50
LAMPIRAN
50
51 Lampiran 1. Komposisi media Sea Water Completed (SWC) untuk 1 L
Bahan
Jumlah
Pepton Yeast extract Gliserol Agar Air laut Air destilata
5 gr 1 gr 3 ml 15 gr 750 ml 250 ml
52 Lampiran 2. Prosedur analisis logam berat Pb terlarut dalam contoh air laut (Hutagalung et al., 1997) 1. Contoh air laut (telah disaring dengan kertas saring ukuran pori 0,45 μm), standar, dan blanko diambil sebanyak 250 ml 2.
pH contoh disesuaikan menjadi ± 3 dengan menambahkan H2SO4 pekat sebanyak 1 ml
3. Contoh ditambahkan larutan APDC (2%) sebanyak 5 ml, lalu dikocok 5 Menit 4. Panaskan selama 1 jam dan dinginkan 5. Masukkan ke dalam corong pisah polyetilen 6. Kemudian ditambahkan 10 ml MIBK 7. Contoh dikocok (5 menit) dan dibiarkan hingga terbentuk 2 fase (± 10 menit) 8. Fase anorganik (lapisan bawah) di buang dan diambil fase organiknya (lapisan atas) 9. Fase organik ditambahkan HNO3 sebanyak 1 ml dan dikocok 2 – 5 menit. Diamkan 15 menit 10. Biarkan hingga terbentuk dua fase 11. Ambil fase anorganik (lapisan bawah) dan siap diukur dengan AAS menggunakan nyala udara – asetilen. Konsentrasi logam berat terlarut dapat langsung dilihat pada hasil print-out hasil pembacaan AAS.
53 Lampiran 3. Prosedur analisis Total Suspended Solid (TSS) dalam contoh air laut 1. Membran miliophore 0,45 µm dipreparasi dengan disaring dengan 60 ml akuades menggunakan vacuum pump 2. Membran dioven selama 1 jam dengan suhu 100o C dan dinginkan di dalam desikator selama setengah jam 3. Berat kering membrane ditimbang sehingga mendapatkan berat awal (Wo dalam gram) 4. Air sampel 250 ml disaring dengan membran yang sudah dipreparasi sebelumnya 5. Setelah air sampel disaring, bilas menggunakan akuades dengan jumlah yang sama dengan air sampel yang disaring sebelumnya 6. Membran dioven selama satu jam dan didinginkan di dalam desikator 7. berat akhir membran ditimbang sehingga didapat berat akhir (Wt dalam gram) 8. Nilai TSS didapat dengan rumus sebagai berikut:
TSS (mg/L) =
54 Lampiran 4. Prosedur analisis Nitrat (NO3N) dalam contoh air laut 1. Contoh air laut dan blanko diambil sebanyak 5 ml dan disaring dengan kertas saring 2. Contoh ditambahkan 0,5 ml Bruscine dan 5 ml H2SO4 pekat 3. Kemudian contoh dihomogenkan dengan kortex 4. Contoh dipanaskan setengah jam kemudian dinginkan 5. Kemudian diukur arbsorbansinya dengan spektofotometer pada λ = 410 nm dan dicari nilai nitratnya dengan rumus sebagai berikut :
55 Lampiran 5. Prosedur analisis Nitrit (NO2N) dalam contoh air laut 1. Contoh air laut dan blanko diambil sebanyak 10 ml dan disaring dengan kertas saring 2. Contoh ditambahkan 8 tetes pewarna nitrit 3. Kemudian contoh dihomogenkan dengan kortex da didiamka selama 5 menit 4. Kemudian diukur arbsorbansinya dengan spektofotometer pada λ = 543 nm dan dicari nilai nitritnya dengan rumus sebagai berikut :
56 Lampiran 6. Prosedur analisis Amonia (NH3N) dalam contoh air laut 1. Contoh air laut dan blanko diambil sebanyak 25 ml dan disaring dengan kertas saring 2. Contoh ditambahkan 1 ml fenol dan 1 ml sodium nitrofusit 3. Kemudian contoh ditambahka 2,5 ml oksidation solution dan didiamkan selama 1 jam di ruangan gelap 4. Contoh diukur arbsorbansinya dengan spektofotometer pada λ = 640 nm dan dicari nilai nitritnya dengan rumus sebagai berikut :
