznačují, že podávání sulforafanu po dobu 3
dnů nepůsobí imunostimulačně ani imunosupresivně. Dokonce v kombinaci s MNU
vede ke zvýšení fagocytární aktivity myších leukocytů. Sulforafan tedy pravděpodobně v kombinace s použitými mutageny nesnižuje oxidační poškození myších leukocytů a nebyl shledán účinným přímým antioxidantem, což je v souladu se současnými poznatky.
Výsledky celkového počtu leukocytů a krevního obrazu myší jsou znázorněny na
obr. 23. a 24.
počet leukocytů.mm-3
Celkový počet leukocytů 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
*
S
S + IQ
S + MNU
IQ
MNU
7 % DMSO
Aplikované látky
Obr.23. Celkový počet leukocytů (* p<0,05) Hodnoty počtu leukocytů u myší byly velmi variabilní a pohybovaly se v daném
průměru (10 tisíc.mm-3, 4 – 30 tisíc.mm-3). Statisticky významné zvýšení celkového počtu leukocytů bylo sledováno mezi II. skupinou, které byl aplikován sulforafan
v kombinaci s mutagenem IQ a aplikací samotného mutagenu IQ. Statisticky významné
snížení bylo patrné v podílu polymorfonukleárních leukocytů na celkovém počtu leukocytů mezi V. skupinou ve vztahu k VI. skupině. Tento výsledek je patrně dán supresivním účinkem mutagenu MNU na počet leukocytů.
96
Poměr lymfocytů a PMNL (% )
*
120 100 %
80
PMNL
60
Lymfocyty
40 20 0
S
S + IQ
S + MNU
IQ
Aplikované látky
MNU
7% DMSO
Obr. 24. Poměr lymfocytů a polymorfonukleárních leukocytů (PMNL) (* p<0,05) U ostatních skupin jsme nezaznamenali změny v celkovém počtu leukocytů, ani
v počtu fagocytujících polymorfonukleárních buněk (PMNL) a lymfocytů, jejichž poměr byl v rozmezí normy (lymfocyty 54 – 85 %).
97
4.2 Hodnocení antimutagenního účinku indol-3-karbinolu a jeho vlivu na imunitní odpověď u myší Výsledky druhého experimentu rozdělíme opět pro přehlednost do dvou etap. Výsledky 1.etapy
Výsledky mikronukleus testu in vivo jsou zobrazeny v tab. 14. a na obr. 25.
Třídenní administrace BALB/C myší indol-3-karbinolem v dávce 250 mg.kg-1
nevedla ke statisticky významným změnám ve vztahu k negativní kontrole (VI. sk.) a potvrzuje, že I3C v aplikované dávce nevyvolává u myší mutagenní poškození polychromatických erytrocytů kostní dřeně.
Tab. 14. Počet mikrojader na 1000 polychromatických erytrocytů po aplikaci I3C (250 mg.kg-1) a vybraných mutagenů (IQ, MNU) Skupina
I.
II.
III. IV. V.
VI.
Aplikované látky I3C 250 mg.kg-1 I3C+ IQ
I3C + MNU
MNPCE/1000 PCE
n
2,1,3,0,2,4,2
7 7
3,4,5,4,4,3,4
11,12,11,12,10,12,10
IQ
MNU
18,19,19,20,22,19,17
7 % DMSO
11,14 ± 0,90*
7
19,14 ± 1,57**
7
1,2,4,3,2,1,4
3,86 ± 0,69*
7 7
7,9,8,9,7,9,8
Průměr ± SD 2,00 ± 1,29
8,14 ± 0,90** 2,43 ± 1,27
MNPCE – počet mikrojader v polychromatických erytrocytech PCE – polychromatické erytrocyty n – počet zvířat
SD – směrodatná odchylka
* p < 0,05 – signifikantně nižší počet mikrojader ve vztahu k IQ a MNU
** p < 0,05 – signifikantně vyšší počet mikrojader ve vztahu ke kontrole (7% DMSO)
Třídenní aplikace I3C v dávce 250 mg.kg-1 v kombinaci s oběma mutageny (II. a III.
skupina)
statisticky
významně
(p
<
0,05)
redukovala
počty
mikrojader
v polychromatických erytrocytech ve vztahu k samotné aplikaci mutagenů IQ (IV. sk.) a MNU (V. sk.) v dávkách 20 mg.kg-1 a 50 mg.kg-1. 98
7 % DMSO
MNU 50 mg/kg
IQ 20 mg/kg
I3C 250 mg/kg + MNU 50 mg/kg
Medián; Box: 25%-75%; Whisker: Rozsah neodleh.
I3C 250 mg/kg + IQ 20 mg/kg
24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2
I3C 250 mg/kg
Počet mikrojader/1000 polychromatických erytrocytů
Krabicový graf I3C 250 mg/kg
Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy
Obr. 25. Vliv I3C (250 mg.kg-1) na mutagenitu IQ a MNU v mikronukleus testu Výsledky chemiluminiscenčního testu jsou pro přehlednost opět zobrazeny ve dvou
grafech, na obr. 26. a 27.
Třídenní aplikace indol-3-karbinolu v dávce 250 mg.kg-1 vedla ke statisticky
významnému snížení (p < 0,05) fagocytární aktivity myších leukocytů ve vztahu k negativní kontrole.
Aplikace IQ i jeho kombinace IQ a I3C nevedla ke statisticky významným změnám.
Naopak jednorázové podání přímého mutagenu MNU vedlo ke statisticky významné
stimulaci fagocytární aktivity myších leukocytů ve srovnání se samotnou aplikací I3C, niko-li však ve srovnání s negativní kontrolou (7 % DMSO).
Ve sledované skupině (I3C 250 mg.kg-1 + MNU 50 mg.kg-1) došlo ke statisticky
významnému snížení chemiluminiscence ve srovnání s jednorázovou administrací mutagenu (MNU). K podobnému rozdílu vedla i aplikace I3C v kombinaci s IQ vůči samotné aplikaci IQ, nicméně snížení chemiluminiscence nebylo statisticky významné.
Výsledky chemiluminiscenčního testu napovídají, že sice samotná aplikace
mutagenů zvyšuje fagocytární aktivitu myších leukocytů, která může být spojena se zvýšenou tvorbu ROS, nicméně aplikace I3C v kombinaci s mutageny jejich tvorbu 99
snižuje, což by odpovídalo i
snížení chemiluminiscence po samotné aplikaci I3C
v dávce 250mg.kg-1.
Tento výsledek může na jedné straně naznačovat zvýšenou obranu organismu, ale na
druhé straně zvýšené riziko poškození tkání.
-1
medián chemiluminiscence/1000 leu
I3C 250 mg.kg + IQ 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
-10 -5
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 t (min)
I3K
I3K + IQ
IQ
DMSO
Obr. 26. Chemiluminiscenční křivka myších leukocytů (I3C 250 mg.kg-1 + IQ)
-1
medián chemiluminiscence/1000 leu
I3C 250 mg.kg + MNU 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
-10 -5
0
5
I3K
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
t (min)
I3K + MNU
MNU
DMSO
Obr. 27. Chemiluminiscenční křivka myších leukocytů (I3C 250 mg.kg-1 + MNU) 100
Výsledky stanovení počtu leukocytů a diferenciálního krevního obrazu jsou
zobrazeny na obr. 28. a 29. Hodnoty počtu leukocytů u myší byly velmi variabilní a pohybovaly se v daném průměru (10 tisíc.mm-3, 4 – 30 tisíc.mm-3) (viz obr. 28.).
Mohli jsme nicméně sledovat statisticky významné zvýšení počtu leukocytů po
třídenní aplikaci I3C v dávce 250 mg.kg-1 ve srovnání s negativní kontrolou (VI. sk.).
Naopak došlo ke statisticky významnému snížení počtu leukocytů v V. skupině, po jednorázové aplikaci MNU. Tento výsledek potvrzuje supresivní roli MNU na počet leukocytů, v souladu s výsledky získanými ve 1. experimentu.
Počet leukocytů.mm-3
Celkový počet leukocytů -1 I3C 250 mg.kg 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
*
* *
I3C
I3C + IQ
IQ
I3C + MNU
MNU
7% DMSO
Aplikované látky
Obr. 28. Celkový počet leukocytů (I3C 250 mg.kg-1) (* p<0,05) Poměr lymfocytů a PMNL (% ) I3C 250 mg.kg
%
-1
120 100 80 60 40 20 0
PMNL
Lymfocyty
I3C
I3C + IQ
I3C + MNU
IQ
Aplikované látky
MNU
7% DMSO
Obr. 29. Poměr lymfocytů a polymorfonukleárních leukocytů (PMNL) (I3C 250
mg.kg-1)
(* p<0,05)
101
Aplikace I3C v kombinaci s mutageny vedla ke statisticky významnému zvýšení
počtu leukocytů ve vztahu k mutagenům a tento výsledek by mohl potvrzovat, že aplikace I3C snižuje negativní vliv mutagenů na počty leukocytů.
V poměrech lymfocytů a PMNL jsme nezaznamenali statisticky významné rozdíly. Výsledky 2. etapy
Výsledky mikronukleus testu 2. etapy druhého experimentu jsou zobrazeny v tab. 15
a na obr. 30.
Tab. 15. Počet mikrojader na 1000 polychromatických erytrocytů po aplikaci
I3C (125 mg.kg-1) a vybraných mutagenů (IQ, MNU) Skupina Aplikované látky I3C 125 mg.kg-1 I. I3C+ IQ II. I3C + MNU III. IQ IV. MNU V. 7 % DMSO VI.
MNPCE/1000 PCE
2,1,3,2,3,3,1
5,3,6,3,3,5,4
10,11,15,11,13,11,11 8,7,8,7,8,9,8
18,21,21,19,18,18,21 3,3,2,3,1,2,2
n 7 7
11,71 ± 1,70*
7
19,43 ± 1,51**
7 7
PCE – polychromatické erytrocyty n – počet zvířat
SD – směrodatná odchylka
** p < 0,05 – signifikantně vyšší počet mikrojader ve vztahu ke kontrole (7% DMSO)
102
4,14 ± 1,22*
7
MNPCE – počet mikrojader v polychromatických erytrocytech
* p < 0,05 – signifikantně nižší počet mikrojader ve vztahu k IQ a MNU
Průměr ± SD 2,14 ± 0,90
7,86 ± 0,70** 2,29 ± 0,76
7 % DMSO
MNU 50 mg/kg
IQ 20 mg/kg IQ 20 mg /kg
I3C 125 mg/kg + MNU 50 mg/kg
I3C 125 mg/kg + IQ 20 mg/kg
Me di á n; B o x: 25 %-75% ; Wh i sker : Rozsah neodl eh. 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 I3C 125 mg/kg
Počet mikrojader /1000 polychromatických erytrocytů
K rabi cový graf I3C 125 m g/kg
M edi án 2 5%-75% Rozsah neodl eh. O dl ehl é E xtrém y
Obr. 30. Vliv I3C (125 mg.kg-1) na mutagenitu IQ a MNU v mikronukleus testu
Z výsledků je patrné, že ani poloviční dávka I3C 125 mg.kg-1 nevedla ke statisticky
významným změnám v počtu mikrojader ve vztahu k negativní kontrole (VI. sk.) a nezpůsobovala žádné mutagenní změny v počtu mikrojader v polychromatických erytrocytech kostní dřeně myší.
Třídenní aplikace I3C v dávce 125 mg.kg-1 v kombinaci s mutageny IQ a MNU (sk.
II. a III.) vedla ke statisticky významnému (p < 0,05) snížení počtu mikrojader
v polychromatických erytrocytech kostní dřeně, ve vztahu ke skupinám IV. (IQ 20 mg.kg-1) a V. (MNU 50 mg.kg-1), kterým byly aplikovány pouze mutageny. Tyto
výsledky opět potvrzují supresivní roli I3C na účinek aplikovaných mutagenů.
Výsledky chemiluminiscenčního testu zobrazují pro přehlednost dva grafy – obr. 31.
a 32. Třídenní aplikace indol-3-karbinolu v dávce 125 mg.kg-1 vedla k nepatrnému
snížení
fagocytární aktivity polymorfonukleárních myších leukocytů, nicméně toto
snížení nebylo statisticky významné (p > 0,05) a naznačuje slabší účinek ve srovnání s vyšší dávkou I3C (250 mg.kg-1), která vedla ke statisticky významnému snížení.
Aplikace I3C v dávce 125 mg.kg-1 v kombinaci s IQ nevedla ke statisticky
významným změnám ve srovnání se samotnou administrací IQ.
103
Aplikace I3C v kombinaci s druhým mutagenem (MNU) vedla ke statisticky
významnému zvýšení fagocytární aktivity leukocytů ve vztahu k samotné aplikaci
MNU (p < 0,05). Jednorázová aplikace MNU překvapivě vykazovala statisticky významné snížení tvorby ROS ve vztahu k negativní kontrole (p < 0,05).
medián chemiluminiscence/1000 leu
I3C 125 mg/kg + IQ 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
t (min) I3K
I3k + IQ
IQ
DMSO
Obr. 31. Chemiluminiscenční křivka myších leukocytů (I3C 125 mg.kg-1 + IQ)
medián chemiluminiscence/1000 leu
I3C 125 mg/kg + MNU 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
-10
-5
0
5 I3K
10
15
20
25
t (min)
30
I3K + MNU
35 MNU
40
45
50
55
60
DMSO
Obr. 32. Chemiluminiscenční křivka myších leukocytů (I3C 125 mg.kg-1 + MNU) Celkový počet leukocytů a krevní obraz myší je znázorněn na obr. 33. a 34. Hodnoty
počtu leukocytů u myší byly značně variabilní, přesto se pohybovaly v průměru normálních hodnot (10 tisíc.mm-3, 4 – 30 000 tis.mm-3).
104
Aplikace samotného I3C v dávce 125 mg.kg-1 nevedla ke statisticky významným
změnám ve vztahu k negativní kontrole (VI. sk.). Nicméně statisticky významné
zvýšení leukocytů bylo patrné při srovnání skupiny II. a I.
Počet leukocytů.mm
-3
Celkový počet leukocytů -1 I3C 125 mg.kg 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
*
*
I3C
I3C + IQ
I3C + MNU
IQ
MNU
7% DMSO
Aplikované látky Obr. 33. Celkový počet leukocytů (I3C 125 mg.kg-1) (* p<0,05) Počet lymfocytů a PMNL (% ) I3C 125 mg.kg
-1
120 100 %
80
PMNL
60
Lymfocyty
40 20 0
I3C
I3C + IQ
I3C + MNU
IQ
Aplikované látky
MNU
7% DMSO
Obr. 34. Poměr lymfocytů a polymorfonukleárních leukocytů (I3C 125 mg.kg-1)
(* p<0,05)
105
Jednorázová administrace MNU opět vedla ke statisticky signifikantnímu snížení
počtu leukocytů. Tento výsledek potvrzuje supresivní roli MNU na počet leukocytů, v souladu s výsledky získanými ve 1. experimentu. Při hodnocení poměru
lymfocytů a polymorfonukleárních leukocytů nebyly
zaznamenány statisticky významné rozdíly ve vztahu ke negativní kontrole (7 % DMSO) a jejich zastoupení se pohybovalo v rozmezích normy.
106
4.3 Hodnocení antimutagenní aktivity brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem Výsledky třetího experimentu uvedeme opět do dvou etap dle aplikovaných
mutagenů. 1. etapa
Antimutagenní aktivita brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem byla hodnocena
mikronukleus testem po 14 denním perorálním podávání této substance v kombinaci
s mutagenními látkami u samců BALB/C myší. Počty mikrojader na 1000 polychromatických erytrocytů u jednotlivých skupin jsou
zobrazeny v tab. 16.
Průměrný počet mikrojader u negativní kontroly (IV. sk.) činil 2,13 ± 0,83, u II. skupiny, které byla aplikována pouze brokolicová šťáva
2,13± 0,83. Mezi těmito
skupinami nebyl statisticky významný rozdíl (p>0,01). Z výsledků je tedy patrné, že
podávání brokolicové šťávy po dobu 14 dní nevedlo ke statisticky významnému zvýšení počtu mikrojader a brokolicová šťáva samotná nevyvolává mutagenní účinky v polychromatických erytrocytech kostní dřeně myší.
Tab. 16. Počet mikrojader na 1000 polychromatických erytrocytů po aplikaci brokolicové šťávy a IQ
Skupina Aplikované látky Brokolicová šťáva + IQ I. Brokolicová šťáva II. IQ III. 7% DMSO IV.
MNPCE/1000 PCE
n
Průměr ± SD
3,3,3,2,3,4,2 2,3,1,3,2,2,1,3 6,8,8,5,5,5,6,7 1,2,3,3,2,3,1,2
7 8 8 8
2,86 ± 0,69* 2,13 ± 0,83 6,25 ± 1,28** 2,13 ± 0,83
MNPCE – počet mikrojader v polychromatických erytrocytech PCE – polychromatické erytrocyty n – počet zvířat
SD – směrodatná odchylka
* p < 0,01 – signifikantně nižší počet mikrojader ve vztahu k IQ
** p < 0,01 – signifikantně vyšší počet mikrojader ve vztahu ke kontrole (7% DMSO)
Obr. 35. představuje krabicový graf, který vyjadřuje hodnotu mediánu, rozsah
hodnot (25 - 75 %) a odlehlé či extrémní hodnoty.
107
V I. skupině, brokolicová šťáva podávána per os sondou v kombinaci s mutagenem
IQ (20 mg.kg-1) signifikantně snižovala počet mikrojader (p<0,01) ve srovnání s III.
skupinou, které byl podáván pouze samotný IQ. V III. skupině, které byl podán pouze jednorázově mutagen byl taktéž statisticky významný rozdíl (p < 0,01) ve srovnání s negativní kontrolou (IV. sk.). To opět potvrzuje, že aplikace 7 % DMSO nevyvolává
mutagenní změny. Dosažené výsledky z 1. fáze 1. experimentu prokazují supresivní úlohu brokolicové šťávy na účinek mutagenu IQ. Krabicov ý graf
Počet mikrojader/1000 polychromatických erytrocytů
9
Medián; Box : 25%-75%; Whisker: Rozsah neodleh.
8 7 6 5 4 3 2 1 0
Brokolice a IQ
IQ Brokolice
7% DMSO
Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy
Obr. 35. Vliv brokolicové šťávy na tvorbu mikrojader vyvolaných aplikací IQ 2. etapa
Výsledky druhé etapy 3. pokusu jsou zobrazeny v tab. 17. a na obr. 36.
Z obr. 36 je zřejmé, že brokolicová šťáva podávána per os sondou v kombinaci s mutagenem MNU (50 mg.kg-1) redukuje počet mikrojader v I. skupině ve srovnání s III. skupinou, které byl podáván
pouze samotný mutagen MNU. Čtrnáctidenní
aplikaci brokolicové šťávy (II. sk.) nevedla ke statisticky významnému rozdílu (p >
0,01) v počtu mikrojader ve vztahu k negativní kontrole (IV. sk.). Opět bylo potvrzeno, že čtrnáctidenní podávání brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem nevede
k mutagenním změnám. Statisticky významný rozdíl byl také prokázán mezi III. 108
skupinou, které byl aplikován pouze jednorázově mutagen a negativní kontrolou (IV. sk.).
Tab. 17. Počet mikrojader na 1000 polychromatických erytrocytů po aplikaci brokolicové šťávy a MNU Skupina Aplikované látky Brokolicová šťáva + MNU I. II. III. IV.
