A fény: elektromágneses hullám
Ujfalusi Zoltán
Elektromágneses spektrum
Fluoreszcencia spektroszkópia
Biofizika szeminárium
PTE ÁOK Biofizikai Intézet
2011. február 14-16.
Lumineszcencia: a fényt kibocsátó
rendszer nem a magas hőmérséklet miatt világít!!! Ez az ún. „hideg emisszió” jelensége.
Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük.
A lumineszcencia típusai
1. Kemilumineszcencia 2. Fotolumineszcencia
1. Kemilumineszcencia • olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott kémiai reakció során felszabaduló energiából adódik pl.: foszfor (P) oxidáció útján való világítása • alkalmas anyagcsere folyamatok vizsgálatára • kis intenzitású • fiziológiás viszonyoktól függő
1
Biolumineszcencia: a kemilumineszcencia egyik típusa, amikor a gerjesztő energiát biztosító kémiai reakció élő organizmusban játszódik le. pl.: szentjánosbogár, mélytengeri halak, medúzák, polipok, baktériumok, planktonok
2. Fotolumineszcencia
Energiaszintek
• olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott hullámhosszú (frekvenciájú, energiájú) fény besugárzásából adódik • alkalmas molekuláris rendszerek vizsgálatára, mert jelentős információt hordoz a molekula tulajdonságairól, kölcsönhatásairól, környezetével való kapcsolatáról
Vibrációs szintek Első gerjesztett állapot Elektron
1.
A luciferáz katalizálja a luciferin oxidációját.
2. Inaktív oxyluciferin és fény (h) keletkezik. 3. A további luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik.
Jablonski-féle termséma Energiaszintek (S0, S1...) felhasadnak vibrációs szintekre (atommagok rezgő mozgásából); minden vibrációs szint felhasad rotációs szintekre (atommagok tengely körüli forgásából)
Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek
energia szintek Alapállapot
• két típusa: fluoreszcencia, foszforeszcencia
Kasha-szabály bizonyítéka:
Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik.
Alap és gerjesztett állapot természetétől függően: Fluoreszcencia: a molekula szinglet gerjesztett állapotból relaxálódik a szinglet alapállapotba Foszforeszcencia: a molekula triplet gerjesztett állapotból relaxálódik a szinglet alapállapotba Megkülönböztetésük: - spektrumuk alakja, - gerjesztett állapot időtartama szerint.
Az S1-S0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában:
a. Fluoreszcencia
Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba Lecsengése: nanoszekundumos (10-9 s) nagyságrendű
b. Foszforeszcencia
S1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T1 triplett állapotba kerül ebből sugárzási energia kibocsátásával kerül S0 alapállapotba (tiltott spinátmenet miatt kisebb valószínűséggel) Lecsengése: 10-6-10 s
c. Késleltetett fluoreszcencia
T1 állapotból termikus gerjesztéssel S1 állapotba, majd onnan S0ba („magas hőmérsékletű foszforeszcencia”)
2
A gerjesztési spektrum
A lumineszkáló anyagot jellemzi:
Abszorpciós spektruma, valamint fluoreszcencia, foszforeszcencia gerjesztési és emissziós spektruma Sugárzás kvantumhatásfoka
Az emissziós spektrum
Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk. • Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. • Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik. •
ΔJE / Δ λ (λ) Azt a sugárzási intenzitást jelöli, mely egy adott hullámhossz Δ λ környezetében mérhető. A Δ λ intervallumot a rés szélessége határozza meg.
Gerjesztés
Gerjesztett állapot élettartama Emisszió polarizációfoka (anizotrópiája)
A kisugárzott fény teljesítménysűrűségének hullámhossztól való függését kifejező függvény:
Fluoreszcencia emissziós spektrum
Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok
Sir George Gabriel Stokes, 1st Baronet (1819–1903)
Foszforeszcencia emissziós spektrum
Az első szinglett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjéről az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik. Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszeréről.
Kvantumhatásfok fluoreszcencia során kibocsátott és elnyelt fotonok számának hányadosa.
= Nemitt / Nabsz < 1 - kifejezhető a sebességi állandók hányadosaként is:
• Az első triplett gerjesztett állapotból a szinglett állapotba való átalakuláskor. • Szobahőmérsékleten csak kristályos anyagokon. (oldatban: kioltók pl. O2) • A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltolódott.
= kf / (kf + kössz)
f – fluoreszcencia össz – f + vibr. + rot. (azaz f + non-radiatív)
3
Az az időtartam, amely alatt a gerjesztett állapotban található molekulák száma e-ad részére csökken.
