III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Objek Penelitian 3.1.1 Ternak Percobaan Itik Cihateup yang dipelihara sebanyak 48 ekor baik jantan maupun betina, berumur 14 minggu (fase grower) dengan berat badan rata-rata 1049,825 gram ± 48,6097 yang diperoleh dari Laboratorium Produksi Ternak Unggas, Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Itik Cihateup tersebut dibagi ke dalam 4 perlakuan dan pengulangan sebanyak 6 kali, dengan jumlah setiap ulangan 2 ekor itik Cihateup. 3.1.2 Ekstraksi Buah Makasar Buah Makasar ini diberikan dalam bentuk ekstrak dengan dosis yang telah ditentukan. Produksi minyak esensial diperoleh secara ekstraksi sesuai dengan prosedur penelitian, yaitu sebanyak 80 kg tepung buah makasar direndam selama 1 minggu dan setiap hari selama 10 menit dilakukan pengadukan. Selanjutnya filtrat disaring dengan menggunakan kain saring dan kemudian diuapkan dengan evaporator menjadi 1 L. Filtrat pekat tersebut kemudian diekstrak dengan etil asetat (EtOAc) hingga diperoleh fraksi air dan EtOAc. Fraksi EtOAc diuapkan hingga kering dan selanjutnya dimasukkan ke dalam silika gel kolom khromatografi dan dielusi dengan CHCl3(3 L), MeOH-CHCl³ (3:97,3L), dan MeOH-CHCl³ (1:4, 3 L), secara berurutan. Fraksi CHCl³ diuapkan hingga kering dan kemudian dimasukkan ke dalam silika gel kolom kromatografi dan dielusi dengan clorofom sehingga
25
diperoleh 3 fraksi. Minyak esensial diperoleh dari fraksi 2 (1:2) lalu dievaporasi untuk memperoleh minyak esensial murni. 3.1.3
Kandang dan Perlengkapan Kandang yang dipakai adalah kandang koloni, kerangka kandang terbuat
dari kayu sebagai alas serta sisinya menggunakan papan dan kawat ram. Ukuran kandang 1 x 0,75 x 0,5 m dengan kapasitas sebanyak 4 ekor tiap flock. 3.1.4 Peralatan Penelitian Peralatan yang digunakan dalam penelitian tersebut adalah : a. Tempat makan dan minum yang terbuat dari plastik b. Timbangan skala 20 kg dan 5 kg untuk menimbang pakan dan itik c. Timbangan digital untuk menimbang ekstrak buah makasar d. Ember plastik sebagai tempat penyimpanan ransum e. Lemari kecil untuk menyimpan peralatan f. Spuit dan jarum oral yang digunakan untuk dicekokan ke itik g. Kertas label 3.1.5 Ransum Penelitian Ransum yang digunakan selama penelitian yaitu ransum formulasi yang berbentuk mash atau tepung dimana bahan pakan diperoleh dari CV. Missouri Bandung. Pada umur 14-17 minggu diberi 125 gr/ekor/hari dan untuk umur 18-20 minggu diberikan sebanyak 130 gr/ekor/hari, untuk rincian komposisi zat-zat makanan dari bahan pakan yang digunakan disediakan pada tabel dibawah berikut ini :
26
Tabel 1. Kandungan Zat-zat Nutrien Bahan Pakan Penelitian EM
PK
SK
LK
Ca
P
Lys
Met
(kkal/kg)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
Jagung Kuning 3370 8,60 2,00 3,90 0,02 0,10 0,20 Dedak Halus 1630 12,00 12,00 13,00 0,12 0,20 0,77 Minyak Kelapa 8600 100 24,00 12,00 Bk. Kedelai 2240 45,00 6,00 0,90 0,32 0,29 2,90 Bk. Kelapa 2120 21,00 15,00 1,80 0,20 0,20 0,64 Tepung Ikan 3080 60,0 1,00 9,00 5,50 2,80 5,00 Tepung Tulang 24,00 12,00 Premix 0,30 0,30 Sumber : Laboratorium Produksi Ternak Unggas Fakultas Peternakan 2015
0,18 0,29 0,65 0,29 1,80 -
Bahan Pakan
PK
: Protein Kasar
EM
: Energi Metabolis
SK
: Serat Kasar
LK
: Lemak Kasar
Ca
: Calcium
P
: Phosfor
Lys
: Lysin
Met
: Metionin
27
Tabel 2. Formulasi Bahan Pakan Penelitian Bahan Pakan
Jumlah (%)
Jagung Kuning Dedak Halus Minyak Bungkil Kedelai Bungkil Kelapa Tepung Ikan Tepung Tulang Premix
65,00 12,00 1,50 8,00 2,00 8,00 2,00 0,5
Total
100
Keterangan: Hasil Perhitungan Berdasarkan Tabel 1. Tabel 3. Kandungan Nutrien pada Ransum Penelitian dan Kebutuhan Itik Grower Nutrien
Ransum Penelitian*
Kebutuhan Itik Grower**
EM (Kkal/Kg)
3014,3
2800
PK (%)
15,96
16,00
Ca (%)
1,028
0,60
P (%)
0,6
0,60
Lys (%)
0,87
0,90
Met (%)
0,36
Keterangan:
*) Hasil perhitungan **) NRC (1984) ***) SNI (2006)
0,56 ***
28
3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Prosedur Kerja a.