Brokolicová šťáva MNU 7% DMSO
MNPCE/1000 PCE
n
Průměr ± SD
8,7,7,6,8,8,8,7
8
7,38 ± 0,74*
17,16,20,21,20,16,16,18 1,2,3,2,0,2,3,2
8 8
18,0 ± 2,07** 1,88 ± 0,99
2,2,3,3,3,0,2,3
8
2,25 ± 1,04
MNPCE – počet mikrojader v polychromatických erytrocytech PCE – polychromatické erytrocyty n – počet zvířat
SD – směrodatná odchylka
* p < 0,01 – signifikantně nižší počet mikrojader ve vztahu k MNU
** p < 0,01 – signifikantně vyšší počet mikrojader ve vztahu ke kontrole (7% DMSO)
Krabicov ý graf
Počet mikrojader/1000 polychromatických erytrocytů
22
Medián; Box : 25%-75%; Whisker: Rozsah neodleh.
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2
Brokolice a MNU
MNU
Brokolice
7% DMSO
Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Ex trémy
Obr. 36. Vliv brokolicové šťávy na tvorbu mikrojader vyvolaných aplikací MNU Z uvedených výsledků je patrné, že aplikace samotné mutagenní látky vyvolává
podstatné zvýšení počtu mikrojader, potvrzující její mutagenní účinky. Naopak kombinace brokolicové šťávy s tímto mutagenen vedla k signifikantnímu snížení jejího mutagenního účinku.
109
5 Diskuze
Četné studie zabývající se působením ovoce a zeleniny zejména čeledě brukvovitých
(Brassicaceae), resp. jejich biologicky aktivních látek v oblasti chemoprevence
potvrzují, že existuje prokazatelný vztah mezi konzumací ovoce a zeleniny a sníženým
výskytem nádorového onemocnění (Steinmetz a Potter, 1991; Block et al., 1992; Weisburger, 2001; Park a Pezzuto, 2002).
Experimenty provedené v rámci této disertační práce jsou součástí grantového
projektu NAZV č. QF 3287 „Funkční potraviny ze zeleniny a ovoce a dalších zemědělských produktů vyrobené za použití vysokotlakového ošetření“, jehož cílem je
vyrobení ovocných a zeleninových šťáv, které vykazují takové vlastnosti, že by mohly
být v budoucnu označeny jako tzv. funkční potraviny. Funkčními potravinami je jakákoli potravina, která má kromě výživové hodnoty příznivý účinek na zdraví
konzumenta. Jedná se o potravinu vyrobenou z přírodních složek a její konzumace může posilovat přirozené obranné mechanismy proti škodlivým vlivům prostředí či
působí preventivně proti nemocem, ovlivňuje duševní i fyzický stav jedince a také přispívá ke zpomalení procesu stárnutí.
Ze všech tří provedených experimentů je zřejmé, ať již s čistými sloučeninami
(sulforafan, indol-3-karbinol) či zeleninovou šťávou ošetřenou vysokým tlakem, že statisticky významně redukují počty mikrojader v polychromatických erytrocytech kostní dřeně BALB/C myších samců a vykazují tak antimutagenní účinky proti užitým
mutagenům - 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-chinolinu (IQ) a N-nitroso-Nmethylurey (MNU).
V prvním a druhém experimentu jsme se zaměřili na sledování antimutagenních
účinků sulforafanu a indol-3-karbinolu. Tyto látky jsou degradačními produkty
glukorafaninu a glukobrassicinu, sloučenin přítomných v mnoha druzích brukvovité zeleniny (např. v brokolici, zelí, růžičkové kapustě). Tyto isothiokyanáty, jejichž
prekurzory jsou glukosinoláty, mohou inhibovat vznik chemicky indukovaného nádoru, přičemž
sulforafan
je
považován
chemopreventivní účinky brokolice.
za
hlavní
sloučeninu
zodpovědnou
za
Co se týká použité dávky sulforafanu aplikované experimentálním zvířatům, neliší
se velmi od expozice člověka. Po konzumaci 100 g porce brokolice či řeřichy přijme
člověk přibližně 50 – 200 µmol sulforafanu a phenethylisothiokyanátů (PEITC). To představuje zhruba 0,7 – 2,9 µmol vybraných isothiokyanátů na kilogram tělesné 110
hmotnosti. Některé odhady příjmu celkových glukosinolátů se blíží až 300 mg za den,
což by odpovídalo množství zhruba 660 µmol na den (Talalay a Fahey, 2001). Tato dávka by představovala 9,5 µmol.kg-1 na den. Množství sulforafanu z celkového obsahu
isothiokyanátů v brokolici se liší dle stáří rostliny a také její odrůdy. Může se pohybovat přibližně od 20 do 50 %.
My jsme aplikovali 3 µmol sulforafanu na jedno
experimentální zvíře o hmotnosti 20 g po dobu 3 dnů. Antimutagenní účinky jsme
sledovali také u indol-3-karbinolu, který jsme aplikovali ve dvou dávkách 125 a 250 mg.kg-1. Tyto dávky jsme zvolili v souladu s dávkami použitými v jiných studiích.
Je možné najít značné množství vědeckých statí věnujících se prokazování in vivo i
in vitro chemopreventivních účinků izolovaných biologicky aktivních látek obsažených
v ovoci a zelenině (Dixit a Gold, 1987; Gischner et al., 1987; Marks et al., 1993;
Sanyal et al., 1997; Hour et al., 1999; Šmerák et al., 2002; Edenharder et al., 2003; Ferguson et al., 2003; Bárta et al., 2005; Langová et al., 2005). Vzhledem
k potencionálním chemopreventivním vlastnostem sulforafanu a indol-3-karbinolu můžeme najít také mnoho in vitro i in vivo studiích věnovaných hodnocení zdraví
prospěšných účinků těchto dvou látek. Nicméně studie zabývající se hodnocením
antimutagenního potenciálu sulforafanu za pomoci krátkodobých testů klastogenity a mutagenity se doposud prováděli zřídka.
Součástí grantového projektu NAZV č. QF 3287 je též hodnocení antimutagenní
aktivity sulforafanu pomocí Amesova testu. Výzkum je však teprve na počátku a výsledky zatím nejsou dostupné. V literatuře jsme nalezli pouze jednu studii věnující se hodnocení antimutagenních vlastností sulforafanu v Amesově testu. V této studii
prokázal sulforafan silné antimutagenní účinky proti heterocyklickým aminům (např. 2-
amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-chinolinu (IQ), 2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5f]chinoxalin (MeIQ), 2-amino-3,8-dimethylimidazo [4,5-f]chinoxalin (MeIQx) (Shishu a Kaur, 2003). Podle našich experimentů sulforafan statisticky významně inhiboval
počet mikrojader v polychromatických erytrocytech kostní dřeně myší a tím snižoval
mutagenní účinek aplikovaných mutagenů (IQ a MNU) po třídenní expozici skupině,
které byl podáván sulforafan v kombinaci s mutageny ve srovnání se skupinou, které byly aplikovány pouze mutageny.
Bárta et al. (2003) prokázali v mikronukleus a Amesově testu antimutagenní účinky
PEITC (patřícího stejně jako sulforafan do skupiny isothiokyanátů) proti stejným
mutagenům a stejným dávkám, které byly použity následně i v našich experimentech. 111
To by potvrzovalo v souladu s našimi výsledky antimutagenní účinky některých isothiokyanátů.
Dle výsledků experimentálních studií může sulforafan přispívat k prevenci procesu
karcinogeneze ovlivněním především jeho iniciační a promoční fáze. Jeho protektivní
účinek je spojován s indukcí enzymů II. fáze, např. glutathion-S-transferázy (GST). Enzymy II. fáze jsou zahrnuty v detoxikaci mnoha karcinogenů a volných kyslíkových radikálů, a také v ochraně buněk proti poškození DNA a následně rozvoji maligní
transformace (Zhang et al., 1992; Zhang et al., 1994; Paolini et al., 2004). Tyto účinky
potvrzují i studie Munday R. a Munday C.M. (2004) a také Matusheski a Jeffery
(2001), kteří potvrdili, že sulforafan v dávkách od 40 do 1000 µmol.kg-1 podávaný per
os sondou po dobu několika dnů vede ke zvýšení aktivity GST a chinon reduktázy
v mnoha tkáních a je tedy silným induktorem enzymů II. fáze. K podobným výsledkům
dospěli i Yoxall et al. (2005), který aplikoval dávku sulforafanu odpovídající běžnému
dennímu příjmu u lidí. Sulforafan také může vést k inhibici CYP2E1, který je
zodpovědný za aktivaci některých karcinogenů (Barcelo et al., 1996).
Sulforafan v kombinaci s jinými isothiokyanáty v in vitro pokusech s liniemi
nádorových buněk tlustého střeva a pankreatu vedou ke snížení DNA zlomů (Bonnesen
et al., 2001). U linie nádorových buněk pankreatu (Pham et al., 2004; Fimognari et al.,
2005) či prostaty (Frydoonfar et al., 2003; Singh A.V. et al., 2004; Singh S.V. et al., 2004; Wang et al., 2004) vyvolával sulforafan apoptózu. V in vivo pokusech
s experimentálními zvířaty sulforafan, ale i jiné isothiokyanáty (PEITC, konjugáty
NAC), snižují tvorbu aberantních buněk (Chung et al., 2001) či statisticky významně
snižují velikost a počet nádorů (Zhang et al., 1994; Chung et al., 2000, Pham et al., 2004). Nicméně, Fimognari et al. (2005) dokazuje, že izolované látky mohou mít
kvantitativně odlišné účinky ve srovnání s isothiokyanáty zastoupenými ve směsi. Také ale poukazuje na skutečnost, že brukvovitá zelenina neobsahuje pouze látky s chemopreventivními účinky, ale také sloučeniny s potencionálními genotoxickými a karcinogenními účinky (BITC a PEITC).
V našich experimentech sulforafan snižoval počty mikrojader u obou použitých
mutagenů podobně. Samostatná aplikaci přímo působícího mutagenu MNU, který
nevyžaduje metabolickou aktivaci vyvolávala tvorbu vysokého počtu mikrojader ve srovnání s nepřímo působícím mutagenem IQ, vyžadujícím metabolickou aktivaci k projevení jeho mutagenního účinku.
112
V experimentech jsme si rovněž kontrolně ověřili, že sulforafan samostatně
aplikovaný myším po dobu tří dnů nevedl ke zvýšení počtu mikrojader a nevedl tak k chromosomálnímu poškození polychromatických erytrocytů kostní dřeně.
Studií věnujících se posuzování antimutagenní aktivity indol-3-karbinolu (I3C) je
možné nalézt ve srovnání se sulforafanem větší množství. Nicméně ve většině těchto studií byly použity jiné referenční mutageny (benzo[a]pyren - BP, cyklofosfamid - CP,
azoxymethan - AOM) než v námi provedených experimentech. Shukla et al. (2003)
prokázal, že I3C v Amesově testu statisticky významně inhibuje mutagenitu BaP a CP. K podobným výsledkům dospěl i v mikronukleus testu in vivo po pětidenní aplikaci I3C
v různých dávkách. O rok později prokázal, že i velmi nízká dávka I3C (5 mg.kg-1) aplikovaná i.p. vede ke statisticky
významné inhibici
frekvence aberantních
chromozomů u myší (Shukla et al., 2004). Antimutagenní účinky indol-3-karbinolu také potvrdil v mikronukleus testu in vivo např. Agrawal a Kumar (1998), kteří aplikovali
stejné dávky testované látky jako v našich experimentech. Tyto výsledky byly srovnatelné s výsledky našich experimentů s indol-3-karbinolem,
nicméně nelze je
zcela porovnávat vzhledem k použití rozdílných referenčních mutagenů.
Námi zjištěné výsledky potvrzují, že indol-3-karbinol aplikovaný po dobu tří dnů a
následné aplikaci mutagenů (IQ, MNU) vede ke statisticky významnému snížení počtu mikrojader v polychromatických erytrocytech kostní dřeně myší.
Mezi jednotlivými dávkami indol-3-karbinolu nebyl zaznamenán statisticky
významný rozdíl v počtu mikrojader ve skupinách myší, kterým byl aplikován indol-3-
karbinol v kombinaci s mutageny. Přesto bylo možné u vyšší z aplikovaných dávek (250 mg.kg-1) pozorovat nepatrně nižší počet mikrojader a tedy silnější vliv na potlačení
mutagenity aplikovaných mutagenů.
Indol-3-karbinol si vysloužil pozornost díky svému antikarcinogennímu působení
v experimentech se zvířaty a v inhibici růstu různých nádorových buněk v kulturách, kde I3C indukuje zastavení buněčného cyklu a apoptózu nádorových buněk prostaty
(Sarkar a Li, 2004), tlustého střeva a prsu (Lee et al., 2005). I3C je slibnou
chemopreventivní sloučeninou na zvířecích modelech. Nicméně chybí údaje o jeho farmakokinetice. Anderton et al. (2004) prokázali, že I3C se rychle absorbuje, distribuuje a eliminuje z krevní plazmy do jednotlivých tkání, klesající pod limit
detekce v krevní plasmě během jedné hodiny. Nejvyšší koncentrace I3C byla nalezena v játrech. Distribuce I3C do tkání umožňuje projevení farmakologických účinků. Indol-
3-karbinol patří do skupiny indolových derivátů, které však mohou působit jako 113
bifunkční induktory, které aktivují detoxikační enzymy I. fáze a slabě indukují enzymy
II. fáze. Mohou tedy dle Fahey et al. (1997) působit jako potenciální promotory karcinogenních látek. V experimentech na zvířatech tedy velmi záleží na době
aplikovaného I3C a karcinogenní látky, na výběru karcinogenní látky a také na dávce aplikovaného I3C. V našem experimentu jsme podávali mutageny po třídenní aplikaci
I3C, který vedl k potlačení jejich mutagenního účinku. Objevují se však i studie, které potvrzují promutagenní či prokarcinogenní účinky I3C. Pokud je I3C administrován
během promoční fáze karcinogeneze, může tento proces potencovat (Potter, 1997). K těmto výsledkům dospěl Kang et al. (2001), který sledoval post-iniciační účinky I3C
na mutagenitu MNU u potkanů. Počet nádorů (adenokarcinomů) u zvířat byl vyšší u
obou skupin (100 a 300 mg I3C ve stravě) ve srovnání se skupinou po jednorázové aplikaci MNU, nicméně rozdíl nebyl statisticky významný a mohl spočívat mimo jiné i
v estrogenních účincích I3C, který inhibuje růst nádorových buněk prsu zvýšením 2hydroxyestronu., který může stimulovat růst nádorových buněk.
Výsledky věnující se studiu I3C jsou nejednotné. V Amesově testu byl sledován I3C
proti přímému mutagenu MNU a N-methyl-N´-nitro-N-nitrosoguanidinu (MNNG).
Experiment potvrdil, že I3C nemá žádný vliv na mutagenitu aplikovaných látek. V absenci mutagenů nevykazoval I3C žádné toxické či mutagenní vlastnosti. (Birt et al., 1986), což je v souladu s našimi výsledky v in vivo mikronukleus testu, kdy nebyl
zaznamenán podobně jako u sulforafanu vliv samostatné třídenní aplikace indol-3karbinolu na počet mikrojader. Indol-3-karbinol tak nevykazoval mutagenní vlastnosti. Mezi dvěmi dávkami indol-3-karbinolu nebyl zaznamenán žádný rozdíl.
Podobně nekonzistentní data platí i pro výsledky in vivo studií s experimentálními
zvířaty. Obohacení stravy I3C a následné podávání mutagenu 2-amino-1-methyl-6phenylimidazo[4,5-b]pyridin (PhIP) ze skupiny HA vedlo ke snížení tvorby DNA adduktů v epiteliálních buňkách mléčné žlázy, tlustého střeva, játrech a v bílých krvinkách. Pokud bylo schéma aplikace obráceno, neměl I3C žádný vliv na snížení
počtu DNA adduktů vyvolaných mutagenem (He et al., 1997). Guo et al. (1995) potvrdil, že po předchozí administraci potkanů mutagenu ze skupiny HA – PhIP a
následnému obohacení stravy o I3C došlo k inhibici růstu aberantních buněk tlustého střeva. Sledované hladiny enzymů v játrech prokázaly zvýšenou indukci enzymů I. i II.
fáze. Pokud byl I3C aplikován před i po administraci MNU, vedl ke snížení výskytu
nádorů mléčné žlázy o 65 % (Grubbs et al., 1995). Podobné výsledky přináší i Xu et al.
(1996) ve vztahu k mutagenu IQ. Tyto výsledky potvrdili i v následující studii (Xu et 114
al., 1997), ve které naznačili, že I3C pravděpodobně indukuje CYP1A1 a CYP1A2, isoenzymy, které metabolizují IQ hydroxylací. Indukce detoxikačních enzymů záleží
pravděpodobně na aplikované dávce. Vyšší dávky I3C (100 – 1000 mg) zvyšovaly tyto isoenzymy, nicméně nižší dávky (10 - 25 mg) redukovaly aktivitu enzymů. V Amesově testu I3C aktivoval IQ na karcinogen. Vliv dávky se potvrdil i ve studii, ve které byl
potkanům jednorázově aplikován I3C (25 – 100 mg) krátce před administrací IQ. Při vyšší dávce došlo k významné inhibice tvorby DNA adduktů, ale k nepatrnému zvýšení
při nejnižší dávce. Podobné závěry vyvodil v experimentech se zvířaty i Xu et al. (2001) s použitím různých dávek I3C na růst nádorů tlustého střeva vyvolaného aplikací
IQ. Výsledky naznačují, že v pokusech na zvířatech záleží nejen na výběru karcinogenní látky, ale také na dávce aplikované modulační látky, pokud je podávána
následně po látce karcinogenní. V našich experimentech byly sice použity dvě dávky
I3C (125 a 250 mg.kg-1), nicméně rozdíl mezi nimi nebyl velký a neovlivňoval žádným způsobem počty mikrojader.
Protichůdné účinky indol-3-karbinolu i výsledky experimentálních studií vedou
vědce stále k opatrnosti širšího používání I3C v prevenci nádorového onemocnění u lidí, dokud nebude jeho chemopreventivním účinkům lépe porozuměno, což potvrzuje i
jedna z posledních studií (Kim a Milner, 2005), věnující se hodnocení mechanismů účinku I3C v prevenci nádorového onemocnění.
V prvním i druhém experimentu jsme kromě antimutagenních účinků sledovali vliv
samostatné aplikace sulforafanu a I3C, i v kombinaci s mutageny (IQ a MNU) na imunitní
systém
myší
a
na
počet
imunokompetentních
krevních
buněk.
Chemiluminiscenční test jsme provedli především z důvodu zvýšené pozornosti vědců o
flavonoidy a některé polyfenolické sloučeniny, ale i degradační produkty glukosinolátů
jako o látky s antioxidačním působením. Antioxidační účinek by mohl být zčásti zodpovědný za protektivní vliv zeleniny v prevenci nádorového onemocnění.
Antioxidační účinek flavonoidů spočívá ve schopnosti vychytávat volné radikály (např. superoxidový či hydroxylový radikál) (Cotelle et al., 1996). Mnoho studií demonstruje,
že některé rozkladné produkty glukosinolátů mohou vykazovat také antioxidační
účinky, a to nepřímo oproti přímo působícím flavonoidním látkám, indukcí endogenního enzymatického systému
(GST, UDP-glukuronyl transferáza, chinon
reduktáza) a inhibicí enzymů aktivujících karcinogeny (CYP1A1) (Williamson et al.,
1998; Basten et al., 2002) a to jak v buněčných kulturách tak v pokusech in vivo (Kim 115
et al., 2004). Nicméně antioxidační vlastnosti glukosinolátů nebyly doposud systematicky studovány.
