HUNGALIMENTARIA KONFERENCIA BUDAPEST,

ÉLELMISZERFELDOLGOZÓ KÖRNYEZETÉBŐL IZOLÁLT BAKTÉRIUMOK ANTAGONISTA HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA YERSINIA ENTEROCOLITICA ELLEN DEÁK BERNADETT, BELÁK ÁGNES, SOMOGYI GABRIELLA HUNGALIMENTARIA KONFERENCIA BUDAPEST, 2017.04.27.

Biokontroll és élelmiszerbiztonság • Biztonságos, kémiai tartósító szerektől mentes élelmiszer előállítása • Érzékszervi tulajdonságok ne változzanak • Friss jellegű termékek, kényelmi termékek (RTE)

• Biokontroll: • Élő szervezetek alkalmazása más szervezetek gátlására • Alkalmazása kártevő állatok, gyomnövények, patogén mikroorganizmusok ellen

• Az élelmiszerben és annak feldolgozó környezetében található mikrobák között előfordulhatnak olyanok is, amelyek valamilyen módon képesek visszaszorítani az esetlegesen jelen levő patogének szaporodását

2

2017. 04.27.

Deák Bernadett, Hungalimentaria 2017

Yersinia enterocolitica • Bélbaktériumok (Enterobacteriaceae) családja, Yersinia (korábban Pasturella) nemzetsége • Humánpatogén faj • Jellemzői:

• Gram-negatív, aerob vagy fakultatív anaerob • Peritrich csillói vannak 22-25°C-on (szobahőmérsékleten) mozgásképes, de 37°C-on csillótlan • Pszichrotróf, hőm. opt.: 28-29 °C (-2 -+42 °C), a fagyasztva tárolást is hosszú ideig túléli, ismételt fagyasztást és felengedtetést is • pH opt.: 7-8 (min. pH: 4,2) • 7% NaCl gátolja • Hőtűrése nem kiemelkedő (D60=0,4-0,5perc tejben; z=4,5°C)

• Előfordulása: • • • •

Számos emlős (kutya, macska, patkány) béltraktusában Gyakori szabad vizekben Kecsketejben (általában pasztőrözés nélkül használják fel) Borjú, sertés, bárány, baromfi, tejtermékek, fagylalt

• Az összes előfordulás 65-90%-a élelmiszer eredetű. A betegség be- és kijelentésre kötelezett 3

2017. 04.27.


Célkitűzések

4

2017. 04.27.


Élelmiszerből baktériumok izolálása

Morfológia szerinti csoportosítás

Izolátumok gátlóhatásának keresése Yersinia enterocolitica ellen

Kontakt inhibíció vizsgálata

Gátló hatású baktériumok jellemzése

KOH, OF, spórafestés (GP)

Izolátumok azonosítása

16S rDNS

Sejtmentes felülúszó gátlóhatás vizsgálata

10x Koncentrált felülúszó gátlóhatás vizsgálata

Együttenyésztési vizsgálat

TSB és tej

Proteáz aktivitás

Módszerek • Izolálás élelmiszerrel érintkező élelmiszerből • • • •

felületekről és

Vágóhíd Zöldség feldolgozó üzem Tojásüzem Tejüzem

• Mintavételhez használt táptalaj: TSA vagy TSB • TSA és WL agaron megfigyelt morfológia szerinti csoportosítás

5

2017. 04.27.


Módszerek





• Yersinia enterocolitica (98001)-val masszívan leoltott TSA lemezekre 6) Gátló(~10 hatású tesztmikroba felcseppentése KOH, OF, • Inkubálás nyolc 42°C

baktériumok jellemzése hőmérsékleten : 5 °C,

spórafestés (GP) 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 37°C,

• Leolvasás: egy kettő háromIzolátumok és hat nap után azonosítása

16S rDNS

• Feltisztulási zóna keresése (részleges vagy teljes gátlás)

6

2017. 04.27.





TSB és tej


Módszerek • KOH teszt Gram


Izolátumok Kontakt gátlóhatásának inhibíció pozitív éskeresése GramYersinia negatív baktériumok vizsgálata enterocolitica ellen

elkülönítésére

• Oxidatív-fermentatív teszt (glükóz) • Spórafestés • Proteáz aktivitás • • • • •

7

2017. 04.27.

Gátló hatású baktériumok jellemzése

Tejporos TGE agaron Sejtszuszpenzió felcseppentése Izolátumok Inkubálás: 20°C, 25°C, 30°C azonosítása Leolvasás 24, 48 és 120 órát követően Feltisztulás megfigyelése



16S rDNS




TSB és tej

Proteáz aktivitás


Módszerek • Első lépésben

Izolátumok gátlóhatásának keresése Yersinia miniatürizált identifikációs enterocolitica ellen


Kontakt inhibíció tesztekkel vizsgálata

• API, BBL Crystal

• Azonosítás szekvenálássalGátló hatású • 16S rDNS alapján • R1492 primer • NetBlast, EzTaxon

8

2017. 04.27.


baktériumok jellemzése


Izolátumok azonosítása

16S rDNS




TSB és tej

Módszerek • Tesztmikróba TSB-ben





• Inkubálás egy három és hat napig 25°C-on

• Sejtmentes felülúszó készítése Gátló hatású • Centrifugálás (14000rpm, 4°C),baktériumok szűrés jellemzése


• Yersinia szaporodásának megfigyelése a felülúszó jelenlétében • Multiscan ascent , 595nm-en szaporodás detektálása

• Felülúszó

Izolátumok bekoncentrálása azonosítása liofilizálással

16S rDNS

• Koncentrált felülúszó gátló hatásának megfigyelése

9

2017. 04.27.





