KENNISGEVING GGO-VELDPROEFAANVRAAG. Technisch dossier

KENNISGEVING GGO-VELDPROEFAANVRAAG Technisch dossier A. ALGEMENE INFORMATIE A1. Kennisgever VIB Rijvisschestraat 120 9052 GENT Tel.: 09 2446611 Fax.: 09 2446610 e-mail: [email protected] A2. Naam, kwalificaties en ervaring van de verantwoordelijke wetenschapper(s). Verantwoordelijke wetenschapper: dr. Hilde Nelissen VIB-UGent Departement Planten Systeembiologie Technologiepark 927 9052 GENT Kwalificaties: doctor in de wetenschappen. Ervaring: meer dan 15 jaar ervaring in de plantenbiotechnologie, al eerder betrokken geweest bij de veldproef B/BE/11/V4 met genetisch gewijzigde maïs. Bioveiligheidscoördinator: René Custers, MSc VIB Rijvisschestraat 120 9052 GENT Kwalificaties: Msc in moleculaire wetenschappen Ervaring: meer dan 20 jaar ervaring in bioveiligheid, zowel wat betreft ingeperkt gebruik als introductie in het leefmilieu. Voorzitter van de Belgian Biosafety Professionals, en plaatsvervangend lid van de Adviesraad voor Bioveiligheid.

A3. Titel van het project Wetenschappelijk veldonderzoek naar maïs met gewijzigde groeikarakteristieken.

REG/rc-bvl/14-00375

VIB GA2Ox::KLUH technisch dossier

pag. 1/28

B. INFORMATIE OVER DE RECIPIЁNTEN B1. Volledige naam a) familie: b) genus: c) species: d) subspecies: e) cultivar/teeltlijn: f) gangbare naam:

Poaceae Zea, sectie Zea Zea mays mays inteeltlijn B104 maïs

De modificatie is in inteeltlijn B104 geïntroduceerd. De gemodificeerde B104 inteeltlijn is vervolgens via klassieke weg gekruist met inteeltlijn CML91 met de vorming van de hybride B104(GA2ox::KLUH) x CML91 tot gevolg. B2. Informatie over de voortplanting B2a) Voortplanting en generatietijd i) Wijze(n) van voortplanting: Maïs is een allogame plant die zich generatief voortplant door middel van zaden. De plant heeft een mannelijke bloeiwijze in de vorm van een pluim. De vrouwelijke bloeiwijzen bevinden zich op de aren (kolf). Maïs is voornamelijk kruisbevruchtend en de bestuiving vindt plaats mbv de wind, al kan insectbestuiving niet geheel worden uitgesloten. Maïs kent geen asexuele voortplanting (OECD, 2003). ii) Mogelijke specifieke factoren die van invloed zijn op de voortplanting; Maïszaden kennen geen kiemrust waardoor ze alleen bij bepaalde klimaatomstandigheden kunnen overleven. Maïs is vorstgevoelig en zal daarom de winter in het algemeen niet overleven. Maïs heeft zijn vermogen om te verwilderen verloren (OECD, 2003) iii) Generatietijd; Maïs is een eenjarig gewas. B2b) Sexuele compatibiliteit met andere gekweekte of in het wild levende species, met inbegrip van de verspreiding in Europa van de compatibele species. Maïs is sexueel compatibel met alle in Europa geteelde maïsvariëteiten. Er komen in Europa geen wilde verwanten in de natuur voor waarmee maïs succesvol kan kruisen. B3. Overlevingsvermogen B3a) vermogen om overlevings- of ruststadia te vormen; Maïs vormt per plant een aantal kolven met zaad. Op elke kolf zit een aantal rijen (8-16) met zaden (OECD, 2003). Cultuurmaïs laat de zaden niet spontaan vallen, maar houdt ze vast. Het vasthouden van de zaden is een van de belangrijkste domesticatieeigenschappen van onze cultuurgraangewassen. Maïszaden kennen geen kiemrust en kunnen om die reden alleen bij bepaalde klimatologische omstandigheden overleven (HIN, 2001; COGEM, 2008). In België is de kans dat maïs opslagplanten vormt in een navolgend gewas klein, maar niet nul. In de praktijk zijn er op verschillende plaatsen opslagplanten van maïs waargenomen. Deze maïsplanten waren niet erg groot en meestal ook niet erg rechtopstaand. Als er in België opslagplanten voorkomen dan gaat het om geïsoleerde planten. In Spanje komen maïsopslagplanten ook af en toe voor. Daarvan is bekend dat

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 2/28

deze planten in 80% van de gevallen het stadium bereiken waarin ze mannelijke vruchtbaarheid bereiken en stuifmeel kunnen gaan verspreiden (Palaudelmàs et al, 2009). Maïsexperts van ILVO zijn van mening dat ook in België niet kan worden uitgesloten dat opslagplanten van maïs het stadium van mannelijke vruchtbaarheid bereiken en stuifmeel gaan verspreiden. B3b) mogelijke specifieke factoren die op het overlevingsvermogen van invloed zijn. Onder Europese omstandigheden is het vermogen van het zaad om de winter te overleven beperkt. Het optreden van opslag is om die reden zeldzaam. Opslagplanten worden in het algemeen door landbouwers bestreden met behulp van herbiciden, of door manueel of mechanisch de opslagplanten te verwijderen. B4. Verspreiding B4a) wijzen en mate (b.v. een raming van de afname van levensvatbare pollen en/of zaad met de afstand) van verspreiding: Maïs produceert een grote hoeveelheid pollen die mbv de wind wordt verspreid. Per plant kan dat variëren van 14 miljoen tot 50 miljoen pollenkorrels (Emberlin, 1999). Vergeleken met andere windbestuivers is het pollen van maïs relatief groot (diameter van gemiddeld 90 µm) en zwaar (0.25 µg). (Aylor et al., 2003; Di-Giovanni et al., 1995; Raynor et al., 1972). Hierdoor verspreidt maïspollen zich niet erg ver. Experimenten hebben aangetoond dat 90% van het geproduceerde pollen binnen 5 meter en 98% binnen 25 tot 50 meter van de grens van het veld neerkomen. Boven de 50 meter is de pollenverspreiding echter niet nul. De windrichting en –sterkte kan hierbij een grote invloed hebben op het verspreidingspatroon. In het algemeen kan gesteld worden dat het kruisbevruchtingspercentage zeer snel afneemt met de afstand: rond de 1% op 10 meter en rond de 0.1% op 50 meter (Sigmea project WP2, deliverables, www.inra.fr/sigmea). Er zijn echter als gevolg van convectieve luchtstromen kruisbevruchtingshotspots gevonden tot op 650 meter afstand. (Henry et al, 2003). De levensduur van maïspollen is afhankelijk van luchtvochtigheid en temperatuur en kan variëren van 30 minuten tot 9 dagen (Emberlin et al, 1999). N.B. In deze veldproef zullen de maïsplanten worden ‘ontpluimd’ (de mannelijke bloeiwijzen verwijderd), zodat ze geen pollen zullen kunnen verspreiden. Wanneer maïszaden bij lage temperatuur en een laag luchtvochtigheidsgehalte bewaard worden, kan het zijn kiemkracht lang behouden. Temperaturen beneden het vriespunt en boven de 50 graden celcius, en/of een hoge luchtvochtigheid doen de kiemkracht relatief snel afnemen. Bij hoge luchtvochtigheid (boven de 80%) kan het vochtgehalte in de maïszaden stijgen, waardoor de maïszaden gevoeliger worden voor de aantasting door schimmels. Zoals al eerder aangegeven laat maïs zijn zaden niet spontaan vallen. Verspreiding van maïszaden kan het gevolg zijn van oogstwerkzaamheden: tijdens de oogst kunnen zaden in de bodem terecht komen, en zaden kunnen over grotere afstanden buiten het perceel terecht komen als gevolg van transport. B4b) mogelijke specifieke factoren die van invloed zijn op de verspreiding. De twee belangrijkste specifieke factoren die van invloed zijn op de verspreiding zijn (1) wind, en (2) menselijke activiteit.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 3/28