Chemiluminiscenční test představuje jednoduchou, rychlou a citlivou metodu pro
studium oxidačního metabolismu fagocytů a nepřímo fagocytózy, která blízce koreluje s funkcí
polymorfonukleárních
leukocytů
(PMNL,
neutrofilní
granulocyty)
a
s poškozením tkání při chronickém zánětu. Tento test je vhodný pro identifikaci
sloučenin s antioxidačními a protizánětlivými vlastnostmi. Metabolická aktivace
fagocytů během fagocytózy způsobuje aktivaci NADPH oxidázy, za produkce
superoxidového radikálu a jiných reaktivních forem kyslíku (ROS) (Ielpo et al., 2000), které však dle Agarwala (2004) nelze s přesností určit.
Důležitost chemiluminiscenčního testu spočívá v možnosti vlivu individuálních
sloučenin na produkci reaktivních forem kyslíku v PMNL. Tato schopnost ovlivňuje
vznik zánětlivých reakcí a fagocytózy ve vztahu k bakteriálním buňkám, nicméně
zároveň zde existuje zvýšené riziko tvorby volných radikálů za nedostatečné antioxidační ochrany. Produkce volných kyslíkových radikálů (VKR) je důležitá vzhledem k aterogennímu procesu jako i k procesu karcinogeneze. Chemiluminiscenční
test detekuje produkci VKR, především peroxidu vodíku v komplexu peroxid vodíku –
myeloperoxidáza – Cl- (Šmerák et al., 2002). PMNL stimulují pomocí myeloperoxidázy
tvorbu kyseliny chlorné z chloridového iontu a peroxidu vodíku. Kyselina chlorná je
silný oxidant. Kyselina chlorná může být dalším zdrojem hydroxylového radikálu po reakci se superoxidem. PMNL ji používají s dalšími reaktivními formami kyslíku a
dusíku jako baktericidní prostředek. Plasmatická membrána PMNL je vybavena NADPH – oxidázou. Tento komplex po pohlcení částice aktivuje a redukuje dioxygen na superoxid, který se pohotově mění na peroxid vodíku (Štípek et al., 2000).
Zdá se, že reaktivní formy kyslíku (ROS) produkované PMNL nemusí vykazovat
baktericidní účinky, ale mohou sloužit jako signální molekuly, ovlivňující řadu
buněčných funkcí včetně syntézy cytokininů, adhezních molekul a regulátorů proliferace. Zdá se, že působením ROS mohou měnit svoji aktivitu dva ze známých
transkripčních faktorů - NF-κB, který řídí syntézu regulačních proteinů zánětu a AP-1,
který řídí syntézu proteinů regulujících proliferaci, apoptózu a hypertrofii (Štípek et al.,
2000).
Naše výsledky chemiluminiscenčního testu prokazují značnou variabilitu vlivu
isothiokyanátů na produkci VKR a to v závislosti na použité dávce a kombinaci s mutagenem.
116
Z výsledků vyplývá, že aplikace sulforafanu v porovnání s kontrolou nepůsobí
imunostimulačně ani imunosupresivně, nicméně u obou koncentrací I3C jsme
pozorovali snížení produkce VKR, které bylo u koncentrace 250 mg.kg-1 statisticky
významné. Uvedené výsledky by bylo možné vysvětlit tak, že I3C indukuje aktivitu antioxidačních enzymů rychleji než sulforafan, a nebo že vykazuje určité imunosupresivní vlastnosti. Vzhledem k použité metodice, která měří světelné impulsy
po reakci VKR s luminolem nelze říci, která z možností je pravděpodobnější. Vysvětlení opírající se o působení antioxidačních enzymů je značně závislé na mechanismu interakce VKR s luminolem a zejména rychlosti této reakce.
V kombinaci s mutageny můžeme pozorovat zajímavé výsledky. MNU aplikovaný
následně po sulforafanu a po nižší dávce I3C zvyšuje fagocytární aktivitu myších leukocytů, zatímco s vyšší dávkou I3C snižuje tvorbu VKR. Vysvětlením může být
prooxidační a fagocytózu stimulující působení nízkých dávek isothiokyanátů a opačný efekt vyšších dávek.
Předpokládali jsme, že po aplikaci samotného mutagenu bude zvýšená hodnota
chemiluminiscence v důsledku poškození buněk a aktivace fagocytárního systému. Naproti tomu kombinace mutagen-isothiokyanát by měla v případě antimutagenních vlastností isothiokyanátů hodnoty chemiluminiscence snižovat. Takovéto výsledky jsme
však pozorovali pouze při použití sulforafanu a IQ a vyšší dávky I3C a MNU. U ostatních skupin byly výsledky proti předpokládaným odlišné a v některých případech i
naprosto opačné, což by naznačovalo synergistický mutagenní účinek použitých látek (sulforafan + MNU, I3C 125 mg.kg-1 + MNU), což však neodpovídá výsledkům mikronukleus testu.
Výsledky chemiluminiscenčního testu nejsou jednoznačné, ale jejich interpretace
bývá vždy komplikovaná. Zvýšenou produkci VKR lze prokázat zvýšenou fagocytární
aktivitu leukocytů. Otázkou však zůstává, je-li toto zvýšení pro organismus změnou pozitivní, která může znamenat zvýšenou odolnost organismu vůči patogenním
podnětům, a nebo je zvýšená fagocytární aktivita vyvolána poškozením některých
buněčných struktur a slouží k udržení homeostázy a odstranění poškozených buněk. Singh A.V. et al. (2004) sledoval vliv sulforafanu na tvorbu reaktivních forem kyslíku
v PC-3 nádorových buňkách prostaty. Sulforafan je elektrofilní molekula schopná
reagovat např. s glutathionem, což vyvolává otázku, zda sulforafan nevyvolává tvorbu ROS, které mohou poškodit DNA. Ošetřování buněk 20 µmol sulforafanu mělo za
následek časově závislé zvýšení ROS sledované fluorescenční metodou. Protože ROS 117
mohou vyvolat poškození DNA, sledovali tito vědci DNA zlomy po ošetření
sulforafanem a výsledky jejich domněnku potvrdily. Sulforafan tak může reagovat vzhledem ke svým elektrofilním vlastnostem nebo může vyvolávat oxidační stres a
následně vede k poškození DNA, které ale může u nádorových buněk vést k zastavení buněčného cyklu (Singh S.V. et al., 2004).
Nevýhodou námi použité chemiluminiscenční metody je použití plné krve, která
může obsahovat i jiné zdroje VKR než jen leukocyty a také látky s antioxidačními
vlastnostmi. Tímto způsobem může dojít k ovlivnění naměřené hodnoty a odchylce od reálné hodnoty chemiluminiscence příslušející pouze leukocytům. Vliv aplikovaných
látek na produkci VKR jinými komponentami než leukocyty je však zanedbatelný. Mechanismus účinku použitých mutagenů spočívá ve vazbě na DNA či její methylaci a bloku transkripce a translace genetické informace. Snížení produkce VKR by mohlo být
u isothiokyanátů pozorováno, protože jsou u nich popisovány antioxidační vlastnosti.
I3C a sulforafan jsou však nepřímé antioxidanty, které po krátké stimulaci produkce
VKR indukují aktivitu antioxidačně působících enzymů superoxid dismutázy a glutathion peroxidázy.
Vliv aplikovaných látek na imunitní systém bude nutné ověřit na modelu
s chronickou administrací těchto látek, neboť je důležité si uvědomit, že imunitní
systém hraje důležitou roli v prooxidačních i oxidačních procesech, které probíhají
v lidském organismu a mohou ovlivnit právě iniciační fázi procesu karcinogeneze (Bárta et al., 2006).
V roce 2003 Bárta et al. (2003) sledovali imunomodulační aktivitu PEITC pomocí
modifikovaného chemiluminiscenčního testu. PEITC v kombinaci s IQ a MNU zcela
eliminoval imunosupresivní účinky mutagenů. K podobným výsledkům dospěl Šmerák
et al. (2002) a Bárta et al. (2005) i při studiu polyfenolů - (-)-epigallokatechin-3-gallátu
a kyseliny ellagové. Naše výsledky však nelze zcela srovnávat s modifikovaným
chemiluminiscenčním testem, při kterém byly reakce imunitního systému myší sledovány po dobu jednoho měsíce. Během této doby se naplno projevil
imunosupresivní účinek mutagenů a na druhé straně imunostimulační vliv látek ochranných. Dále se také jednalo o testování především látek ze skupiny polyfenolů, s výjimkou PEITC, které jsou známy svými přímými antioxidačními účinky.
Dle Bárty et al. (2006) chování mnoha sloučenin záleží na různých podmínkách,
zvláště na dávce. Takové látky pak mohou působit buď jako mutagenní či
antimutagenní sloučeniny nebo nevykazují prokazatelně ani pozitivní ani negativní 118
mutagenní účinky. V tomto případě záleží nejen na aplikované dávce, ale také na čase. Časový faktor je důležitý nejen vzhledem k trvání účinku jednotlivých sloučenin, ale také vzhledem k časové reakci, tedy období, kdy začne látka působit.
Současně s chemiluminiscenčním testem jsme hodnotili počet leukocytů a krevní
obraz myší. Tato vyšetření by mohla pomoci k lepší interpretaci výsledků získaných
z chemiluminiscenčního testu. Počet imunokompetentních buněk se lišil u sulforafanu a indol-3-karbinolu. Po třídenní aplikaci sulforafanu v kombinaci s mutagenem IQ došlo k signifikantnímu zvýšení celkového počtu leukocytů ve srovnání se skupinou, které byl
podán samotný mutagen, v jehož důsledku došlo pravděpodobně k poškození buněk.
Zvýšený počet leukocytů může naznačovat vznik zánětlivé reakce v organismu nebo
reakci na tvorbu reaktivních forem kyslíku. Mutagen MNU snižoval celkový počet leukocytů a současně vedl ke zvýšení počtu PMNL na úkor lymfocytů, což může být dáno supresivním účinkem mutagenu MNU, při kterém opět došlo k poškození buněk.
V experimentu s I3C jsou výsledky stanovení počtu imunokompetentních buněk
narozdíl od výsledků chemiluminiscenčního testu podobné při obou použitých dávkách.
Počet celkových leukocytů byl statisticky významně vyšší po aplikaci samotného I3C ve vyšší dávce, ale i v kombinaci s mutagenem IQ, naopak aplikace mutagenu MNU vedla opět k významnému snížení počtu leukocytů. Tento výsledek potvrzuje supresivní
roli MNU na počet leukocytů, v souladu s výsledky prvního experimentu. Výsledky získané z experimentu s I3C by mohly potvrzovat, že I3C snižuje negativní vliv
aplikovaných mutagenů na počet leukocytů. Bohužel naše výsledky nelze srovnávat, neboť v literatuře chybí studie zabývající se hodnocením vlivu aplikovaných isothiokyanátů na počty imunokompetentních buněk.
Ve třetím experimentu jsme hodnotili komplexní směs biologicky aktivních látek
obsažených v brukvovité zelenině a to experimentem s brokolicovou šťávou ošetřenou vysokým tlakem. Způsob technologické úpravy brukvovité zeleniny má významný vliv
na výsledné zdraví prospěšné účinky. Jako velmi šetrná metoda se zdá být ošetření
vysokým tlakem. Tato metoda konzervace se hodí pro výrobu potravin, např. z ovoce a
zeleniny. Při této metodě se uplatňuje působení vysokého tlaku a nízkých teplot. Tato kombinace se zdá být velmi vhodnou právě pro skupinu ovoce a zeleniny, konkrétně
jejich šťáv, přičemž dochází k zachování biologicky aktivních látek v nich obsažených. Z chemických analýz vyplývá, že obsah těchto látek (vitamin C, celkové polyfenoly,
fenolové kyseliny, rutin, sulforafan a celkové isothiokyanáty) se nijak významně neměnil dle různých technologických úprav s výjimkou sulforafanu. 119
U sulforafanu velmi záleželo na předchozí úpravě. Pokud byla použita šťáva
z mražené brokolice, byl obsah sulforafanu nižší než při použití brokolicové dřeňové šťávy z chlazené brokolice. Ještě před tlakovým ošetřením se brokolice lisuje za vzniku
dřeňové šťávy. Při lisování dochází k aktivaci enzymu myrosinázy a uvolnění aktivních
isothiokyanátů (např. sulforafan), jejichž obsah stoupá s klesajícím pH (pH = 4),
přičemž doba prodlevy po vylisování a dobou tlakové úpravy je také velmi důležitá,
neboť po 180 minutách po vylisování již nedochází ke zvyšování obsahu sulforafanu. Při ošetření vysokým tlakem nedojde ke snížení ani ke změně obsahu sulforafanu (16,19 µg.ml-1), čímž se potvrzuje zachování biologicky aktivních látek v brokolicové šťávě,
což prokazují i provedené chemické analýzy (Houška et al., 2004, Strohalm et al., 2005).
Při této metodě ošetření tak dochází k zachování nutriční a senzorické hodnoty
produktů, je možné zpracovávat potraviny bez přídavku chemických aditiv a rovněž se prodlužuje údržnost potravin. Na druhé straně působením tlaku dochází k odstranění nežádoucích mikroorganismů.
Z našich experimentů s brokolicovou šťávou ošetřenou vysokým tlakem vyplývá, že
čtrnáctidenní podávání brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem BALB/C myším
samcům v kombinaci s mutagenními látkami (MNU a IQ), vedlo prokazatelně ke
snížení počtu mikrojader v polychromatických erytrocytech kostní dřeně a tedy k prokazatelnému snížení mutagenních účinků IQ a MNU.
Dávky mutagenů byly následující - 20 mg.kg-1 pro IQ a 50 mg.kg-1 pro MNU. Tyto
dávky jsou totožné s dávkami použitými v experimentech vedených Bártou na 3. LF UK v Praze. Toto pracoviště se již několik let intenzivně zabývá výzkumem
chemopreventivních vlastností ovoce a zeleniny a biologicky aktivních látek zde zastoupených. Celkově se ve studiích věnuje málo pozornosti vlivu různých technologických úprav (např. pasterování, vaření, mražení či ošetření vysokým tlakem) na výsledné zdraví prospěšné účinky ovoce a zeleniny.
Rovněž jsme prokázali, že kontrolní podávání samotné brokolicové šťávy ošetřené
vysokým tlakem nevedlo ke zvýšení počtu mikrojader ve srovnání s negativní kontrolou
a lze tedy vyvodit závěr, že brokolicová šťáva ošetřená vysokotlakou metodou nevyvolává žádné mutagenní změny. Naše výsledky
jsou zcela v souladu s testy na bakteriální úrovni, které byly
provedeny na stejném pracovišti. Hodnocena byla brokolicové šťáva ošetřené vysokým tlakem, ale také pasterací a mražením a to v krátkodobém testu mutagenity na kmenu 120
Salmonela typhimurium TA 98 s metabolickou aktivací. Tento test slouží pro hodnocení
genových mutací. Bylo použito referenčního mutagenu IQ. Z výsledků bylo patrné, že šťáva ošetřená vysokotlakou metodou a mražením vykazovala inhibici mutagenity silně
pozitivní ve vztahu k mutagenu IQ, ošetření pasterací negativní. Byly hodnoceny také šťávy z bílého a červeného zelí, růžičkové kapusty a květáku, u kterých byly nalezeny podobné výsledky podporující jejich antimutagenní účinky.
Antimutagenní aktivita brokolicové šťávy byla hodnocena také dle metodiky
cytogenetické analýzy lidských periferních lymfocytů in vitro. Z výsledků testů inhibice
klastogenity vyplynulo, že nejvýraznějšího efektu, spočívajícího ve snížení počtu aberovaných chromozomů, bylo dosaženo u chlazené šťávy zmražené, následovalo
ošetření pasterací a poté vysokým tlakem. Nicméně u čerstvých šťáv ošetřených
pasterací bez přítomnosti referenčního mutagenu (CP) byl u žen zjištěn vzestup počtu aberovaných chromozomů a tyto výsledky vyžadují další výzkum (Houška et al., 2004).
Podobná studie byla provedena na již vzpomenuté 3. LF UK v Praze. Sedmíková et
al. (1999) prokázali pomocí Amesova testu, že květáková šťáva ošetřená vysokým
tlakem i mražená šťáva, vykazují silné antimutagenní účinky vůči IQ ve srovnání se šťávou pasterovanou, která vykazovala znatelně slabší antimutagenní působení.
Z uvedených studií i z našeho experimentu lze souhrnně říci, že způsob ošetření
vysokým tlakem lze považovat za metodu, při které dochází nejen k prodloužení trvanlivosti, deaktivaci mikroorganismů, udržení nutriční hodnoty, ale také k zachování biologicky aktivních látek a jejich antimutagenní aktivity.
Lze předpokládat, že mechanismus antimutagenního působení brukvovité zeleniny
by mohl spočívat např. v mechanické či chemické inaktivaci mutagenu, např. absorpci
mutagenu na substráty s vysokou molekulovou hmotností či inhibici tvorby mutagenu z promutagenu, konkrétně u IQ (Sedmíková et al., 1999). Pravděpodobný účinek na inaktivaci spočívá v indukci detoxikačních enzymů II. fáze, což bylo dokázáno v mnoha studiích s izolovanými látkami obsaženými v brukvovité zelenině.
Experimentům s ovocem a zeleninou se dlouhodobě věnuje Edenharder et al.
(1994), kteří sledovali v Amesově testu inhibici mutagenity vybraných látek ze skupiny
HA (IQ, MeIQ a MeIQx). U 68 % ovoce a 73 % zeleniny, které byly testovány, byly
nalezeny silné antimutagenní účinky. Ze zeleniny byla nejúčinnější právě brukvovitá zelenina. Pokud však byly tyto suroviny tepelně zpracovány, měl tento technologický postup u některých druhů ovoce a zeleniny za následek pokles antimutagenních vlastností. Rauscher et al. (1998) dospěl k podobným výsledkům s ovocem a zeleninou 121
bohatou na karotenoidy (meruňky, pomeranče, růžičková kapusta, mrkev, rajčata, papriky). Dle Rauschera je za tyto účinky pravděpodobně zodpovědná inhibice metabolické aktivace aplikovaných prokarcinogenních látek. Chemoprotektivní účinky
brukvovité zeleniny proti působení mutagenů ze skupiny HA jsou prokazovány také mnohými studiemi s experimentálními zvířaty. Přičemž bylo potvrzeno, že dochází ke
stimulaci detoxikačních enzymů II. fáze, snížení poškození DNA (Humblot et al.,
2004), snížení tvorby preneoplastických lézí (Steinkellner et al., 2001; Uhl et al. 2004), zvýšení aktivity CYP1A2 a UDP-glukuronyl transferázy (Kassie et al., 2003)
Brukvovitá zelenina je studována také ve vztahu k přímému mutagenu MNU.
V pokusech s experimentálními zvířaty vedla strava obohacená brukvovitou zeleninou ke snížení incidence nádorů mléčné žlázy (Bresnick et al., 1990) a zvýšení aktivity enzymů II. fáze (Wortelboer et al., 1992).