57 Lampiran 7. Prosedur analisis perhitungan total bakteri 1. Pilih cawan yang bakterinya adalah yang mengandung koloni antara 30 – 300 2. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua (satuan) dan angka kedua (desimal), apabila angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5 harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua 3. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni antara 30300 koloni dan perbandingan hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil dari atau sama dengan dua, maka nilai tersebut dirata-ratakan dengan memperhitungkan pengencerannya
58 Lampiran 8. Prosedur analisis uji pewarnaan Gram 1. Bersihkan kaca objek dengan kapas yang telah diberi alcohol 2. Teteskan akuades steril pada bagian tengah kaca objek 3. Ambil biakkan bakteri pada agar miring dengan menggunakan jarum ose steril dan disuspensikan dengan akuades pada kaca objek 4. Preparat dibiarkan mengering dengan difiksasi di atas Bunsen 5. Tetesi preparat dengan larutan Kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan akuades dengan cara memegang kaca objek pada posisi miring dan dikeringkan dengan tisu secara perlahanlahan 6. Tetesi preparat dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 2 menit lalu dibilas dengan akuades 7. Tetesi preparat dengan larutan pemucat warna yaitu alkohol 95%, kemudian dicuci dengan larutan akuades dan dikeringkan dengan menggunakan tisu. 8. Tetesi preparat dengan larutan safranin selama 30 detik lalu dicuci dengan akuades dan dikeringkan menggunakan tisu.
59 Lampiran 9. Prosedur analisis uji pewarnaan spora 1. Satu sampai dua ose air steril diletakkan pada kaca objek, kemudian dihomogenkan dan biarkan kering diudara 2. Olesan bakteri ditetesi pewarna malachite green dan dipanaskan di atas Bunsen selama 10 menit, namun jangan sampai mengering atau mendidih. 3. Setiap kali pewarna menjadi kering, tetesi dengan pewarna baru. Setelah itu dinginkan kaca objek 4. Warna dicuci dengan hati-hati selama 20-30 detik, 5. Olesan diberi larutan safranin selama 30 detik, dibilas kembali dengan menggunakan air dan dikeringkan dengan kertas serap.
60 Lampiran 10. Prosedur analisis uji motilitas 1. Tumbuhkan isolat bakteri ke dalam media SWC broth dengan menggunakan jarum ose tusuk steril dan diinubasi selama satu hari pada suhu 37o C 2. Isolat dambil dan diteteskan diatas kaca objek yang sudah dibersihkan dengan alkohol dan dikeringkan kemudian dilihat pergerakannya dibawah mikroskop.
61 Lampiran 11. Prosedur analisis uji hidrolisis pati 1. Biakkan digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium Nutrient Agar ditambah pati dan diinkubasikan pada suhu 30ºC selama dua hari 2. Teteskan larutan iodium pada koloni yang tumbuh 3. Uji aktivitas hidrolisis pati ini dikatakan positif jika tidak terbentuk warna biru sewaktu penambahan larutan iodium ke dalam media.
62 Lampiran 12. Prosedur analisis uji hidrolisis protein 1. Bakteri digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium Nutrient Agar yang ditambah Skim Milk Agar (SMA) dan diinkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam 2. Uji hidrolisis protein positif ditandai dengan adanya areal bening disekeliling koloni
63 Lampiran 13. Prosedur analisis uji hidrolisis lemak 1. Bakteri digoreskan pada cawan petri yang berisi medium NA yang telah ditambah lipid 1% dan indikator neutral red dan inkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam 2. Uji hidrolisis lemak positif ditandai dengan koloni yang dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak yang terlihat berwarna merah di bawah koloni bakteri.