Wind Wind kan maïspollen over grotere afstanden (kilometers) verspreiden (Van Droogenbroeck et al, 2011, fig.12). De hoeveelheid pollen neemt met de afstand zeer snel af. Tijdens de bloei kan een dominante windrichting tot gevolg hebben dat de pollenwolk boven een perceel maïs een pluimvorm krijgt die zich in de windrichting over een grotere afstand van het perceel verwijderd. In Vlaanderen is sprake van een dominante zuid-westelijke windrichting (Van Droogenbroek et al, 2011, fig.16). Menselijke activiteit Het zijn vooral de oogstwerkzaamheden en het daaropvolgende transport die kunnen leiden tot verspreiding van maïszaden. Toch leidt deze verspreiding van zaden niet tot verspeiding van maïs buiten de akker waarop de maïs geteeld is. Deels omdat de zaden worden opgegeten door vogels en dieren, maar vooral ook omdat maïs zijn vermogen om te verwilderen heeft verloren. B5. Geografische verspreiding van de plant Cultuurmaïs wordt op alle continenten geteeld. De origine van maïs ligt in MiddenAmerika (midden-zuiden van Mexico en Centraal-Amerika), wat algemeen ook gezien wordt als centrum van biodiversiteit. De domesticatie van maïs heeft naar alle waarschijnlijkheid op verschillende plaatsen tegelijkertijd plaatsgehad. In de tijd dat Columbus Amerika ontdekte werd maïs al van Chili tot Zuid-west Canada verbouwd, en ook op Cuba (OECD, 2003). De originele habitat van maïs was hoogland met relatief sterke seizoensvariaties: droge winters en natte zomers (Wilkes & Goodman, in Maize Genetic Resources, CIMMYT, 1995). Maïs heeft echter blijk gegeven van een groot aanpassingsvermogen, en kan nu geteeld worden in heel verschillende omstandigheden qua vochtigheid, zonlicht, hoogte en temperatuur. Voor zijn verspreiding en overleving is de cultuurmaïs echter afhankelijk van de mens (OECD, 2003). B6. Voor plantensoorten die normaal niet in de lid-Staten voorkomen een beschrijving van de natuurlijke habitat, waaronder informatie over natuurlijke predatoren, parasieten, concurrenten en symbionten. Maïs komt in België alleen voor als cultuurgewas. Maïs is in België het grootste landbouwgewas. In 2007 werd er in België ongeveer 250.000 ha maïs geteeld. Deze maïs wordt voornamelijk voor dierlijke consumptie geteeld, deels als kuilvoer, deels als korrelmaïs. De grootste concentraties van de maïsteelt komen voor in de gebieden waar veel veeteelt voorkomt, zoals bijvoorbeeld de Kempen. Wat ziekten en plagen betreft heeft maïs vooral te maken met schimmelziekten, zoals bijvoorbeeld bladvlekkenziekte die door verschillende schimmelsoorten veroorzaakt kan worden. Temperatuur en vochtigheid spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling en verspreiding van de schimmels. Maïskolven worden, vooral in de rand van percelen, soms aangevreten door duiven. Vaak zie je later dan schimmelaantasting op de aangevreten kolven. Bepaalde schimmels, zoals Fusarium, kunnen mycotoxines produceren die schadelijk zijn. B7. Andere eventuele interacties die voor het GGO van belang zijn, van de plant met organismen in het ecosysteem waar hij gewoonlijk wordt geteeld, of elders, waaronder informatie over de toxische effecten op mensen, dieren en andere organismen. Bijlage C van het OECD consensus document ‘on the biology of Zea mays ssp mays (OECD, 2003) vermeldt een lange lijst van insecten, schimmels, bacteriën en virussen

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 4/28

die op maïs problemen kunnen veroorzaken. In delen van Europa, maar niet in België, is de Europese stengelboorder (Ostrinia nubilalis) een probleem. Maïs is niet schadelijk voor mens of dier. Het bevat weinig antinutritionele stoffen (OECD, 2003). Maïs wordt al lang op grote schaal geconsumeerd, zowel door mensen als door dieren en kent een lange historie van veilig gebruik. Maïs staat ook niet bekend als een gekend allergeen. Allergieën tegen maïs bestaan wel, maar zijn uitzonderlijk (OECD, 2003). Maïs staat niet op de Europese lijsten van allergenen (bijlage IIIa van EU-richtlijn 2003/89) die op het label van een voedingsproduct vermeld moeten staan. N.B. De maïs uit de proef zal niet worden geconsumeerd. Noch door dieren, noch door de mens.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 5/28

C. INFORMATIE OVER DE GENETISCHE MODIFICATIE C1. Beschrijving van de voor de modificatie toegepaste methoden De maïslijnen GA2ox_KLUH 139-01 en GA2ox_KLUH 140-01 zijn gemaakt door middel van Agrobacterium tumefaciens gemedieerde transformatie. Onvolgroeide maïsembryos van de inteeltlijn B104 zijn met Agrobacterium tumefaciens, die de over te dragen modificatie op zijn T-DNA droeg, gecocultiveerd. De onvolgroeide maïsembryos zijn vervolgens omgezet in embryogeen callusweefsel. Na selectie op een medium dat glufosinaat bevat is het callusweefsel aangezet tot de vorming van wortels en groene plantendelen. De kleine plantjes zijn geacclimatiseerd en vervolgens in potten uitgegroeid tot volwassen planten. Hieronder staat puur ter illustratie het modificatieproces schematisch weergegeven. In dit illustratieve schema zijn de planten met het gus-gen gemodificeerd (N.B. de planten in deze aanvraag zijn niet met het gus-gen gemodificeerd, maar met het GA2ox::KLUH gen uit Zea mays en het bar-gen uit Streptomyces hygroscopicus).

C2. Aard en herkomst van de gebruikte vector Voor de genetische modificatie is de vector pBbm42GW7/GA2ox KLU gebruikt. Dit is een zogenoemde ‘gateway’ planttransformatievector met het bar-gen (resistentie tegen glufosinaat) als selectiemerker. Gateway-vectoren worden in het wetenschappelijk onderzoek veelvuldig gebruikt. Het gateway-systeem is zo ontworpen dat DNA fragmenten op een heel eenvoudige manier in een specifieke volgorde, oriëntatie en in een specifiek reading frame aan elkaar kunnen worden gekoppeld. Voor meer informatie over het hoe en het waarom van het gebruik van gateway-vectoren zie Karimi et al, 2007; Katzen, 2007; Hilson, 2006 en Hartley et al, 2000. De vector backbone van pBbm42GW7/GA2ox KLU is dezelfde als die gebruikt is voor de maïsplanten van veldproef B/BE/11/V4 en bestaat uit sequenties afkomstig van vector pPZP200 (Hajdukiewicz et al 1994).

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 6/28

C3. Omvang en aard (naam) van het (de) donororganisme(n) en bedoelde functie van ieder onderdeel van de sequentie die zal worden ingebouwd

Onderdeel Linker T-DNA-border NOS-BAR (= bar -TNOS)

Positie 6679-7011 7015-7862

Grootte 333 bp 848 bp

P35S AttB4 PGA2ox

7865-8892 8917-8937 8940-10985

1028 bp 21 bp 2046 bp

AttB1 CYP78A1 (KLUH)

10987-11007 11013-12846

21 bp 1834 bp

AttB2 T35S

12851-13 80-297

21 bp 218 bp

Rechter T-DNAborder aadA**

321-520

200 bp

5424-6673

1250 bp

Functie T-DNA insert border Phosphinotrycine acetyl transferase gevolgd door de nopaline synthase terminator Transcriptie promoter Recombinatie site* Promotor van het GA2oxidase gen Recombinatie site* Coderende sequentie voor het CYP78A1 (KLUH) cytochroom P450 monooxygenase Recombinatie site* Transcriptie terminator van het bloemkool mozaiek virus 35S gen T-DNA insert border

Donor Agrobacterium tumefaciens Streptomyces hygroscopicus en Agrobacterium tumefaciens

Spectomycine/streptomycine resistentie

Escherichia coli

Bloemkoolmozaiekvirus Lysogene E.coli Zea mays Lysogene E.coli Zea mays

Lysogene E.coli Bloemkoolmozaiekvirus

Agrobacterium tumefaciens

*De AttB1, -2 en -4 zijn gemuteerde versies van de oorspronkelijk uit lysogene E.coli geïsoleerde AttB sequentie **Het aadA gen, dat onder controle staat van bacteriele expressiesignalen, ligt op de backbone van de vector, en is niet in de planten ingebouwd.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 7/28