Tahap Persiapan Meliputi sanitasi kandang, pembuatan ekstrak buah makasar, penyediaan bahan pakan dan peralatan serta pengadaan ternak percobaan.
b.
Tahap Penelitian Waktu pemberian ekstrak minyak buah makasar dilakukan seminggu tiga kali pada hari Selasa, Kamis, dan Sabtu sore selama 5 minggu dengan awal pemberian ekstrak buah makasar pada saat itik masuk umur 12 minggu atau 3 bulan pada fase grower sampai dengan akhir fase grower, dengan konsentrasi minyak buah makasar sesuai dengan perhitungan. Ekstrak buah makasar diberikan dengan cara dicekokan menggunakan spuit 5ml larutan dicekokan tiga kali dalam seminggu setiap hari Selasa, Kamis, dan Minggu.
c.
Tahap Pengambilan Sampel Sampel diambil dengan cara membedah itik pada akhir penelitian untuk diperoleh ileum itik tersebut. Kemudian ileum yang didapat dicuci dengan menggunakan larutan NaCl Fisiologis kemudian setelah bersih dimasukan ke dalam larutan fiksatif.
d.
Tahap Analisis Sampel Analisis nekrosis dan apoptosis sel-sel ileum itik Cihateup menggunakan metode Mallory-Asam (MA) yang dilakukan di Laboratorium Mikro Teknik Hewan Jurusan Biologi, Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran.
29
3.2.2 Pemeliharaan Itik a.
Itik diberi pakan dua kali dalam sehari yaitu pada pagi hari pukul 07.00 – 08.00 WIB dan sore hari pukul 16.00 – 17.00 WIB sedangkan pemberian air minum secara addlibitum.
b.
Tempat minum dicuci setiap hari pada pagi hari. Setelah itu tempat minum diisi menggunakan air bersih dan diberikan pada itik.
c.
Pemberian minyak BJ dilakukan pada sore hari sebelum itik diberi pakan.
d.
Pengecekan keadaan itik dilakukan setiap hari, bila ada ada itik yang mati maka itik tersebut harus dikuburkan supaya tidak menimbulkan sumber penyakit bagi itik lainnya.
3.2.3 Prosedur Analisis Nekrosis dan Apoptosis Sel-Sel Ileum Itik Cihateup Menggunakan Metode Mallory-Asam Metode mallory asam merupakan salah satu dari metode pembuatan preparat awetan trikrom mallory yang menghasilkan kontras warna dan kemunculan berbagai struktur yang lebih jelas. Metode ini efektif untuk jaringan ikat, serat otot, sel-sel glial, kolagen, stoma glomerulus (ginjal), eritrosit dan kromatin nuklir. Tahapan pembuatan sediaan metode mallory-asam adalah sebagai berikut: (a)
Isolasi jaringan. Ileum diambil secepat mungkin setelah itik mati kemudian dicuci dengan NaCl Fisiologis. Keterlambatan pengambilan menyebabkan jaringan cepat membusuk.
(b)
Fiksasi. Menggunakan larutan fiksatif selama 2 hari. Fiksasi ini bertujuan untuk mengawetkan semua struktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan kondisi waktu masih hidup.
30
(c)
Siapkan larutan-larutan berikut untuk reagen. Larutan A (Minyak Aniline, ehanol 95%, Aquades) Larutan B (Azocarmine G Cl n.50085, Asam Asetat Glasial, Aquades), Larutan C (ethanol 95%, Asam Asetat Glasial, Asam Phospomolybdic), Larutan D Trikrom Mallory (Aniline blue Cl n. 42755, Orange G Cl n. 16230, Aquades, Asam Asetat Glasial)
(d)
Sediakan larutan utama yang terdiri dari Larutan A (ethanol 95% 100 ml, Minyak Aniline 0,1 ml), Larutan B (Azocarmine G 0,1 mg, Aquades 100 ml, Asam Asetat Glasial 1 ml), Larutan C (ethanol 95% 100 ml, Asam Asetat Glasial 1 ml), Larutan D ( Aniline blue 0,5 mg, Orange G 2 mg, Aquades 100 ml, Asam Asetat Glasial 5-7 ml ).
