Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta
Známe referenční interval glutamátdehydrogenázy?
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí bakalářské práce:
Autor:
Prim. MUDr. RNDr. Pavel Neshyba, CSc.
Marcela Šišková
Brno, duben 2009
-2-
Jméno a příjmení autora: Marcela Šišková
Název bakalářské práce: Známe referenční interval glutamátdehydrogenázy?
Pracoviště: Nemocnice Kroměříž a.s. odd. klinické biochemie, Biochemická a hematologická laboratoř RNDr. Martina Nováka Kroměříž
Vedoucí bakalářské práce: Prim. MUDr. RNDr. Pavel Neshyba, CSc.
Rok obhajoby bakalářské práce: 2009
Klíčová slova: glutamátdehydrogenáza, enzym
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
-3-
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením prim.MUDr.RNDr. Pavla Neshyby, CSc. a konzultanta RNDr. Šárky Valčíkové a uvedla v seznamu všechny použité literární a odborné zdroje.
V Brně dne ………........
………………………………. ( Marcela Šišková )
-4-
OBSAH
Prohlášení………………………………………………………………3 Obsah…………………………………………………………………...4 Seznam zkratek………………………………………………………...6 1 ÚVOD…………………………………………………………………7 TEORETICKÁ ČÁST…………………………………………………8 2 INFORMACE O ENZYMU…………………………………………8 2.1 Definice a zařazení enzymu………………………………………8 2.2 Struktura enzymu………………………………………………...8 2.3 Struktura nikotinamidových nukleotidů……………………….10 2.4 Funkce glutamátdehydrogenázy………………………………..11 3 KLINICKÝ VÝZNAM GLUTAMÁTDEHYDROGENÁZY……12 3.1 Játra………………………………………………………………12 3.1.1 Popis a poloha jater…………………………………………..12 3.1.2 Mikroskopická stavba jater…………………………………..12 3.1.3 Topografie enzymů v hepatocytu…………………………….14 3.1.4 Krevní oběh v játrech…………………………………….......15 3.1.5 Funkce jater………………………………………………….16 3.2 Proč vyšetřovat glutamátdehydrogenázu……………………...20 4 MĚŘENÍ AKTIVITY ENZYMŮ………………………………….22 4.1 Základy enzymologie……………………………………………22 4.2 Vlastnosti enzymů……………………………………………….22 4.3 Klasifikace a názvosloví enzymů……………………………….23 4.4 Vyjadřování aktivity enzymů…………………………………..24 4.5 Kinetika enzymových reakcí……………………………………25 4.6 Faktory ovlivňující enzymovou katalýzu………………………26 4.7 Metody stanovení katalytické koncentrace enzymů…………..27
-5-
SPECIÁLNÍ ČÁST…………………………………………………......30 5 CÍL PRÁCE…………………………………………………………...30 6 STANOVENÍ AKTIVITY GLUTAMÁTDEHYDROGENÁZY….31 6.1 Stanovení aktivity glutamátdehydrogenázy v minulosti………...31 6.2 Stanovení aktivity glutamátdehydrogenázy v současnosti………32 6.2.1 Znaky metody……………………………………………………33 7 VYŠETŘOVANÉ OSOBY A METODY…………………………….35 8 VÝSLEDKY……………………………………………………………36 8.1 Interlaboratorní stanovení aktivity glutamátdehydrogenázy…...36 8.2 Distribuční křivky aktivity glutamátdehydrogenázy…………….37 9 DISKUZE………………………………………………………………39 10 ZÁVĚR………………………………………………………………..42 11 LITERATURA………………………………………………………..43 Přílohy…………………………………………………………………….45 Poděkování.……………………………………………………………….47
-6-
Seznam zkratek:
ADP
adenosintrifosfát
ALP
alkalická fosfatáza
ALT
alaninaminotransferáza
AST
aspartátaminotransferáza
DGKC
Německá společnost klinické biochemie
E
enzym
GGT
gama-glutamyltransferáza
GLU-BD
glutamát vázající doména
GMD
glutamátdehydrogenáza
GTP
guanosintrifosfát
HBD
hydroxybutyrátdehydrogenáza
CHS
cholinesteráza
IUB
mezinárodní biochemická unie
Km
Michaelisova konstanta
LD
laktátdehydrogenáza
NAD
NAD vázající doména
NAD-BD
nikotinamiddinukleotid
NADH+
redukovaná forma nikotinamiddinukleotidu
NADP
nikotinamiddinukleotidfosfát
NADPH+
redukovaná forma nikotinamiddinukleotidu fosfátu
NTS
5´nukleotidáza
OKB
oddělení klinické biochemie
P
produkt
S
substrát
V max
maximální rychlost
-7-
1 ÚVOD
Glutamátdehydrogenáza (dále jen GMD) je mitochondriální enzym s klíčovou rolí v dusíkovém a glutamátovém metabolismu a v udržení energetické homeostázi. GMD je přítomný ve tkáni jater, mozku, slinivky břišní, ledvin, ale není přítomen ve svalové tkáni. GMD vykazuje funkci jak v syntéze, tak katabolismu glutamátu a v detoxikaci amoniaku. Jeho hladina v séru se zvyšuje při těžkém poškození jaterních buněk a je mírou rozsahu nekrotického procesu v játrech. Dále slouží při diferenciaci jaterních onemocnění spolu s dalšími jaterními enzymy.
obr.1 struktura glutamátdehydrogenázy
-8-
TEORETICKÁ ČÁST
2 INFORMACE O ENZYMU
2.1 Definice a zařazení enzymu
Lidský GMD je lokalizován na 10-tém chromozomu a obsahuje 13 exonů. Nachází se výhradně v mitochondriích buněk a to ve zvlášť vysoké koncentraci v jaterních buňkách.
E.C.:
1.4.1.2.
CAS:
9001-46-4
Kategorie: Oxidoreduktáza Reakce:
L-glutamát + H2O+NAD+ ↔ 2 – ketoglutarát + NH3 + NADH+H+
tab.1 zařazení enzymu
2.2 Struktura enzymu
GMD je hexamer, který je složen z 505-ti aminokyselin. Každá monomerní jednotka obsahuje: a/ N-terminál GLU-BD (glutamát vázající doménu), který je složen většinou z ß-řetězců. b/ NAD-BD (NAD vázající doménu) – může vázat buď NAD+ nebo NADP+. c/ 48 zbytkových antén, které vedou z každého NAD-BD.
-9-
Anténa se skládá ze vzestupné šroubovice a sestupného nesouvislého vlákna, které obsahuje malou alfa helix směřující k C-terminálu na konci řetězce.