De coderende sequentie van het CYP78A1 (KLUH) gen afkomstig uit Zea mays is: ATGGCGATGGCCTCCGCGGCTTGCTCATGCACGGACGGCACGTGGTGGGTGTACGCGCTC CCGGCGCTGCTCGGCTCCGACACCCTGTGCGCCCACCCGGCCCTCCTGGCTGGCCTGATC TTTCTGGCCACCGTCTCGGTGGCTCTGCTGGCGTGGGCCACGTCGCCGGGCGGTCCGGCG TGGACGAACGGCCGCGGCCGCCTCGGCGTCACTCCTATCGTGGGACCCCGTGGTCTGCCC GTGTTCGGCAGCATCTTCGCGCTGTCCCGCGGGCTGCCGCACCGCGCCCTCGCCGAGATG GCCCGCGCCGCAGGGCCCCGGGCCAAGGAGCTCATGGCGTTCTCCGTCGGTGACACGCC CGCGGTCGTGTCGTCCTGCCCGGCCACGGCACGTGAGGTGCTCGCGCACCCGTCATTCGC CGACCGCCCTGTGAAGCGGTCGGCCCGGGAGCTCATGTTCGCGCGTGCCATCGGGTTCGC GCCCAACGGCGAGTACTGGCGCCGCCTCCGCCGCGTCGCGTCCACGCACCTATTCTCCCC GCGCCGGGTCGCCTCGCACGAGCCGGGACGCCAAGGTGACGCGGAGGCCATGCTCCGCT CCATCGCCGCCGAACAGTCGGCCTCTGGCGCCGTCGCCCTCCGCCCGCACCTCCAGGCCG CCGCTCTCAACAACATCATGGGCAGCGTCTTCGGCACGCGGTACGACGTCACATCAGGCGC CGGCGCCGCGGAGGCCGAGCATCTCAAGAGCATGGTGCGCGAGGGGTTCGAGCTCCTCG GCGCCTTCAACTGGTCCGACCACCTCCCCTGGCTCGCCCACCTGTACGACCCAAGCAACGT CACCCGCCGGTGCGCCGCGCTCGTGCCGCGCGTCCAGACCTTCGTCCGTGGCGTCATCGA CGAGCACCGGCGCCGCCGCCAAAACTCCGCCGCCCTCAACGACAATGCTGACTTCGTCGA CGTGCTCCTCTCCCTCGAGGGTGACGAGAAGCTCGGCGACGACGACATGGTCGCCATCCT CTGGGTAAAGTTCAAATCGATCGCTTTCCTAGCTTGTTTAACTGCGCATACTTCTCAGTTCTC AACTGCGCATACCTGTCGGTTCTACAGTTTTGTGTCGGGCTGTCGGTTGTTCCCGGAAGGG AAAAAAAAGAACAAAGCTCTGTCGCTGAAAAAAACATACTGTACATGCATATAATTTGTTTTTG CAGGAGATGGTCTTCCGCGGTACGGACACGACGGCGCTTCTGACCGAGTGGTGCATGGCG GAGCTGGTGCGCCACCCGGCGGTGCAGGCGAGGGTGCGCGCCGAGGTCGACGCGGCTGT CGGTGCCGGAGGTTGCCCCACCGACGCCGACGTGGCGCGCATGCCGTACCTGCAGGCGG TTGTGAAGGAGACGCTGCGCGCCCACCCGCCTGGCCCGCTGCTGAGCTGGGCTCGCCTCG CCACCGCCGACGTGCCACTCTGCAACGGCATGGTGGTCCCGGCTGGCACCACGGCGATGG TGAATATGTGGGCCATAACCCACGATGCCGCCGTGTGGGCCGACCCGGACGCGTTCGCGC CGGAGCGGTTCCTGCCCTCCGAGGGCGGCGCCGACGTGGACGTCCGCGGCGTCGACCTC CGCCTGGCCCCGTTCGGCGCCGGGCGTCGCGTCTGCCCCGGCAAGAACCTGGGCCTCAC CACCGTGGGCCTCTGGGTTGCCCGCCTCGTGCACGCCTTCCAGTGGGCCCTGCCTGACGG CGCGGCGGCCGTTTGCCTCGACGAGGTCCTCAAGCTCTCCCTGGAGATGAAGACGCCGCT CGTCGCCGCAGCCATCCCCCGCACCGCCTGA Overzicht van de transgene lijnen in de veldproef N° van de event GA2ox_KLUH 139-01 GA2ox_KLUH 140-01

Recipiënt Gebruikt construct Inteeltlijn B104 pBbm42GW7/GA2ox KLU Inteeltlijn B104 pBbm42GW7/GA2ox KLU

De genetisch gemodificeerde inteeltlijnen B104(GA2ox::KLUH 139-01) en B104(GA2ox::KLUH 140-01) zijn vervolgens gekruist met de inteeltlijn CML91 om de genetisch gemodificeerde hybride maislijnen te verkrijgen die in de veldproef worden gebruikt: 1. Hybride: B104(GA2ox_KLUH 139-01) x CML91 2. Hybride: B104(GA2ox_KLUH 140-01) x CML91 In de eerdere veldproef B/BE/11/V4 werd de inteeltlijn B104 gebruikt, zonder dat er sprake was van een hybride. De B104 lijn heeft nadelen in de zin dat deze relatief slecht aangepast is aan de Belgische klimatologische omstandigheden en hier ook pas heel laat tot bloei komt. Het is om die reden dat in de afgelopen jaren verschillende (niet-gemodificeerde) hybriden zijn uitgetest geweest waarbij B104 één van de ouderlijnen was. Uit veldproeven over twee achtereenvolgende seizoenen is gebleken dat B104 x CML91 een hybride is die veel beter aangepast is aan de Belgische klimatologische omstandigheden, met een veel vroegere bloei en een goede kolfzetting

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 8/28

en afrijping onder Belgische omstandigheden. Het is om die reden dat in deze veldproef nu met deze B104 x CML91 hybride wordt gewerkt, waarbij de modificatie in de B104 inteeltlijn werd ingebracht.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 9/28

D. INFORMATIE OVER DE GENETISCH GEMODIFICEERDE PLANT D1. Beschrijving van de eigenschappen die zijn geïntroduceerd of gewijzigd De genetisch gemodificeerde maïs bevat het bar-gen dat resistentie verleent tegen glufosinaat (ook wel fosfinotrycine genaamd), de actieve stof in de herbiciden Basta en Liberty. Het gen codeert voor het enzym fosfinotrycine-acetyl-tranferase (PAT). Dit enzym acetyleert fosfinotrycine waardoor het zijn werking verliest. Het bar-gen is enkel in de planten aanwezig als selectiemerker voor het vergemakkelijken van het modificatieproces. Het is niet ingebracht met de bedoeling om herbiciden met de actieve stof fosfinotrycine in het veld te gaan gebruiken. Daarnaast bevat de genetisch gemodificeerde maïs ook het CYP78A1 gen (ook bekend onder de naam‘KLUH’) onder controle van de GA2oxidase promoter, beiden afkomstig uit Zea mays. Het KLUH-gen codeert voor een cytochroom P450 monooxygenase dat betrokken is bij de celproliferatie en zo een rol speelt in de grootte van plantorganen. Cytochroom P450 monooxygenases zijn een superfamilie van haem-afhankelijke enzymen die betrokken zijn in de biosynthese en detoxificatie van een grote variatie aan molecules. Een aantal cytochroom P450 monooxygenase-gemedieerde reacties, waaronder die gemedieerd door CYP78A1, leidt tot de vorming van producten die noodzakelijk zijn voor de controle van de cel-expansie in planten. CYP78A1 komt van nature sterk tot expressie in de perifere regios van de vegetatieve en reproductieve apicale meristemen in scheuten (Zondlo SC and Irish VF (1999) The Plant Journal 19(3), 259-268). Wanneer CYP78A1 tot overexpressie wordt gebracht dan heeft dit een effect op meerdere celtypen en veroorzaakt het verdraaiingen en knikken in de stam en defecten in de ontwikkeling van de bloemen. Het constitutief tot overexpressie brengen van CYP78A1 leidt tot kleinere bladeren in getransformeerde planten. Maar wanneer het CYP78A1 gen wordt toegevoegd onder controle van de promotor van het GA2oxidase gen, dan leidt dit in mais (onder meer) tot meer dan 30% grotere bladeren. De transgene planten zijn oorspronkelijk gemaakt in de inteeltijn B104. Omdat we uit de veldproef B/BE/11/V4 geleerd hebben dat planten met deze genetische achtergrond niet goed gedijen in Belgische weersomstandigheden en het groeiseizoen in België voor planten van deze inteeltlijn te kort is om goede zaadvorming te verkrijgen, zullen deze lijnen naar het veld gebracht worden als hybriden met CML91. Tijdens de voorbije twee groeiseizoenen (2013 en 2014) werd aangetoond dat B104 x CML91 planten zich vergelijkbaar gedragen met in België verkrijgbare commerciele hybriden en ook goed gevulde kolven vormen, wat ons in staat stelt om het effect van de modificatie op de zaadvorming te onderzoeken.