64 Lampiran 14. Prosedur analisis uji katalase 1. Secara aseptik diambil satu jarum ose isolat bakteri dari agar miring dan dipindahkan pada kaca objek 2. Teteskan satu sampai dua tetes larutan 3% H2O2 3. Adanya enzim katalase ditandai dengan adanya gelembung-gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun
65 Lampiran 15. Prosedur analisis uji oksidase 1. Kultur bakteri dari agar miring diambil dan dengan steril dioles menggunakan kertas oksidase stripes 3. Jika isolat berubah menjadi ungu berarti isolat tersebut positif mempunyai oksidase sitokrom, jika tidak ada perubahan pada warna isolat maka isolat tersebut tidak memiliki oksidase sitokrom
66 Lampiran 16. Prosedur analisis uji indol 1. Isolat diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi Tryptone Broth dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama dua hari 2. Tambahkan 0,5 ml pereaksi Kovac’s 3. Uji ini dikatakan positif jika terbentuk warna merah yang menunjukkan adanya indol dalam medium.
67 Lampiran 17. Prosedur analisis uji H2S 1. Isolat diinokulasi pada agar miring TSIA dengan cara membuat goresan pada agar miring dan menusukkannya pada bagian bawah agar 2. Lihat perubahan pada media Bagian bawah agar Agar pecah/terangkat keatas Agar berwarna hitam
Bagian atas agar -
Keterangan Produksi gas Produksi H2S
68 Lampiran 18. Prosedur analisis uji fermentasi gula 1. Isolat ditumbuhkan pada media Oksidative Fermentative yang mengandung 1% glukosa, laktosa, sukrosa. Kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama dua hari 2. Reaksi uji fermentasi gula dinyatakan positif apabila terjadi perubahan warna menjadi kuning pada media yang mengandung gula
69 Lampiran 19. Komposisi media yang digunakan (1 L) No
Nama media
1
Nutrient Agar
2
Nutrient Agar (hidrolisis lemak)
3
Nutrient Agar (hidrolisis protein)
4
Tryptone broth
5
Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
6
Oksidative Fermentative semi padat
Komposisi Nutrient Agar Akuades Nutrient Agar Mentega (1 %) Akuades Nutrient Agar Skim Milk Akuades Tripton Akuades TSIA Akuades Glukosa Sukrosa Laktosa Mannosa NaCl Agar Tripton K2HPO4 Bromthymol Blue Dye Akuades
Jumlah 23 g 1000 ml 23 g 10 g 1000 ml 23 g 100 ml 1000 ml 10 gr 1000 ml 65 gr 1000 ml 10 gr 10 gr 10 gr 10 gr 5 gr 2 gr 2 gr 0,3 gr 0,08 gr 1000 ml