NAD-BD nasedá na vrchol GLU-BD. NAD-BD a GLU-BD tvoří katalytickou štěrbinu. Během vazby substrátu se NAD-BD v molekule přesunuje. Tento pohyb má 2 části, rotace podél dlouhé osy šroubovice z NAD-BD zvané pivot helix a zpět a kroucení kolem antény ve směru hodinových ručiček. Porovnání otevřené a uzavřené konfirmace GMD ukáže změny v malé šroubovici sestupného vlákna antény, které pravděpodobně odskočí, když se štěrbina otevře. Uzavření jedné podjednotky je spojeno se zakřivením malé alfa helix sestupného vlákna, které je tlačeno do antény sousední podjednotky. Jaderná struktura hexameru je srovnána do dimeru a za její vybudování je odpovědná GLU-BD.
obr.2 rentgenová struktura GMD
- 10 -
2.3 Struktura nikotinamidových nukleotidů Nikotinamiddinukleotid (NAD+) a nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADP+) jsou koenzymy vázané na glutámátdehydrogenázu. Jsou to nebílkovinné, molekuly jsou
thermostabilní,
nízkomolekulární,
organické
látky.
Jejich
tvořeny dvěma odlišnými nukleotidy, nikotinamidových a
adeninových, které jsou spojeny kyselinou difosforečnou. Podívame-li se na strukturu podrobněji, zjistíme, že jejich molekula obsahuje dvě různé heterocyklické dusíkaté baze, purin jako součást adeninu a pyridin, který je přítomen v nikotinamidu. Nikotinamid je derivát kyseliny nikotinové, která je strukturou odvozená od pyridinu a patří mezi vitamíny skupiny B. Vyšší organismy si jej nedokáží samy plně syntetizovat. Musí ho přijímat v potravě v různých formách buď jako nikotinamid nebo kyselinu nikotinovou. Stačí ale i prekurzor, esenciální aminokyselina tryptofan, ze které je už přeměna v organismu možná. Hlavní využití molekul NAD(P) je v oxidoredukčních pochodech metabolismu jako přenašeč vodíku a elektronů.
obr.3 struktura koenzymů NAD a NADP
- 11 -
2.4 Funkce glutamátdehydrogenázy
GMD má centrální úlohu v metabolismu dusíku. GMD katalyzuje oxidační deaminace kyseliny glutámové. Tato reakce je mezikrokem metabolismu aminokyselin. Jako kofaktor slouží buď NAD+ nebo NADP+ . Reakce probíhá odštěpením dvou vodíkových iontů za vzniku 2-iminoglutarátu, který je poté hydrolyzován a vzniká 2-oxoglutarát a volný amoniak.
obr.4 oxidační deaminace
Protože je amoniak pro tělo toxický, musí být z těla vyloučen. Děje se tak tvorbou močoviny probíhající v játrech. Močovina je poté z těla vyloučena ledvinami. Aktivita glutamátdehydrogenázy je v játrech inhibitory ATP, GTP a NADH a aktivována ADP.
regulována allosterickými
- 12 -
3 KLINICKÝ VÝZNAM GLUTAMÁTDEHYDROGENÁZY
3.1 Játra
3.1.1 Popis a poloha jater
Játra jsou největší žlázou v lidském těle, váží asi 1500 g. Zdravá játra jsou tuhá, ale poddajná a mají červenohnědou barvu. Jejich tkáň je dost křehká, takže při nadměrných otřesech může dojít k jejich natržení a masivnímu, život ohrožujícímu krvácení. Játra jsou orgánem dutiny břišní ležící pod bránicí na pravé straně. K bránici naléhají brániční plochou a z druhé strany naléhají na orgány dutiny břišní tzv. viscerální plochou. Uprostřed viscerální plochy se nachází jaterní brána (porta hepatis), tudy do jater vstupuje jaterní tepna a vrátnicová žíla a vystupují vývodné žlučové cesty. Ve žlučníkové jámě je vrostlý žlučový měchýř. Z anatomického hlediska se játra dělí na 4 laloky: větší pravý lalok (lobus dexter) menší levý lalok (lobus sinister) ocasatý lalok (lobus caudatus) čtyřhranný lalok (lobus quadratus)
3.1.2 Mikroskopická stavba jater Základní morfologickou jednotkou jater je lalůček centrální žíly (lobulus venae centralis), který je asi 2 mm velký a má podobu šestibokého hranolu tvořeného hvězdicovitými trámci jaterních buněk uspořádaných kolem centrální žíly protékající středem lalůčku. V prostorech mezi trámci probíhají jaterní sinusoidy - zvláštní typ krevních kapilár, zde se vyskytuje typ makrofágu -
- 13 -
Kuppferovy buňky, a kolem sinusoid, v perisinusoidálním prostoru jsou mezi stěnou sinusoidy a jaterní buňkou, v tzv. Disseho prostoru, buňky Itovy, které uskladňují vitamín A. Uprostřed trámců se nacházejí žlučové kapiláry - prostory mezi hepatocyty, kam je produkována žluč. V místě styku tří nebo čtyř sousedících lalůčků je portobiliární prostor (area periportalis) vyplněný řídkým kolagenním vazivem, kudy probíhá interlobulární artérie (arteria interlobularis), interlobulární véna (vena interlobularis) a interlobulární žlučovod. Jejich soubor se nazývá triáda ( trias hepatis). Funkční jednotka jater je lalůček portální (lobulus venae interlobularis), který má tvar trojúhelníku, jehož vrcholy tvoří centrální žíly sousedících lalůčků. Střed portálního lalůčku je nejlépe zásoben živinami. Funkční jednotka jaterního parenchymu je primární jaterní acinus. Jedná se o jednu šestinu lalůčku centrální vény a ještě další jednu šestinu ze sousedního lalůčku centrální vény. Tyto dvě části mají společné krevní zásobení (vénu a artérii) z jedné (cirkumlobulární) větve vedoucí z portorbitálního prostoru. Podle vzdálenosti od vény se v acinu rozlišují tři distribuční zóny: •
1. zóna, periportální - je nejbližší přívodným cévám, a proto nejlépe zásobená kyslíkem a živinami, je místem s převahou oxidačních dějů, probíhá zde beta-oxidace mastných kyselin, transaminace a katabolismus aminokyselin, tvorba močoviny, glukoneogeneze a uvolňování glukózy do krve, tvorba žluči a syntéza cholesterolu.
•
2. zóna - je přechodnou zónou, její rozsah závisí na místním i celkovém zásobení krví.