D2. Informatie over de sequenties die zijn geïntroduceerd/geëlimineerd : D2a) omvang en structuur van het donormateriaal en de methoden die zijn gebruikt voor de karakterisering daarvan, waaronder informatie over alle delen van de in de GGHP's geïntroduceerde vector of over eventuele dragers van vreemd DNA dat in de GGHP's achterblijft; De aanwezigheid van het GA20x::KLUH-gen is aangetoond dmv PCR, met één primer in de promoter en één primer in het KLUH gen, zodat een amplicon wordt verkregen dat de junctie tussen promoter en gen overspant en dat dus niet aanwezig is in wild type planten. De aanwezigheid van het bar-gen kan afgeleid worden uit het feit dat de plantjes geselecteerd zijn geweest op een fosfinotrycine-houdend medium. Zonder funtionerend bar-gen hadden de plantjes dit niet kunnen overleven.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 10/28

Daarnaast is er door middel van PCR bepaald of er in de plant eventueel ook nog sequenties van de backbone aanwezig zijn. Daarbij werd volgend PCR-protocol werd uitgevoerd: 1,5µl 1,5µl 1µl 2,5µl 2,5µl 0,2µl 15,8µl 100ng 25µl

primer1 primer2 10mM dNTP’s 10xpcr buffer 10xMgCl2 buffer Amplitaq polymerase MQ-water gDNA totaal

PCR-programma: o

Stap 1:

3’ 95 C

Stap 2:

30’’ 95 C o 30’’ 58 C o 1’ 72 C

o

Stap 2, 25 keer herhalen o

Stap 3:

3’ 72 C

Stap 4:

Hold 10 C

o

target sequence

amplicon length

primer seq

aadA

284bp

Fw-CGCTATGTTCTCTTGCTTTTG Rv-TGATTTGCTGGTTACGGTGAC

Frame2

307bp

Fw-GGGCCGATGTTCTGTTAGTC Rv-CTTCCATCCGTGACCTCAAT

Frame3

251bp

Fw-CGAGGGTGAAGCCTTGATTA Rv-TGCGTTCGTAGATCGTCTTG

Frame 2 en 3 zijn twee stukken sequentie van de vector backbone die gekozen zijn om delen van de backbone te beslaan buiten het aadA-gen. Hieronder is schematisch de positie van frame2 en frame3 weergeven op vector pPZP200, die de backbone van de transformatievector vormt.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 11/28

Sph I (6714)

RB Hin dIII (6543) Sph I (6541) Pst I (6535) Sal I (6525) Xba I (6519) Bam HI (6513) Sma I (6510) Xma I (6508) Sac I (6502)

frame 2 -fw

Eco RI (6492)

LB Sm/SpR

Nde I (1521)

PPZP200 (GW)

frame 2 -rv

6741 bp

Nde I (4010)

frame 3-fw Cla I (3056) frame 3- rv

Op hetzelfde DNA een PCR uitgevoerd om de aanwezigheid van het GA2ox::KLUH gen en het bar-gen te bevestigen. Daarbij werd het 18S-RNA-gen meegenomen als positieve genomische controle. Dit om de geschiktheid van het DNA aan te tonen voor PCR. Gebruikt PCR protocol: 100ng template 1,5µl primer1 10uM 1,5µl primer2 10uM 1µl dNTP’s 10mM 2,5µl 10xPCR buffer 2,5µl 10xMgCl2 0,4µl Taq enzyme Invitrogen 10,6µl H20 20µl totaal o

Stap 1

3min 95 C

Stap 2

30sec 95 C o 30sec 58 C o 40sec 72 C

o

herhaal stap 2 30x o

Stap 3

3min 72 C

Stap 4

product opslaan bij 10 C

REG/rc-bvl/14-00375

o


pag. 12/28

Target sequence

Amplicon length

Primer sequentie

GA2ox::KLUH

391 bp

bar

242 bp

18SRNA

180 bp

Fw-CTTTTCTCTCCCTGTCAGC Rv-GAAAGATCAGGCCAGCCA Fw-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC Rv-AGTCGACCGTGTACGTCTCC Fw-ACCTTACCAGCCCTTGACATATG Rv-GACTTGACCAAACATCTCACGAC

Alle PCRs werden in duplo uitgevoerd. De resultaten van de PCRs staan in de onderstaande tabel samengevat: KLUH

bar

aadA

Frame2

Frame3

Genomische controle 18S + + + +

139-01 + + 140-01 + + 140-03* + + + + + B104 + = aanwezig - = niet aanwezig *positieve controle voor aanwezigheid van backbone sequenties. Deze lijn maakt geen onderdeel uit van de veldproef.

Procedure voor isolatie van genomisch DNA Voor de isolatie van het genomisch DNA uit de maïs werd het volgende protocol gebruikt (ook voor het DNA gebruikt voor D2c):          



Grind tissue is dissolved in approximately 500 μl of CTAB buffer. o Incubate the CTAB/plant extract mixture for about 30 min at 55 C in a thermomixer After incubation, spin the CTAB/plant extract mixture at 12000 g for 5 min to spin down cell debris. Transfer the supernatant to clean microfuge tubes. To each tube add 250 μl of Chloroform : Iso Amyl Alcohol (24:1) and mix the solution by inversion. After mixing, spin the tubes at 13000 rpm for 1 min. Transfer the upper aqueous phase only (contains the DNA) to a clean microfuge tube. To each tube add 1/10 vol of 3M Sodium Acetate followed by 2 volumes of ice cold absolute ethanol. Invert the tubes slowly several times to precipitate the DNA. Generally the DNA can be seen to precipitate out of solution. Alternatively the tubes can be placed for 1 hr at o -20 C after the addition of ethanol to precipitate the DNA. Spin the tube at 13000 rpm for a minute to form a pellet. Remove the supernatant and wash the DNA pellet by adding two changes of ice cold 70 % ethanol. Remove all the supernatant and allow the DNA pellet to dry (approximately 15 min). Do not allow the DNA to over dry or it will be hard to re-dissolve. Resuspend the DNA in sterile DNase free water (approximately 50-400 μl H2O; the amount of water needed to dissolve the DNA can vary, depending on how much is isolated). RNaseA (10 μg/ml) can be added to the water prior to dissolving the DNA to remove any RNA in the preparation (10 μl RNaseA in 10ml H2O). o After resuspension, the DNA is incubated at 65 C for 20 min to destroy any DNases o that may be present and store at 4 C.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 13/28

D2b) bij een eliminatie, omvang en functie van de geëlimineerde sequentie(s); Niet van toepassing. D2c) aantal kopieën van het donormateriaal;

N° van de event GA2ox::KLUH 139-01 GA2ox::KLUH 140-01

Aantal kopieën 2 1

De bepaling van het aantal genkopijen is als volgt uitgevoerd:

Met behulp van een segregatie analyse op basis van de BASTA resistentie werd vastgesteld dat beide lijnen (139-01 en 140-01) single locus lijnen zijn. Om het kopijnummer in de twee lijnen te bepalen werd er gebruik gemaakt van kwantitatieve PCR op genomisch DNA. Hiervoor was het nodig om gebruik te maken van een aantal referentiestalen waarvoor er reeds Southern data voorhanden waren over het aantal kopijen. De controle stalen bevatten > 4 kopijen, 2 kopijen en 1 kopij respectievelijk. Bij Q-PCR met Bar primers (D2a) bleek dat lijn 139-01 2 kopijen en lijn 140-01 1 kopij van het T-DNA bevat. De waarneming dat de waarden van de lijnen met 2 kopijen praktisch exact een verdubbeling zijn van de lijnen met 1 kopij, lijkt overeen te komen met de verwachtingen.

D2d) plaatsen van het donormateriaal in de plantencellen (geïntegreerd in een chromosoom, in chloroplasten of mitochondriën of achterblijvend in niet-geïntegreerde vorm) en methoden voor de bepaling daarvan. Het donormateriaal is geïntegreerd in het chromosomaal DNA van de plant (zie D2c).

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 14/28

D3. Informatie over de expressie van het donormateriaal D3a) informatie over de ontwikkelingsexpressie van het donormateriaal tijdens de levenscyclus van de plant en over de methoden die voor de beschrijving daarvan worden toegepast; De activiteit van de GA2ox promoter werd onderzocht door middel van een GA2ox::GUS construct. De promoter is zwak aangezien er slechts een vage blauwkleuring kan worden waargenomen na overnacht incubatie. Promoter ativiteit werd waargenomen in het endosperm, het scheut apicaal meristeem, in groeiende wortels en bladeren. In jonge bladeren werd er expressie waargenomen aan de basis van het blad, wat overeenkomt met de groeizone van het maisblad (Nelissen et al., 2012; 2013). In oudere bladeren wordt er geen promoteractiviteit meer waargenomen. Volgens de publieke mais expressie databank (http://bar.utoronto.ca/efp_maize/cgi-bin/efpWeb.cgi) komt het GA2ox gen ook tot expressive in voortplantingsorganen, maar tot op heden konden we geen promoteractiviteit aantonen in de pluim of de kolf. De afwezigheid van promoteractiviteit kan te wijten zijn aan een te kort promoter fragment of aan een onvoldoende resolutie van onze staalnames tijdens kolfontwikkeling (als de promoter enkel tijdens een kleine tijdsspanne actief is tijdens de ontwikkeling van een jonge kolf, kan het zijn dat we dit gemist hebben). In ieder geval kunnen we uitsluiten dat de promoter actief is in volwassen pluim, pollen en ontwikkelde kolf.