70 Lampiran 20. Data hasil perhitungan TPC dengan standar error Pengenceran -3 10 ul1 -3 10 ul2 -3 10 ul3 Rata-rata -4 10 ul1 -4 10 ul2 -4 10 ul3 Rata-rata -5 10 ul1 -5 10 ul2 -5 10 ul3 Rata-rata Rata-rata jumlah koloni keseluruhan Standar error
Pengenceran -3 10 ul1 -3 10 ul2 -3 10 ul3 -3 Rata-rata 10 -4 10 ul1 -4 10 ul2 -4 10 ul3 -4 Rata-rata 10 -5 10 ul1 -5 10 ul2 -5 10 ul3 -5 Rata-rata 10 Rata-rata jumlah koloni keseluruhan Standar error
Pengenceran -3 10 ul1 -3 10 ul2 -3 10 ul3 Rata-rata -4 10 ul1 -4 10 ul2 -4 10 ul3 Rata-rata -5 10 ul1 -5 10 ul2 -5 10 ul3 Rata-rata Rata-rata jumlah koloni keseluruhan Standar error
JUMLAH KOLONI/GRAM KBagian atas Bagian tengah 3 46 x10 TBUD 3 3 4 x10 100 x10 3 32 x10 TBUD 3 3 27 x10 100 x10 4 4 1 x10 2 x10 TBUD TBUD 4 4 5 x10 31 x10 4 4 3 x10 16 x10 5 TBUD 4 x10 TBUD TBUD 5 3 x10 TBUD 5 5 3 x10 4 x10 119000 90504
220000 91652
JUMLAH KOLONI/GRAM K+ Bagian atas Bagian tengah 3 3 10x10 24 x10 3 3 18 x10 22 x10 3 14 x10 TBUD 3 3 14 x10 23 x10 4 TBUD 16 x10 4 5 x10 TBUD TBUD TBUD 4 4 5 x10 16 x10 5 TBUD 11 x10 TBUD 0 5 260 x10 TBUD 5 5 260 x10 11 x10 8688000 8656006
427667 338485
JUMLAH KOLONI/GRAM P Bagian atas Bagian tengah 3 TBUD 16 x10 3 3 41 x10 4 x10 3 3 28 x10 9 x10 3 3 34 x10 9 x10 4 4 10 x10 8 x10 4 11 x10 TBUD 4 4 22 x10 4 x10 4 4 14 x10 6 x10 5 5 2 x10 1 x10 5 2 x10 TBUD 0 0 5 5 2 x10 1 x10 124666 48529
56333 26333
Bagian bawah TBUD TBUD 3 12 x10 3 12 x10 TBUD TBUD 4 1 x10 4 1 x10 5 11 x10 TBUD 0 5 11 x10 374000 363000
Bagian bawah 3 54 x10 3 20 x10 3 28 x10 3 34 x10 TBUD TBUD TBUD TBUD 5 10 x10 5 14 x10 5 88 x10 5 37 x10 1867000 1496638
Bagian bawah 3 7 x10 3 7 x10 3 9 x10 3 7 x10 4 7 x10 4 6 x10 4 3 x10 4 5 x10 TBUD TBUD 5 2 x10 5 2 x10 85666 58499
71 Lampiran 21. Foto dari morfologi sel
Batang – Gram Positif Perbesaran 10 x 100
Batang – Gram Negatif Perbesaran 10 x 100
Kokus – Gram Negatif Perbesaran 10 x 100
72 Lampiran 22. Tabel identifikasi Bergey’s Mannual Bakteri Genus Alteromonas, Bacillus, Deleya, dan Vibrio
73 Lampiran 23. Data nilai arbsorbansi tss, nitrat, nitrit, dan amonia
Parameter TSS (gr) Nitrat Nitrit Amonia
Blanko -
Stasiun 1 Wo = 0.0719 Wt = 0.079 0.829 0.181 0.007 0.038 0.113 0.418
74
Lampiran 24. Dokumentasi penelitian
Pipet Mikro
Cawan Petri
Media SWC Steril
Bahan – bahan Media
Refraktometer Biakan Bakteri Tunggal
GPS
HNO
• Morfologi sel
• •
Pewarnaan Gram Pewarnaan spora Uji motilitas
Uji morfologi
Phallusia sp.