•
3. zóna, periacinární - je nejvzdálenější, leží na periferii acinu a je místem s převahou biotransformačních a redukčních dějů, perivenózní hepatocyty jsou odpovědné za vychytávání glukózy, syntézu glykogenu, glykolýzu, lipogenezi a ketogenezi, tedy tvorbu tuků a ketolátek.
- 14 -
Jaterní buňky, hepatocyty, tvoří asi 60-70 % buněčné populace jaterní tkáně a jejich bohatá enzymová výbava je podstatou nadřazené úlohy jater v tělesném metabolismu. Zajímavé je, že periportální a perivenózní hepatocyty jaterních acinů se od sebe liší množstvím a uspořádáním buněčných organel i metabolickou kapacitou. Jaterní makrofágy - Kuppferovy buňky, tvoří 25-30% buněk jater a jsou to fixní makrofágy, které fagocytují bakterie, cizorodé bílkoviny a přestárlé červené krvinky. Dalšími buňkami jsou jaterní hvězdicovité, neboli Itovy buňky, jejichž přesná úloha je zatím nejasná. Ve zdravých játrech skladují retinoidy, v poškozených mění svůj fenotyp, produkují kolagen a zřejmě se tak podílejí na patogenezi fibrózy a cirhózy. Dalšími buňkami jater jsou tzv. Pit buňky, což jsou jaterní NK buňky, a endotelie, které tvoří stěnu cév.
3.1.3 Topografie enzymů v hepatocytu
Znalost topografie enzymů v jaterní buňce je velmi důležitá při interpretaci výsledků biochemických vyšetření. V cytoplazmě se nalézá především ALT, která je pro jaterní buňku relativně specifická. Dalším enzymem cytoplasmy je AST, tohoto enzymu se zde nachází pouze 30%, zbytek je v mitochondriích. Dalším výhradně cytoplasmatickým enzymem je LD a HBD. V mitochondriích se nachází již zmíněná AST a to 70%. Charakteristicky mitochondriální enzym je GMD. Mitochondriální enzymy pronikají do séra až při větším poškození jaterního parenchymu vedoucího k nekróze jaterních buněk.
- 15 -
V membránách endotelu žlučovodů a v kanikulární membráně jaterních buněk jsou lokalizované enzymy, jejichž zvýšení v séru ukazuje přítomnost cholestázy a jsou to: ALP, NTS, GGT. V lysosomech se nacházejí hydrolytické enzymy. Endoplasmatické retikulum a ribosomy jsou místem syntézy bílkovin. Poškození jaterní buňky vede ke snížení proteosyntézy. Snižuje se CHS, stejně tak koagulační faktory a plasmatické bílkoviny.
obr.5 schéma hepatocytu
- 16 -
3.1.4 Krevní oběh v játrech Játry protéká značné množství krve, až ¼ minutového objemu srdečního výdeje, což u člověka činí asi 1,5 litru krve za minutu. Krevní oběh v játrech je dvojí: funkční a výživný. Funkční oběh zajišťuje vrátnicová žíla, která přivádí až 90% krve, která obsahuje vstřebané živiny z trávicího traktu, včetně případných toxinů bakterií střev, a zplodiny metabolismu buněk. Vrátnicová žíla (vena portae), vstupuje do jater jaterní bránou a větví se až na žíly protékající portobiliárním prostorem. Ty se větví do sinusoid protékajících mezi trámci hepatocytů a stékají se v centrální žíle. Centrální žíly se opět spojují, krev konečně vtéká do jaterních žil které se vlévají do dolní duté žíly. Výživný oběh představuje jaterní tepna a její větve, které přivádí krev bohatou na kyslík, vstupuje v jaterní bráně a větví se podobně jako vrátnicová žíla. V sinusoidách dochází ke smíšení obou oběhů.
3.1.5 Funkce jater Funkce jater je všestranná, většina procesů v nich probíhajících souvisí s metabolismem a detoxikací, kromě toho jsou však játra též exokrinní i endokrinní žláza a zasahují i do dalších dějů. V hepatocytech probíhají vzájemné přeměny
živin,
jejich
syntézy,
degradace
a
resorbce
z
krve.
Metabolické děje probíhající v játrech: • Metabolismus sacharidů: jaterní buňky vychytávají glukózu z portální krve, skladují ji jako glykogen nebo přeměňují na lipidy. V játrech probíhají vzájemné
- 17 -
přeměny hexos, dále pentózový cyklus a přeměna laktátu na glukózu (Coriho cyklus) a přeměna alaninu na glukózu. Při hladovění je z jater glukóza uvolňována po glykogenolýze nebo syntetizována v procesu glukoneogeneze. Ke zpracovávání glukózy jsou jaterní buňky vybaveny specifickými enzymy (glukokinasa, fruktokinasa a galaktokinasa). Játra udržují stálou glykémii. • Metabolismus lipidů: v játrech probíhá syntéza, beta-oxidace a peroxidace mastných kyselin, syntéza triacylglycerolů, cholesterolu a fosfolipidů, tvorba ketolátek (acetacetát, beta-hydroxymáselná kyselina, aceton). Jaterní buňky tvoří také lipoproteiny např. VLDL, které transportují lipidy do tkání, a HDL, pomocí kterého se cholesterol dostává z tkání do jater. V játrech jsou též zpracovávány chylomikrony, ve kterých jsou tuky transportovány ze střeva. •
Metabolismus aminokyselin: játra pomáhají udržovat stálou hladinu
aminokyselin v krevní plasmě, vychytávají glukoplastické aminokyseliny (alanin, serin, threonin), syntetizují neesenciální aminokyseliny a také v nich probíhá katabolismus většiny esenciálních aminokyselin (výjimku tvoří ty s rozvětveným řetězcem). • Detoxikace amoniaku: volný amoniak narušuje acidobazickou rovnováhu organismu a je neurotoxický. V těle je tvořen při deaminaci aminokyselin a také činností střevní mikroflóry - játra jsou proto vybavena dvěma účinnými systémy na jeho odstranění. Prvním systémem je ornitinový cyklus, při které je syntetizována močovina. Je to energeticky nákladný proces, probíhá proto v periportální zóně jaterního acinu. Takto je detoxikována většina amoniaku. Druhým systémem detoxikace je syntéza glutaminu (z glutamátu a amonného iontu), která se odehrává v perivenózních hepatocytech. Amoniak z glutaminu je následně uvolněn v ledvinách a vyloučen močí. Regulací zastoupení těchto dvou systémů na detoxikaci amoniaku zároveň získávají játra silný nástroj k řízení poměru kyselin a bází v organismu.
