Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP

Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP 2011.02.15.

Emlékeztető: fluoreszcencia spektrumok

Definíció!

a. Emissziós spektrum b. Gerjesztési spektrum (ld. abszorpciós sp.)

Stokes-féle eltolódási törvény Az emissziós spektrum maximuma eltolódik a nagyobb hullámhosszak irányába (energiaveszteség!).

Térjünk vissza a foszforeszcenciára • A foto-lumineszcencia egy típusa. – Időtartam (élettartam): ~10-3 – 10-1s (~ms - s) – Triplett - szingulett átmenettel jár – Spinátfordulás – tiltott átmenet!

Jablonski diagram; hol lesz az emissziós spektruma? Gerjesztett-állapot

Vibrációs relaxáció (10-12s)

S1 S1  T1: rendszerek közötti átmenet (10-10 – 10-8 s)

T1 gerjesztés (10-15s) S0 – S1 h S0 Alap-állapot

T1  S0 (10-3 – 10-1s )

5 4 3 2 1 0

vibrációs szintek

Foszforeszcencia

Fluoreszcens folyamatok időtartama átmenet

elnevezés

sebességi állandó jele

időtartam (s)

S(0)  S(1) (Sn)

gerjesztés

-

10-15

S(n)  S(1)

belső átalakulás

k(ic)

10-14 - 10-10

S(1)  S(1)

vibrációs relaxáció

k(vibr.)

10-12 - 10-10

S(1)  S(0)

fluoreszcencia

k(f)

10-9 - 10-7

S(1)  T(1)

rendszerek közötti átmenet

k(intersys.crossing)

10-10 - 10-8

S(1)  S(0)

sugárzásmentes átmenet

k(q)

10-7 - 10-5

T(1)  S(0)

foszforeszcencia

k(p)

10-3 - 1

T(1)  S(0)

sugárzásmentes átmenet

k(qp)

10-3 - 1

Hogyan mérünk fluoreszcenciát? (‘steady-state’ eset) hullámh. fényforrás

választás

minta

hullámh.

választás

detektor

Nem lineáris elrendezés !!!

SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA F

M

S

90o

M

D

Nem lineáris elrendezés !!!

A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei

- jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluoreszcencia érzékeny a környezetre

A fluoreszcencia alapvető paraméterei • • • • •

Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció

Kvantumhatásfok (Q) • Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra.

emittált fotonok száma Q abszorbeált fotonok száma



Fluoreszcencia élettartam () A gerjesztett állapot élettartama: Időtartam, mely alatt a gerjesztett molekulák száma e-ad részére csökken. 1.2

1

F0

F  F0 e

0.8

0.6

F0

0.4

e

0.2

( k t  k nr ) t

 F0 e



t



0 0

1



2

3

4

5

t

6

7

8

9

10

Fluoreszcencia élettartam mérése • „frekvencia-függő” mérés („frequency domain measurement”) • „idő-függő” mérés („time domain measurement”)



Polarizált fény, polarizáció Megjelenés fotózáskor!

Miért van ilyen hatása?

Elektromágneses hullámok

Polarizáció fogalma • Az elektromágneses sugárzás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatározott görbe mentén mozog (térbeli irányultság!). • Ha a görbe egyenes: lineáris v. sík polarizáció • Ha a görbe kör: cirkuláris polarizáció

• (Ha a görbe elipszis: elliptikus polarizáció)

• A polarizálatlan fényben a polarizációs síkok keverednek.

• A polarizált fényben a polarizációs síkok összhangban vannak (azonosak).

A polarizált fény

Síkban polarizált fény

A polarizátor • Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen.

Polarizátor működésének elve

Hol találkoztunk már polarizátorral?

Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Optikai aktivitás: poláros fény síkját elforgatják t       lc

Fényforrás

Polarizátor Mintatartó

Analizátor Megfigyelő

• királis molekulák • nem kell gerjeszteni!

Polariméter

Polarizáció, intenzitások Intenzitás egy adott irányban:

 polarizátor

   max cos  2

Párhuzamos állás: Θ = 0°, I = Imax Merőleges állás: Θ = 90°, I = 0

Az abszorpciós vektor fogalma z

MA = abszorpciós vektor

A

E y

gerjesztés

x

abszorpciós vektor: megszabja a foton abszorpciójának valószínűségét.

Fotoszelekció Nincs abszorpció (= 90o)

Maximális abszorpció (= 0o)

A

Abszorpció ~ cos2A (max=1)

A fotoszelekció eredménye

 E

Mi történik a fotoszelekciót követően?

 E

Mozgás: - transzláció; - rotáció.

Minderre  idő van!

Hogyan jellemezhető ez a rotációs mozgás?

