Biomolekuláris szerkezet és dinamika vizsgálata Fluoreszcencia, egymolekula biofizika, rádióspektroszkópiák (EPR, NMR, MRI)
1 nm John Dalton (1766-1844)
Oxigén atomok rhodium egykristály felületén Cary and Michael Huang (http://htwins.net)
Fluoreszcencia és különleges alkalmazásai
Fénykibocsátás: E=hf
Egy molekula energiáját mozgásállapota is befolyásolja
Vibráció
Fluoreszcencia genetikailag módosított fajban:
Sugárzásmentes relaxációs folyamatok
Gerjesztés (energia elnyelés)
GFP: ~27 kDa, 238 aa;11-szálú β-hordó; kromofór a központi hélix Ser65-Tyr66Gly67 oldalláncaiból
Belső konverzió (hő) kic Rendszerek közötti átmenet S→T
Fénysugárzással járó relaxáció: fluoreszcencia
Alapállapot
Növekvő energiájú pályák
Energiaátmenetek molekulában Gerjesztett energiaállapotok
Energiaátmenetek atomban
Gerjesztés során elnyelt energia sorsa
kisc
ENERGIA
kf Fluoreszcencia (ns) Foszforeszcencia (ms)
kQ
Fluoreszcencia kioltás (“quenching”)
kFRET Förster Rezonancia Energia Transzfer (FRET)
Vibrációs energiaszint Elektron energiaszint
Sugárzásos és nem sugárzásos átmenetek! “Zöld egér”
• A gerjesztett állapotban lévő molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. • Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET): ha az energiatranszfer szereplői fluorofórok. hν -
hν
D
Theodor Förster (1910-1974)
hν +
E ~ kFRET ~ 1/R6
+
A -
A gerjesztett donor (D) relaxációjához hozzájárul az akceptor (A) molekula emissziója!
A FRET feltételei • Fluoreszcens donor (D) és akceptor (A) molekula. • A donor és akceptor molekula közötti távolság (R) 2-10 nm! • Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között.
R06 E= 6 R0 + R 6 R0: Förster-távolság (Az a távolság melyen a FRET hatásfok felére csökken: transzferhatásfok 0.5) R: A fluorofórok (D-A) közötti aktuális távolság
Fl intenzitás ill. OD
Förster Rezonancia Energia Transzfer (FRET)
Spektrális átfedés (átfedési integrál)
Hullámhossz (nm)
R
A FRET alkalmazása
Érzékenyített fluoresczencia video mikroszkópia Izom
• Molekuláris mérőszalag: távolságmérés a nm-es (10-9m) tartományban. • Nagyon érzékeny (lásd hatvány összefüggés)! • Alkalmazás: – Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása. – Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.
Izomrost Miofibrillum
In vitro motilitási próba
Szarkomer
FRET mikroszkópia Donor emisszió
Akceptor emisszió 50 μm
Rodamin-jelölt aktin filamentumok motilitása érzékenyített epifluoreszcencia videomikroszkópia
Transzfer hatásfok Vastag filamentum Szubsztrát
Egyedi fluoreszcens molekulák feloldása: Szuperfelbontású mikroszkópia
Multifoton fluoreszcencia mikroszkópia •Két (vagy több) foton energiája összeadódik a gerjesztéskor •Gerjesztés (következésképp emisszió) csak a fókuszpontban (limitált fotokárosítás) •Gerjesztés nagy (közeli IR) hullámhosszú, rövid (fs) fényimpulzusokkal •Nagy hullámhossz miatt mély optikai behatolás (akár 2 mm)
Kémiai Nobel-díj, 2014 A feloldási problémát pozíciómeghatározási problémává alakítjuk Pozíciómeghatározási probléma
Feloldási probléma (Abbé-elv)
“Sztochasztikus” adatgyűjtés egyedi fluorofórokról
(pontosság a fotonszámtól függ)
d
d=
λ=800 nm
Fényemisszió
Foton
Gerjesztés
Fényemisszió
Gerjesztés
λ=400 nm
0.61λ n sinα
x2
STORM (“stochastic optical reconstruction microscopy”); PALM (“photoactivated localization microscopy”)
Foton
ALAPÁLLAPOT
Mikrotubulusok
Egyfoton fluoreszcencia
Bekapcsolt fluorofórok 1
Feloldás: λ ! != "##$ %α "
Bekapcsolt fluorofórok 2
Kétfoton fluoreszcencia
N: fotonszám Agykérgi piramissejtek
Zöld: proximális vesetubulusok; Vörös: albumin (plazma) Adatgyűjtési folyamat
Egymolekula biofizika 1. Egyének (tér- időbeli trajektóriák) azonosíthatók sokaságban
2. Sztochasztikus eseményeket fedezetünk fel
Bekapcsolt fluorofórok 3
Bekapcsolt fluorofórok 4
Mikrotubuláris rendszer
Pozíciókból számított kép
Egyedi molekulák manipulálása Lézernyaláb kitérés
Intenzitás (a.u.)
