15 III BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Ternak Penelitian Ternak yang diamati adalah itik cihateup sebanyak 48 ekor dalam fase grower umur 14 minggu dengan berat rata – rata 1040,825 gram + 48,6097 gram.
Itik
diperoleh dari Breeding Center Ternak Itik Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Itik percobaan ditempatkan pada 4 perlakuan dan diulang sebanyak 6 kali dengan masing – masing ulangan 2 ekor. 3.1.2 Ekstraksi Minyak Buah Makasar (Brucea javanica) Produksi minyak esensial diperoleh secara ekstraksi sesuai dengan prosedur penelitian Subeki dkk. (2006), yaitu sebanyak 80 kg tepung buah makasar direndam selama 1 minggu dan setiap hari selama 10 menit dilakukan pengadukan. Selanjutnya filtrat disaring dengan menggunakan kain saring dan kemudian diuapkan dengan evaporator menjadi 1 L. Filtrat pekat tersebut kemudian diekstrak dengan etil asetat (EtOAc) hingga diperoleh fraksi air dan EtOAc. Fraksi EtOAc diuapkan hingga kering dan selanjutnya dimasukkan ke dalam silika gel kolom khromatografi dan dielusi dengan CHCl3(3 L), MeOH-CHCl³ (3:97,3L), dan MeOH-CHCl³ (1:4, 3 L), secara berurutan. Fraksi CHCl³ diuapkan hingga kering dan kemudian dimasukkan ke dalam silika gel kolom kromatografi dan dielusi dengan clorofom sehingga diperoleh 3 fraksi. Minyak esensial diperoleh dari fraksi 2 (1:2) lalu dievaporasi untuk memperoleh minyak esensial murni.
16 3.1.3 Kandang Penelitian Kandang yang digunakan dalam penelitian adalah kandang panggung dengan sistem kelompok. Kerangka kandang terbuat dari bambu dan kawat yang disekat sehingga membentuk flock. Setiap flock berukuran 1 m x 0,75 m x 0,5 m dengan kapasitas 2 ekor. masing – masing flock diberi tempat makan dan tempat minum. 3.1.4 Alat Penelitian a. Tempat pakan dan minum b. Kertas label c. Timbangan skala 5 kg untuk menimbang ransum. d. Spuit digunakan untuk memberikan MBM pada itik secara oral. e. vakutainer yang mengandung antikoagulan EDTA f. Cooling box g. Real Time PCR Illumina EcoTM h. Jarum Suntik i. Rneasy Kit Oigen j. Sentrifugasi k. spektrofotometer 3.1.5 Bahan Penelitian a. Alcohol 70% b. Silika gel c. Minyak buah makasar d. Buffer RW 1 e. INVITROGEN : PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini Kit f. INVITROGEN : SuperScript® III Platinum® SYBR Green One-Step qRTPCR Kit
17 g. INVITROGEN The SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RTPCR 3.1.6 Ransum Percobaan Ransum yang digunakan selama penelitian berbentuk mash. Pakan yang digunakan selama penelitian merupakan pakan dengan formula sesuai pada tabel 2. Ransum tersebut disusun berdasarkan kebutuhan itik cihateup dan kondisi itiknya, Komposisi zat-zat bahan pakan penelitian disajikan pada Tabel 1 berikut : Tabel 1. Kandungan Zat Dan Energi Metabolis Bahan Pakan BahanPakan Jagungkuning Dedakhalus Bungkilkedelai Bungkilkelapa Tepungikan Tepungtulang Minyakkelapa Premix
EM Kkal/kg 3370 1630 2240 2120 3080 0 8600 0
PK LK SK Ca P Lisin Metionin Sistin ..............................................%............................................................ 8,60 3,90 2,00 0,02 0,10 0,20 0,18 0,18 12,00 13,00 12,00 0,12 0,20 0,77 0,29 0,40 45,00 0,90 6,00 0,32 0,29 2,90 0,65 0,67 21,00 1,80 15,00 0,20 0,20 0,64 0,29 0,30 60,00 9,00 1,00 5,50 2,80 5,00 1,80 0,94 0,00 0,00 0,00 24,00 12,00 0,00 0,00 0,00 0,00 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 10,00 5,00 0,30 0,30 0,10
Sumber : Data sekunder dari Laboratorium Produksi Ternak Unggas Fakultas ………….. Peternakan Universitas Padjadjaran, 2015. Keterangan : EM = Energi Metabolis PK = Protein Kasar LK = Lemak Kasar SK = Serat Kasar Ca = Calsium P = Phospor
18 Tabel 2. Formula Ransum Percobaan Bahan Pakan
Jumlah ...............................................%..................................... Jagung kuning 65,00 Dedak halus 12,00 Bungkil kedelai 8,00 Bungkil kelapa 3,00 Tepung ikan 8,00 Tepung tulang 2,00 Minyak kelapa 1,50 Premix 0,50 Jumlah 100,00 Sumber : Hasil Perhitungan Berdasarkan Tabel 1.