Fig: GUS kleuring op GA2ox::GUS planten. (A) In het endosperm verschijnt een GUS signaal op dag 2 en verdwijnt het gradueel op dag 8. (B) Het primordium van blad 9 (pijl), noch het shoot apical meristeem (*) vertonen een GUS signaal in een 23 dagen oude plant. (C) GUS kleuring in de wortels en scutella van GA2ox::GUS planten. (D) Kleuring van blad 1 van het moment dat het verschijnt. De nummers geven het aantal dagen na zaai aan.

Het geïntroduceerde bar-gen staat onder controle van de 35S promoter. Meestal wordt aangegeven dat deze promoter tot constititieve expressie leidt. Het is gekend dat deze promoter, eenmaal een bepaald stadium in de embryogenese voorbij, leidt tot expressie

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 15/28

in de meeste cel- en weefseltypes, al varieert de mate van expressie per celtype (Sunilkumar et al, 2002). Er is geen weefselspecifieke expressie. D3b) delen van de plant waar het donormateriaal tot expressie wordt gebracht (b.v. wortels, stam, pollen enz.). Het KLUH-gen staat onder controle van een maïs GA2-oxidase promoter en komt tot expressie in de groeizone van jonge bladeren en wortels en in het sheut apicaal meristeem, maar niet in volwassen luim, kolf of pollen (zie D3a). Het bar-gen staat onder controle van de 35S promoter. Deze leidt tot constitutieve expressie (zie verder D3a.). D4. Informatie over de verschillen tussen de genetisch gemodificeerde plant en de recipiënte plant D4a) voortplantingswijze(n) en/of -snelheid; De mannelijke bloeiwijze van de gemodificeerde plant heeft gemiddeld 2 extra laterale vertakkingen, wat erop wijst dat er meer pollen kan worden gevormd. Daarnaast blijken de gemodificeerde planten later tot bloei te komen (gemiddeld ongeveer 7 dagen), maar is het interval tussen pollen vrijstelling en het vormen van de silks op de kolf (anthesis silking interval; ASI) verkort in de gemodificeerde lijnen ten opzichte van de nietgemodificeerde planten. ASI is een belangrijke agronomische factor aangezien het interval tussen pollen vrijstelling en het verschijnen van de silks de zaadopbrengst bepaalt. Een kortere ASI bevordert de zaadopbrengst. Daarenboven is dit interval sterk gevoelig voor droogtestress: droogte verlengt het interval tussen anthese en silking waardoor de zaadopbrengst vermindert. Er werd in de serre geen effect waargenomen op de kolfvorming en zaadopbrengst, al is het onder serreomstandigheden moeilijk om dit goed vast te stellen. D4b) verspreiding; De pluim van de mannelijk bloem heeft extra vertakkingen in de serre, waardoor er mogelijk meer pollen gevormd wordt. Aangezien de planten ontmand zullen worden, zal dit geen risico inhouden. De modificatie blijkt geen invloed te hebben op de vrouwelijke bloeiwijze, zaadvorming of zaadverspreiding. D4c) vermogen om te overleven. Er zijn geen redenen om te veronderstellen dat er een verschil zal zijn in het vermogen van pollen en zaden om te overleven. Er zijn ook geen redenen om te veronderstellen dat deze planten beter bestand zouden zijn tegen afbraak of tegen winterse omstandigheden. Integendeel, in het labo hebben we aangetoond dat de gemodificeerde planten even gevoelig zijn voor koude stress, althans wat bladgroei betreft, als de niet-gemodificeerde planten. Aangezien er geen verschillen zijn in bloemen zaadvorming, veronderstellen we dat er ook geen verschil zal zijn in het vermogen van pollen en zaden om te overleven.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 16/28

D5. Genetische stabiliteit van het donormateriaal en fenotypische stabiliteit van de genetisch gemodificeerde maïs Er is een PCR uitgevoerd op materiaal van de 2e generatie. In dit materiaal bleek het insert zoals verwacht in het chromosomaal DNA aanwezig. De fenotypische stabiliteit van de gemodificeerde planten op de lange termijn is niet getest. Wel is bekend dat in materiaal van de 2e generatie het fenotype behouden blijft. De vraag kan gesteld worden of de attB1, -2 en -4 sequenties eventueel bijdragen tot een hogere instabiliteit van de genetische modificatie. Dit is niet direct getest.Gateway vectoren worden in het plantenonderzoek op grote schaal gebruikt. Er zijn al heel grote hoeveelheden planten getransformeerd met behulp van dit type vectoren, waarbij met name in Arabidopsis thaliana al meerdere generaties zijn bestudeerd. Voor zover ons bekend zijn hierbij nog geen problemen opgedoken in de vorm van genetische instabiliteit van het donormateriaal. Het gateway systeem is ontwikkeld om in verschillende systemen op een eenvoudige en efficiente manier aan ‘recombinatorial cloning’ te kunnen doen. Vergelijkbare systemen zijn ook specifiek ontwikkeld voor de toepassing in planten. Deze systemen zijn gebaseerd op Cre-lox (Vergunst et al. 2000), FLP-FRT (Li et al. 2009), R-RS (Nanto et al. 2005), phiC31-att (Lutz et al. 2004) and Bxb1-att (Yau et al. 2011). Ze zijn gemaakt om op een eenvoudige manier extra modificaties toe te voegen aan planten die al een modificatie hebben, en om op een eenvoudige manier bepaalde genen weer uit de planten te kunnen verwijderen (Ow, 2011). In geen van de gevallen wordt genetische instabiliteit van de geïntroduceerde traits gerapporteerd. Excisie geschiedt enkel in doelbewust gecreëerde omstandigheden. D6. Wijziging in het vermogen van de genetisch gewijzigde maïs om genetisch materiaal op andere organismen over te dragen Bij de gemodificeerde planten duurt het iets langer voordat ze de generatieve fase opstarten, en blijkt de ASI korter te zijn dan bij niet-gemodificeerde planten. Daarnaast hebben de mannelijke bloeiwijzen iets meer spikes. De eerste twee fenomenen wijzigen naar ons oordeel niets aan het vermogen van de planten om genetisch materiaal naar andere planten over te dragen. Het grotere aantal spikes zou echter kunnen betekenen dat de gemodificeerde planten iets meer pollen produceren dan niet-gemodificeerde planten en het kan niet uitgesloten worden dat dit positief bijdraagt tot het vermogen om genetisch materiaal over te dragen naar andere maisplanten. De planten bevatten zoals onder D1 al vermeld ook de AttB1, AttB2 en AttB4 sequenties die afgeleid zijn van DNA sequenties die faag lambda gebruikt bij het integreren van zijn genoom in dat van de E.coli bacterie. De AttB1, AttB2 en AttB4 sequenties kunnen recombineren met respectievelijk de AttP1, AttP2 en AttP4 sequenties in aanwezigheid van gelijke hoeveelheden van de faag lambda eiwitten Int en Xis (Katzen, 2007; Hartley, 2000). Dit zijn de eiwitten van het ‘integrase-excisionase complex’. De vraag die zich hier stelt is of de aanwezigheid van de AttB1, AttB2 en AttB4 sequenties de kans op horizontale genoverdracht vanuit de gemodificeerde plant naar bacteriën vergroot, en zo ja, of dat zou kunnen leiden tot ongewenste milieueffecten. Om succesvolle recombinatie te bewerkstelligen tussen het planten-DNA en bacterieel DNA moet het planten-DNA in een micro-omgeving terecht komen waarin: a) de voor recombinatie benodigde eiwitten Int en Xis in gelijke hoeveelheden aanwezig zijn, en b) een DNA-molecule aanwezig is die minimaal twee van de volgende drie Attsequenties bevat: AttP1, AttP2, AttP4.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 17/28