Atomi erőmikroszkóp (AFM)
Üveg mikropipetta
Sokaság - mikrotubuláris Egyedi mikrotubulusok rendszer - treadmilling
3. Párhuzamos útvonalon haladó folyamatokat ismerhetünk meg
Sokaság intenzitás
Idő (s) Egyedi kvantumpont - pislogás
Rugólapka módszerek
Mikrofabrikált laprugó
talapzat
4. Biomolekulák mechanikáját jellemezhetjük von Willebrand faktor
Rugólapka lehajlás
Kinezin
Kigombolyodott állapot Foton mező (lézercsipesz)
F1F0 ATPáz
Riboszóma
Mező alapú módszerek
Latex gyöngy
Konformációs tér Mozgatható mikropipetta Natív állapot
Mágneses csipesz Hidrodinamikai mező (Stokes) Paramágneses gyöngy
Mérhető paraméterek I. Erő
Mérhető paraméterek II. Távolság
Mekkora erő fejlődik egy dsDNS molekula nyújtásakor?
Mekkorát lép egy motorfehérje?
Erő (pN)
Szerkezeti túlnyúlás
DNS Latex gyögy
Távolság (nm)
Lézercsipesz
Miozin V molekula
Entalpikus tartomány
mozgatható mikropipetta
Entrópikus tartomány
Miozin V krioelektronmikroszkópiás felvételsorozat
Megnyúlás (µm)
Lézercsipesz (erővisszacsatolt, követi a mozgást)
Idő (s)
Mérhető paraméterek I. Fluoreszcencia
Mérhető paraméterek II. Elfordulási szög
Milyen állapotok között fluktuál egy molekula?
Hogyan működik az ATP szintáz?
Foszfoglicerát kináz (PGK)
Kimogram
Külső tér Mitokondrium belső membrán Belső tér
1 mM ATP
200 nM ATP
20 nM ATP
Diszkrét 120˚ rotációs lépések Idő Körbefordulás
fluoreszkáló állapot Intenzitás (a.u.)
Aktin filamentum
Fotokifehéredés egy lépésben (sokaságban exponenciális függvény!)
kifehéredett állapot
50 μm
Idő (s)
PGK molekulák Alexa488-cal jelölve, TIRF mikroszkópia Idő (s)
Sokaság versus egymolekula viselkedés
“Rádióspektroszkópiák”: forradalmasították a fizikát, kémiát, biológiát és orvostudományt • Elektronspin rezonancia (ESR, elektron paramágneses rezonancia - EPR)
[Enzimszubsztrát komplex]
[Termék]
EPR spektroszkópia
Sokaság:
Idő (s)
[Termék]
lépcsők jelenhetnek meg
[Enzimszubsztrát komplex]
Ferhérje molekuláris dinamika NMR-rel
Nagyfelbontású, anatómiai MRI
Fluktuáció diszkrét állapotok között
Idő (s)
MRI spektroszkópia
MRI angiográfia
Funkcionális MRI (fMRI)
Diffúziós MRI (tractographia)
Musculoskeletalis MRI
Idő (s)
Atomi, molekuláris rendszerek elemi mágnesként viselkedhetnek
Eredő spinnel rendelkező rendszerek: elemi mágnesek • Elemi részecskék (p, n, e) saját spinnel rendelkeznek. • Az elemi részecskék száma és bizonyos rendező elvek (pl. Pauli-elv) miatt a rendszerben eredő spin
Stern-Gerlach kísérlet (1922)
A nyaláb két részre hasad Az eredő mágneses dipólmomentumot az 5s1 elektron adja (pályaperdület=0)
Walther Gerlach (1889-1979)
NMR spektroszkópia
Idő (s)
Egyedi molekula:
Otto Stern (1888-1969)
• Mágneses magrezonancia (NMR, MRI)
Exponenciális lecsengés
Inhomogén mágneses térben nemcsak forgatónyomaték, hanem eredő erő is hat a mágneses dipólra:
léphet fel.
• Atommag: páratlan tömegszám - feles magspin (1H, 13C, 15N, 19F, 31P); páros tömegszám, páratlan rendszám - magspin egész; páros tömegszám és rendszám - magspin zérus.
• Elektron: eredő elektronspin stabil párosítatlan elektront tartalmazó rendszerekben (pl. szabad gyökök). • Töltés és eredő spin miatt mágneses momentum lép fel. A spin mágneses momentum két értéket vehet fel.
Magmágneses momentum: γN = atommag perdület aránya) L = magspin (
Mágneses magrezonancia (“nuclear magnetic resonance”, NMR) Nobel-díj, 1952
giromágneses hányadosa (mágneses momentum
), ahol l=eredő spinkvantumszám.
Elektronspin mágneses momentuma: Isidor Rabi (1898-1988)
Felix Bloch (1905-1983)
Mágneses rezonancia: Mágneses térbe helyezett minta általi, rezonancia-abszorpció jellegű elektromágneses energia elnyelés.