- 18 -
• Degradace cholesterolu: v játrech se degraduje přebytečný cholesterol. Při tomto procesu vznikají primární žlučové kyseliny - kyselina cholová a kyselina deoxycholová. Ty jsou dále konjugovány s taurinem nebo glycinem. • Degradace hemu: hem z rozpadlých červených krvinek je navázán na protein hemopexin a transportován do jater, kde je vzniklý komplex fagocytován Kuppferovými buňkami. V nich dochází k přeměně hemu na biliverdin a dále na bilirubin. Bilirubin se váže na další protein krevní plasmy, albumin, odkud je vychytáván hepatocyty. Ve vazbě na protein ligandin se dostává do endoplasmatického retikula, kde je konjugován na bilirubindiglukosiduronát. Ten je pak aktivním transportem vyloučen do žluči. • Detoxikační funkce: v játrech jsou hydrofobní cizorodé molekuly, které proto nemohou být vyloučeny močí, oxidovány cytochromem P450 a konjugovány s hydrofilními látkami, jako je kyselina glukuronová, kyselina sírová a další. Vzniklé molekuly jsou pak vyloučeny do žluče nebo do krevní plasmy, odkud jsou odstraněny v ledvinách. •
Tvorba hormonů: játra produkují angiotenzinogen, který má vliv na
hospodaření s vodou, solemi a udržování krevního tlaku. Dále syntetizují somatomedin, jehož prostřednictvím působí růstový hormon, a v malém množství v nich vzniká též erytropoetin, který zajišťuje erytropoézu. • Degradace a inaktivace hormonů: v játrech se likvidují hormony, jako je inzulin, steroidní hormony a další. •
Syntéza plasmatických proteinů: v játrech jsou syntetizovány všechny
plazmatické
proteiny
kromě
imunoglobulinů
(tzn.
protilátek)
a
von
Willebrandova faktoru. Za 24 hodin se v jaterní tkáni vytvoří až 50 g plasmatických bílkovin. Při poruše jaterních funkcí se proto po vyčerpání funkčních bílkovin v krvi objeví poruchy srážlivosti krve (nejsou syntetizované
- 19 -
koagulační faktory) a dále otoky způsobené sníženým onkotickým tlakem v cévách. • Zásobní funkce: játra jsou depo lipidů (až 10% jejich hmotnosti), glykogenu, železa (ve formě ferritinu) a vitamínů A, D, K a B12. • Orgán krvetvorby: během embryonálního vývoje savců jsou játra orgánem, kde probíhá krvetvorba. V případě těžkého poškození kostní dřeně se může tvorba krevních elementů v játrech obnovit i u dospělých jedinců. Tato mnohostranná účast jater v životně důležitých funkcích činí játra nepostradatelným a zatím nenahraditelným orgánem.
- 20 -
3.2 Proč vyšetřovat Glutamátdehydrogenázu
Ačkoliv je GMD jaterní, specifický enzym, je nevhodný jako jaterní screeningový test pro hepatobiliární onemocnění. Jeho diagnostická senzitivita je pouze 47%. GMD se nachází výhradně v mitochondriích hepatocytů. Jeho zvýšení je tedy měřítkem rozsahu nekrotického procesu v játrech (těžké toxické poškození, hepatodystrofie). Může však být podmíněno i zvýšením syntézy enzymu, např. drážděním endotelu žlučových cest cholestázou (tumor, zánět). GMD hraje důležitou roli v diferenciální diagnostice jaterního onemocnění zejména v kombinaci s aminotransferázami.
Onemocnění Akutní selhání jater
Patofyziologické poznámky Hodnoty mohou být až 100krát vyšší (rozdíl od akutní virové hepatitidy, kde je mnohem nižší).
Akutní virová hepatitida
U nekomplikovaných průběhů je vzestup mírný.
Chronická aktivní hepatitida
Chronická perzistující má GMD obvykle normální.
Jaterní cirhóza
Vzestup výrazem nekrotizující ataky.
- 21 -
Obstrukční ikterus
Projev zvýšené syntézy. Vzestup asi 10krát za 36 hod. po kolice, pak pokles.
Tumory
tab. 2 patologické změny aktivity GMD
Současně vzestup GGT, ALP a aminotransferáz
- 22 -
4 MĚŘENÍ AKTIVITY ENZYMŮ
4.1 Základy enzymologie
Enzymy jsou biokatalyzátory chemických reakcí, tzn. urychlují většinu chemických reakcí v organismu tím, že snižují aktivační energii. Enzymy patří mezi bílkoviny. Pokud je enzym jednosložkový (obsahuje pouze bílkovinnou část) nazývá se apoenzym. Může obsahovat i nebílkovinnou část zvanou kofaktor. Pokud je kofaktor vázán pevnou kovalentní vazbou, tak vytváří tzv. prostetickou skupinu. V případě vazby slabé, schopné disociace je nebílkovinná část nazvána koenzym. Koenzymy jsou obvykle vitamíny nebo ionty kovů. Nejdůležitější část enzymu je aktivní místo enzymu, které je tvořeno zbytky aminokyselin, do kterého se váže substrát pomocí vodíkových můstků, van der Waalsových sil a elektrostatických sil.
4.2 Vlastnosti enzymů
Substrátová specifita – určuje, který substrát bude přeměněn. Enzym může být jednak absolutně specifický, což znamená, že bude působit pouze na jeden jediný substrát nebo relativně specifický, kdy je enzym schopen vazby několika substrátů strukturou podobných ovšem afinita je jiná.
Specifita účinku – určuje jaká reakce bude katalyzována (např. jeden substrát může podlehnout transaminaci nebo dekarboxylaci), a do jisté míry závisí na přítomném koenzymu.
- 23 -
4.3 Klasifikace názvosloví enzymů
Zpočátku byly objevované enzymy nazývány podle svých objevitelů. Některé enzymy končily koncovkou –in a mnohé z nich se používají dodnes (pepsin, trypsin). Později se jako koncovka používala –asa a to buď podle substrátu (ureasa, amylasa) nebo podle katalyzované reakce (dehydrogenasy, oxygenasy). Protože objevovaných enzymů přibývalo, začalo docházet ke zmatkům. Pravidla stanovila
až
Mezinárodní
biochemická
unie
(International
Union
of
Biochemistry), dále jen IUB.