I některé epidemiologické studie se v dnešní době zaměřují na porovnávání
protektivních účinků zeleniny čeledě brukvovitých (Brassicaceae). Murray et al. (2001) potvrdil, že zvýšená konzumace této čeledě zeleniny má vliv na metabolismus HA u lidí. Účinek se projevil sníženou exkrecí PhIP a MeIQx močí a vzestupem aktivity
CYP1A2, který je spojován s aktivací prokarcinogenů na karcinogeny. Pokles
vylučování HA může být spojeno se zvýšeným metabolismem aminů. V další fázi
pokusu, při které se zvýšila konzumace masa, došlo k vzestupu HA v moči což je
v souladu s jejich zvýšeným metabolismem. Po 12 dnech bez brukvovité zeleniny se snížila aktivita CYP1A2, ale exkrece HA byla stále snížená, nicméně moč neustále
vykazovala zvýšenou mutagenitu (s metabolickou aktivací). Tato prodloužená odpověď
metabolismu aminů na zvýšený příjem brukvovité zeleniny může naznačovat účast jiných enzymů než jen CYP1A2. Walters et al. (2004) v podstatě opakovali tuto studii
se stejným schématem podávání brukvovité zeleniny. Z výsledků bylo opět patrné, že
brukvovitá zelenina vedla ke značnému zvýšení CYP1A2, ale také současně ke zvýšené exkreci metabolitů PhIP v moči. To opět potvrzuje působení brukvovité zeleniny na I. i
II. fázi detoxikačních enzymů. Zvýšení enzymů CYP1A2 potvrdil také Lampe et al.
(2000).
Konzumace masa vede ke zvýšení mutagenity moče a naopak konzumace
brukvovité zeleniny, konkrétně červeného zelí předcházející konzumaci masa vede
k jejímu významnému snížení. Tyto výsledky byl prokázány v Amesově testu se S.
typhimurium YG1024 (Watanabe et al., 1990). Podobné výsledky byly
zjištěny
po konzumaci šťávy z červeného zelí. To naznačuje, že redukce mutagenity moče nelze 122
připisovat vazbě na vlákninu a následné kyselé hydrolýze, neboť po konzumaci zelí
došlo k vyloučení velkého množství mutagenních sloučenin v moči v podobě konjugátů (Turesky et al., 1994). Tyto výsledky mohou být brány jako indikátory, že konzumace
brukvovité zeleniny ovlivňuje metabolismus HA u lidí prostřednictvím indukce detoxikačních enzymů. Hughes et al. (2002) zkoumal
vliv konzumace 400 g
brukvovité zeleniny denně na snížení hladiny N-nitrososloučenin ve stolici. Tento účinek nebyly potvrzen, nicméně strava bohatá na zeleninu zrychlovala pasáž střevem a
tím byl omezen kontakt střevní sliznice s těmito látkami. Za tento účinek by mohla být zodpovědná přítomnost vlákniny.
Výsledky většiny zmíněných studií i výsledky našich experimentů dokazují, že
brukvovitá zelenina a její šťávy mohou chránit proti různým karcinogenům, a tyto vlastnosti jsou spojovány především s indukcí biotransformačních enzymů, které se podílí na jejich detoxikaci. Otázkou je, zda protektivní účinky brukvovité zeleniny mohou být připisovány individuálním sloučeninám, jako jsou isothiokyanáty či indoly či dalším
přítomným fytochemikáliím
(karotenoidy, vitaminy, selen, vláknina,
flavonoidy apod.) (Steinkellner et al., 2001; Conaway et al., 2002). Naše výsledky
potvrzují, že jak vybrané biologicky aktivní látky, tak také brokolicová šťáva ošetřená vysokým tlakem snižuje mutagenní působení aplikovaných mutagenů.
Přesto je nezbytné si uvědomit, že ovoce a zelenina představují komplexní směs
biologicky aktivních látek, jejichž účinky se vzájemně prolínají a mohou se za
přítomnosti ostatních látek potencovat či být naopak potlačeny. Hlavním smyslem
antimutagenních a antikarcinogenních studií izolovaných látek je právě identifikace
sloučenin, které vykazují zdraví prospěšné účinky. Na druhé straně výběr experimentálního modelu a schéma experimentu, včetně dávek a doby aplikace, má velký vliv na extrapolaci výsledků laboratorních experimentů na člověka. U člověka
může probíhat naprosto odlišně absorpce, metabolismus a biologická využitelnost aktivních látek. Také jejich působení proti vzniku nádorového onemocnění může být
odlišné, některé působí jako tumor supresivní látky, zabraňující rozvoji nádorového onemocnění, některé jako blokující činitelé, které zabraňují tvorbě rakovinných buněk
proti konkrétnímu mutagenu, který však nemusí tímto způsobem působit u člověka. Navíc se ve studiích na zvířatech často používají velmi vysoké dávky biologicky
aktivních látek a také mutagenů, které člověk není schopen přirozenou cestou přijmout a účinek takové látky v mnohem nižší dávce může být zcela odlišný. Některé biologicky
aktivní látky působí v nízkých dávkách chemopreventivně, nicméně ve vysokých 123
dávkách mohou mít účinky zcela opačné (např. kyseliny kávová, kumarová, tříslová, vanillová, chrysin či isothiokyanáty) (Knasmüller et al., 2002). Doposud je zřejmé, že
biologicky aktivní látky obsažené v ovoci a zelenině se mohou společně podílet na
jejich antikarcinogenním působení. Na druhé straně však neexistuje komplexní
zhodnocení všech aspektů mezi prevencí nádorového onemocnění a konzumací např. zeleniny z čeledě Brassicaceae. Jsme stále daleko od porozumění chemopreventivních
účinků látek působících v brukvovité zelenině a jejich celkovému mechanismu akcí vedoucích k protektivním účinkům (Murillo a Mehta, 2001). Proto je nezbytné se nadále systematicky věnovat studiu jejich chemopreventivních vlastností.
124
6 Závěr
Z řady zpracovaných studií uvedených v teoretické části vyplývá, že ovoce a
zelenina i nutričně významné látky v nich obsažené vykazují chemopreventivní účinky. Stále však není zcela jasné, které z biologicky aktivních látek působí nejvíce protektivně
proti nádorovému onemocnění, neboť zelenina a ovoce představují komplexní směs látek, jejichž účinky se vzájemně prolínají.
Stanovené cíle, popsané v experimentální části, se podařilo disertační prací naplnit.
Posoudili jsme antimutagenní potenciál biologicky aktivních látek obsažených v brukvovité zelenině a dále brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem. Rovněž jsme
zhodnotili vliv sulforafanu a indol-3-karbinolu na fagocytární aktivitu myších leukocytů.
Dílčí úkoly byly splněny a závěry z nich lze shrnout takto: 1. V prvním a druhém experimentu jsme se zaměřili na izolované látky obsažené v brukvovité zelenině. Přičemž jsme vybrali sulforafan, jako potencionálně
nejmocnější isothiokyanát nalézající se v této zelenině a dále indol-3-karbinol, také široce studovanou složku zastoupenou v brukvovité zelenině. Porovnávali
jsme jejich antimutagenní aktivitu ve vztahu k referenčním mutagenům (IQ a
MNU). Prokázali jsem statisticky významné antimutagenní účinky testovaných látek.
2. V třetím experimentu jsme porovnávali antimutagenní aktivitu brokolicové
šťávy ošetřené vysokým tlakem. Vybrali jsme stejné referenční mutageny, ve stejných dávkách, jako v prvním a druhém experimentu. Podařilo se nám
prokázat schopnost brokolicové šťávy potlačit klastogenní potenciál vybraných
mutagenů. Při srovnání těchto výsledků se závěry studií jiných autorů jsme dospěli k podobným závěrům.
3. Vzhledem k nedostatečnému studiu antioxidačních a imunomodulačních
vlastností biologicky aktivních látek, konkrétně glukosinolátů jsme se rozhodli, jako třetí úkol, zhodnotit vliv sulforafanu a indol-3-karbinolu na fagocytární
aktivitu myších leukocytů a také na počty imunokompetentních buněk. 125
Aplikované látky nezvyšovaly počty imunokompetentních buněk s výjimkou
mírného zvýšení po aplikaci vyšší dávky indol-3-karbinolu.. Fagocytární aktivita
myších leukocytů nebyla po jejich aplikaci ve vztahu ke kontrole změněna. Naopak indol-3-karbinol měl tendenci tuto aktivitu ještě snižovat, nicméně
snížení bylo statisticky významné pouze u vyšší z aplikovaných dávek. V
kombinaci s mutageny sulforafan nepotlačoval produkci reaktivních forem kyslíku. Indol-3-karbinol nepřinesl přesvědčivé výsledky, neboť v nižší dávce snižoval
a naopak ve vyšší dávce zvyšoval fagocytární aktivitu myších
leukocytů ve vztahu k MNU. Výsledky chemiluminiscenčního testu nebyly jednoznačné a jejich interpretace bývá vždy komplikovaná.
4. Předposledním dílčím úkolem bylo rozšíření nabídky krátkodobých testů mutagenity v laboratoři Ústavu preventivního lékařství MU zavedením námi
použité metody - mikronukleus testu in vivo. Tento úkol byl také úspěšně splněn. 5. Pátý úkol představoval zavedení chemiluminiscenčního testu v laboratoři Ústavu preventivního lékařství MU. I poslední úkol byl úspěšně splněn.
Při kontrolním posuzování žádné z testovaných látek nevykazovaly v mikronukleus
testu in vivo mutagenní účinky. Naopak se projevily silné antimutagenní účinky
aplikovaných látek a tyto výsledky jsou v souladu s literaturou. Nicméně se nám nepodařilo jednoznačně stanovit vliv isothiokyanátů na aktivitu imunitního systému a
proto by bylo vhodné tyto výsledky ověřit v dalších experimentech, za použití specifičtějších metod.
126
7 Souhrn
Cíl: Předložená disertační práce hodnotí výsledky studia antimutagenních vlastností
biologicky aktivních látek zastoupených v zelenině a ovoci a také brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem. Část výzkumu byla zaměřena na hodnocení vlivu vybraných biologicky aktivních látek na imunitní systém myší.
Materiál a metodika: Pro hodnocení antimutagenních vlastností byl vybrán krátkodobý
test mutagenity – mikronukleus test in vivo. Pro hodnocení vlivu na
imunitní systém myší jsme zvolili chemiluminiscenční test – chemiluminometrické měření fagocytární aktivity myších leukocytů.
Pro testování byly vybrány látky nejvíce zastoupené v brukvovité zelenině –
sulforafan a indol-3-karbinol, látky s potencionálními chemopreventivními účinky. Pro testování byly zvoleny následující dávky – sulforafan - 3 µmol na jedno testované zvíře,
indol-3-karbinol - 250 a 125 mg.kg-1. Pro další testování jsme vybrali ze zeleniny rodu Brassicaceae brokolici, konkrétně brokolicovou šťávu ošetřenou vysokým tlakem.
Tento způsob technologické úpravy by měl vést k zachování biologicky aktivních látek, což bylo potvrzeno chemickými analýzami.
Jako modelové mutageny byly vybrány dvě látky. Nepřímý mutagen, vyžadující
metabolickou aktivaci v organismu - 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-chinolin
(IQ) a přímý mutagen - N-nitroso-N-methylurea (MNU). Obě tyto sloučeniny, jak IQ ze
skupiny heterocyklických aminů, tak MNU patřící do skupiny N-nitrososloučenin, vznikají během tepelného zpracování typické západní stravy s vysokým obsahem červeného masa a živočišného tuku.
Ve všech experimentech byly použiti samci BALB/C inbredních myší o průměrné
hmotnosti 18 – 20 gramů a stáří 7 - 10 týdnů. Zvířata byla randomizovaně rozdělena do skupin po 5 - 8 subjektech. Vybraným pokusným skupinám byly perorálně aplikovány testované látky dle jednotlivých pokusů, vždy 1 x denně, ráno v 9 hodin. Biologicky aktivní látky byly podávány po dobu tří dnů, brokolicová šťáva čtrnáct dnů.
Výsledky: Z provedených experimentů vyplývá, že vybrané biologicky aktivní látky
potlačují klastogenní vliv aplikovaných mutagenů. Pokud byly pro kontrolu aplikovány
samostatně, nevedly ke zvýšení počtu mikrojader. Podobné výsledky byly zjištěny i pro
127
brokolicovou šťávu ošetřenou vysokým tlakem. Opět došlo k silné inhibici mutagenity obou aplikovaných mutagenů.
Fagocytární aktivita myších leukocytů nebyla po administraci sulforafanu změněna.
To znamená, že podávání sulforafanu v dané dávce neovlivňuje žádným způsobem
tvorbu reaktivních forem kyslíku. V chemiluminiscenčním testu vedla aplikace obou dávek indol-3-karbinolu ke snížení chemiluminiscenční křivky, přičemž ve vyšší dávce bylo toto snížení statisticky významné. Tento výsledek lze vyložit dvojím způsobem,
buď indol-3-karbinol indukuje aktivitu antioxidačních enzymů rychleji než sulforafan, nebo může vykazovat imunosupresivní vlastnosti.
Závěry: Z výsledků vyplývá, že zkoumané biologicky aktivní látky i brokolicová šťáva
ošetřená vysokým tlakem zcela potlačují klastogenní vliv aplikovaných mutagenů, které se mohou uplatnit jako genotoxické agens přítomné v prostředí. Výsledky naznačují, že
nové technologické postupy aplikované na potraviny mohou sloužit ke zlepšení zdraví prospěšných vlastností.
Klíčová slova: sulforafan, indol-3-karbinol, antimutagenní aktivita, glukosinoláty,
polyfenoly.
128
Summary
Background: This dissertation thesis evaluates the results of research of antimutagenic
properties of biological active substances contained in vegetable and fruit and
antimutagenic properties of broccoli juice treated by high pressure. Part of research was
concentred on evaluation of influence of chosen biologically active substances on imunne system of mice.
Methods and material: For evaluation of antimutagenic properties were choosen shortterm test of mutagenicity – micronucleus assay in vivo. For evaluation of influence on imunne system of mice we chose chemiluminescence assay – chemiluminometric measurement of phagocyte activity of mouse leucocytes.
We chose for testing the two substances which are in cruciferous vegetable in the
highest amount – sulforaphane and indole-3-carbinol, substances with possible
chemopreventive activity. We chose following doses for testing – sulforaphane - 3 µmol per one animal, indol-3-carbinol – 250 a 125 mg.kg-1. For other experiments we
chose from cruciferous vegetable – broccoli, rather broccoli juice treated by high pressure. This method of technological preparation should lead to conservation of nutritionally important substances which was confirmed by chemical analysis.
We selected as a reference mutagen two substances: indirectly acting mutagen - 2-
amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f)-quinoline (IQ) and direct acting mutagen – N-
nitroso-N-methylurea (MNU). These mutagenic compounds, both IQ which belongs to the group of heterocyclic amines and MNU belonging to the group of Nnitrosocompounds, emerging at thermal treatment of high-protein food with high amount of red meat an animal fat.
All in vivo experiments were carried out on 7 – 10 weeks old male BALB/C mice,
each weighing 18 – 20 g. These animals were divided into groups containing 5 – 8 mice. The tested substances were applied to the selected group of animals per os by
gavage once a day, in the morning at 9 o´clock. Biologically active substances were aplied 3 times in one-day intervals, broccoli juice treated by high pressure 14 times in one-day intervals.
Results: It appears from experiments that chosen biologically active substances inhibite
clastogenic effect of applied mutagens. If we applied only this active substances 129
without mutagens for control, they didn´t change the number of micronuclei in
comparison with negative control. We could study the same results for brocolli juice
treated by high pressure. Again we should see the strong inhibition of clastogenic effect of applied mutagens.
Phagocyte activity of mice leucocytes wasn´t change after 14 days apllication of
sulforaphane. It means that the apllication of sulforaphane in a given dose doesn´t influence the formation of reactive oxygen species. The application both doses of
indole-3-carbinol led to decrease of chemiluminescence curve whereas higher dose of indol-3-carbinol led to statistically significant decrease. These results bring double
explanation. Either indol-3-carbinol induces activity of antioxidant enzyme quicker than sulforaphane or it can show imunosupressive properties.
Conclusion: From these results we can deducate that chosen biologically active
substances and broccoli juice treated by high pressure quite inhibite clastogenic activity
of applied mutagens, which can come across as a genotoxic agent present at the environment. The results indicate that the new technological procedures applied on food should help to improve health beneficial properties.
Key words: sulforaphane, indole-3-carbinol, antimutagenic activity, glucosinolates,
polyphenols.
130
8 Seznam použité literatury ADLERCREUTZ H., MAZUR W. Phyto-oestrogens and western diseases. Ann. Med.,
1997, roč. 29, č. 2, s. 95-120.
ADLERCREUTZ H. Phytoestrogens. State of the art. Environ. Toxicol. Pharmacol., 1999, roč. 7, č. 3, s. 201-207.
AGARWAL A., Chemiluminescence technique for measuring reactive oxygen species. RBM Online, 2004, roč. 9, č. 4, s. 466-468.
AGGARWAL B.B., BHARDWAJ A., AGGARWAL R.S., SEERAM N.P., SHISHODIA S., TAKADA Y. Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies. Anticancer Res., 2004, roč. 24, č. 5A, s. 2783-2840.
AGRAWAL R.C., KUMAR S. Prevention of cyclophosphamide-induced micronucleus
formation in mouse bone marrow by indole-3-carbinol. Food Chem. Toxicol., 1998, roč.
36, č. 11, s. 975-977.
AHMAD N., MUKHTAR H. Green tea polyphenols and cancer: biologic mechanisms and practical implications. Nutr. Rev., 1999, roč. 57, č. 3, s. 78-83.
ANDERTON M.J., MANSON M.M., VERSCHOYLE R.D., GESCHER A., LAMB
J.H., FARMER P.B., STEWARD W.P., WILLIAMS M.L. Pharmacokinetics and tissue
disposition of indole-3-carbinol and its acid condensation products after oral administration to mice. Clin. Cancer Res., 2004, roč. 10, č. 15, s. 5233-5241.
ARIZA R.R., SERRANO A., PUEYO C. Direct-acting mutagenic activity in white,
rose, and red wines with the Ara test of Salmonella typhimurium. Environ. Mol.
Mutagen., 1992, roč. 19, č. 1, s. 14-20.
BARCELO S., GARDINER J.M., GESCHER A., CHIPMAN J.K. CYP2E1-mediated mechanism
of
anti-genotoxicity
of
the
Carcinogenesis, 1996, roč. 17, č. 2, s. 277-282. 131
broccoli
constituent
sulforaphane.
BARILLARI J., CANISTRO D., PAOLINI M., FERRONI F., PEDULLI G.F., IORI R., VALGIMIGLI L. Direct antioxidant activity of purified glucoerucin, the dietary
secondary metabolite contained in rocket (Eruca sativa Mill.) seeds and sprouts. J.
Agric. Food Chem., 2005, roč. 53, č. 7, s. 2475-2482.
BARNES S. Evolution of the health benefits of soy isoflavones. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1998, roč. 217, č. 3, s. 386-392.
BARNES S. Soy isoflavones – Phytoestorogens and what else? J. Nutr., 2004, roč. 134, č. 5, s. 1225-1228.
BÁRTA I., POLÍVKOVÁ Z., ŠMERÁK P., ŠESTÁKOVÁ H., LANGOVÁ M., BÁRTOVÁ J., TUREK B., ANDĚL M. Paralelní testování antimutagenní a
imunomodulační aktivity látek přírodního původu v prevenci karcinogeneze. In Sborník. Jesenné pracovné dni české a slovenské společnosti pro mutagenezu zevním
prostředím. Česká a slovenská společnost pro mutagenezu zevním prostředím, Bratislava, 2003, s. 14.