De lambda eiwitten Int en Xis komen in gelijke hoeveelheden voor in door faag lambda geïnfecteerde E.coli (lysogene E.coli) waarin de faag lambda zojuist een lytische cyclus is gestart. Het is op dat moment dat een stabiel geïntegreerd faag genoom afgelezen gaat worden en de twee eiwitten geproduceerd gaan worden. Een lytische cyclus wordt bij hoge uitzondering uitgevoerd, in ongeveer 1 op de 10.000 bacteriële delingen. E.coli en faag lambda komen in het milieu veelvuldig voor. E.coli is een bacterie die algemeen voorkomt in het darmstelsel van de mens en andere dieren. De verspreiding naar het leefmilieu geschiedt vooral via uitwerpselen. Daar waar uitwerpselen en mest in het milieu voorkomen, komt E.coli in verhoogde concentraties voor. Het lijkt niet voorstelbaar dat er buiten een bacteriële cel of buiten een cel waarin genen die coderen voor Int en Xis tot expressie worden gebracht, een micro-omgeving kan ontstaan waarin een integrase-excisionase complex actief kan zijn. Met andere woorden; om horizontale genoverdracht mogelijk te maken moet het planten-DNA dat de Att sequenties bevat door een lysogene bacterie worden opgenomen in stukken die groot genoeg zijn om een intact GA2ox::KLUH construct overgedragen te krijgen. Soortvreemd-DNA wordt over het algemeen in een bacterie echter snel afgebroken door restrictie-enzymen. Opname van planten-DNA door bacteriën geschied niet in intacte plantencellen of weefsels. Planten-DNA komt pas vrij als de plant afgebroken wordt, bijvoorbeeld door compostering. Niet alleen faag lambda heeft het vermogen om in E.coli genen uit te wisselen via een integrase-excisionase complex (Int-Xis). Heel wat van de ‘temperate bacteriophages’ (de fagen die hun erfelijk materiaal in het genoom van de bacterie insereren waardoor de bacterie ‘lysogeen’ wordt), maken gebruik van een Int-Xis complex (Piazolla et al, 2006). Naast faag lambda maken bijvoorbeeld ook de fagen P2, P4 en ᶲ24B gebruik van hetzelfde systeem (Piazolla et al, 2006; Fog et al, 2010). Het is niet bekend of er in de natuur, in een micro-omgeving waarin Int en Xis voorkomen, DNA-moleculen voor kunnen komen die AttP1, AttP2 of AttP4 sequenties bevatten. Feit is dat de AttP1, AttP2 en AttP4 sequenties qua DNA-volgorde doelbewust afwijken van de AttP sequenties die oorspronkelijk uit faag lambda geïsoleerd zijn geweest, en die aan de basis liggen van de ontwikkeling van het Gateway vector systeem. Deze verschillende Att sequenties zijn gemaakt om de directionaliteit van de te cloneren genen te kunnen bewaren (Katzen, 2007; Hartley, 2000). De AttP1, AttP2 en AttP4 sequenties zijn van AttP afgeleid door er mutaties in aan te brengen. AttB1 recombineert met AttP1, AttB2 recombineert met AttP2 en AttB4 recombineert met AttP4, of toch op zijn minst met een zeer grote voorkeur. De kans dat de AttB1, AttB2 en AttB4 sequenties recombineren met de natuurlijke AttP sequentie is klein (Ow, 2007). Als de kans op horizontale genoverdracht niet nul is, dan is uiteindelijk de vraag of zulk een eventuele overdracht naar een bacterie (E.coli) enig ongewenst effect zou kunnen sorteren. De cruciale vraag is dan of het chimere construct pGA2ox::KLUH voor E.coli een selectief voordeel oplevert en of het gen zich in E.coli zal handhaven. GA2oxidase-1 is een gen dat betrokken is bij de controle van de activiteit van bepaalde plantenhormonen, de gibberellines. Deze plantenhormonen zijn met name betrokken bij de strekking van verschillende plantenorganen zoals bijvoorbeeld de stengel. Het is bijzonder onwaarschijnlijk dat een E.coli bacterie in staat is om de zeer ruimtelijk en tijdsgebonden expressie van de GA2ox promoter te activeren. Hoewel het substraat van KLUH nog niet gekend is, is het een niet-cel-autonome molecule met een celdelingsbevorderend karakter. Momenteel is onze werkingshypothese dat deze molecule een rol speelt in de huishouding van plantenhormonen, aangezien de niveaus van auxine en cytokinines veranderd is in de transgene planten, waardoor het onze inschatting is dat deze molecule zich niet zal kunnen handhaven in E. coli, mocht er al horizontale genoverdracht naar bacteriën plaatshebben.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 18/28

Samengevat komt onze analyse op het volgende neer:  de kans op activiteit van een integrase-excisionase complex buiten een bacteriële cel is bijzonder klein.  de kans op opname van planten-DNA dat voldoende intact is, in een bacterie is bijzonder klein;  de kans op aanwezigheid van een actief integrase-excisionase complex in een micro-omgeving waarin voldoende intact planten-DNA aanwezig is en waarin bovendien DNA-moleculen aanwezig zijn waarin de AttP1, AttP2 en/of AttP4 sequenties aanwezig zijn is bijzonder klein;  De kans op succesvolle genoverdracht wordt verkleind door het feit dat de AttB1, -B2 en –B4 sequenties gemuteerd zijn ten opzichte van de wildtype AttB sequenties waarvan ze ooit afgeleid zijn;  Als er al horizontale genoverdracht zou zijn, dan geeft het GA2ox::KLUH construct geen selectief voordeel, waardoor de kans bijzonder klein is dat het er zich zou handhaven. D7. Informatie over toxische, allergene en andere schadelijke effecten op de gezondheid van de mens, als gevolg van de genetische modificatie Het cytochroom P450 monooxygenase CYP78A1 speelt een rol in de biosynthese van stoffen die betrokken zijn bij de controle van de celdeling. Celdeling is een natuurlijk fenomeen in de groei van planten en de stoffen die deze celdeling controleren zijn van nature in planten aanwezig. Er zijn geen redenen om te veronderstellen dat de additionele expressie van CYP78A1 onder controle van de GA2oxidase promotor, leidend tot een langere periode van celdeling met als gevolg grotere bladeren toxische, allergene of andere schadelijke effecten op de gezondheid van de mens zou hebben. Het is natuurlijk niet uit te sluiten dat als gevolg van insertie van het donormateriaal op een ongunstige locatie in het genoom van de plant, ongeweste effecten zijn opgetreden die op dit moment nog niet gekend zijn. Afwezigheid van minder gewenste delen van de backbone Er is expliciet nagegaan of de genetisch gewijzigde lijnen bepaalde minder gewenste delen van de backbone van de vector zouden bevatten, met name het aadA-gen. Het aadA gen verleent resistentie tegen de antibiotica streptomycine en spectinomycine. Volgens EFSA (2004) is gebruik van het aadA-gen toegelaten in planten voor veldproeven, maar niet voor de markt. Toch is door middel van PCR aangetoond dat de lijnen het aadA-gen niet bevatten (zie D2a.). D8. Informatie over de veiligheid van de genetisch gewijzigde maïs voor de gezondheid van het dier, in het bijzonder wat betreft toxische, allergene of andere schadelijke effecten als gevolg van de genetische modificatie, voorzover de genetisch gewijzigde maïs bedoeld is voor gebruik in diervoeders Zie D7. D9. Mechanisme van de interactie tussen de genetisch gemodificeerde maïs en doelwitorganismen Niet van toepassing. De modificatie is niet gericht op een bepaald doelwitorganisme. D10. Eventuele veranderingen in de interacties van de genetisch gewijzigde maïs met nietdoelwitorganismen die voortvloeien uit de genetische modificatie.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 19/28

De modificatie heeft voor zover wij tot op heden onder ingeperkt gebruik condities hebben kunnen vaststellen een effect op de lengte van de bladeren, het bloeitijdstip, en het anthesis-silking interval . Wij zien geen redenen om te veronderstellen dat dergelijke fenotypische wijzigingen een negatief effect zouden hebben op de interacties van de gemodificeerde maïsplanten met niet-doelwitorganismen. Variaties in bladlengte, bloeitijdstip en ASI komen al voor in cultuurmaïs. D11. Eventuele interacties met het abiotische leefmilieu. Wij voorzien geen bijzondere interacties met het abiotische leefmilieu. D12. Beschrijving van de detectie- en bepalingstechnieken voor de genetisch gemodificeerde plant. Er is een aantal technieken voorhanden waarmee de genetisch gewijzigde maïsplanten kunnen worden gedetecteerd / geïdentificeerd. Het betreft met name PCR mbv primers die specifiek zijn voor de geïntroduceerde sequenties. Daarnaast zijn de planten ook fenotypisch te onderscheiden van andere planten door hun significant grotere bladeren. Voor de beschrijving van de detectie- en bepalingstechnieken zie bijlagen. D13. Informatie over eerdere introducties van de genetisch gemodificeerde plant, indien van toepassing. Voor zover wij weten zijn er nog geen eerdere veldproeven uitgevoerd met genetisch gewijzigde maïsplanten waarin het KLUH gen tot expressie wordt gebracht onder controle van de GA2oxidase promoter.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 20/28