Názvosloví je tvořeno dvěma způsoby:
a/ systematický název – označení substrátu/ů následuje reakce + koncovka -asa př. L-alanin 2-oxoglutarát aminotransferáza b/ triviální název – je kratší a většinou obsahuje označení substrátu a typ reakce př. Alaninaminotransferáza IUB zavedla pro každý prozkoumaný enzym číselný kód, který se skládá ze čtyř čísel značících: - třídu - podtřídu - podpodtřídu - pořadové číslo v oficiálním seznamu Enzymy se klasifikují podle povahy katalyzované reakce.
Třídy enzymů jsou následující: 1. Oxidoreduktázy – katalyzují oxidačně-redukční reakce tím, že přenáší vodík, kyslík nebo elektrony. 2. Transferázy – katalyzují přenos funkční skupiny (např.-NH2).
- 24 -
3. Hydrolázy - katalyzují hydrolytické reakce tzn. štěpení substrátu za vstupu vody. 4. Lyásy – štěpí vazbu mezi uhlíky nebo uhlíkem a dusíkem, ale bez vstupu vody. 5. Isomerázy – katalyzují izomerační reakce. 6. Ligázy – spojují dvě sloučeniny za vytvoření nových vazeb mezi atomy a za spotřeby energie získané současným štěpením ATP (Ledvina 2004).
4.4 Vyjadřování aktivity enzymů
Množství enzymu se obvykle uvádí dle látkového množství substrátu, který je přeměněn na produkt za časovou jednotku, což je katalytická koncentrace enzymu. Jednotkou je katal (kat) a je součástí SI soustavy. 1 kat je takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 molu substrátu za 1 s. Vzhledem k tomu, že se enzymy v těle nachází v nižších koncentracích, užívají se jednotky menší, obvykle vztažené na 1l tekutiny (v tomto případě séra): 1ukat/l = 10-6 kat/l
1nkat/l = 10-9 kat/l
Katalytická aktivita enzymu se dá vyjádřit pomocí mezinárodní jednotky (U). 1 (U) má takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 umolu substrátu za 1 min.
- 25 -
4.5 Kinetika enzymových reakcí
Kinetika neboli rychlost enzymové reakce je dána buď úbytkem substrátu za časovou jednotku nebo přírůstkem produktu. Rychlost se nejprve zvyšuje se zvyšujícím se množství substrátu. Při vyšších koncentracích substrátu se již nezvyšuje lineárně, ale postupně se ustaluje a je konstantní – rychlost je maximální Vmax. Další zvyšování substrátu již nemá na reakční rychlost vliv, protože veškerý enzym se nachází v komplexu enzym-substrát, je tedy nasycen. Funkce závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu má tvar hyperboly. Michaelis a Mentenová vypracovali teorii mechanismu enzymových reakcí, která je zatím nejadekvátnějším vyjádřením vztahu mezi rychlostí reakce, kterou enzym katalyzuje, a koncentrací substrátu. Podle této teorie dochází k reverzibilní tvorbě intermediálního komplexu enzym-substrát, který se rozpadá za tvorby produktů a uvolnění enzymu:
E + S ↔ ES → E + P Michaelisova konstanta je taková koncentrace enzymu, při které reakce probíhá právě polovinou maximální rychlosti, její rozměry se vyjadřují v mol/l. Km vyjadřuje afinitu enzymu k substrátu. Čím menší je Km, tím vyšší je afinita k substrátu. Matematickou formulací této teorie kinetiky enzymových reakcí lze odvodit rovnici vyjadřující vztah mezi okamžitou rychlostí enzymové reakce a koncentrací substrátu. Km a Vmax lze odečíst z grafu, ale pro obtížné určování maximální rychlosti, ke které se křivka asymptoticky blíží, je vhodnější používat ke stanovení Km a Vmax upravené formy rovnice Michaelise a Mentenové pomocí transformace dle Lineweavera a Burka.
- 26 -
obr. 6 Michaelisova konstanta
obr. 7 reciproké vyjádření dle Lineweavera a Burka
4.6 Faktory ovlivňující enzymovou katalýzu
• teplota – chemické reakce se se vzrůstem teploty urychlují. U enzymů musíme přijmout fakt, že se jedná o bílkoviny, které při vyšších teplotách podléhají denaturaci. Ta je spojena se zpomalením až ztrátou enzymového působení. Teplotní optimum působení enzymů je +20 až +40 stupňů. • pH - enzymy jsou bílkoviny, proto jsou jejich vlastnost silně ovlivňovány hodnotou pH. Každý enzym pracuje jen v nejpříznivější koncentraci
- 27 -
vodíkových iontů – pH optimum. Enzymy lidského těla mají pH optimum většinou neutrální. Výjimku tvoří pepsin, který působí v žaludku a to v silně kyselém prostředí. • koncentrace substrátu – jestliže se koncentrace substrátu zvyšuje, pak roste rychlost reakce k hodnotě maximální Vmax.
Koncentrace enzymu
ovlivňuje rychlost enzymové reakce až do doby, kdy je enzym substrátem nasycen, potom už je rychlost lineární. • koncentrace enzymu – při konstantní koncentraci substrátu je závislost reakční rychlosti na koncentraci enzymu lineární. • aktivátory – některé enzymy potřebují pro svou činnost určité ionty (Mn2+, Zn 2+, Mg 2+ a další) •
inhibitory – jako inhibitor označujeme látku, která snižuje aktivitu
enzymu, aniž by ho destruovala.
Známe několik typů inhibice: a/ kompetitivní inhibice – při tomto typu inhibice soutěží substrát s inhibitorem o aktivní místo. Kompetitivní inhibice je vratná, lze ji úplně odstranit, jestliže silně vzroste koncentrace substrátu. b/ nekompetitivní inhibice – nekompetitivní inhibitor snižuje aktivitu enzymu tím, že se naváže na enzym ne do aktivního místa, ale na reaktivní skupiny v molekule enzymu a tím ovlivňuje jeho afinitu a zpomalí se tvorba produktu. Nadbytkem substrátu nelze inhibici odstranit. c/ akompetitivní inhibice – je taková inhibice, kdy se inhibitor váže až na komplex enzym-substrát. d/ allosterická inhibice – inhibitor se váže na enzym tak, že mění jeho prostorové uspořádání a enzym pak není schopen katalyzovat.