BÁRTA I., ŠMERÁK P., ŠESTÁKOVÁ H., POLÍVKOVÁ Z., ŠTĚTINA R., BÁRTOVÁ J., TUREK B., LANGOVÁ M. Antimutagenní účinek epigalokatechin
galátu a jeho efekt na imunitní reakci u myší. In Sborník. Aktuální problematika genetické toxikologie. NCONZO, Brno, 2005, s. 37-38. ISBN 80-7013-421-6.
BÁRTA I., ŠMERÁK P., POLÍVKOVÁ Z., ŠESTÁKOVÁ H., LANGOVÁ M., TUREK B., BÁRTOVÁ J. Current trends and perspectives in nutrition and cancer prevention. Neoplasma, 2006, roč. 53, č. 1, s. 19- 25.
BASTEN G.P., BAO Y., WILLIAMSON G. Sulforaphane and its glutathione conjugate
but not sulforaphane nitrile induce UDP-glucuronosyl transferase (UGT1A1) and
glutathione transferase (GSTA1) in cultured cells. Carcinogenesis, 2002, roč. 23, č. 8, s. 1399-1404.
BELL J.R., DONOVAN J.L., WONG R., WATERHOUSE A.L., GERMAN J.B.,
WALZEM R.L., KASIM-KARAKAS S.E. (+)-Catechin in human plasma after 132
ingestion of a single serving of reconstituted red wine. Am. J. Clin. Nutr., 2000, roč. 71, č. 1, s. 103-108.
BIRT D.F., WALKER B., TIBBELS M.G., BRESNICK E. Anti-mutagenesis and anti-
promotion by apigenin, robinetin and indole-3-carbinol. Carcinogenesis, 1986, roč. 7, č. 6, s. 959-963.
BLOCK G., PATTERSON B., SUBAR A. Fruit, vegetables, and cancer prevention: a review of the epidemiologic evidence. Nutr. Cancer, 1992, roč. 18,č. 1, s. 1-29.
BONNESEN C., EGGLESTON I.M., HAYES J.D. Dietary indoles and isothiocyanates that are generated from cruciferous vegetables can both stimulate apoptosis and confer protection against DNA damage in human colon cell lines. Cancer Res., 2001, roč. 61, č. 16, s. 6120-6130.
BOULTON D.W., WALLE U.K., WALLE T. Extensive binding of the bioflavonoid
quercetin to human plasma proteins. J. Pharm. Pharmacol., 1998, roč. 50, č, 2, s. 243d249.
BRAVO L. Polyphenols: Chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutr. Rev., 1998, roč. 56, č. 11, s. 317-333.
BRESNICK E., BIRT D.F., WOLTERMAN K., WHEELER M., MARKIN R.S. Reduction in mammary tumorigenesis in the rat by cabbage and cabbage residue. Carcinogenesis, 1990, roč. 11, č. 7, s. 1159-1163.
BROWNSON D.M., AZIOS N.G., FUQUA B.K., DHARMAWARDHANE S.F.,
MABRY T.J. Flavonoid effects relevant to cancer. J. Nutr., 2002, roč. 132, č. 11, s. 3482-3489.
BULL P., YANEZ L., NERVI F. Mutagenic substances in red and white wine in Chile, a high risk area for gastric cancer. Mutat. Res., 1987, roč. 187, č. 3, s. 113-117.
133
BURDA S., OLESZEK W., LEE C.Y. Phenolic compounds and their changes in apples
during maturation and cold storage. J. Agric. Food Chem., 1990, roč. 38, č. 4, s. 945-
948.
CAO G., SOFIE E., PRIOR R.L. Antioxidant and prooxidant behaviour flavonoids: structure-activity relationships. Free Radical Biol. Med., 1997, roč. 22, č. 5, s. 749-760.
CONAWAY C.C., GETAHUN S.M., LIEBES L.L., PUSATERI D.J., TOPHAM D.K., BOTERO-OMARY M., CHUNG F.L. Disposition of glucosinolates and sulforaphane
in humans after ingestion of steamed and fresh broccoli. Nutr. Cancer, 2000, roč. 38, č. 2, s. 168-178.
CONAWAY C.C., YANG
Y.M., CHUNG F.L. Isothiocyanates as
cancer
chemopreventive agents: their biological activities and metabolism in rodents and humans. Curr. Drug Metabol., 2002, roč. 3, č. 3, s. 233-255.
CONAWAY C.C., WANG C.X., PITTMAN B., YANG Y.M., SCHWARTZ J.E., TIAN D., MCINTEE E.J., HECHT S.S., CHUNG F.L. Phenethyl isothiocyanate and
sulforaphane and their N-acetylcysteine conjugates inhibit malignant progression of
lung adenomas induced by tobacco carcinogens in A/J mice. Cancer Res., 2005, roč. 65, č. 18, s. 8548-8557.
COTELLE N., BERNIER J.L., CATTEAU J.P., POMMERY J., WALLET J.C.,
GAYDOU E.M. Antioxidant properties of hydroxy-flavones. Free Radic. Biol. Med.,
1996, roč. 20, č. 1, s. 35-43.
ČERNÁ M. Čaj a jeho chemopreventivní účinky. DMEV, 2002, roč. 5, č. 3, s. 178-182. ČOPÍKOVÁ J. Čokoláda a zdraví. Chem. Listy, 2001, roč. 95, č. 10, s. 610-615. DE VRIES J.H., JANSSEN P.L., HOLLMAN P.C., VAN STAVEREN W.A., KATAN
M.B. Consumption of quercetin and kaempferol in free-living subjects eating a variety of diets. Cancer Lett., 1997, roč. 114, č. 1-2, s. 141-144. 134
DE BOER J.G. Protection by dietary compounds against mutation in a transgenic rodent. J. Nutr., 2001, roč. 131, Suppl. 11, s. 3082-3086.
DELL´AGLI M., BUSCIALA A., BOSISIO E. Vascular effects of wine polyphenols. Cardiovasc. Res., 2004, roč. 63, č. 4, s. 593-602.
DIXIT R., GOLD B. Mechanism of inhibition of N-methyl-N-nitrosourea-induced
mutagenicity and DNA binding by ellagic acid. IARC Sci. Publ., 1987, č. 84, s. 197199.
DRAGSTED L.O., STRUBE M., LETH T. Dietary levels of plant phenols and other
non-nutritive components: could they prevent cancer? Eur. J. Cancer Prev., 1997, roč. 6, č. 6, s. 522-528.
DREWNOWSKI A., GOMEZ-CARNEROS C. Bitter taste, phytonutrients, and the consumer: a review. Am. J. Clin. Nutr., 2000, roč. 72, č. 6, s. 1424-1435.
DUTHIE G.G., GARDNER P.T., KYLE J.A. Plant polyphenols: are they the new magic bullet? Proc. Nutr. Soc., 2003, roč. 62, č. 3, s. 599-603.
EDENHARDER R., VON PETERSORFF I., RAUSCHER R. Antimutagenic effects of
flavonoids, chalcones and structurally related compounds on the activity of 2-amino3methylimidazo[4,5-f]quinoline (IQ) and other heterocyclic amine mutagens from cooked food. Mutat. Res., 1993, roč. 287, č. 2, s. 261-274.
EDENHARDER R., KURZ P., JOHN K., BURGARD S., SEEGER K. In vitro effect of
vegetable and fruit juices on the mutagenicity of 2-amino-3-methylimidazo[4,5f]quinoline,
2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline
and
2-amino-3,8-
dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline. Food Chem. Toxicol., 1994, roč. 32, č. 5, s. 443459.
EDENHARDER R., LEOPOLD C., KRIES M. Modifying actions of solvent extracts from fruit and vegetable residues on 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline (IQ) a 2135
amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline
(MeIQx)
induced
mutagenesis
Salmonella typhimurium TA 98. Mutat. Res., 1995, roč. 341, č. 4, s. 303-318.
in
EDENHARDER R., FRANGART J., HAGER M., HOFMANN P., RAUSCHER R. Protective effects of fruits and vegetables against in vivo clastogenicity of
cyclophosphamide or benzo[a]pyrene in mice. Food Chem. Toxicol., 1998, roč. 36, č. 8, s. 637-645.
EDENHARDER R., KRIEG H., KÖTTGEN V., PLATT K.L. Inhibition of clastogenicity of benzo[a]pyrene and of its trans-7,8-dihydrodiol in mice in vivo by
fruits, vegetables, and flavonoids. Mutat. Res., 2003, roč. 537, č. 2, s. 169-181.
FAHEY J.W., ZHANG Y., TALALAY P. Broccoli sprouts: An exceptionally rich
source of inducers of enzymes that protect against chemical carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, roč. 94, č. 19, s. 10367-10372.
FAHEY J.W., ZALCMANN A.T., TALALAY P. The chemical diversity and
distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry, 2001, roč. 56, č. 1, s. 5-51.
FAHEY J.W., HARISTOY X., DOLAN P.M., KENSLER T.W., SCHOLTUS I., STEPHENSON K.K., TALALAY P., LOZNIEWSKI A. Sulforaphane inhibits
extracellular, intracellular, and antibiotic-resistant strains of Helicobacter pylori and
prevents benzo[a]pyrene-induced stomach tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, roč. 99, č. 11, s. 7610-7615.
FAITOVÁ K., HEJTMÁNKOVÁ A., LACHMAN J., PIVEC V., DUDÁK J. The
contents of total polyphenolic compounds and trans-resveratrol in white Riesling
originated in the Czech Republic. Czech J. Food Sci., 2004, roč. 22, č. 6, s. 215-221.
FERGUSON L.R., LIM I.F., PEARSON A.E., RALPH J., HARRIS P.J. Bacterial
antimutagenesis by hydroxycinnamic acids from plant cell walls. Mutat. Res., 2003, roč. 542, č. 1-2, s. 49-58.
136
FIALA J. Výživa a riziko rakoviny – část II: Aktuální výživová doporučení pro prevenci rakoviny. Výživa a potraviny, 2004, roč. 59, č. 2, s. 30-33.
FIMOGNARI C., NÜSSE M., BERTI F., IORI R., CANTELLI-FORTI G., HRELIA P. Isothiocyanates as novel cytotoxic and cytostatic agents: molecular pathway on human
transformed and non-transformed cells. Biochem. Pharmacol., 2004, roč. 68, č. 6, s. 1133-1138.
FIMOGNARI C. BERTI F., IORI R. CANTELLI-FORTI G., HRELIA P. Micronucleus
formation and induction apoptosis by different isothiocynates and a mixture of
isothiocyanates in human lymphocyte cultures. Mutat. Res., 2005, roč. 582, č. 1-2, s. 110.
FINLEY J.W. The antioxidant responsive element (ARE) may explain the protective effects of cruciferous vegetables on cancer. Nutr. Rev., 2003, roč. 61, č. 7, s. 250-254.
FOWKE J.H., LONGCOPE CH., HEBERT J.R. Brassica vegetable consumption shifts
estrogen metabolism in healthy postmenopausal women. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2000, roč. 9, č. 8, s. 773-779.
FREMONT L. Biological effects of resveratrol. Life Science, 2000, roč. 66, č. 8, s. 663-
673.
FRYDOONFAR H.R., MCGRATH D.R., SPIGELMAN A.D. The effect of indole-3-
carbinol and sulforaphane on a prostate cancer cell line. A.N.Z.J. Surg., 2003, roč. 73, č.
3, s. 154-156.
FUHRMAN B., LAVY A., AVIRAM M. Consumption of red wine with meals reduces
the susceptibility of human plasma and low-density lipoprotein to lipid peroxidation. Am. J. Clin. Nutr., 1995, roč. 61, č. 3, s. 549-554.
GEE J.M., JOHNSON I.T. Polyphenolic compounds: interactions with the gut and implications for human health. Curr. Med. Chem., 2001, roč. 8, č. 11, s. 1245-1255. 137
GERHAUSER C., YUM M., LIU J., MORIARTY R.M., HAWTHORNE M., MEHTA
R.G., MOON R.C., PEZZUTO J.M. Cancer chemopreventive potential of sulforamate, a novel analogue of sulforaphane that induces phase 2 drug-metabolizing enzymes. Cancer Res., 1997, roč. 57, č. 2, s. 272-278.
GETAHUN S.M., CHUNG F.L. Conversion of glucosinolates to isothiocyanates in
human after ingestion of cooked watercress. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.,
1999, roč. 8, č. 5, s. 447-451.
GIOVANNUCCI E., RIMM E.B., LIU Y., STAMPFER M.J., WILLETT W.C. A
prospective study of cruciferous vegetables and prostate cancer. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2003, roč. 12, č. 12, s. 1403-1409.
GISCHNER T., POSPISIL F., VELEMINSKY J., VOLKEOVA V., VOLKE J. Two types of antimutagenic effects of gallic and tannic acids towards N-nitroso-compounds-
induced mutagenicity in Ames Salmonella assay. Folia Microbiol., 1987, roč. 32, č. 1, s. 55-62.
GOLDMAN R., SHIELDS P.G. Food mutagens. J. Nutr., 2003, roč. 133, Suppl. 13, s.
965-973.
GONTHIER M.P., DONOVAN J.L., TEXIER O., FELGINES C., REMESY CH.,
SCALBERT A. Metabolism of dietary procyanidins in rats. Free Radical Biol. Med., 2003, roč. 35, č. 8, s. 837-844.
GRAEFE E.U., DERENDORF H., VEIT M. Pharmacokinetics and biovavailability of
the flavonol quercetin in humans. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 1999, roč. 37, č. 5, s. 219-233.
GRAHAM S., DAYAL H., SWANSON M., MITTELMAN A., WILKINSON G. Diet
in the epidemiology of cancer of the colon and rectum. J. Natl. Cancer Inst., 1978, roč. 61, č. 3, s. 709-714.
138
GREENWALD P., CLIFFORD C.K., MILNER J.A. Diet and cancer prevention. Eur. J. Cancer, 2001, roč. 37, č. 8, s. 948-965. GREENWALD
P.,
MILNER
J.A.,
ANDERSON
D.E.,
MCDONALD
S.S.
Micronutrients in cancer chemoprevention. Cancer Metastasis Rev., 2002, roč. 21, č. 34, s. 217-230.
GRUBBS C.J., STEELE V.E., CASEBOLT T., JULIANA M.M., ETO I., WHITAKER
L.M., DRAGNEV K.H., KELLOFF G.J., LUBET R.L. Chemoprevention of
chemically-induced mammary carcinogenesis by indole-3-carbinol. Anticancer Res.,
1995, roč. 15, č. 3, s. 709-716.
GUO D., SCHUT H.A., DAVIS C.D., SNYDERWINE E.G., BAILEY G.S., DASHWOOD R.H. Protection by chlorophyllin and indole-3-carbinol against 2-amino1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced DNA adducts and colonic
aberrant crypts in the F344 rat. Carcinogenesis, 1995, roč. 16, č. 12, s. 2931-2937. HACKETT A.M., GRIFFITHS L.A., BROILLET A., WERMEILLE M. The
metabolism and excretion of (+)-[14C]cyanidanol-3 in man following oral administration. Xenobiotica, 1983, roč. 13, č. 5, s. 279-286.
HE Y.H, SMALE M.H., SCHUT H.A. Chemopreventive properties of indole-3-carbinol
(I3C): inhibition of DNA adduct formation of the dietary carcinogen, 2-amino-1-
methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP),in female F344 rats. J. Cell. Biochem. Suppl., 1997, roč. 27, s. 42-51.
HEBER D. Vegetables, fruits and phytoestrogens in the prevention of diseases. J. Postgrad. Med., 2004, roč. 50, č. 2, s. 145-149.
HECHT S.S. Chemoprevention of cancer by isothiocyanates, modifiers of carcinogen metabolism. J. Nutr., 1999, roč. 129, č. 3, s. 768-774.
HECHT S.S., Inhibition of carcinogenesis by isothiocyanates. Drug Metabol. Rev., 2000, roč. 32, č. 3-4, s. 395-411.
139
HECHT S.S., KENNEY P.M.J., WANG M., UPADHYAYA P. Benzyl isothiocynate: an effective inhibitor of polycyclic aromatic hydrocarbon tumorogenesis in A/J mouse lung. Cancer Lett., 2002, roč. 187, č. 1-2, s. 87-94.
HERTOG M.G., HOLLMAN P.C., KATAN M.B., KROMHOUT D. Intake of potentially anticarcinogenic flavonoids and their determinants in adults in the Netherlands. Nutr. Cancer., 1993, roč. 20, č. 1, s. 21-29.
HERTOG M.G., KROMHOUT D., ARAVANIS C., BLACKBURN H., BUZINA R.,
FIDANZA F., GIAMPAOLI S., JANSEN A., MENOTTI A., NEDELJKOVIC S., PEKKARIEN M., SIMIC B., TOSHIMA H., FESKENS E.J., HOLLMAN P.C.,
KATAN M.B. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the Seven Countries Study. Arch. Intern. Med., 1995, roč. 155, č. 4, s. 381-386.
HOLLMAN P.C., GAAG M.V., MENGELERS M.J., VAN TRIJP J.M., DE VRIES J.H., KATAN M.B. Absorption and disposition kinetics of the dietary antioxidant quercetin in man. Free Radical Biol. Med., 1996, roč. 21, č. 5, s. 703-707.
HOLLMAN P.C. Bioavailability of flavonoids. Eur. J. Clin. Nutr., 1997a, roč. 51, Suppl. 1, s. 66-69.
HOLLMAN P.C., VAN TRIJP J..M., BUYSMAN M.N., VAN DER GAAG M.S., MENGELERS M.J., DE VRIES J.H., KAAN M.B. Relative biovailability of the
antioxidant flavonoid quercetin from various foods in man. FEBS Lett.,1997b, roč. 418,
č. 1-2, s. 152-156.
HOUR T.C., LIANG Y.C., CHU I.S., LIN J.K. Inhibition of eleven mutagens by various tea extracts, (-)-epigallocatechin-3-gallate, gallic acid and caffeine. Food Chem. Toxicol., 1999, roč. 37, č. 6, s. 569-579.
HOUŠKA M., STROHALM J., TOTUŠEK J., LEFNEROVÁ D., TŘÍSKA J., VRCHOTOVÁ N., KOCUROVÁ K., FENCL T., HOLASOVÁ M., FIEDLEROVÁ V., GABROVSKÁ D., PAULÍČKOVÁ I., PRŮCHOVÁ J., CHALOUPKOVÁ J. Směsná 140
zeleninová šťáva a její složky. Výzkumná zpráva č. 8/360/2004. VÚPP: Praha, 2004, 36 s.
HUGHES R., POLLOCK J.R., BINGHAM S. Effect of vegetables, tea, and soy on endogenous N-nitrosation, fecal ammonia, and fecal water genotoxicity during a high red meat diet in humans. Nutr. Cancer., 2002, roč. 42, č. 1, s. 70-77.
HUMBLOT C., LHOSTE E., KNASMÜLLER S. HUMBLOT C., GLOUX K., BRUNEAU A., BENSAADA M., DURAO J., RABOT S., ANDRIEUX C., KASSIE F.
Protective effect of Brussels sprouts, oligosaccharides and fermented milk towards 2amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline (IQ)-induced genotoxicity in the human flora
associated F344 rat: role of xenobiotic metabolising enzymes and intestinal microflora. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2004, roč. 802, č. 1, s. 231-237.
CHEN C., KONG A.N. Dietary cancer-chemopreventive compounds: from signalin and
gene expression to pharmacological effects. TRENDS Pharmacol. Sci., 2005, roč. 26, č.
6, s. 318-326.