Tabel 3. Kandungan Formula Ransum Percobaan Nutrien
Total EM (Kkal/kg) 3004 PK (%) 16,06 LK (%) 6,44 SK (%) 3,75 Ca (%) 1,03 P (%) 0,61 Lisin (%) 0,88 Metionin + Sistein (%) 0,66 Sumber : Hasil Perhitungan Berdasarkan dari Tabel 1 dan 2. 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Tahapan Persiapan a. Sanitasi kandang yang meliputi pencucian tempat pakan dan minum, pengapuran lantai dan dinding kandang. b. Membuat flock – flock dalam kandang. c. Mempersiapkan ransum itik dengan mencampur beberapa bahan pakan yang telah ditetapkan. d. Mempersiapkan minyak buah Makassar (MBM).
19 3.2.2 Tahap Pemeliharaan Pemberian pakan pada itik adalah sebesar 125 gr/ekor/hari pada umur minggu ke 14 – 17 dan 130 gr/ekor/hari pada umur minggu ke 18 – 20. Minyak buah makasar diberikan pada itik saat umur 16 - 20 minggu dengan perlakuan BJ.A sebanyak 100μl, BJ.B sebanyak 150μl, BJ.C sebanyak 200μl yang dicekokkan menggunakan spluit. Proses tersebut berlangsung awal periode grower dengan pemberian 3 kali dalam seminggu. Dilaksanakan selama 5 minggu. 3.2.3 Tahap Pengambilan Sampel Darah a. Sebanyak 48 ekor itik cihateup yang telah diberi perlakuan dipersiapkan. b. Bagian vena pektoralis eksterna yang terdapat dibawah sayap dibersihkan menggunakan alcohol 70%. c. Darah diambil sebanyak 3 mL. d. Sampel darah segera dimasukkan kedalam vakutainer yang mengandung antikoagulan EDTA untuk mencegah proses pembekuan darah. e. Vakutainer dimasukkan ke dalam cooling box saat akan dibawa ke laboratorium. 3.2.4 Analisis Ekspresi Gen HSP70 Ekspresi mRNA gen HSP 70 diukur dengan Real Time PCR Illumina EcoTM Real Time PCR . Analsis RT-PCR dengan dengan komposisi : KAPA “SYBR FAST (12,5 µL), 0,5 µL reverse transkriptase, TCCAGAAGTTCGGCATTTCTCA
(0,5
µL),
primer forward F: primer
reverse
R:
GGAGAAACTCTGCAACCCGA (0,5 µL) (Jingjing dkk., 2014), RNA template (5 µL), PCR water (5 µL). Reaksi berlangsung pada kondisi : 500C, 10 menit untuk aktivasi reverse transcriptase,
95
0
C, 5 menit untuk inaktivasi reverse
transcriptase, kemudian reaksi diulang sebanyak 40 siklus pada 950C selama 10
20 detik (denaturasi), 520C selama 10 detik (annealing) dan 720C selama 10 detik (elongasi). Baseline dan treshold ditetapkan secara otomatis oleh piranti lunak pada mesin RT-PCR. Perpotongan kurva amplifikasi dengan nilai merupakan cycle treshold (Ct). Ekspresi gen (fold change) dihitung dengan Ct ( 2ΔΔ Ct ). Tahapan analisis ekspresi gen meliputi : a. Ekstraksi mRNA,
cDNA (enzim Reverse Transkriptase/RT), analisis
ekspresi gen dengan Real Time PCR. Gen yang diuji adalah HSP 70. Ekstraksi mRNA dari darah itik menggunakan kit komersial (Rneasy Kit, Qiagen) mengikuti prosedur yang ditetapkan produsen. b. Sampel darah (700 µL) dipindahkan ke kolom spin dan disentrifugasi (8000 g, 15 detik), cairan dibuang. c. Membran kolom spin dicuci dengan cara menambahkan buffer RW 1 (700 µL) d. kolom spin disentrifugasi (8000 g, 15 detik), cairan dibuang. Selanjutnya e. membran kolom spin dicuci dengan 500 µL RPE kemudian kolom spin disentrigugasi (8000 g, 2 menit).