Isolasi bakteri asosiasi
Morfologi koloni
Perhitungan total bakteri
(TPC) • •
SAMPLING Uji fisiologi
P. Onrust
Pengukuran kualitas perairan secara insitu
Bentuk sel
• • • • •
Uji hidrolisis pati Uji hidrolisis lemak Uji hidrolisis Protein Uji oksidase Uji indol Uji H2S dan fermentasi gula Uji katalase
Pengukuran kualitas perairan di laboratorium
Gambar 3. Diagram Alir Penelitian 22
Tabel 5. Uji Morfologi dan Fisiologi Koloni Bakteri Asosiasi Phallusia sp. Media
K+
K-
P
Kode bakteri
MORFOLOGI KOLONI Bentuk Elevasi atas
Warna
Ka3
Bulat
Timbul
Ka4
Lonjong sempurna
Timbul
Ka5
Bulat kecil
Timbul
Kc2
Besar tak beratur
Timbul
Pba1
Bulat sedang
Timbul
Pba2
Lonjong lancip
Timbul
Pba3
Lonjong lancip
Timbul
Pbb1
Bulat kecil
Timbul
Pbb2
Bulat sedang
Timbul
Pbc1
Lonjong besar
Datar
Pbc2
Tak beraturan
Timbul
Pbc3
Agak lonjong
Timbul
Pbc4
Lonjong
Timbul
Pbc5
Agak bulat
Timbul
Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu
Timbul
Putih susu
Ba1
Lonjong besar
Timbul
Ba2
Bulat
Timbul
Ba3
Agak lonjong
Timbul
Ba4
Bulat
Timbul
Bb1
Bulat kecil
Timbul
Bc1
Bulat sedang
Timbul
Bc2
Lonjong
Timbul
Ka1
Tidak beraturan
Timbul
Ka2
Lonjong besar
Timbul
Pbc6
Lonjong
MORFOLOGI SEL Uji Gram Uji Spora Bentuk Gram
UJI FISIOLOGI Uji motilitas
Pati
Hidrolisis Protein Lemak
Katalase
Oksidase
H2S
Indol
Glukosa
Fermentasi Gula Laktosa Sukrosa
Mannose
Basil pendek
-
Motil
-
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Kokus
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
-
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil panjang
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
-
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Motil
-
-
+
+
-
Gas
-
+
+
+
+
Sel vegetatif
Basil pendek
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
-
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Kokus
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
-
-
-
+
+
Gas
-
+
+
+
-
Basil pendek
-
Motil Non motil
-
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
-
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
-
-
+
+
+
Gas
-
+
-
-
+
Basil panjang
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
-
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
-
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
+
-
+
+
+
Gas
-
+
+
+
+
Basil pendek
-
Motil
-
-
+
+
Gas
-
+
+
+
+
35
Tabel 6. Karakteristik Morfologi dan Fisiologi Genus Alteromonas, Bacillus, Deleya, Vibrio Berdasarkan Bergey's Mannual MORFOLOGI SEL Media
Kode bakteri Ba1
K+
K-
P
Uji Gram Bentuk
Gram
Basil
-
Ba2
Basil
Ba3
Kokus
Ba4
Basil
Bb1
Basil
Bc1
Basil
Bc2
Basil
Ka1
Basil
Ka2
Basil
Ka3
Basil
Ka4
Basil
Ka5
Kokus
Kc2
Basil
Pba1
Basil
Pba2
Basil
Pba3
Basil
Pbb1
Basil
Pbb2
Basil
Pbc1
Basil
Pbc2
Basil
Pbc3
Basil
Pbc4
Basil
Pbc5
Basil
Pbc6
Basil
UJI FISIOLOGI Uji
+ -
Uji Spora Motilitas Motil
Hidrolisis Pati
Lemak
-
+
Katalase
Oksidase
+
Gas Gas
Motil
+ +
+
Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil Motil
+ + + D +
+ + + -
+ + + D +
Motil
Gas Gas Gas Gas Gas
Glukosa
Laktosa
+ +
+ +
+ +
+ +
+ + + + + + + +
+ + + + +
+ + + + + +
+ + + + + +
Sukrosa
Mannose
+ + + -
-
+
Gas Gas Gas
+ + + + + -
+ + + + + +
Gas Gas Gas Gas Gas Gas Gas Gas
Vibrio Alteromonas Deleya Vibrio Alteromonas Vibrio Vibrio Vibrio Bacillus
-
+
+
Vibrio Unidentified
+ + + + + + + + + +
+ + + + + + + +
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + + +
Gas
-
Genus
Unidentified
Gas
Motil
-
+ Gas Gas
Motil
-
Gas
Motil Motil
Endospora
H2S
Motil
+
Pendugaan Nama Bakteri Fermentasi Gula
Vibrio Alteromonas Alteromonas Vibrio Vibrio Vibrio Vibrio Vibrio Vibrio Alteromonas Unidentified
+
+
+
+
Alteromonas
38