CHEN X., YIN O.Q., ZUO Z., CHOW M.S. Pharmacokinetics and modeling of quercetin and metabolites. Pharm. Res., 2005, roč. 22, č. 6, s. 892-901.
CHIAO J.W., WU H., RAMASWAMY G., CONAWAY C.C., CHUNG F.L., WANG L., LIU D. Ingestion of an isothiocyanate metabolite from cruciferous vegetables inhibits growth of human prostate cancer cell xenografts by apoptosis and cell cycle arrest. Carcinogenesis, 2004, roč. 25, č. 8, s. 1403-1408.
CHUNG F.L., CONAWAY C.C., RAO C.V., REDDY B.S. Chemoprevention of
colonic abberant crypt foci in Fischer rats by sulforaphane and phenethyl isothiocynate. Carcinogenesis, 2000, roč. 21, č. 12, s. 2287-2291.
IELPO M.T., BASILE A., MIRANDA R., MOSCATIELLO V., NAPPO C., SORBO S.,
LAGHI
E.,
RICCIARDI
M.M.,
RICCIARDI
L.,
VUOTTO
M.L.
Immunopharmacological properties of flavonoids. Fitoterapia, 2000, roč. 71, Suppl. 1, s. 101-109.
141
IGNATOWICZ E., BAER-DUBOWSKA W. Resveratrol, a natural chemopreventive agent against degenerative disease. Pol. J. Pharmacol., 2001, roč. 53, č. 6, s. 557-569.
ISRAEL K., YU W., SANDERS B.G., KLINE K. Vitamin E succinate induces apoptosis in human prostate cancer cells: role for Fas in vitamin E succinate-triggered apoptosis. Nutr. Cancer, 2000, roč. 36, č. 1, s. 90–100.
JACKSON S.J., SINGLETARY K.W. Sulforaphane: a naturally occurring mammary
carcinoma mitotic inhibitor, which disrupts tubulin polymerization. Carcinogenesis,
2004, roč. 25, č. 2, s. 219-227.
KALAČ P. Současný výzkum antikarcinogenních složek potravin. Výživa a potraviny.
2001, roč. 56, č. 3, s. 66-67.
KANG J.S., KIM D.J., AHN B., NAM K.T., KIM K.S., CHOI M., JANG D.D. Post-
initiation treatment of indole-3-carbinol did not supress N-methyl-N-nitrosourea induced mammary carcinogenesis in rats. Cancer Lett., 2001, roč. 169, č. 2, s. 147-154.
KAPIOTIS S., HERMANN M., HELD I., SEELOS C., EHRINGER H., GMEINER B.M. Genistein, the dietary-derived angiogenesis inhibitor, prevent LDL oxidationn and
protects endothelial cells from damage by atherogenic LDL. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1997, roč. 17, č. 11, s. 2868-2874.
KASSAHUN K., DAVIS M., HU P., MARTIN B., BAILLIE T. Biotransformation of
the naturally occuring isothiocyanate sulforaphane in the rat: identification of phase I
metabolites and glutathione conjugates. Chem. Res. Toxicol., 1997, roč.10, č. 11, s. 1228–1233.
KASSIE F., PARZEFALL W., MUSK S., JOHNSON I., LAMPRECHT G., SONTAG
G., KNASMÜLLER S. Genotoxic effects of crude juices from Brassica vegetables and
juices and extracts form phytopharmaceutical preparations and spices of cruciferous
plants origin in bacterial and mammalian cells. Chem. Biol. Interact., 1996, roč. 102, č.
1, s. 1-16.
142
KASSIE F., POOL-ZOBEL B., PARZEFALL W., KNASMÜLLER S. Genotoxic
effects of benzyl isothiocyanate, a natural chemopreventive agent. Mutagenesis, 1999,
roč. 14, č. 6, s. 595-604.
KASSIE F, KNASMÜLLER S. Genotoxic effects of allyl isothiocyanates (AITC) and
phenethyl isothiocyanates (PEITC). Chem. Biol. Interact., 2000, roč. 127, č. 2, s. 163180.
KASSIE F., UHL M., RABOT S. GRASL-KRAUPP B., VERKERK R., KUNDI M., CHABICOVSKY
M.,
SCHULTE-HERMANN
R.,
KNASMÜLLER
S.
Chemoprevention of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline (IQ)-induced colonic
and hepatic preneoplastic lesions in the F344 rat by cruciferous vegetables administered simultaneously with the carcinogen. Carcinogenesis, 2003, roč. 24, č. 2, s. 255-261.
KECK A.S., QIAO Q., JEFFERY E.H. Food matrix effects on bioactivity of broccoli-
derived sulforaphane in liver and colon of F344 rats. J. Agric. Food. Chem., 2003, roč. 51, č. 11, s. 3320-3327.
KECK A.S., FINLEY J.W. Cruciferous vegetables: cancer protective mechanisms of
glucosinolate hydrolysis products and selenium. Integr. Cancer Ther., 2004, roč. 3, č. 1, s. 5-12.
KERRY N.L., ABBEY M. Red wine and fractionated phenolic compounds prepared from red wine inhibit low density lipoprotein oxidation in vitro. Atherosclerosis, 1997,
roč. 135, č. 1, s. 93-102.
KIM S.J., JIN S., ISHII G. Isolation and structural elucidation of 4-(β-D-
glucopyranosyldisulfanyl)butyl glucosinolate from leaves of rocket salad (Eruca sativa
L.) and its antioxidative activity. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2004, roč. 68, č.12, s. 2444-2450.
KIM Y. Present knowledge in nutrition – Nutrition and cancer. 8. vyd., Washington,
DC: ILSI Press, 2001, s.573-587.
143
KIM Y.S., MILNER J.A. Targets for indole-3-carbinol in cancer prevention. J. Nutr. Biochem., 2005, roč. 16, č. 2, s. 65-73.
KIMIRA M., ARAI Y., SHIMOI K., WATANABE A. Japanese intake of flavonoids and isoflavonoids from foods. J. Epidemiol., 1998, roč. 8, č. 3, s. 168-175.
KING A., YOUNG G. Characteristics and occurrence of phenolic phytochemicals. J.
Am. Diet Assoc., 1999, roč. 99, č. 2, s. 213-218.
KIRSCH-VOLDERS M., VANHAUWAERT A., EICHENLAUB-RITTER U., DECORDIER I. Indirect mechanism of genotoxicity. Toxicol. Lett., 2003, roč. 140-141, s. 63-74.
KLEIN K.O. Isoflavones, soy-based infant formulas, and relevance to endocrine function. Nutr. Rev., 1998, roč. 56, č. 7, s. 193-204.
KNASMÜLLER S., FRIESEN M.D., HOLME J.A., ALEXANDER J., SANYAL R.,
KASSIE F., BARTSCH H. Effects of phenethyl isothiocyanate on metabolism and on
genotoxicity of dimethylnitrosamine and 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4, 5b]pyridine (PhIP). Mutat. Res., 1996, roč. 350, č. 1, s. 93-102.
KNASMÜLLER S., STEINKELLNER H., MAJER B.J., NOBIS E.C., SCHARF G., KASSIE F. Search for dietary antimutagens and anticarcinogens: methodological
aspects and extrapolation problems. Food Chem. Toxicol., 2002, roč. 40, č. 8, s. 10511062.
KOPEC K. Resveratrol – chemoprotektivní složka vinných hroznů a vín. Zahradnictví. Hort. Sci., 1999, roč. 26, č. 4, s. 135-138.
KOPEC K. Stilbenoly – chemoprotekrivní složky hroznů a vín. Výživa a potraviny, 2000, roč. 55, č. 1, s. 5.
KRISHNASWAMY K., RAGHURAMULU N. Bioactive phytochemicals with emphasis on dietary practices. Indian J. Med. Res., 1998, roč. 108, s. 167-181. 144
KROON P.A., CLIFFORD M.N., CROZIER A., DAY A.J., DONOVAN J.L.,
MANACH C., WILLIAMSON G. How should we assess the effects of exposure to dietary polyphenols in vitro? Am. J. Clin. Nutr., 2004, roč. 80, č. 1, s.15-21.
KÜHNAU J. The flavonoids. A class of semi-essential food components: their role in human nutrition. World Rev. Nutr. Diet., 1976, roč. 24, s.117–191.
KUNDU J.K., SURH Y.J. Molecular basis of chemoprevention by resveratrol: NF-κB and AP-1 as potential targets. Mutat. Res., 2004, roč. 555, č. 1-2, s. 65-80.
KVASNIČKA J. Víno jako ochrana před aterosklerózou a proti nádorovým chorobám. Prakt. Lék., 1999, roč. 79, č. 8, s. 458-461.
LACHMAN J., ORSÁK M., PIVEC V. Antioxidační komplex bioflavonoidů a
askorbové kyseliny v jablkách (Mulus pumila mill.). Chem. Listy, 2000, roč. 94, č. 9, s. 818-821.
LAMARTINIERE C.A., MURILL W.B., MANZOLILLO P.A., ZHANG J.X., BARNES S., ZHANG X.S., WEI H.C., BROWN N.M. Genistein alters the ontogeny of mammary gland development and protects against chemically-induced mammary cancer in rats. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1998, roč. 217, č. 3, s. 358-364.
LAMBERT J.D., YANG C.S. Mechanisms of cancer prevention by tea constituents. J. Nutr., 2003, roč.133, č. 10, s. 3262-3267.
LAMBERT J.D., HONG J., YANG G.Y., LIAO J., YANG C.S. Inhibition of
carcinogenesis by polyphenols: evidence from laboratory investigations. Am. J. Clin.
Nutr., 2005, roč. 81, Suppl. 1, s. 284-291.
LAMPE J.W. Health effects of vegetables and fruit: assessing mechanisms of action in
human experimental studies. Am. J. Clin. Nutr., 1999, roč. 70, Suppl. 3, s. 475-490.
LAMPE J.W., KING I.B., LI S. GRATE M.T., BARALE K.V., CHEN C., FENG Z., POTTER J.D. Brassica vegetables increase and apiaceous vegetables decrease 145
cytochrome P450 1A2 activity in humans: changes in caffeine metabolite ratios in
response to controlled vegetable diets. Carcinogenesis, 2000, roč. 21, č. 6, s. 11571162.
LANGOVÁ M., POLÍVKOVÁ Z., ŠMERÁK P., BÁRTOVÁ J., BÁRTA I. Antimutagenic effect of resveratrol. Czech J. Food Sci., 2005, roč. 23, č. 5, s. 202-208.
LARROSA M., TOMAS-BARBERAN F.A., ESPIN J.C. The grape and wine polyphenol piceatannol is a potent inducer of apoptosis in human SK-Mel-28 melanoma cells. Eur. J. Nutr., 2004, roč. 43, č. 5, s. 275-284.
LEE S.H., KIM J.S., YAMAGUCHI K., ELING T.E., BAEK S.J. Indole-3-carbinol and
3,3´-diindolylmethane induce expression of NAG-1 in a p53-independent manner. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, roč. 328, č. 1, s. 63-69.
LEVI M.S., BORNE R.F., WILLIAMSON J.S. A review of cancer chemopreventive agents. Curr. Med. Chem., 2001, roč. 8, č. 11, s. 1349-1362.
LUTHY J., CARDEN B., FRIEDERICH U., BACHMANN M. Goitrin–a
nitrosatable constituent of plant foodstuffs. Experientia, 1984, roč. 40, č. 5, s. 452453.
MAHEO K., MOREL F., LANGOUET S., KRAMER H., LE FERREC E., KETTERER B., GUILLOUZO A. Inhibition of cytochromes P-450 and induction of glutathione S-
transferases by sulforaphane in primary human and rat hepatocytes. Cancer Res., 1997,
roč. 57, č. 17, s. 3649-3652.
MALAVEILLE CH., HAUTEFEUILLE A., PIGNATELLI B., TALASKA G., VINEIS P., BARTSCH H. Dietary phenolics as anti-mutagens and inhibitors of tobacco – related
DNA adduction in the urothelium of smokers. Carcinogenesis, 1996, roč. 17, č. 10, s. 2193-2200.
MALÝ I. Brokolice – nutričně hodnotná zelenina. Výživa a potraviny, 2001, roč. 55, č.
2, s. 44-46.
146
MANACH C., SCALBERT A., MORAND CH., REMESY CH., JIMENEZ L.
Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr., 2004, roč. 79, č. 5, s.
727-747.
MANACH C., MAZUR A., SCALBERT A. Polyphenols and prevention of cardiovascular diseases. Curr. Opin. Lipidol., 2005a, roč. 16, č. 11, s. 77-84.
MANACH C., WILLIAMSON G., MORAND CH., SCALBERT A., REMESY CH. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97 bioavailability studies. Am. J. Clin. Nutr., 2005b, roč. 81, Suppl.1, s. 230-242.
MARKS H.S., ANDERSON J.A., STOEWSAND G.S. Effect of S-methyl cysteine sulphoxide and its metabolite methyl methane thiosulphinate, both occurring naturally
in Brassica vegetables, on mouse genotoxicity. Food Chem. Toxicol., 1993, roč. 31, č. 7, s. 491-495.
MASELLA R., DI BENEDETTO R., VARI R., FILESI C., GIOVANNINI C. Novel
mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of
glutathione and glutathione-related enzymes. J. Nutr. Biochem., 2005, roč. 16, č. 10, s.
577-586.
MATUSHESKI N.V., JEFFERY E.H. Comparison of the bioactivity of two glucoraphanin hydrolysis products found in broccoli, sulforaphane and sulforaphane nitrile. J. Agric. Food Chem., 2001, roč. 49, č. 12, s. 5743-5749.
MATUSHESKI N.V., JUVIK J.A., JEFFERY E.H. Heating decrease epithiospecifier
protein activity and increase sulforaphane formation in broccoli. Phytochemistry, 2004,
roč. 65, č. 9, s. 1273-1281.
MAZUR W. Phytoestrogen content in foods. Bailliére´s Clin. Endocrinol. Metab., 1998, roč. 12, č. 4, s. 729-742.
147
MCNAUGHTON S.A., MARKS G.C. Development of a food composition database for the estimation of dietary intakes of glucosinolates, the biologically active constituents of cruciferous vegetables. Br. J. Nutr., 2003, roč. 90, č. 3, s. 687-697.
MESKIN M.S., BIDLACK W.R., DAVIES A.J., LEWIS D.S., RANDOLPH R.K.
Phytochemicals: Mechanisms of action. 1. vyd. USA: CRC Press, 2004, s. 107-119. ISBN 0-8493-1672-3.
MIDDLETON E., KANDASWAMI CH., THEOHARIDES T.C. The effect of plant flavonoids on mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol. Rev., 2000, roč. 52, č. 4, s. 673-751.
MORAVCOVÁ J., KLEINOVÁ T. Fytoestrogeny ve výživě – přinášejí užitek nebo riziko? Chem. Listy, 2002, roč. 96, č. 5, s. 282-289.
MORTON M.S., GRIFFITHS K., BLACKLOCK N. The preventive role of diet in prostatic disease. Br. J. Urol., 1996, roč. 77, č. 4, s. 481-493.
MUNDAY R., MUNDAY C.M. Induction of phase II detoxification enzymes in rats by
plant-derived isothiocyanates: comparison of allyl isothiocyanate with sulforaphane and related compounds. J. Agric. Food. Chem., 2004, roč. 52, č. 7, s. 1867-1871.
MURRILL W.B., BROWN N.M., ZHANG J.X., MANZOLILLO P.A., BARNES S., LAMARTINIERE C.A. Prepubertal genistein exposure suppresses mammary cancer
and enhances gland differentiation in rats. Carcinogenesis, 1996, roč. 17, č. 7, s. 14511457.
MURILLO G., MEHTA R.G. Cruciferous vegetables and cancer prevention. Nutr.
Cancer, 2001, roč. 41, č. 1-2, s. 17-28.
MURRAY S., LAKE B.G., GRAY S., EDWARDS A.J., SPRINGALL C., BOWEY
E.A., WILLIAMSON G., BOOBIS A.R., GOODERHAM N.J. Effect of cruciferous vegetable consumption on heterocyclic aromatic amine metabolism in man. Carcinogenesis, 2001, roč. 22, č. 9, s. 1413-1420. 148
MUSK S.R., JOHNSON I.T. The clastogenic effects of isothiocanates. Mutat. Res.,
1993, roč. 300, č. 2, s. 111-117.
MUSK S.R., SMITH T.K., JOHNSON I.T. On the cytotoxicity and genotoxicity of
allyl and phenethyl isothiocyanates and their parent glucosinolates sinigrin and gluconasturtiin. Mutat. Res., 1995, roč. 348, č. 1, s. 19-23.
NESTLE M. Broccoli sprouts as inducers of carcinogen-detoxifying enzyme systems:
Clinical, dietary, and policy implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, roč. 94, č. 21, s. 11149-11151.
NHO C.W., JEFFERY E. Crambene, a bioactive nitrile derived from glucosinolate hydrolysis, acts via the antioxidant response element to upregulate quinone reductase
alone or synergistically with indole-3-carbinol. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2004, roč. 198, č. 1, s. 40 – 48.
NIGDIKAR S.V., WILLIAMS N.R., GRIFFIN B.A., HOWARD A.N. Consumption of red wine polyphenols reduces the susceptibility of low-density lipproteins to oxidation in vivo. Am. J. Clin. Nutr., 1998, roč. 68, č. 2, s. 258-265.
PAOLINI M., PEROCCO P., CANISTRO D., VALGIMIGLI L., PEDULLI G.F., IORI
R., CROCE C.D., CANTELLI-FORTI G., LEGATO M.S., ABDEL-RAHMAN S.Z. Induction of cytochrome P450, generation of oxidative stress and in vitro cell-
transforming and DNA-damaging activities by glucoraphanin, the bioprecursor of the
chemopreventive agent sulforaphane found in broccoli. Carcinogenesis, 2004, roč. 25, č. 1, s. 61-67.
PARK E.J., PEZZUTO J.M. Botanicals in cancer chemoprevention. Cancer Metastasis
Rev., 2002, roč. 21, č. 3-4, s. 231-255.
PETRI N., TANNERGREN C., HOLST B., MELLON B.H., BAO Y., PLUMB G.W.,
BACON J., O´LEARY K.A., KROON P.A., KNUTSON L., FORSELL P., ERIKSSON T., LENNERNAS H., WILLIAMSON G. Absorption/metabolism of sulforaphane and 149
quercetin, and regulation of phase II. enzymes, in human jejunum in vivo. Drug Metab. Dispos., 2003, roč. 31, č. 6, s. 805-813.
PHAM N.A., JACOBBERGER J.W., SCHIMMER A.D., CAO P., GRONDA M.,
HEDLEY D.W. The dietary isothiocyanate sulforaphane targets pathwys of apoptosis, cell cycle arrest, and oxidative stress in human pancreatic cancer cells and inhibits
tumor growth in severe combined immunodeficient mice. Mol. Cancer Ther., 2004, roč. 3, č. 10, s. 1239-1248.
PIERPOINT W.S. Flavonoids in human food and animal feedstuffs. Flav. Biol. Med., 1990, roč. 3, s. 497-514.
PISKULA M.K., TERAO J. Accumulation of (-)-epicatechin metabolites in rat plasma
after oral administration and distribution of conjugation enzymes in rat tissues. J. Nutr.,
1998, roč. 128, č. 7, s. 1172-1178.
PLUMB G.W., LAMBERT N., CHAMBERS S.J., WANIGATUNGA S., HEANEY R.K.,
PLUMB
J.A.,
ARUOMA
O.I.,
HALLIWELL
B.,
MILLER
N.J.,
WILLIAMSAON G. Are whole extracts and purified glucosinolates from cruciferous vegetables antioxidants? Free Radic. Res., 1996, roč. 25, č. 1, s. 75-86.