E. INFORMATIE OVER HET INTRODUCTIEGEBIED E1. Ligging en omvang van het introductiegebied Het introductiegebied ligt in de gemeente Wetteren op gronden die behoren tot het ILVO. Een liggingsplan is bijgevoegd in bijlage. Het introductiegebied zal inclusief niet-GGO 2 buffer niet meer dan 1000 m bedragen. E2. Beschrijving van het ecosysteem van het introductiegebied Het introductiegebied kan omschreven worden als landelijk/agrarisch gebied dat op maximaal enkele kilometers omsloten wordt door bebouwing in de vorm van industriezone en dorpskernen. De omgeving van de veldproef bestaat uit akker- en grasland waartussen zich af en toe een zoom van groen bevindt (bomen en/of struikgewas), en dat doorkruist wordt door infrastructuur in de vorm van wegen. De Schelde bevindt zich ten noorden van de veldproef. Wat flora en fauna betreft zijn er in het introductiegebied geen grote bijzonderheden. Er komen planten, dieren, en insecten voor zoals die gebruikelijk zijn in een verstedelijkt agrarisch gebied waarin bermen, boomstroken en kleine stukje bos voorkomen. Er is sprake van een gematigd zeeklimaat met relatief zachte temperaturen in de winter (kans op lichte tot soms matige vorst) en gematigde temperaturen in de zomer (tot o ongeveer 33 C), een overheersende zuid-westelijke windrichting, en een over het jaar verspreide neerslag van ruim 800 liter per vierkante meter (www.meteo.be). E3. Aanwezigheid van seksueel compatibele in het wild levende verwanten of gekweekte plantensoorten De afstand tot andere maïsplanten zal minimaal zijn. Niet-genetisch gemodificeerde maïsplanten zullen direct rondom de genetisch gewijzigde maïsplanten gezaaid worden. Anders gezegd: de proef wordt in een bestaand maïsperceel ingepast. Ook daarbuiten bevinden zich in de nabije omgeving percelen met niet-genetisch gewijzigde maïs. E4. Afstand tot officieel erkende biotopen of beschermde gebieden die kunnen worden beïnvloed De dichtstbijzijnde waardevolle gebieden zijn de bossen ten zuiden van Gontrode (op meer dan 1 kilometer afstand), en het erkende Schelde-Durme estuarium (ten oosten van Gent tot aan de NL grens, op meer dan 1 kilometer ten noorden van de proef). De Kalkense meersen liggen op ongeveer 6 km afstand.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 21/28

F. INFORMATIE OVER DE INTRODUCTIE F1. Doel van de introductie De veldproef vindt plaats in het kader van wetenschappelijk onderzoek naar de groei en ontwikkeling van planten. In dit geval heeft deze wetenschappelijke veldproef de volgende doelen: 1) Nagaan of de planten ook onder reële teeltcondities eenzelfde gewijzigd fenotype laten zien als in de serre, en nagaan wat het effect op de biomassa is. 2) Het meten van de kolfzetting en kolfvulling onder reële teeltcondities. F2. Geplande datum/data en duur van de introductie De proef zal aanvangen eind april of begin mei 2015 en lopen tot en met oktober 2017. De proef neemt dus drie achtereenvolgende groeiseizoenen in beslag. F3. Methode die zal worden gebruikt voor de introductie van de genetisch gemodificeerde planten De maïs zal met de hand worden gezaaid. F4. Methode voor de behandeling en het beheer van het introductiegebied vóór, tijdens en na de introductie, waaronder teelt- en oogstmethoden Het introductiegebied zal voorafgaand aan de introductie een mechanische grondbewerking (ploegen / cultivator / grondfrees) ondergaan met het doel een voldoende luchtig en verkruimeld zaaibed te verkrijgen. Gedurende het seizoen zal een of enkele keren met een herbicide en/of handmatig het onkruid bestreden worden, zoals gebruikelijk is in de teelt van maïs. Er zal geen glufosinaat worden gebruikt. De mannelijke bloemen (de pluimen) van de GGO- en referentielijnen zullen met de hand verwijderd en daarna vernietigd worden, voordat ze stuifmeel kunnen gaan verspreiden. De mannelijke bloeiwijzen van de rijen niet-gemodificeerde B104xCML91 planten die rondom en tussen de blokken met GGO- en referentielijnen staan (in het plotplan in bijlage 3 in het blauw aangeduid) zullen niet verwijderd worden. Deze planten hebben immers de functie van bestuiver en het stuifmeel van deze planten moet de vrouwelijke bloemen op de GGO- en referentielijnen bevruchten. Zonder bevruchting is er immers geen zaadzetting. De oogst van de genetisch gewijzigde maïsplanten zal met de hand gebeuren. Daarbij zal er vooral gelet worden op het verzamelen van alle kolven/zaden, ook de allerkleinste. Dit is immers het enige reproductieve materiaal. Na de oogst zal het perceel enige tijd braak liggen om vervolgens ten laatste in het eerstvolgende voorjaar geploegd te worden. De proef zal de drie achtereenvolgende seizoenen op exact dezelfde plaats worden uitgevoerd. F5. Aantal planten, bij benadering (of planten per vierkante meter) Er worden twee genetisch gewijzigde lijnen in drie herhalingen gezaaid. Elke herhaling bestaat uit vier rijen met een tussenafstand van 0.75m en een lengte van 6 meter. De 2 oppervlakte van elke herhaling is 18m . Het aantal planten bedraagt ongeveer 10 planten 2 2 per m . Dit maakt dat er dus 108m en bij benadering 1080 GGO planten in de veldproef aanwezig zullen zijn. Voor elk van de genetisch gewijzigde lijnen wordt ook evenveel

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 22/28

niet-ggo referentielijn gezaaid (dus twee niet-ggo referentielijnen), ook in drie herhalingen. Als referentielijnen worden de negatieve segreganten gebruikt. Daarnaast zullen er rond en tussen de herhalingen van GGO’s en referentielijnen bestuiverplanten staan. Dit is de niet-gemodificeerde B104xCML91 hybride. De oppervlakte van de gemodificeerde maïs samen met de oppervlakte van de referentielijnen en 2 bestuiver/bufferrijen zal niet meer dan 1000m bedragen. We verwijzen voor meer detail naar het plotplan in bijlage 3.

G. INFORMATIE OVER PLANNEN VOOR BEHEERSING, CONTROLE, FOLLOW-UP EN AFVALBEHANDELING G1. Genomen voorzorgsmaatregelen: G1a) afstand(en) tot sexueel compatibele plantensoorten, zowel in het wild levende verwanten als cultuurgewassen; De afstand tot niet-genetisch gewijzigde maïsplanten zal minimaal zijn. De proef wordt ingeplant in een bestaand maïsperceel. G1b) maatregelen om de verspreiding van een voortplantingsorgaan van de genetisch gewijzigde maïs (b.v. pollen, zaad, knollen) tot een minimum te beperken of te voorkomen. Om verspreiding van de genetisch gemodificeerde eigenschap te verhinderen zullen de genetisch gewijzigde maïsplanten worden ontpluimd voordat er sprake is van verspreiding van pollen. Op deze manier wordt verspreiding van de gemodificeerde eigenschap naar omliggende maïsplanten voor de volle 100% voorkomen. De monitoring op bloeiwijzen zal starten vanaf het moment van de vorming van het laatste blad. De proefplot zal dan om de twee dagen bezocht worden om te controleren op mannelijke bloeiwijzen. De ervaring met de eerdere maisveldproef B/BE/11/V4 heeft geleerd dat het niet nodig is om dagelijks te gaan controleren. De mannelijke bloemen worden verwijderd van zodra ze zichtbaar zijn en de ervaring heeft geleerd dat wanneer er om de andere dag wordt gecontroleerd er nooit een mannelijke bloem een stadium zal kunnen bereiken dat hij pollen gaat kunnen verspreiden. Met de monitoring op, en het verwijderen van mannelijke bloeiwijzen zal telkens op 15 september worden gestopt, ook al zouden op dat moment nog niet alle mannelijke bloeiwijzen verwijderd zijn. De reden is dat de eventuele verspreiding van stuifmeel op dat moment geen aanleiding meer kan geven tot de verspreiding van genetisch gewijzigd materiaal omdat de kolven in de omringende mais en de verre omgeving allang bevrucht zijn geweest en volop met zaden gevuld zullen zijn. Er zal rondom de genetisch gewijzigde en referentiemaïs een buffer van 3 meter met niet-genetisch gewijzigde maïs gehanteerd worden die net zoals de proefplot na de oogst vernietigd zal worden (zie proefplan). G2. Beschrijving van de methoden voor de behandeling van het gebied na de introductie Het plot zal na de oogst gedurende een korte periode braak liggen en dan gedurende de winter of ten laatste in het eerstkomende voorjaar worden geploegd. G3. Beschrijving van de methoden voor de behandeling van de oogst en de afvalstoffen van de genetisch gemodificeerde plant