- 28 -
4.7 Metody stanovení katalytické koncentrace enzymů
a) Kinetické měření – stanovení rychlosti enzymové reakce fotometricky, kontinuálním
měřením
absorbance
v závislosti
na
čase
opakovaným
zaznamenáváním změn absorbance ve stejných časových intervalech. Měříme buď přírůstek nebo úbytek substrátu nebo koenzymu, případně jiného reaktantu. Jestliže stanovujeme koncentraci koenzymu typu NAD, NADP nazýváme tento způsob měření optický test. Při něm využíváme rozdílu v absorpčních maximech jejich redukovaných NADH+ NADPH+ a oxidovaných forem NAD+ NADP+. Při 340 nm absorbují pouze redukované formy. Důležitý je také časový interval, ve kterém měříme. Většinou neměříme ihned na začátku enzymové reakce, neboť rychlost nebývá ještě konstantní, tuto fázi nazýváme lag-fáze. Měříme až v čase, kdy je rychlost reakce konstantní, tj. nezávisí na koncentraci reagujících látek. Tuto fázi reakce kontrolujeme. Automatické analyzátory mají tyto časy definovány v parametrech metod. Stejně tak i kontrolu vyčerpání substrátu.
obr. 8 redukovaná forma NADH má absorpční maximum při 340 nm
- 29 -
b) Metody End-point – u této metody necháme reakci proběhnout až do konce (tedy do vyčerpání substrátu). Koncentrace je určena z celkové změny měřícího signálu. Tato metoda již není moc doporučována.
c) Imunochemické metody – zde využíváme
specifickou protilátku proti
stanovovanému enzymu nebo můžeme využít některou z imunoanalytických metod a stanovit přímo množství enzymu vyjádřenou přímo v jednotkách hmotnostní koncentrace (ug/l).
- 30 -
SPECIÁLNÍ ČÁST
5 CÍL PRÁCE
Cílem práce bylo ověření předpokladu, že fyziologické „cut off ” hodnoty pro GMD jsou v současné době vypočítány a nastaveny nedostačujícím způsobem, který nám neumožňuje spolehlivě odlišit hepatopatii zejména od funkční hyperbilirubinemie.
- 31 -
6 STANOVENÍ AKTIVITY GLUTAMÁTDEHYDROGENÁZY
6.1 Stanovení aktivity glutamátdehydrogenázy v minulosti
Metodu na stanovení GMD popsali Holzer a spol., Gerlach, Schmidtovi a jiní. Metoda dle Schmidtových:
Reagencie: - triethanolaminový nárazník (TRA)
5.10-2
M
-octan amonný
3,2
M
- NADH2 v 1% NaHCO3
1,2.10-2 M
- α-ketoglutarát
4,1.10-1 M
Provedení: Do kyvety spektrálního fotometru o síle vrstvy 10 mm pipetujeme postupně: 2 ml TRA 1 ml séra 0,10 ml NH4+ 0,05 ml NADH2 Vše promícháme a necháme stát při pokojové teplotě 20-25 °C po dobu 20 minut. Potom změříme extinkci při světle o vlnové délce 340 nm proti destilované vodě. Tuto extinkci označíme E1. Přesně za 10 minut po prvním změření provedeme měření znovu. Tím získáme extinkci E2. Většinou jsou tato měření shodná a extinkce stejné. Reakci
startujeme
přidáním
0,05
α-ketoglutarátu.
Obsah
promícháme
plastikovou lopatičkou a extinkci, kterou odečteme za 1 minutu, označíme jako E3. Přesně za 10 minut od třetího měření změříme extinkci znovu, čímž získáme E4.
- 32 -
Mírou aktivity GMD je rozdíl extinkcí, který získáme ze vztahu:
(E3 – E4) – (E1 – E2) = ∆E ∆E GMD 340 . 3,09 = mikrokoky/ml/1hod. ∆E GMD 340 . 51,5 = milijednotky/ml.
6.2 Stanovení aktivity glutamátdehydrogenázy v současnosti
Stanovení katalytické aktivity GMD v séru a plazmě na systémech COBAS INTEGRA.
- princip testu : UV test podle standardizované metody. Enzym GMD katalyzuje reakci závislou na NADH s rovnováhou na straně glutamátu NAD. α – ketoglutarát + NADH + NH4+
→
glutamát + NAD + + H2O
Pokles NADH je přímo úměrný aktivitě GMD.
Složky
Koncentrace
Reagencie:
R1
R2 = SR test
Trietanolamin
60
8,6
EDTA
3,1
2,1 mmol/l
Octan amonný
124
82,7 mmol/l
ADP
≥1,36
≥0,91 mmol/l
41,3 mmol/l
- 33 -
NADH (kvasinky)
0,27
0,18 mmol/l
LDH (králičí svaly)
≥ 45
≥ 30 ukat/l (≥ 1,8 U/ml)
α- ketoglutarát
48
pH
8,0
7,53mmol/l
7,9
R1 a R2 obsahují nereaktivní stabilizátory a konzervans.
Definice testu : Způsob měření
absorbance
Způsob výpočtu absorbance
kinetický
Způsob reakce
R1-S-SR
Směr reakce
pokles
Vlnové délky A/B
340/409 nm
Výpočet první/poslední
43/65
Jednotky
U/L
Očekávané hodnoty: Muži
do 6,4 U/L
(do 0,11ukat/l)
Ženy
do 4,8 U/L
(do 0,08 ukat/l)
Vypočítáno s teplotním faktorem 1,61 (25→37°C)
6.2.1 Znaky metody
Rozsah měření: 1-80 U/L (0,0167-1,34 ukat/l) Rozšířený rozsah měření (vypočítaný) Faktor postdiluce: 5 doporučeno
- 34 -
1-400 U/L (0,0167-6,68 ukat/l) Spodní detekční limit: 1 U/L (0,167 ukat/l) Detekční limit představuje nejnižší měřitelnou hladinu analytu, kterou lze odlišit od nuly. Je vypočítána jako 3-násobek standardní odchylky od vzorku s nulovou hodnotou (nulový vzorek + 3 SD, přesnost v sérii, n=21).