Elusi RNA pada membran dengan
memindahkan kolom spin ke tabung kolektor 1,5 mL, kemudian ditambahkan 30-50 µL air bebas RNA se dan disentrifugasi (8000 g, 1 menit). Tahap ini bisa diulang untuk mendapatkan RNA lebih banyak. f. Konsentrasi mRNA kemudian diukur dengan spektrofotometer pada 260 nm. 3.2.5
Parameter yang Diukur Parameter yang diukur dalam penelitian ini adalah dengan mengamati
ekspresi gen (fold change) yang dihitung. Kemudian dibandingkan antar perlakuan. Ekspresi mRNA gen HSP 70 diukur dengan Real Time PCR Illumina EcoTM Real Time PCR.
21 3.2.6
Rancangan Penelitian Penelitian dilakukan berdasarkan metode eksperimental dengan rancangan
percobaan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan 4 macam perlakuan ekstrak minyak buah makasar (MBM) setiap perlakuan diulang 6 kali. Setiap pengulangan terdiri dari 2 ekor itik. Pengaruh perlakuan akan diuji menggunakan analisis ragam polynomial orthogonal dilanjutkan dengan uji contrast orthogonal dengan menggunakan perangkat lunak SPSS. Perlakuan terdiri dari : K
: Kontrol (tanpa perlakuan)
BJ. A : Penambahan MBM 100 µL BJ. B : Penambahan MBM 150 µL BJ. C : Penambahan MBM 200 µL Hipotesis yang akan diuji adalah : H0 : K = BJ.A= BJ.B= BJ.C = 0 artinya tidak terdapat perbedaan antar perlakuan. H1 : K = BJ.A= BJ.B= BJ.C ≠0atau paling sedikit ada sepasang perlakuan yangtidak sama. Kaidah keputusan : Jika Fhitung ≤ Ftabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H0 dan tolak H1. Jika Fhitung > Ftabel 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H0 dan terima H1.
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode ortogonal polinomial. Suatu derajat polynomial ke-n digunakan untuk mengetahui hubungan antara peubah respon Y dan peubah predictor X diujikan sebagai berikut : Y = α + β1X + β2X2 + …. + βnXn
22 Perhitungan untuk mendapatkan koefisien orthogonal polynomial untuk derajat polynomial pertama (linier), derajat polynomial kedua (kuadratik) dan derajat polynomial ketiga (kubik), sebagai berikut : L = a + X1 Q1 = b + cX1 + Xi2 C1 = d + eX1 + f X12 + X12 Keterangan : Yij = Pengamatan perlakuan ke-i ulangan ke-j. μ = Rataan umum. αi = Pengaruh perlakuan ke-i. εij = Pengaruh acak perlakuan ke-i ulangan ke- j / galat. Tabel 4. Analisis Ragam Sesuai dengan Perbandingan orthogonal polynomial Sumber Keragaman
Derajat Bebas (db)
Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah (JK) (KT)
Statistik Uji F
t–1
JKP
KTP
F
Linier
1
JKP1
KTP1
F1
Kuadratik
1
JKP2
KTP2
F2
Kubik
1
JKP3
KTP3
F3
Kuartik
1
JKP4
KTP4
F4
Galat Percobaan
Sisa
JKG
KTG
Total
n-1
JKT
Perlakuan
Pengambilan keputusan dapat dilihat dari hasil pembandingan nilai statistik uji F yang telah dihitung dengan nilai kritis. Penentuan derajat polinomial didasarkan pada kontras – kontras ortogonal yang nyata, sehingga akan didapatkan hubungan fungsi respon antar perlakuan sesuai dengan derajat polinomial yang signifikan.