Edward Mills Purcell (1912-1997)
Pörgettyűmodell
és
g = elektron g-faktora (a mágneses momentum és giromágneses hányados kapcsolatát leíró dimenziónélküli arányszám) μβ = Bohr magneton (az elektron mágneses dipólmomentumának egysége) S = spinkvantumszám
Precesszió Mágneses tér hiányában: Klasszikus (“pörgettyű”) modell szerint Precessziós vagy Larmor frekvencia:
elemi mágnesek orientációja random Paramágnesség: külső mágneses tér hatására fellépő mágnesezettség (mágneses dipólok orientációja).
ω 0 = γB0 fLarmor =
Mágneses térben: elemi mágnesek orientálódnak B0
energiaszintek felhasadnak
γ B0 2π
Rezonanciafeltétel:
E
parallel
ΔE
B0
antiparallel
Rezonanciafeltétel: ΔE=hf
Pörgettyű, giroszkóp
B Felix Bloch, 1946
NMR és EPR spektroszkópia
Makroszkópos mágnesezettség különböző energiaszinteken spintöbblet miatt B0 = mágneses tér M = makroszkópos mágnesezettség
B0 •NMR spektrum: elnyelt elektromágneses sugárzás intenzitása frekvencia függvényében.
•“NMR-vonal” görbe alatti területe az abszorbeáló atommagok számával arányos.
M Acetaldehid NMR spektruma
•Elektronfelhő (i.e., annak szerkezete) befolyásolja a
μi
lokális mágneses teret: frekvenciafeltétel elhangolódik (“kémiai eltolódás”). Kémiai szerkezetmeghatározás lehetősége.
•EPR spektrum: elnyelt elektromágneses sugárzás intenzitása a mágneses tér függvényében. •NMR-énél alacsonyabb mágneses tér, de nagyobb elektromágneses sugárzási frekvenciák (mikrohullám). •Spin-jelölés: stabil párosítatlan elektront tartalmazó vegyülettel való jelölés. •Mozgási (rotációs) sebességek mérési lehetősége a 10-4 - 10-2 s időtartományban.
Alacsony energia állapot proton esetében parallel
Spinjelölt citokróm-C ESR spektruma
Magas energia állapot proton esetében antiparallel Mágneses tér (G)
Gerjesztés
Spin-rács relaxáció
rádiófrekvenciás elektromágneses sugárzással
T1 vagy longitudinális relaxáció
Rezonancia feltétel: Larmor frekvencia
Mz
M
t
B1
T1 relaxációs idő: elemi mágnes (proton) és környezete közötti kölcsönhatásra utal
B0 = mágneses tér M = makroszkópos mágnesezettség B1 = besugárzott rádiófrekvenciás elektromágneses tér
Spin-spin relaxáció
MRI:
T2 vagy tranzverzális relaxáció
az emberi test makroszkópos mágnesezettségét hozza létre Nobel-díj (2003)
Mxy
“free induction decay”
(FID)
Raymond V. Damadian (1936-)
Paul C. Lauterbur (1929-)
t
T2 relaxációs idő: elemi mágnesek (protonok) közötti kölcsönhatásra utal
Ábra Damadian szabványügyi bejelentéséből
“indomitable”: “a rettenthetetlen”
Peter Mansfield (1933-)
NMR jel térbeli kódolása: a precessziós
MRI képalkotás I:
frekvencia mágneses térfüggésére épül
Térbeli felbontás
voxel: térfogatelem
Elemi 3D képpontok (voxel) definiálása és címezhetősége: grádiens tér segítségével
Bz
pixel: felületelem, elemi képpont
RF tekercs
Kép
Fourier transzformáció
By Bx
MRI képalkotás II:
MRI összefoglalás
Tranzverzális jelveszteség
színfelbontás (kontraszt) relaxációs idők alapján
„A” szövet
„B” szövet
Rövid T1
Gerjesztő impulzus
Liquor
B0
B0
B0
Zsír
Hosszú T1
Tekercs
Idő (ms)
A proton RF hullámot emittál gerjesztést követően.
B0 Kriogén mágnes
Rádiofrekvenciáns tekercs Grádiens tekercs
Vízmolekula Képanalízis (2D-FFT)
NMR berendezés
T1-súlyozás
protonsűrűségsúlyozás
T2-súlyozás
MRI:
MRI:
képi információ manipulálása I
Non-invazív angiográfia
képszelet
Újraszeletelés merőleges síkban
telített spinek
véráram
telítetlen spinek
Térbeli projekció („volume rendering”)
MRI mozgókép
Funkcionális MRI (fMRI)
Nagy időfelbontású felvételek alapján
Élettani folyamattal szinkron felvett Nagy időfelbontású képsorozat
Aortabillentyű nyílása-záródása
Villogó fény hatása a látókéregre
Szuperponált MRI és PET képsorozat
Cary and Michael Huang (http://htwins.net)
PET aktivitás: szemmozgatás során Térbeli rekonstrukció