Přesnost: Reprodukovatelnost byla stanovena analýzou lidských vzorků a kontrol podle interního postupu (v sérii n=21, mezi sériemi n=21). Byly získány následující výsledky: V sérii Vzorek
Mezi sériemi
Průměr
VK
Průměr
VK
U/L (ukat/l)
%
U/L (ukat/l)
%
Hladina 1
22,8 (0,380)
0,8
22,7 (0,378)
1,2
Hladina 2
22,3 (0,372)
0,4
22,0 (0,367)
1,0
tab.3 výsledky reprodukovatelnosti
- 35 -
7 VYŠETŘOVANÉ OSOBY A METODY Aktivita GMD byla vyšetřována ve skupině dárců krve. Dárci krve jsou společenská frakce s poměrně vysokou úrovní zdraví. Je to dáno jednak zdravotním dohledem a filtrem, jež provádějí ošetřující praktičtí lékaři, a jednak vyšetřeními dárců která jsou prováděna na transfúzním oddělení bezprostředně před odběrem. Dárců bylo celkem 380, 278 mužů a 102 žen ve věku 26-55 let. Vyšetřované osoby se nacházely ve standardních režimových opatřeních, které cca 24 hod. předcházely odběru. Ten byl proveden podle zásad správné transfúzní praxe jako součást odběrů venózní krve pro ta vyšetření, které předcházejí darování krve. Stanovení aktivity GMD proběhlo v den odběru. Bylo prováděno „a promisque“ ve dvou pracovištích nacházejících se v regionu města Kroměříž. A sice v Oddělení klinické biochemie Kroměřížské nemocnice a.s. a v Biochemické a hematologické laboratoři RNDr. Martina Nováka. Používané testové soupravy, kalibrační a kontrolní materiály a přístrojová technika, konkrétně analyzátory INTEGRA 800 a 400, jsou na obou pracovištích provenience ROCHE. Na obou je postupováno podle prakticky shodných zásad správné laboratorní praxe. Před započetím této práce jsme si pečlivě ověřili srovnatelnost, resp. totožnost, výsledků stanovení aktivity GMD obou pracovišť. Je to uvedeno v následující kapitole.
- 36 -
8 VÝLEDKY
8.1 Interlaboratorní stanovení aktivity glutamátdehydrogenázy
Vzhledem k tomu, že vyšetření aktivity GMD probíhalo „a promisque“ na dvou pracovištích, bylo nutné předem pečlivě ověřit vzájemnou srovnatelnost jejich výsledků a proto prokázat jejich totožnost. Bylo postupováno v režimu „ze dne na den“. Po dobu 40 dní bylo každý den na obou pracovištích analyzováno jedno náhodně vybrané sérum. Výsledky uvedené v tabulce 4. dokládají shodu obou pracovišť.
MN*
NEM** 40
N: X ± s:
62.8 ± 56.9
61.0 ± 54.1
t
0.1837
p
> 0.1
tab.4 interlaboratorní srovnání aktivity GMD
______________________________________________________________ * Biochemická a hematologická laboratoř RNDr. Martina Nováka ** Nemocnice Kroměříž a.s. odd. klinické biochemie
- 37 -
8.2 Distribuční křivky aktivity glutamátdehydrogenázy
Po ověření vzájemné srovnatelnosti výsledků bylo možné následně stanovovat aktivitu GMD ve skupině dárců krve. Dárců bylo celkem 380, 278 mužů a 102 žen ve věku 25-56 let. Stanovení aktivity GMD proběhlo v den odběru. Jejich výsledky jsou uvedeny v grafu 1 a 2. Je očividné, že tvary distribučních křivek jsou u obou pohlaví podobné. Jsou deviovány směrem doprava a relativně často překračují, u těchto zdravím kypících osob, doporučenou referenční hranici. U 10% mužských dárců a 13% žen (v absolutních číslech to bylo 27 mužů a 13 žen) aktivita GMD přesáhla hranice normy a ocitla se v oblasti patologie, v některých případech dosti daleko.
graf 1. distribuční křivka aktivity GMD u dárců krve mužského pohlaví
- 38 -
graf 2. distribuční křivka aktivity GMD u dárců krve ženského pohlaví
- 39 -
9 DISKUZE
Důvod, proč vzniklo toto upozorňující sdělení, je skutečnost, která vyplynula z rutinního analytického provozu obou laboratoří. Tam jsme pozorovali, zpočátku náhodně, občasný nesoulad mezi zvýšenou aktivitou GMD a negativitou ostatních enzymatických jaterních markerů, tj. AST, ALT, ALP a GGT. Toto sdělení však vychází zejména z poznatků Metabolické ambulance OKB Kroměřížské nemocnice a.s., která provádí v rámci svých služeb i hepatologická vyšetření. A to v rámci potřeby spolehlivě diagnostikovat funkční hyperbilirubinemii a zejména odlišit tuto odchylku od jaterní patologie. Na této úrovni je již dobře možné, v komplexu klinických, biochemických a zobrazovacích nálezů s velkou jistotou diagnostikovat, nebo naopak vyloučit hepatopatii. A právě u řady těch pacientů, u nichž jsme hepatopatii vyloučili, jsme znepokojivě často nalézali, a to u obou pohlaví, hodnoty GMD přesahující „cut off“ hodnoty doporučené firmou až o 100% a tedy svědčící pro aktivní hepatopatii. V současné době je stanovení aktivity GMD na evropské úrovni z velké části standardizováno.
Reakční procesy probíhají jednotně při 37 oC, soupravy
různých výrobců jsou si navzájem složením reakčních směsí velice podobné (neli totožné) a referenční intervaly se prakticky shodují. Dokládá to tabulka 5., kde jsou uvedeny „cut off“ hodnoty GMD deklarované Instituty pro klinickou biochemii pěti německých universitních klinik na jejich internetových stránkách. Klinika
ROCHE
Muži
Ženy
Düsseldorf
<107
<80
Rostock
<117
<83
Bonn
<107
<80
Magdeburg
<117
<83
Hamburg
<100
<83
<120
<80
tab.5 Aktuální „cut off“ hodnoty aktivity GMD v evropské populaci
- 40 -
Je to vskutku okouzlující shoda, která však obsahuje skrytý háček. Jde o toto: „Velkou Matkou“ standardizace enzymatických analytických postupů je Německá společnost pro klinickou chemii. Ta jako první, bylo to v roce 1972, vypracovala a doporučila optimalizované procedury pro stanovení aktivity různých enzymů, mimo jiné právě i GMD. Teplota reakční směsi byla v těchto postupech fixována na 25 oC jednak proto, že se věřilo tomu, že při této teplotě inaktivace enzymů v reakční směsi nebude probíhat, nebo bude probíhat velice malou rychlostí, a jednak, a to v neposlední řadě, tím bylo učiněno zadost technickým možnostem své doby. Tehdejší přístrojová technika, ponejvíce manuální, dokázala mnohem snadněji zvládnout rychlou a precizní temperaci reakční směsi na teplotu 25 oC, blízkou teplotě místnosti, než skok na teplotu, jež obvykle panuje v lidském organizmu tj. 37 oC. Nicméně postupem času technické možnosti oboru netušeně rostly. A ukázalo se také, a teoreticky to bylo plně zdůvodněno na mezinárodní úrovni, že je nutné z řady důvodů optimalizovat a sjednotit stanovení aktivity enzymů fixací reakční teploty na 37 oC. V roce 1992 proto doporučila Německá lékařská společnost přechod stanovení aktivity enzymů na postupy optimalizované při teplotě 37 oC. Proces měl být ukončen „v blízké budoucnosti“. Předpokládalo se, že to bude do konce roku 1995 včetně, pomocí multicentrických studií, které by patřičně ohraničily nové referenční intervaly. Tyto záměry se nepodařilo realizovat a přechodné stadium muselo být několikrát prodlužováno. Proto počátkem roku 2003 došlo ke konsenzu
mezi Německou společností pro klinickou chemii a laboratorní
medicinu (DGKL) a Spolkem výrobců diagnostik a diagnostických přístrojů (VDGH). S platností od 1.4.2003 byly na základě tohoto konsenzu deklarovány jednotné referenční intervaly pro stanovení aktivit celkem 9 enzymů, mezi nimi i GMD. Bylo to provedeno matematickou konverzí dosavadních referenčních hodnot, které byly kdysi stanoveny a platily pro teplotu 25 oC, na teplotu 37 oC.