Az emissziós vektor ME = emissziós vektor

z IZ  E gerjesztés

E

IX

IY

y

Detektor

x

emissziós vektor: megszabja a foton emissziójának valószínűségét.

Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a z komponens!

z IZ  E IX x

IY

y

IZ vs. Isum = IZ + IX + IY

(A teljes intenzitáshoz tudjuk viszonyítani.)

SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA

F

M

S

P

90o Vagy vertikálisan, vagy horizontálisan helyezzük el a polarizátorokat: IVV

IVH

IHV

IHH

P M

D

Polarizátorokat alkalmazunk !!!

Így a teljes intenzitás: Isum = IZ + IX + IY

z

Isum = IVV + IVH + IVH

IZ  E IX x

IY

y

Isum = IVV + 2IVH

Fluoreszcencia polarizáció

Fluoreszcencia polarizáció p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) • dimenzió nélküli • nem függ a fluorofór koncentrációjától • a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja • nem additív !!! • értéke 0-tól 1-ig változhat (ld. következő dia).

G = IHV / IHH

p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) Ha  = 0 lenne: IVV max., IVH = 0, tehát p = 1.

Ha  nagyon hosszú lenne: IVV = IVH , tehát p = 0.

De nem additív !!!

Emissziós anizotrópia

Emissziós anizotrópia r = (IVV - GIVH) / (IVV + 2GIVH) • dimenzió nélküli

G = IHV / IHH

• nem függ a fluorofór koncentrációjától • a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja • additív !!! Emlékezzünk!

Isum = IZ + IX + IY Isum = IVV + IVH + IVH Isum = IVV + 2IVH

Az anizotrópia jelentése és alkalmazásai

Mint láttuk, rotációs mozgást ír le!

z

z

Polarizált fény

τ

IZ  E IX

IY

y

IZ  E IX

IY

y

x

x

Részben polarizált fény

Rotációs diffúzió

Az anizotrópia időfüggése I(t) = I0 exp-t/ r

r (t )  r0  ai exp( t /  ) t Mire emlékeztet az időfüggés?

Alkalmazások Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata • Fehérje denaturáció nyomonkövetése • Protein-ligand kölcsönhatás vizsgálata • Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (pH, ionok) változásának függvényében Dinamikus tulajdonságok vizsgálata • Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról •Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról

Példa alkalmazásra

Az aktin de novo polimerizációja Actin filament

Actin monomer

Depolymerisation

Dimer Elongation Trimer Nucleation T. D. Pollard: Cell, 112, 453-465, 2003.

A forminok domén szerkezete

GBD

FH3

FH1

FH2

DAD

Mammalian Diaphanous-related formins

Formin homology (FH) domains: FH1, FH2, FH3 Rho-GTPase binding domain (GBD): Diaphanous Autoregulatory domén (DAD):

Autoregulation

Kutatási kérdés

Hogyan változik meg az aktin filamentumok szerkezete a forminok kötődésének hatására?

Alkalmazott módszerek

Fehérjék (formin, miozin, aktin, tropomiozin) preparálása. Mérések fluoreszcencia anizotrópia lecsengés módszerével.

A mérések alapelve

twisting

bending

monomer rotation

segmental motion

Az anizotrópia időfüggésének mérése

shorter rotational correlation time (ns)

600

400

5

A

4 3 2 1 0

0 1 2 3 4 5 [mDia1-FH2] (M)

200

3,0 o

T = 30 C

0 0

1

2

3

[mDia1-FH2] (M)

4

5

flexibility (arb. units)

longer rotational correlation time (ns)

800

2,5

2,0

1,5

1,0 0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

[mDia1-FH2+linker] : [actin]

A forminok megnövelték az aktin filamentumok flexibilitását.

Hogyan értelmezhetjük az eredményeket?

Side - binding

3,0 o

flexibility (arb. units)

T = 30 C 2,5

2,0

1,5

1,0

End - binding

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

[mDia1-FH2+linker] : [actin]

1,0

További fogalmak, összefüggések

Határérték anizotrópia (r0) A teljes mozdulatlan, „fagyott” fluorofór anizotrópiája.

2  3 cos 2   1   r0     5 2 

z

Abszorpciós vektor



Emissziós vektor

: az abszorpciós és emissziós vektor által bezárt szög.

y 

r0

0

0.4

45

0.1

54.7

0

90

-0.2

x

Mitől függ az anizotrópia értéke? - A rotációs mozgás gyorsaságától; rotációs diffúzió; - A rendelkezésre álló időtől; fluoreszcencia élettartam!