PLUMB G.W., PRICE K.R., RHODES M.J., WILLIAMSON G. Antioxidant properties
of the major polyphenolic compounds in broccoli. Free Radic. Res., 1997, roč. 27, č. 4, s. 429-435.
POTTER J.D. Food, nutrition and the prevention of cancer: a global perspective. Washington DC: World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research, 1997, 670 s. ISBN: 1899533052.
PRIOR R.L. Fruits and vegetables in the prevention of cellular oxidative damage. Am. J. Clin. Nutr., 2003, roč. 78, Suppl. 3, s. 570-578.
PRUGAR J, ZUKALOVÁ H. Dvojí tvář glukosinolátů. Výživa a potraviny, 2002, roč.
57, č. 6, s. 184 – 185.
150
RAMBOUSKOVÁ J. Brokolice – nutriční význam a účinky podporující zdraví. DMEV, 2002, roč. 5, č. 1, s. 38-42.
RASMUSSEN S.E., FREDERIKSEN H., KROGHOLM K.S., POULSEN L. Dietary
proanthocyanidins: occurrence, dietary intake, bioavailability, and protection against cardiovascular disease. Mol. Nutr. Food Res., 2005, roč. 49, č. 2, s. 159-174.
RAUSCHER R., EDENHARDER R., PLATT K.L. In vitro antimutagenic and in vivo
anticlastogenic effects of carotenoids and solvent extracts from fruits and vegetables rich in carotenoids. Mutat. Res., 1998, roč. 413, č. 2, s. 129-142.
RENWICK A.B., MISTRY H., BARTON P.T., MALLET F., PRICE R.J., BEAMAND J.A., LAKE B.G. Effect of some indole derivatives on xenobiotic metabolism and
xenobiotic-induced toxicity in cultured rat liver slices. Food Chem. Toxicol., 1999, roč.
37, č. 6, s. 609-618.
RHODES M.J. Physiologically-active compounds in plant foods: an overview. Proc. Nutr. Soc., 1996, roč. 55, č. 1B, s. 371-384.
RIETJENS I.M., BOERSMA M.G., VAN DER WOUDE H., JEURISSEN S.M., SCHUTTE M.E., ALINK G.M. Flavonoids and alkenylbenzenes: Mechanisms of mutagenic action and carcinogenic risk. Mutat. Res., 2005, roč. 574, č. 1-2, s. 124-138.
RIOS L.Y., BENNETT R.N., LAZARUS S.A., REMESY CH., SCALBERT A.,
WILLIAMSON G. Cocoa procyanidins are stable during gastric transit in humans. Am.
J. Clin.Nutr., 2002, roč. 76, č. 5, s. 1105-1110.
ROEDIG-PENMAN A., GORDON M.H. Antioxidant properties of catechin and green
tea extracts in model food emulsion. J. Agric. Food. Chem., 1997, roč. 45, č. 11, s. 4267-4270.
ROUZAUD G., YOUNG S.A., DUNCAN A.J. Hydrolysis of glukosinolates to isothiocyanates after ingestion of raw or microwaved cabbage by human volunteers. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2004, roč. 13, č. 1, s. 125-131. 151
SAFE S.H., MCDOUGAL A. Environmental factors and breast cancer. Endocr. Relat.
Cancer, 1997, roč. 4, č. 1, s. 113-123.
SANYAL R., DARROUDI F., PARZEFALL W., NAGAO M., KNASMÜLLER S. Inhibition of the genotoxic effects of heterocyclic amines in human derived hepatoma cells by dietary bioantimutagens. Mutagenesis, 1997, roč. 12, č. 4, s. 297-303.
SARKAR F.H., LI Y. Indole-3-carbinol and prostate cancer. J. Nutr., 2004, roč. 134,
Suppl. 12, s. 3493-3498.
SATO K., KAWAKAMI N., OHTSU T., TSUTSUMI A., MIYAZAKI S., MASUMOTO T., HORIE S., HARATANI T., KOBAYASHI F., ARAKI S. Broccoli consumption and chronic atrophic gastritis among Japanese males: An epidemiological investigation. Acta Med. Okayama, 2004, roč. 58, č. 3, s. 127-133.
SCALBERT A., WILLIAMSON G. Dietary intake and bioavailability of polyphenols.
J. Nutr., 2000, roč. 130, Suppl. 8S, s. 2073-2085.
SCALBERT A., JOHNSON I.T., SALTMARSH M. Polyphenols: antioxidant and beyond. Am. J. Clin. Nutr., 2005, roč. 81, Suppl.1, s. 215-217.
SEDMÍKOVÁ M., TUREK B., BÁRTA I., STROHALM J., ŠMERÁK P., HOUŠKA
M.,
MÜLLEROVÁ
J.
Hodnocení
antimutagenní
aktivity
tlakově
ošetřené
(paskalizované) a tepelně ošetřené (pasterované) květákové šťávy. Czech J. Food Sci., 1999, roč. 17, č. 4, s. 149-152.
SHAPIRO T.A., FAHEY J.W., WADE K.L. STEPHENSON K.K., TALALAY P.
Human metabolism and excretion of cancer chemoprotective glucosinolates and
isothiocyanates of cruciferous vegetables. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, roč. 7, č. 12, s. 1091-1100.
SHAPIRO T.A., FAHEY J.W., WADE K.L., STEPHENSON K.K, TALALAY P. Chemoprotective glucosinolates and isothiocyanates of broccoli sprouts: metabolism 152
and excretion in humans. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2001, roč. 10, č. 5, s.
501-508.
SHERTZER H.G., SENFT A.P. The micronutrient indole-3-carbinol: implications for
disease and chemoprevention. Drug Metabol. Drug Interact., 2000, roč. 17, č. 1-4, s. 159-188.
SHISHU, KAUR I.P. Inhibition of mutagenicity of food-derived heterocyclic amines by
sulforaphane – a constituent of broccoli. Indian J. Exp. Biol., 2003, roč. 41, č. 3, s. 216219.
SHOJI T., AKAZOME Y., KANDA T., IKEDA M. The toxicology and safety of polyphenol extract. Food Chem. Toxicol., 2004, roč. 42, č. 6, s. 959-967.
SHUKLA Y., ARORA A., TANEJA P. Antigenotoxic potencial of certain dietary
constituents. Teratog. Carcinogen. Mutagen., 2003, roč. 23, Suppl.1, s. 323-335.
SHUKLA Y., SRIVASTAVA B., ARORA A., CHAUHAN L.K. Protective effects of
indole-3-carbinol on cyclophosphamide-induced clastogenecity in mouse bone marrow cells. Hum. Exp. Toxicol., 2004, roč. 23, č. 5, s. 245-250.
SCHMID W. The micronucleus test. Mutat. Res., 1975, roč. 31, č. 1, s. 9-15. SCHONHOF I., KRUMBEIN A., BRÜCKNER B. Genotypic effects on glucosinolates
and sensory properties of broccoli and cauliflower. Nahrung/Food, 2004, roč. 48, č. 1, s.
25-33.
SCHUT H.A., SNYDERWINE E.G. DNA adducts of heterocyclic amine food
mutagens: implications for mutagenesis and carcinogenesis. Carcinogenesis, 1999, roč. 20, č. 3, s. 353-368.
SILBERBERG M., MORAND C., MATHEVON T., BESSON C., MANDACH C., SCALBERT A., REMESY C. The bioavailability of polyphenols is higly governed by 153
the capacity of the intestine and of the liver to secrete conjugated metabolites. Eur. J.
Nutr. 2005, roč. 45, č. 2, s. 88-96.
SIMONETTI P., PIETTA P., TESTOLIN G. Polyphenol content and total antioxidant
potencial of selected Italian wines. J. Agric. Food Chem., 1997, roč. 45, č. 4, s. 11521155.
SINGH A.V., XIAO D., LEW K.L., DHIR R., SINGH S.V. Sulforaphane induces caspase-mediated apoptosis in cultured PC-3 human prostate cancer cells and retards growth o PC-3 xenografts in vivo. Carcinogenesis, 2004, roč. 25, č. 1, s. 83-90. SINGH
S.V.,
HERMAN-ANTOSIEWICZ
A.,
SINGH
A.V.,
LEW
K.L.,
SRIVASTAVA S.K., KAMATH R., BROWN K.D., ZHANG L., BASKARAN R.
Sulforaphane-induced G2/M phase cell cycle arrest involves checkpoint kinase 2-
mediated phosphorylation of cell division cycle 25C*. J. Biol. Chem., 2004, roč. 279, č. 24, s. 25813-25822.
SKIBOLA C.F., SMITH M.T. Potential health impacts of excessive flavonoid intake. Free Radic. Biol. Med., 2000, roč. 29, č. 3-4, s. 375-383.
SOLEAS G.J., DIAMANDIS E.P., GOLDBERG D.M. Wine as a biological fluid:
History, production, and role in disease prevention. J. Clin. Lab. Anal., 1997, roč. 11, č. 5, s. 287-313.
STEINKELLNER H., RABOT S., FREYWALD C., NOBIS E., SCHARF G., CHABICOVSKY M., KNASMÜLLER S., KASSIE F. Effects of cruciferous vegetables and their constituents on drug metabolizing enzymes involved in the
bioactivation of DNA-reactive dietary carcinogens. Mutat. Res., 2001, roč. 480-481, s.
285-297.
STEINMETZ K.A., POTTER J.D. Vegetables, fruit, and cancer, I. Epidemiology. Cancer Causes Control, 1991, roč. 2, č. 5, s. 325-357.
154
STEINMETZ K.A., POTTER J.D. Vegetables, fruit, and cancer prevention: a review. J.
Am. Diet. Assoc., 1996, roč. 96, č. 10, s. 1027-1039.
STEPHANOU G., VLASTOS D., VLACHODIMITROPOULOS D., DEMOPOULOS N.A. A comparative study on the effect of MNU on human cultures in vitro evaluated by O6-mdG formation, micronuclei and sister chromatid exchanges induction. Cancer Lett., 1996, roč. 109, č. 1-2, s. 109-114.
STICHA K.R., KENNEY P.M., BOYSEN G., LIANG H., SU X., WANG M., UPADHYAYA P., HECHT S.S. Effects of benzyl isothiocynate and phenethyl
isothiocynate on DNA adduct formation by a mixture of benzo[a]pyrene and 4(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in A/J mouse lung. Carcinogenesis, 2002, roč. 23, č. 9, s. 1433-1439.
STOCLET J.C., CHATAIGNEAU T., NDIAYE M., OAK M.H., BEDOUI J. E., CHATAIGNEAU M., SCHINI-KERTH V.B. Vascular protection by dietary polyphenols. Eur. J. Pharmacol., 2004, roč. 500, č. 1-3, s. 299-313.
STOEWSAND G.S. Bioactive organosulfur phytochemicals in Brassica oleracea
vegetables – a review. Food Chem. Toxic., 1995, roč. 33, č. 6, s. 537-543.
STRATIL P. KUBÁŇ V. Exogenní karcinogeny v potravinách a karcinogeny vznikající při jejich technologickém zpracování. Chem. Listy, 2005, roč. 99, č. 1, s. 3-12.
STROHALM J., PRŮCHOVÁ J., HOLASOVÁ M., FIEDLEROVÁ V., GABROVSKÁ D.,
PAULÍČKOVÁ
I.,
HOUŠKA
M.,
TOTUŠEK
J.,
LEFNEROVÁ
D.,
CHALOUPKOVÁ J., MANDELOVÁ L., ŠIMŮNEK J., TŘÍSKA J., VRCHOTOVÁ N., NĚMCOVÁ B., GŘESOVÁ P., LOUČKOVÁ K. Směsná zeleninová šťáva a její
složky s průkazem antimutagenní aktivity. Výzkumná zpráva č. 10/360/2005. VÚPP: Praha, 2005, 44 s.
SUGIMURA T. Nutrition and dietary carcinogens. Carcinogenesis, 2000, roč. 21, č. 3, s. 387-395.
155
SUGIMURA T. Food and cancer. Toxicology, 2002, roč. 181-182, č. 17-21. SURH Y.J. Molecular mechanism of chemopreventive effects of selected dietary and
medicinal phenolic substances. Mutat. Res., 1999, roč. 428, č. 1-2, s. 305-327.
ŠMERÁK P., ŠESTÁKOVÁ H., POLÍVKOVÁ Z., BÁRTA I., TUREK B., BÁRTOVÁ
J., LANGOVÁ M., ANDĚL M. Antimutagenic effect of ellagic acid and its effect on the immune response in mice. Czech J. Food. Sci., 2002, roč. 20, č. 5, s. 181-191.
ŠMIDRKAL J., FILIP V., MELZOCH K., HANZLÍKOVÁ I., BUCKIOVÁ D., KŘÍSA B. Resveratrol. Chem. Listy, 2001, roč. 95, č. 10, s. 602-609.
ŠTERZL J. Imunitní systém a jeho fyziologické funkce. Praha: Česká imunologická
společnost, 1993, 480 s.
ŠTÍPEK S., BOROVANSKÁ J. ČEJKOVÁ J., HOMOLKA J., KLENER P., LUKÁŠ
M., ŠPIČÁK J., TESAŘ V., ZEMAN M., ZIMA T., ŽÁK A. Antioxidanty a volné
radikály ve zdraví a v nemoci. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2000, 320 s. ISBN 807169-704-4.
TALALAY P., FAHEY J.W. Phytochenicals from cruciferous plants protect against
cancer by modulating carcinogen metabolism. J. Nutr., 2001, roč. 131, Suppl. 11, s.
3027-3033.
´T HART B.A., IP VIA CHING T.R., VAN DIJK H., LABADIE R.P. How flavonoids
inhibit the generation of luminol-dependent chemiluminiscence by activated human neutrophils. Chem. Biol. Interact., 1990, roč. 73, č. 2-3, s. 323-335.
THORGEIRSSON U.P., DALGARD D.W., REEVES J., ADAMSON R.H. Tumor
incidence in a chemical carcinogenesis study of nonhuman primates. Regul. Toxicol. Pharmacol., 1994, roč. 19, č. 2, s. 130-151
THORNALLEY P.J. Isothiocyanates: mechanism of cancer chemopreventive action. Anticancer Drugs, 2002, roč. 13, č. 4, s. 331-338. 156
TOTUŠEK J., VRCHOTOVÁ N., TŘÍSKA J., MAREČKOVÁ L. Resveratrol v
červených vínech z jihomoravských vinařských oblastí. Chem. Listy, 2000, roč. 94, č.
10, s. 973-974.
TROSZYNSKA A., CISKA E. Phenolic compounds of seed coats of white and
coloured varieties of Pea (Pisum sativum L.) and their totla antioxidant activity. Czech
J. Food Sci., 2002, roč. 20, č. 1, s. 15-22.
TUKEY J.W. Exploratory data analysis. USA, Addison Wesley: Reading Mass, 1977,
688 s.
TUREK B., HRUBÝ S., ČERNÁ M. Nutriční toxikologie. 1. vyd. Brno: IDVPZ, 1994,
123 s., ISBN 80-7013-177-2.
TURESKY R.J., GROSS G.A., STILLWELL W.G., SKIPPER P.L., TANNENBAUM
S.R. Species differences in metabolism of heterocyclic aromatic amines, human
exposure, and biomonitoring. Environ. Health Perspect., 1994, roč. 102, Suppl. 6, s. 4751.
UHL M., KASSIE F., RABOT S., GRASL-KRAUPP B., CHAKRABORTY A., LAKY
B., KUNDI M., KNASMULLER S. Effect of common Brassica vegetables (Brussels sprouts and red cabbage) on the development of preneoplastic lesions induced by 2-
amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline (IQ) in liver and colon of Fischer 344 rats. J. Chromatogr. B Analyt.Technol. Biomed. Life Sci., 2004, roč. 802, č. 1, s. 225-230.
URSINI F., TUBARO F., RONG J., SEVANIAN A. Optimization of nutrition: Polyphenols and vascular protection. Nutr. Rev., 1999, roč. 57, č. 8, s. 241-249.
US Department of Agriculture. USDA database for the flavonoid content of selected
foods.
March
10.12.2005)
2003.
Internet:
http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/
157
(staženo
VAN POPPEL G., VERHOEVEN D.T., VERHAGEN H., GOLDBOHM R.A. Brassica
vegetables and cancer prevention. Epidemiology and mechanisms. Adv. Exp. Med. Biol., 1999, roč. 472, s. 159-168.
VANG O., MORTENSEN J., ANDERSEN O. Biochemical effects of dietary intake of
different broccoli samples. II. Multivariate analysis of contributions of specific glucosinolates in modulating cytochrome P-450 and antioxidant defense enzyme activities. Metabolism, 2001, roč. 50, č. 10, s. 1130-1135.
VELÍŠEK J. Glukosinoláty v zelenině: jejich nežádoucí a prospěšné účinky. Výživa a potraviny, 1996, roč. 51, č. 4, s. 109 – 110.
VELÍŠEK J. Chemie potravin 3. 2. vyd. Tábor: Ossis, 2002, 368 s., ISBN 80-86659-02-
X.
VERHOEVEN D.T., GOLDBOHM R.A., VAN POPPEL G., VERHAGEN H., VAN
DEN BRANDT P.A. Epidemiological studies on brassica vegetables and cancer risk. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1996, roč. 5, č. 9, s. 733-748.
VERHOEVEN D.T., VERHAGEN H., GOLDBOHM R.A., VAN DEN BRANDT P.A., VAN POPPEL G. A review of mechanisms underlying anticarcinogenity by brassica vegetables. Chem. Biol. Interact., 1997, roč. 103, č. 2, s. 79-129.
VINSON J.A., HONTZ B.A. Phenol antioxidant index index: Comparative antioxidant
effectiveness of red and white wines. J. Agric. Food Chem., 1995, roč. 43, č. 2, s. 401403.
VINSON J.A., HAO Y., SU X., ZUBIK L. Phenol antioxidant quantity and quality in food: vegetables. J. Agric. Food Chem., 1998, roč. 46, č. 9, s. 3630-3634.
WAKAI K., EGAMI I., KATO K., KAWAMURA T., TAMAKOSHI A., LIN Y., NAKAYAMA T., WADA M., OHNO Y. Dietary intake and sources of isoflavones among Japanese. Nutr. Cancer, 1999, roč. 33, č. 2, s. 139-145. 158
WALLE T. Absorption and metabolism of flavonoids. Free Radic. Biol. Med., 2004,
roč. 36, č. 7, s. 829-837.
WALTERS D.G., YOUNG P.J., AGUS C., KNIZE M.G., BOOBIS A.R., GOODERHAM N.J., LAKE B.G. Cruciferous vegetable consumption alters the
metabolism of the dietary carcinogen 2-amino-1-methyl-1,6-phenethylimidazo[4,5b]pyridine (PhIP) in humans. Carcinogenesis, 2004, roč. 25, č. 9, s. 1659-1669.
WANG L., LIU D., AHMED T., CHUNG F.L., CONAWAY C., CHIAO J.W.
Targeting cell cycle machinery as a molecular mechanism of sulforaphane in prostate cancer prevention. Int. J. Oncol., 2004, roč. 24, č. 1, s. 187-192.
WATANABE M., ISHIDATE M., NOHMI T. Sensitive method for the detection of mutagenic nitrosarenes and aromatic amines: new derivatives of Salmonella
typhimurium tester strains possessing elevated O-acetyltransferase levels. Mutat. Res.,
1990, roč. 234, č. 5, s. 337-348.