(e)
Larutan Preparat Larutan A : Siapkan larutan aniline oil 0,1% dalam ethanol 95% Larutan B : Larutkan azocarmine G dengan aquades, didihkan. Kemudian tambahkan asam asetat glasial, dinginkan dan saring. Masukkan ke dalam oven suhu 50 C selama 24 jam. Sebelum digunakan tambahkan 1 ml asam asetat glasial dan di oven selama 1 jam. Larutan D : Larutkan aniline blue dan orange G dalam aquades, didihkan. Kemudian tambahkan asam asetat glasial, didihkan sebentar. Dinginkan, lalu saring. Sebelum digunakan encerkan terlebih dahulu dengan aquades dengan perbandingan 1:3
(f)
Metode Pewarnaan Hilangkan lilin lalu bilas dengan air dan masukkan ke dalam larutan A selama
1-2 menit, lalu bilas dengan ethanol 95% kemudian bilas aquades. Letakkan dalam larutan B (azocarmine) suhu 50 C selama 1 jam, dinginkan lalu bilas dengan aquades. Bedakan dengan larutan A (aniline) selama 10 menit. Letakkan potongan
31
dalam larutan C (alkohol asetat) selama 1 menit. Kemudian letakkan potongan dalam larutan asam phosphomolybdic** selama 1-3 jam. Kemudian bilas dengan aquades. Letakkan potongan dalam larutan D (Mallory’s) selama 1-3 jam, bilas dengan aquades. Bedakan dengan ethanol 95% lalu keringkan dengan ethanol murni selama 2-4 menit, dengan xylene atau pengganti selama 5-15 menit, lalu ikat dengan eukitt. Hasil yang didapat adalah sebagai berikut kromatin, eritrosit dan butiran sitoplasma acidhophilic dari sel kelenjar hipofisis berwarna merah, neurofibril berwarna merah muda, otot dan eritrosit berwarna jingga, butiran, serat reticular, butiran basofilik sel kelenjar hipofisis, butiran juxtaglomerular dan stroma ginjal berwarna biru, serat kolagen berwarna biru cerah, serat reticular berwarna , kebiruan dan inti berwarna merah. 3.2.4 Peubah Yang Diamati Peubah yang diukur dalam penelitian ini adalah jumlah sel-sel ileum itik Cihateup yang mengalami nekrosis dan apoptosis menggunakan Metode MalloryAsam. 3.2.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Statistika Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 macam perlakan, setiap perlakuan diulang sebanyak 6 kali dengan masing-masing unit percobaan 4 ekor. Pengujian pengaruh perlakuan digunakan analisis ragam (Uji F) dilanjutkan dengan Uji Duncan.
32
Perlakuan terdiri dari : P0 : tanpa perlakuan P1 : Konsentrasi minyak buah makasar 100 𝜇l P2 : Konsentrasi minyak buah makasar 150 𝜇l P3 : Konsentrasi minyak buah makasar 200 𝜇l Hipotesis yang akan diuji adalah : H0 : P0 = P1 = P2 = P3 = 0 artinya tidak terdapat perbedaan antar perlakuan. H1 : P0 ≠ P1 ≠ P2 ≠ P3 ≠ 0 atau paling sedikit ada sepasang perlakuan yang tidak sama. Kaidah keputusan : Jika Fhitung ≤ Ftabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H0 dan tolak H1. Jika Fhitung > Ftabel 0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H0 dan terima H1. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode ortogonal polinomial. Suatu derajat polynomial ke-n digunakan untuk mengetahui hubungan antara peubah respon Y dan peubah predictor X diujikan sebagai berikut : Y = α + β1X + β2X2 + …. + βnXn Perhitungan untuk mendapatkan koefisien orthogonal polynomial untuk derajat polynomial pertama (linier), derajat polynomial kedua (kuadratik) dan derajat polynomial ketiga (kubik), sebagai berikut : L = a + X1 Q1 = b + cX1 + Xi2 C1 = d + eX1 + f X12 + X13
33
Tabel 4. Analisis Ragam Sesuai dengan Perbandingan orthogonal polynomial Sumber Keragaman
Derajat Bebas (db)
Jumlah Kuadrat Kuadrat Tengah (JK) (KT)
Statistik Uji F
t–1
JKP
KTP
F
Linier
1
JKP1
KTP1
F1
Kuadratik
1
JKP2
KTP2
F2
Kubik
1
JKP3
KTP3
F3
Kuartik
1
JKP4
KTP4
F4
Galat Percobaan
Sisa
JKG
KTG
Total
n-1
JKT
Perlakuan
Pengambilan keputusan dapat dilihat dari hasil pembandingan nilai statistik uji F yang telah dihitung dengan nilai kritis. Penentuan derajat polinomial didasarkan pada kontras-kontras ortogonal yang nyata, sehingga akan didapatkan hubungan fungsi respon antar perlakuan sesuai dengan derajat polinomial yang signifikan.