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 23/28

De oogst van de maïsplanten zal handmatig gebeuren. Eerst zullen de kolven – ook de allerkleinste – zeer zorgvuldig handmatig worden geoogst en in dubbele zakken worden gestoken die met touw zullen worden afgesloten en gelabeld. Stengels en bladeren zullen ter plaatse worden verhakseld. Er zullen monsters worden genomen om drogestof gehaltes op te bepalen. Stengels en bladeren zijn niet reproductief en om die reden geen GGO meer. Wortels en onderste deel van de stengel zullen in de grond achtergelaten worden en composteren. De zakken met kolven zullen in een gesloten vervoermiddel naar het VIBonderzoeksdepartement PSB in Zwijnaarde worden gebracht. De geoogste kolven/zaden zullen daar bewaard worden en eventueel gebruikt worden voor verder laboratoriumonderzoek. Materiaal dat niet meer nodig is voor verder onderzoek zal worden geïnactiveerd. G4. Beschrijving van controleplannen en –technieken De proef zal visueel worden gecontroleerd. Deze visuele controle zal op regelmatige tijdstippen (minimaal twee keer per maand) plaatshebben met een intensivering in de periode dat de mannelijke bloeiwijzen verschijnen. Deze periode van intensieve monitoring start zoals onder G1b al vermeld op het moment dat het laatste blad gevormd wordt en om de twee dagen plaatshebben en doorlopen tot 15 september. Mannelijke bloemen worden met de hand in hun geheel verwijderd. De pluimen worden in gesloten houders afgevoerd in een gesloten vervoermiddel en worden geïnactiveerd. G5. Beschrijving van noodmaatregelen Een eerste noodmaatregel is dat de veldproefplot zal worden voorzien van een buffer van 3 meter met niet-genetisch gewijzigde maïsplanten die net als de proefplot na oogst zal worden vernietigd. Mocht er een genetisch gewijzigde maïsplant omwaaien, dan zal die plant door de buffer worden opgevangen. Als bij een controle een omgewaaide maïsplant wordt aangetroffen, dan wordt deze verwijderd, inclusief kolven en zaad en vervolgens worden vernietigd. Er is voor een buffer met maïsplanten gekozen in plaats van een buffer in de vorm van gras of braakligging, om randeffecten in de veldproefplot zo veel mogelijk te voorkomen. Er zou zich in de praktijk een aantal calamiteiten kunnen voordoen. Een voorbeeld is moedwillige beschadiging van de proef. Zodra dit wordt opgemerkt zal het beschadigde materiaal dat niet meer te redden is zorgvuldig worden opgeruimd en vernietigd. Een tweede calamiteit die zich zou kunnen voordoen is dat de auto met zakken met geoogste kolven bij een ongeval betrokken zou raken en dat de kolven op straat zouden belanden. Als dat gebeurt dan zal al het materiaal zorgvuldig worden verzameld, bijeengeveegd en in tonnen worden gedaan die afgesloten worden, om vervolgens hun reis naar het onderzoeksdepartement weer te hervatten. G6. Methoden en procedures om het gebied te beschermen De proef vind plaats op een privédomein dat omgeven is door een gesloten hekwerk en dat verboden toegang is voor onbevoegden.

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 24/28

H. ONDERTEKENING

H1. Namens de rechtspersoon VIB: Naam:

Jo Bury

Functie:

managing director, VIB

Opgemaakt te Gent, op

Handtekening:

H2. Verantwoordelijk onderzoeker: Naam:

Hilde Nelissen

Handtekening:

H3. Bioveiligheidscoördinator: Naam:

René Custers

Handtekening:

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 25/28

Referenties

Aylor D (2003) Rate of dehydration of corn (Zea mays L.) pollen in the air. J. Exp. Bot. 54: 2307– 2312 CIMMYT, 1995, Maize Genetic Resources COGEM advies CGM/080131-04, 31 januari 2008 Di-Giovanni F, Kevan P, Nasr M (1995) The variability in settling velocities of some pollen and spores. Grana 34: 39–44 EFSA, 2004, Opinion of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on the use of antibiotic resistance genes as marker genes in genetically modified plants, The EFSA Journal (2004) 48, 1-18 Emberlin et al, A report on the dispersal of maize pollen, January 1999. Fog et al, 2010, Characterization of the relationship between integrase, excisionase and antirepressor activities associated with a superinfecting Shiga toxin encoding bacteriophage,Nucleic Acids Research, 2010, 1–14 Hajdukiewicz et al, The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation, Plant Molecular Biology 25: 989-994, 1994 Hartley et al, 2000, DNA Cloning Using In Vitro Site-Specific Recombination, Genome Res. 2000 10: 1788-1795 Henry C, Morgan D, Weekes R, Daniels R, Boffey C (2003), Farm scale evaluations of GM crops: monitoring gene flow from GM crops to non-GM equivalent crops in the vicinity: part I: forage maize. DEFRA report EPG 1/5/138, http://www.defra.gov.uk/environment/gm/research/pdf/epg_15-138.pdf Hilson, 2006, Cloned sequence repertoires for small- and large-scale biology, TRENDS in Plant Science Vol.11 No.3 March 2006 Hin, 2001, Landbouwkundige risico’s van uitkruising van GGO-gewassen, Centrum voor Landbouw en Milieu, 2001. Karimi et al, 2007, Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors, Plant Physiology, December 2007, Vol. 145, pp. 1144–1154 Katzen 2007, Gateway® recombinational cloning: a biological operating system, Expert Opin. Drug Discov. (2007) 2(4):571-589 Li et al 2009, Site-Specific Integration of Transgenes in Soybean via Recombinase-Mediated DNA Cassette Exchange, Plant Physiology, November 2009, Vol. 151, pp. 1087–1095 Lutz et al 2004, A novel approach to plastid transformation utilizes the ᶲC31phage integrase, The Plant Journal (2004), 37, 906-913 Munkvold, 2003, Cultural and Genetic Approaches to managing Mycotoxins in Maize, Annu. Rev. Phytopathol. 2003. 41:99–116

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 26/28

Nanto et al, 2005, Agrobacterium-mediated RMCE approach for geneReplacement, Plant Biotechnology Journal (2005) 3, pp. 203–214 Nelissen, H., Rymen, B., Jikumaru, Y., Demuynck, K., Van Lijsebettens, M., Kamiya, Y., Inzé, D., and Beemster, Gerrit T.S. (2012). A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology 22, 1183-1187. Nelissen, H., Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., and Beemster, G.S. (2013). Kinematic analysis of cell division in leaves of mono- and dicotyledonous species: A basis for understanding growth and developing refined molecular sampling strategies. In Plant Organogenesis (Methods in Molecular Biology Vol. 959), I. De Smet (ed.), New York, Humana Press, pp. 247-264. OECD, 2003, Consensus document on the biology of Zea mays ssp. mays Ow, 2011, Recombinase-mediated Gene Stacking as a Transformation Operating System, Journal of Integrative Plant Biology 2011, 53 (7): 512–519 Piazolla et al, 2006, Expression of phage P4 integrase is regulated negatively by both Int and Vis, Journal of General Virology (2006), 87, 2423–2431 Sunilkumar et al, 2002, Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP, Plant Molecular Biology, volume 50, nr 3, October 2002, p.463-479 Van Droogenbroeck et al, 2011, De Vlaamse regelgeving omtrent co-existentie: een evaluatie in praktijkomstandigheden, Eindrapport, ILVO Vergunst et al, 2000, Cre/lox-mediated recombination in Arabidopsis: evidence for transmission of a translocation and a deletion event, Chromosoma (2000) 109:287–297 Viljoen, Status and Prevalence of Mycotoxins in Maize Yau et al 2011, Method for Bxb-1 mediated site specific integration in planta, Methods Mol Biol, 2011;701:147-66 Zondlo SC and Irish VF (1999) The Plant Journal 19(3), 259-268).

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 27/28

Bijlagen 1. Gezondheids- en leefmilieurisicobeoordeling 2. Liggingsplan 3. Ontwerp veldproefplan 4. Proefprotocol 5. Monitoringsplan 6. SNIF formulier 7. Verklaring inzake burgerlijke aansprakelijkheid 8. Verklaring inzake levering van controlestalen 9. Detectie- en bepalingstechnieken 10. Bewijs van betaling van dossiertaks 11. Vertrouwelijke gegevens

REG/rc-bvl/14-00375


pag. 28/28

KENNISGEVING GGO-VELDPROEFAANVRAAG. Technisch dossier

Recommend Documents