TSB és tej



Módszerek •

Izolátumok Kontakt gátlóhatásának inhibíció keresése Yersinia Egy, a kontakt inhibíciós vizsgálat során jelentős gátlási zónával rendelkező vizsgálata enterocolitica ellen

izolátum kiválasztása

CSE-T-4

• A gátló mikróba és a Y. enterocolitica Gátló hatású beoltása TSB-be és UHT-tejbe KOH, OF, • A beoltott koncentráció 1:1 és baktériumok 1:10 arányú (~101 patogén mind spórafestés (GP) a két esetben) jellemzése

• Inkubálás 4°C-on és 25°C-on

• Kioltás TSA és Mossel agar Izolátumok lemezekre egy, kettő, három és hat nap után azonosítása • TSA: mind a két baktérium szaporodik • Mossel: Yersinia nem szaporodik

10

2017. 04.27.


16S rDNS




TSB és tej

Eredmények • Összesen 78 izolátum került begyűjtésre négy helyről • Morfológia alapján csoportosítva 68 féle izolátummal végeztünk további vizsgálatokat

11

2017. 04.27.


Eredmények • Az izolátumok közül 14 volt képes a Yersinia enterocolitica részleges vagy teljes gátlására kontakt inhibíciót figyelve

Forrás Zöldség

Hús

• A legjobb gátlóhatás • 15°C-30°C között • első és második napon

Tojás

Tej

12

2017. 04.27.


Kód C2Z CP-P-5 CP-P-8 CSE-B-2 CE-B-1 CE-PT-1 CSE-T-1 CSE-T-3 CSE-T-4 CE-E-1 CM-CT-2 CM-SMT-1 CSM-RMT-1 CSM-RMTII-1

Eredmények Forrás Zöldség Hús

Tojás

Tej

13

2017. 04.27.

Kód OF (glükóz) C2Z O CP-P-5 F CP-P-8 O CSE-B-2 CE-B-1 CE-PT-1 CSE-T-1 O/F CSE-T-3 CSE-T-4 CE-E-1 CM-CT-2 CM-SMT-1 CSM-RMT-1 O/F CSM-RMTII-1 O/F


KOH + + + + + + + + -

Spóra + + + -

Eredmények Forrás Zöldség Hús

Tojás

Tej

14

2017. 04.27.

Kód

API/BBL C2Z Enterococcus avium Pseudomonas putida CP-P-5 Sphingomonas paucimobilis CP-P-8 Acinetobacter baumanii/ calcoaceticus CSE-B-2 Corynebacterium renale CE-B-1 Staph. kloosii CE-PT-1 Lactococcus lactis ssp. cremoris CSE-T-1 Staph. haemolyticus CSE-T-3 Helcococcus kunzii CSE-T-4 Satph. haemolyticus CE-E-1 Ps. Fluorescens CM-CT-2 CM-SMT-1 Streptococcus intermedius CSM-RMT-1 Burkholderia cepacia CSM-RMTII-1 Aeromonas hydrophilia/caviae


szekvenálás Bacillus weihenstephanensis (99.91%) Pseudomonas lundensis (99.9%) Paenibacillus pabuli (99.9%) Pseudomonas rhizosphaerae (99.05%) Macrococcus caseolyticus (99.8%) Rothia endophytica (100%) Staphylococcus vitulinus (100%) Macrococcus caseolyticus (99.8%) Bacillus pumilus (100%) Macrococcus caseolyticus (99.79%) Pseudomonas azotoformans (99.52%) Staphylococcus sciuri subsp. sciuri (100%) Serratia marcescens subsp. marcescens (99.5%) Serratia marcescens subsp. marcescens (100%)

Eredmények

Yersinia _lio_1.nap 0,6

0,5 Yersinia kontroll CE-EJ-2 day1

Absorbance595nm

0,4

CE-EJ-2 day3 CP-P-5 day1 CP-P-5 day3

0,3

CSM-RMT-1 day1 CSM-RMT-1 day3

0,2

CSM-RMT-1 day6 CM-CT-2 day1

0,1

CM-CT-2 day3 CM-CT-2 day6

0 -0,5

4,5

9,5

14,5 Idő (óra)

15

2017. 04.27.


19,5

24,5

Koncentrált felülúszók

Eredmények

Tejben jelenlévő természetes antimikrobás anyagok 16

2017. 04.27.


Összefoglalás • Élelmiszerfeldolgozó környezetéből sikerült potenciálisan antagonista baktériumok izolálása (Y. enterocolitica 98001 ellen vizsgálva) • Kontakt inhibíció esetén a gátlóhatás hőmérsékleti optimuma 15°C -30°C • Sejtmentes felülúszó gátlóhatása koncentrált (10x-es töménységű) esetben kedvező

• Szükséges a molekuláris azonosítás a fajok pontos meghatározásához környezeti izolátumok esetében • A gátló komponensek • Feltehetően elsődleges metabolitok (a gátlóhatás 24 óra után megjelenik és akkor a legjelentősebb) • Koncentráltan tudnak kedvezőbb hatást kifejteni (folyadék tenyészetben minimális hatás)

17

2017. 04.27.


Köszönöm a megtisztelő figyelmet!

HUNGALIMENTARIA KONFERENCIA BUDAPEST,

Recommend Documents