- 41 -
A to vynásobením empiricky zjištěnými teplotními faktory. Pro stanovení aktivity GMD má tento faktor hodnotu 1.61, doporučené „cut off“ hodnoty GMD byly následně ohraničeny hodnotami 110 nkat/t pro mužskou populaci a 80 nkat/l pro ženy. Tabulka.5 dokazuje, že tyto hodnoty byly poslušně aktceptovány biochemickým komplementem a samozřejmě také výrobci diagnostik. Shora uvedený háček spočívá v tom, že takto získané meze
mají velice
daleko k dokonalosti. Jde o to, že změnou teploty z 25 na 37 oC vzniká ve zkumavce jiný a specifický termodynamický systém, který může značně variabilně determinovat nastavení terciální struktury molekul enzymu, a proto samozřejmě jejich aktuální aktivitu. Na analytické úrovni to vede k variabilitě teplotních koeficientů a na postanalytické nebo postlaboratorní úrovni k rozostření hranic referenčních intervalů a k výskytu falešně zvýšených, nebo naopak falešně snížených výsledků. Experti, zúčastnění v konsenzu, považovali jejich řešení za dočasné provizorium které bude nutné nahradit výsledky příslušných multicentrických studií a to „v blízké budoucnosti“. Tato budoucnost však doposud nenastala. V současné době
říkáme s plnou odpovědností, že referenční meze GMD
neznáme. Proto navrhujeme vytvořit skupinu, která by příslušnou studii provedla v tuzemsku. Jako počinek jí věnujeme náš soubor 380 osob.
- 42 -
10 ZÁVĚR
Vyšetřením 380 dárců krve je v této práci doloženo, že u 10% mužských dárců a 13% žen (v absolutních číslech to bylo 27 mužů a 13 žen) aktivita GMD, stanovená dle přísných zásad správné laboratorní praxe, přesahovala hranice současné a všeobecně akceptované středoevropské normy. Tato aktuální norma je však pouhým, i když řadu let trvajícím provizoriem, jež bylo získáno matematickou extrapolací referenčního intervalu GMD původně platného pro stanovení aktivity GMD při 25 °C a to pomocí empiricky stanovených teplotních koeficientů. Je to indikace k určení referenčních intervalů GMD současnými postupy „lege artis”.
- 43 -
11 LITERATURA
1. Pracovní návod ROCHE: GLDH Generace 3. 2. Consensus of
DGKL and VDGH for interim reference intervals on
enzymes in serum, J.Lab.Med. 2005, 24, 201-208. 3.Schumann G., Bonora M. et al.: Reference procedure for the measurement of catalytic activity of GLDH. Clin.Chem.Lab. Med. 2002, 40, 643-648. 4. doc.MUDr. Milan Dastych,Csc. MBA,RNDr.Petr Breinek a kolektiv: Klinická biochemie, 2008, ISBN 978-80-210-4572-9. 5. Donald Voeta a Judith G. Voetová: Biochemie, 1.vydání, Victoria publishing,a.s. Praha, 1995, ISBN 80-85605-44-9. 6. Miroslav Ledvina, Alena Stoklasová, Jaroslav Cerman: Biochemie pro studující medicíny Ι.díl, 1.vydání Praha, nakladatelství Karolinum 2004, ISBN 80-246-0849-9. 7. Murray Robert K., Granner Daryl K., Mayes Peter A., Rodwell Victor W.: Harperova Biochemie, 1993, ISBN 80-7319-003-6. 8. Masopust Jaroslav: Klinická biochemie Požadování a hodnocení biochemických vyšetření část Ι . ,vydalo nakladatelství Karolinum Praha 1998, ISBN 80-7184-648-1. 9. Ivan Dylevký, Rastislav Druga, Olga Mrázková: Funkční anatomie člověka,vydala Grada publishing 2000, ISBN 80-7169-681-1. 10. Masopust Jaroslav a kolektiv: Patobiochemie buňky, vydala Česká společnost klinické biochemie a Universita Karlova,2.lékařská fakulta Praha 2003, ISBN 80-239-1011-0. 11. Lothar Thomas: Clinical Laboratory diagnostics Use and Assesment of Clinical Laboratory Results, English Edition 1998, ISBN 3-9805215-4-0. 12. Lidské tělo: kolektiv autorů,2.vydání, Gemini Bratislava 1992, ISBN 8085265-59-1.
- 44 -
13. Prof.dr.J.Pojer a spolupracovníci: Enzymologie jaterních nemocí, 2.vydání, Praha:státní zdravotnické nakladatelství 1968, 08-037-68.
Webové odkazy: http://en.wikipedia.org/wiki/Glutamate_dehydrogenase_1 http://cs.wikipedia.org/wiki/játra http://chemistry.webzdarma.cz/enzymy.htm
- 45 -
PŘÍLOHY
příloha 1. analyzátor COBAS INTEGRA 400 Plus
příloha 2. set od firmy ROCHE k měření glutamátdehydrogenázy
- 46 -
příloha 3. vzorky připravené k analýze
- 47 -
PODĚKOVÁNÍ
Tímto bych chtěla poděkovat zejména panu Prim. MUDr. RNDr. Pavlu Neshybovi, CSc., za odborné vedení mé bakalářské práce, cenné rady a čas, který mi věnoval. Dále RNDr. Šárce Valčíkové za nemalou pomoc při uskutečňování mé práce. Ing. Šárce Žákové a RNDr. Martinu Novákovi. A nakonec kolektivu obou laboratoří.