WEISBURGER J.H. Approaches for chronic disease prevention based on current
understanding of underlying mechanisms. Am. J Clin. Nutr., 2000, roč. 71, Suppl. 6, s. 1710-1714.
WEISBURGER J.H. Antimutagenesis and anticarcinogenesis, from the past to the future. Mutat. Res., 2001, roč. 480-481, s. 23-35.
WILLIAMSON G., FAULKNER K., PLUMB G.W. Glucosinolates and phenolics as antioxidants from plant foods. Eur. J. Cancer Prev., 1998, roč. 7, č. 1, s. 17-21.
WILLIAMSON G., MANACH C. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in
humans. II. Review of 93 intervention studies. Am.J. Clin. Nutr., 2005, roč. 81, Suppl. 1, s. 243-255.
WORTELBOER H.M., DE KRUIF C.A., VAN IERSEL A.A. NOORDHOEK J., BLAAUBOER B.J., VAN BLADEREN P.J., FALKE H.E. Effects of cooked brussels 159
sprouts on cytochrome P-450 profile and phase II enzymes in liver and small intestinal mucosa of the rat. Food Chem. Toxicol., 1992, roč. 30, č. 1, s. 17-27.
XU M., BAILEY A.C., HERNAEZ J.F., TAOKA C.R., SCHUT H.A., DASHWOOD
R.H. Protection by green tea, black tea, and indole-3-carbinol against 2-amino-3methylimidazo[4,5-f]quinoline-induced DNA adducts and colonic aberrant crypts in the F344 rat. Carcinogenesis, 1996, roč. 17, č. 7, s. 1429-1434.
XU M., SCHUT H.A., BJELDANES L.F., WILLIAMS D.E., BAILEY A.C., DASHWOOD R.H. Inhibition of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline-DNA
adducts by indole-3-carbinol: dose-response studies in the rat colon. Carcinogenesis, 1997, roč. 18, č. 11, s. 2149-2153.
XU M., ORNER G.A., BAILEY G.S., STONER G.D., HORIO D.T., DASHWOOD
R.H. Post-initiation effects of chlorophyllin and indole-3-carbinol in rats given 1,2-
dimethylhydrazine or 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline. Carcinogenesis, 2001, roč. 22, č. 2, s. 309-314.
YAMAGISHI M., NATSUME M., NAGAKI A., ADACHI T., OSAKABE N., TAKIZAWA T., KUMON H., OSAWA T. Antimutagenic activity of cacao: inhibitory
effect of cacao liquor polyphenols on the mutagenic action of heterocyclic amines. J.
Agric. Food Chem., 2000, roč. 48, č. 10, s. 5074-5078.
YANG Y.M., JHANWAR-UNIYAL M., SCHWARTZ J., CONAWAY C.C., HALICKA H.D., TRAGANOS F., CHUNG F.L.
N-acetylcysteine conjugate of
phenethyl isothiocyanate enhances apoptosis in growth-stimulated human lung cells. Cancer Res., 2005, roč. 65, č. 18, s. 8538-8547.
YOON J-H., BACK S.J. Molecular targets of dietary polyphenols with antiinflammatory properties. Yonsei Med. J., 2005, roč. 46, č. 5, s. 585-596.
YOUDIM K.A. SHUKITT-HALE B., JOSEPH J.A. Flavonoids and the brain:
interactions at the blood-brain barrier and their physiological effects on the central nervous system. Free Radic. Biol. Med., 2004, roč. 37, č. 11, s. 1683-1693. 160
YOXALL V., KENTISH P., COLDHAM N., KUHNERT N., SAUER M.J., IOANNIDES C. Modulation of hepatic cytochromes P450 and phase II enzymes by
dietary doses of sulforaphane in rats: Implications for its chemopreventive activity. Int. J. Cancer, 2005, roč. 117, č. 3, s. 356-362.
ZHANG Y., TALALAY P., CHO C.G, POSNER G.H. A major inducer of anticarcinogenic protective enzymes from broccoli: isolation and elucidation of structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1992, roč. 89, č. 6, s. 2399-2403.
ZHANG Y., KENSLER T.W., CHO C.G., POSNER G.H., TALALAY P. Anticarcinogenic activities of sulforaphane and structurally related synthetic norbornyl isothiocyanates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, roč. 91, č. 8, s. 3147-3150.
ZHANG Y. Molecular mechanism of rapid cellular accumulation of anticarcinogenic isothiocyanates. Carcinogenesis, 2001, roč. 22, č. 3, s. 425-431.
ZHANG Y., TANG L., GONZALES V. Selected isothiocyanates rapidly induce growth inhibition of cancer cells. Mol. Cancer Ther., 2003, roč. 2, č. 10, s. 1045-1052.
ZIEGLER E.E., FILER L.J. Present knowledge in nutrition. 7. vyd. Washington, DC: ILSI Press, 1996, s. 596-603. ISBN 0-944398-72-3.
161
9 Seznam publikovaných prací a prací přijatých k publikaci Seznam publikovaných prací MANDELOVÁ L., LEFNEROVÁ D., HOUŠKA M., STROHALM J., TOTUŠEK J., TŘÍSKA J., VRCHOTOVÁ N., GABROVSKÁ D. Antimutagenní aktivita brokolicové
šťávy ošetřené vysokým tlakem. In Sborník. 28. pracovní dny - Aktuální problematika genetické toxikologie. NCO NZO, Brno, 2005, s. 39-40.
MANDELOVÁ L. Polyfenoly: Rozdělení a zdroje v potravě. Výživa a potraviny, 2005, roč. 60, č. 1, s. 11-14.
MANDELOVA L., ZENDULKA O., TOTUŠEK J. Antimutagenní a imunomodulační
účinky sulforafanu a indol-3-karbinolu. In Sborník. IV. Martinské dni hygieny a
verejného zdravotníctva. UK Bratislava, Jesseniova lekárská fakulta, Martin, 2005, s. 33-34.
STROHALM J., PRŮCHOVÁ J., HOLASOVÁ M., FIEDLEROVÁ V., GABROVSKÁ D.,
PAULÍČKOVÁ
I.,
HOUŠKA
M.,
TOTUŠEK
J.,
LEFNEROVÁ
D.,
CHALOUPKOVÁ J., MANDELOVÁ L., ŠIMŮNEK J., TŘÍSKA J., VRCHOTOVÁ N., NĚMCOVÁ B., GŘESOVÁ P., LOUČKOVÁ K. Směsná zeleninová šťáva a její
složky s průkazem antimutagenní aktivity. Výzkumná zpráva č. 10/360/2005. 2005, 44s. MANDELOVÁ L., TOTUŠEK J. Chemoprotective effects of broccoli juice treated with high presssure. Czech J. Food Sci., 2006, roč. 24, č. 1, s. 19-25.
MANDELOVA L., TOTUŠEK J. Antimutagenní aktivita brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem. Hygiena, 2006, roč. 51 , č. 1, s. 6-10.
MANDELOVÁ L., LEFNEROVÁ D., TOTUŠEK J., TŘÍSKA J., VRCHOTOVÁ N., HOUŠKA M., STROHALM J. Inhibice mutagenity působením šťáv a biologicky
162
aktivních látek z brukvovité zeleniny. In Sborník. 29. pracovní dny - Aktuální problematika genetické toxikologie. NCO NZO, Brno, 2006, s. 71-72. Práce přijatá k publikaci MANDELOVA L., ZENDULKA O., TOTUŠEK J. Antimutagenní a imunomodulační
účinky sulforafanu a indol-3-karbinolu. Podpora zdravia, prevencia a hygiena v teórii a praxi – IV, 2006
Nepublikované sdělení přednesené na konferenci MANDELOVÁ L., LEFNEROVÁ D., HOUŠKA M., STROHALM J., TOTUŠEK J., TŘÍSKA J., VRCHOTOVÁ N., GABROVSKÁ D. Antimutagenní aktivita brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem. Liškutínovy dny, Hradec Králové, 2005
163
10 Seznam použitých zkratek 1
O2
3-ICN
singletový kyslík
indol-3-acetonitril
AFB1
aflatoxin B1
AOM
azoxymethan
AITC AP-1 AR
ARE
BaP
BITC
COX CP
CYP
allylisothiokyanáty transkripční faktor AP-1 androgenový receptor
antioxidant responsive element benzo[a]pyren
benzylisothiokyanát cyklooxygenáza cyklofosfamid cytochrom
DIM
3,3´- diindolylmethan
DMH
1,2-dimethylhydrazin
DMBA DMSO DNA
7,12-dimethylbenz[a]antracen dimethylsulfoxid
deoxyribonukleová kyselina
EC
(-)-epikatechin
EDHF
hyperpolarizační faktor vzniklý v endotelu
ECG
EGC
EGCG eNOS ER
Egr-1 GS
GSH GST HA
HDL HE
HO*
HOCl
(-)-epikatechin-3-gallát (-)-epigallokatechin
(-)-epigallokatechin-3-gallát endoteliální NO syntáza estrogenní receptor
transkripční faktor Egr-1 glukosinoláty
redukovaný glutathion
glutathion-S-transferáza heterocyklické aminy
lipoprotein o vysoké hustotě (high density lipoprotein) hydroxyestron
hydroxylový radikál kyselina chlorná
164
H2O2
peroxid vodíku
I3C
indol-3-karbinol
HSR IL
IQ
ITC
LDL
MeIQ
MeIQx
MNNG MNU NAC
NADPH
NF-κB NK
NO*
Hanksův solný roztok interleukin
2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]chinolin isothiokyanát
lipoprotein o nízké hustotě (low density lipoprotein) 2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]chinoxalin
2-amino-3,8-dimethylimidazo [4,5-f]chinoxalin N-methyl-N´-nitro-N-nitrosoguanidin N- nitrosoN-methylurea N-acetylcystein
redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát transkripční faktor NF-κB přirozené zabíječe oxid dusnatý
NO2*
oxid dusičitý
PAPS
3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfát
O2*
PEITC PhIP
superoxid
phenethylisothiokyanáty
2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin
PMNL
polymorfonukleární leukocyty
PUFA
polynenasycené mastné kyseliny
PSA
RNA RNS
ROS SPF
TBARS TCDD
UDP
specifický antigen prostaty ribonukleová kyselina
reaktivní formy dusíku
reaktivní formy kyslíku
specifických patogenů volný
reaktivní sloučeniny kyseliny thibarbiturové 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin
uridindifosfát
VEGF
vaskulární endotelový růstový faktor
VLDL
lipoprotein o velmi nízké hustotě (very low density lipoprotein)
VKR
WHO XRE
volné kyslíkové radikály
světová zdravotnická organizace (world health organization) xenobiotic responsive element
165
11 Přílohy Příloha č. 1 Přehled a rozdělení polyfenolů Příloha č. 2 Obsah polyfenolických sloučenin ve vybraných potravinách Příloha č. 3 Obsah polyfenolů ve vybrané zelenině a potravinách Příloha č. 4 Obsah polyfenolů ve vybraném ovoci Příloha č. 5 Obsah polyfenolů ve vybraných nápojích Příloha č. 6 Obsah polyfenolů v různých druzích potravin a nápojů dle Brava (1998)
166
Příloha č. 1 Přehled a rozdělení polyfenolů Fenolové kyseliny kyselina
benzoová a její deriváty kyselina
skořicová a její deriváty
kyselina gallová
kyselina ellagová
kyselina kávová
kyselina ferulová
kyselina sinapová Flavonoidy
Flavonoly
Flavony Isoflavony
Flavanony
Anthokyanidiny
kyselina chlorogenová kvercetin kemferol
myricetin apigenin luteolin
genistein daidzein
glycitein
hesperetin
naringenin
eriodictyol kyanidin
petunidin malvidin
pelargonidin Flavanoly
Stilbeny Lignany
delfinidin katechin
epikatechin
gallokatechin resveratrol matairesinol
sekoisolariciresinol
Příloha č. 2 Obsah polyfenolických sloučenin ve vybraných potravinách (King a
Young, 1999)
Třída a podtřída Hlavní zástupci
Potravina či nápoj
Flavonoly
Olivy
Flavonoidy
Quercetin, kemferol, myricetin
Cibule
347
321
Brusinky
249
308
Cherry rajčata
17-203
Jablka
21-72
Tuřín
48
Brokolice
Fazole, zelená/žlutá Čekanka
102 49
46
Čaj zelený, listy
30-45 g.kg-1 DWb
Čaj černý, nápoj
20
Jablečný džus Celer
Flavony
Apigenin, luteolin
Flavanoly
Katechin, epikatechin Hrušky
Olivy
Červené víno
Čaj zelený, listy Bílé víno Jablka Genistein, daidzein
270-830
Kapusta
Salát listový
Isoflavony
Množství (mg kg-1)a
Sójové boby,zralé, suché
6-52 130
6-29
70-420 274
128-226 g.kg-1 DW 35
23-30
888-2.407
Sójové ořechy
1.437-2.363
Sójová mouka
1.036-1.778
Zeleninový protein Tofu
Miso
Sójové boby, zralé, čerstvé
1.175-1.191 280-499
256-540
182-205
Sójové mléko
105-251
Sójový hot dog
116
Tofu jogurt Sójový sýr
Sójová omáčka
151
7-74
13-23
Příloha č. 2 Obsah polyfenolických sloučenin ve vybraných potravinách pokračování (King a Young, 1999) Třída a podtřída
Fenolové kyseliny
Hlavní zástupci
Hydroxyskořicové Kyselina kávová, kyseliny
Potravina či nápoj Borůvky
1.881-2.112
Hrušky
44-1.270
ferulová, chlorogenová, Třešně sladké neochlorogenová
Jablka
Pomeranč
Taniny
Kondensované taniny
gallová
epikatechinu
124
Kávové boby
Maliny Jahody
Hroznový džus, tmavý
Čočka
Černý hrách
Hrozno, tmavé Hrozno, světlé Červené víno Bílé víno
Jablečný džus
a
miligramy na kilogram potraviny či litr džusu DW= suchá váha
b
21-182
Třešňový džus
Hroznový džus, světlý Polymery katechinu a
2-258
100-190
Jablečný džus
kyseliny
290-1.280
Brambory, bílé Grapefruit
Hydroxybenzoové Kyselina ellagová a
Množství (mg.kg-1)a
25-60
9-114
56 g.kg-1 DW 19-102 21-89 79
110 3.800
141-1.774 43-64
39-53 2.567 239
8-87
Příloha č. 3 Obsah polyfenolů ve vybrané zelenině a potravinácha (King a Young, 1999) Flavonoidy
Zelenina/
potravina
Celer
Flavonoly
Fazole, zelená/žlutá
49
Brokolice
102
Kapusta
321
Černý hrách Čekanka
Salát listový Čočka
Tuřín
48
Sójové boby, zralé, čerstvé Sójové ořechy
Sójová mouka
Zeleninový protein Tofu
Sójové mléko Miso
Sójová omáčka Sójový hot dog Sójový sýr
Tofu jogurt
Tofu zmrzlina
Hydroxyskořicová
tanniny
mg.kg-1
130
141-1.774
308
347
Sójové boby,zralé, suché
Isoflavony
Kondenzované
46
Cibule
Brambory, bílé
Flavony
Fenolové kyseliny
3.800 100-190 888-2.407 182-205
1.437-2.363
1.036-1.778
1.175-1.191 280-499
105-251
256-540 13-23 116
7-74 151 31
Jedná se pouze o obsah polyfenolických sloučenin u zeleniny a vybraných potravin s relativně vysokou koncentrací (>30 mg.kg-1) určité polyfenolické sloučeniny. Pokud zde není uveden obsah, zeleniny a vybrané potraviny poskytují méně než 30 mg.kg-1 určité polyfenolické sloučeniny. a
Příloha č. 4 Obsah polyfenolů ve vybraném ovocia (King a Young, 1999)
Jablko
21-72
Borůvky
Třešně, sladké Brusinky
Hrozno, světlé
23-30
Isoflavony
Flavanoly
Flavony
Flavonoly
Ovoce
mg.kg-1
Olivy
Pomeranče Hruška Jahody
Cherry rajčata
17-203
2-258
39-53
25-160
6-29 70-420
Maliny
tanniny
290-1.280
249
270-830
Kondenzované
1.881-2.112
Hrozno, tmavé Grapefruit
Hydroxyskořicová
Fenolové kyseliny
Hydroxybenzoová
Flavonoidy
21-182
59-142
44-1.270
43-64
630-1.110
21-80
Jedná se pouze o obsah polyfenolických sloučenin u ovoce s relativně vysokou koncentrací (>30 mg.kg) určité polyfenolické sloučeniny. Pokud zde není uveden obsah, ovoce poskytuje méně než 30 mg.kg-1 určité polyfenolické sloučeniny. a
1
Příloha č. 5 Obsah polyfenolů ve vybraných nápojícha (King a Young, 1999)
Nápoj Jablečný džus
Třešňový džus
Flavonoidy
Flavonoly
Flavanoly
6-52
Hroznový džus, tmavý Červené víno
Zelený čaj, listy
mg.l-1
79
Hroznový džus, světlý
Černý čaj, vařený
Hydroxybenzoová Hydroxyskořicová
274 20
9-114 124
Kávové boby
Bílé víno
Fenolové kyseliny
56
110 95
Kondenzované tanniny 8-87
56 g.kg-1 DWb
2.567 239
30-45 g.kg-1 DW 128-226 g.kg-1 DW
Jedná se pouze o obsah polyfenolických sloučenin u nápojů s relativně vysokou koncentrací (>30 mg.l) určité polyfenolické sloučeniny. Pokud zde není uveden obsah, nápoj poskytuje méně než 30 mg.l-1 určité fenolické sloučeniny. b DW= suchá váha a
1
Příloha č.6 Obsah polyfenolů v různých druzích potravin a nápojů dle Brava (1998)
Potravina/Nápoj Cereálie (mg.kg sušiny)
Obsah
celkových
Potravina/Nápoj
polyfenolů
Obsah
celkových
polyfenolů
-1
ječmen
12.000-15.000 borůvky
jáhly
5.900-10.600
rýže
86
kukuřice
309
oves
87
čirok
1.350-2.800
třešně
600-900
brusinky
770-2.470
hrozno
500-4.900
pomeranč
500-1.000
angrešt
220-750
1.700-102.600 grapefruit
pšenice
Luštěniny ( mg.kg-1 sušiny ) černé boby
cizrna beranní
220-400
5.400-12.000 780-2.300
fazole
340-2.800
500
broskev
100-1.500
švestka
40-2.250
hruška
20-250
maliny
370-4.290
jahody
380-2.180
zelené boby
4.400-8.000
betel ořechy
26-33
Ovocné džusy ( mg.l-1)
burské oříšky
0.04
pomerančový džus
Ořechy (% sušiny) kešu oříšky
33.7
pecanové ořechy
Zelenina ( mg.kg ) -1
8-14
růžičková kapusta
60-150
pór
200-400
zelí
cibule
1.000-20.250
petržel celer
550-1.800
Ovoce ( mg.kg ) jablko
meruňka
černý rybíz
250
-1
940
270-2.980 300-430
1.400-12.000
červený rybíz
jablečný džus
Nápoje
čajové listy (%sušiny) zelené
černé
170-200
20-160
3.700-71.000
20-35
22-33
čaj, šálek (mg/200ml)
150-210
káva, šálek (mg/150ml)
200-550
kávové boby (% sušiny)
kakaové boby (% sušiny)
víno (mg.l ) -1
bíle
červené
pivo (mg.l ) -1
0,2-10 26-33
2.000-3.000
1.000-40.000 600-1.000