Francis Perrin - 1926 ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ  flureszcencia depolarizáció

határérték anizotrópia

Perrin egyenlet:

r

r0 1





r0 1  6 D

diffúziós állandó

 Rotációs korrelációs idő



V RT

Perrin egyenlet

r

r0 1

 



r0 1  6 D

r~ • r0 • 1/ •  • 1/D

FRAP

FRAP („Fluorescence Recovery After Photobleaching”)

• cél: membrán-fehérjék laterális diffúziójának (DL) vizsgálata • • Fehérjék szelektív jelölése fluorofórral • • Fényforrás: lézer • • Mikroszkóp a fluoreszcencia detektálására • • „Photobleaching” = fotohalványodás (kifehéredés)

A „Photobleaching” fogalma fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója gerjesztő fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát elkerülése: • anti-photobleaching oldat (pl. glükóz oxidáz – kataláz – merkaptoetanol) • expoziciós idő csökkentése • pulzusszerű gerjesztés • alacsonyabb intenzitású gerjesztő fény • ellenállóbb fluorofor (pl. Alexa)

használata: • háttér eliminálása • autoquenching

• FLIP, FRAP

www.microscopyu.com

Módszer

1. Fluoreszcens minta 2. Meghatározott terület „kiégetése” (pl. lézerrel)

4. Egyensúly beállta (általában: y < x)

Photobleach

Relativ fluoreszcencia (%)

3. Fluoreszcencia helyreállás

Lippincott-Schwartz, 2003

I0

I0 2

x

y

0 t1/2

Idő

Alkalmazás

• Membránkomponensek laterális diffúziója • Monomer turnover / beépülés

• Fehérje motilitás • Diffúziós konstans meghatározás

D



2

4t1/2

Összefoglalás

A polarizátorok típusai • Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen.

• Típusai: – Prizmás (Nicol; Glan-Thomson; GlanTaylor) – Film-polarizátor (kinyújtott polimer háló – nagy tűrőképesség – lézerekben gyakran előfordul)

A polarizátorok működése

Snellius –Descart törvény

n1

1

sin 1 sin  2



n2 n1



c1

n2 2

c2

Refrakció és teljes visszaverődés levegő

v2

β

n2 n1

α v 1

Snellius-Descartes törvény

sin  v1   n21 sin  v2

víz

levegő

v2

n2 αh

v1

n1 víz

Teljes visszaverődés

sin  h  n21

Teljes visszaverődés sin 1



sin  2 sin 1 sin 90

n1 



sin 1

n2

n2 n1



1

 1  arc sin

n2 2

n1

n2

n2 n1

1  arc sin

1.55 1.658

1  69.2 

n1

1

1  arc sin

1.55 1.486

1 !?!

1. komponens 68°

22°

CaCO3 76.94° 90°

13.06°

90°

22°

90°

sin  2 

sin  1 n1 n2

nlevegő=1.00028 nNicol1=1.658 nNicol2=1.486 nKanada-balzsam=1.555

2. komponens 68°

22°

CaCO3 75.4° 90°

14.6°

90°

22.37° 67.63°

67.63° 75.4°

22°

90°

sin  2 

sin  1 n1 n2

nlevegő=1.00028 nNicol1=1.658 nNicol2=1.486 nKanada-balzsam=1.555

Nicol-prizma Kettős törés!! Határszög!!

ordinárius sugár

68°

extra ordinárius sugár

CaCO3

CaCO3

Kanada-balzsam William Nicol (1768 – 1851) Skót fizikus, geológus, a Nicol prizma megalkotója (1828).

Glan-Thomson prizma


ordinárius sugár

kötőanyag

Glan-Taylor prizma


ordinárius sugár

levegő

Összefoglalás

-Polarizált fény; -Fotoszelekció;

-Fluoreszcencia polarizáció és anizotrópia; -FRAP Segédanyagok: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/index.html http://chemistry.rutgers.edu http://calvino.polito.it

http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence

A mérőrendszer további komponensei

Fényforrások: lámpák, lézerek

Optikai szűrők Felüláteresztő szűrők

Aluláteresztő szűrők

Optikai szűrők

Sáv szűrők

Monokromátorok,

polarizátorok, küvetták, detektorok

A reakció sémája

A fluoreszcencia koncentráció-függése Lineáris függést várnánk, de…! A belső-szűrő hatás (inner-filter effect) jelentkezik.

Fluoreszcens festékek: natív vagy intrinsic fluorofórok (definíció)

Triptofán, tirozin, fenilalanin

Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.

Fluoreszcens festékek: külső vagy extrinsic fluorofórok - e.g., denzil, fluoreszcein, rodamin, kumarin, lantanidak

A fehérjék fluoreszcens jelölése - a jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - a fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk.

- így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.

Teljes visszaverődés

Mila Zinkova:

Minta (víz) Tárgylemez (üveg) Teljes belső visszaverődés mikroszkópia (TIRF)

Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP

Recommend Documents