= 1 / (kf + kössz)
Fluoreszcencia élettartam mérése • „idő-függő” mérés („time domain measurement”)
Fluoreszcencia élettartam mérése • „frekvencia-függő” mérés („frequency domain measurement”)
Intenzitás
Fluoreszcencia élettartam
Intenzitás
Modulált gerjesztés (frekvencia ~20 / 80 MHz)
Idő (ns)
Fluoreszcencia élettartam mérése • „frekvencia-függő” mérés („frequency domain measurement”)
Fluoreszcens festékek
Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.
Intenzitás
• külső vagy extrinsic fluorofórok: Denzil, fluoreszcein, rodamin, kumarin, stb.
Emisszió – rövid élettartamé (pl. 1 ns) Emisszió – hosszú élettartamé (pl. 10 ns) Modulált gerjesztés (50 MHz)
Eltelt idő
Extrinsic (külső) fluorofórok
• natív vagy intrinsic fluorofórok: Triptofán, tirozin, fenilalanin
Demoduláció Fáziseltolódás
Eltelt idő
Direkt jelölés festékekkel: IAEDANS IAF FITC Fluoreszcensen jelölt toxinokkal: Falloidin B-skorpiótoxin A-bungarotoxin Makrofágok Aktin jelölve falloidin-Alexa 568-cal (Piros) Magok: DAPI (Kék) Streptococcus aureus (Zöld)
4
A fehérjék fluoreszcens jelölése
Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémiai jelölés)
- A jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - Így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.
Hogyan mérünk fluoreszcenciát?
A mérés alapelvei
(‘steady-state’ eset)
Legfontosabb probléma: a gerjesztő fény és az általa okozott fényforrás
hullámhossz választás
lumineszcencia fény elkülönítése
Monoklonális és poliklonális antitestek Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve
Indirekt jelölés: az elődleges antitest
• •
•
I. Fluoreszcencia mérésénél hullámhossz választás
• •
A gerjesztési és észlelési irányok célszerű megválasztása Három elrendezés
jelöletlen, a másodlagos antitest van megjelölve
II. Foszforeszcencia mérésénél
•
minta
Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert molekula felszínéhez (epitóp)
A gerjesztő fény a foszforeszcencia fénytől időben elkülönüljön Az intenzitás időbeli változása is mérhető legyen Mindig alacsony hőmérsékleten kell mérni Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyővel eltakarjuk , ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény.
Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik függ: • a forgási sebességtől
detektor
• a nyílások számától
Gyakorlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű
5
A foszforoszkóp
A minta •
A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztő fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át
• • • • •
Negyedfordulat után a gerjesztő fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén
Optikai szűrők
• • •
Általában oldat (fehérje, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió) A küvetta anyaga ne fluoreszkáljon! Üvegküvetta (látható tartomány) Speciális üvegküvetta (λ > 300 nm) Műanyag küvetta Speciális kvarcküvetta (fluoreszcencia mérésre) Küvetta tartó berendezések: Temperálható (több féle módon) Több (ált. 4) minta, forgatható
Optikai szűrők
Szelektivitás bizonyos hullámhosszúságú fényre
Ultraibolya (UV) filterek:
Abszorpciós filterek Általában üvegből készülnek. Szerves vagy szervetlen összetevőket tartalmaznak, emiatt bizonyos hullámhosszúságú fénysugarakat átengednek, míg másokat nem. Műanyag (olcsóbb, könnyebb)
Dikroikus tükrök
Az ultraibolya-fényt nem engedik át, de hosszabb hullámhosszúakat igen.
Neutrális szűrők:
Gerjesztő fényforrások
A mesterséges fényforrások által kibocsátott fény lehet:
Folytonos-, (magas hőmérsékletre hevített anyag) Halogéntöltésű izzószálas lámpák. Nagy nyomású gázokkal töltött lámpák. •
Vonalas-, (atomok) Intenzív, monokromatikus fény állítható elő. Alacsony nyomású higanygőzzel töltött gázkisülési cső. •
•
Stb.
Optikai szűrők Longpass-filterek (Felüláteresztő szűrők) Magasabb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Általában éles csúcs jellemzi őket. Fluoreszcens mikroszkópiában a dikroikus tükrök emissziós filterekként használatosak.
Transzmissziójuk széles színképtartományban a hullámhosszúságtól független. A gerjesztő fény intenzitásától függő fotokémiai, fotobiológiai folyamatok tanulmányozhatók.
Shortpass filterek (Aluláteresztő szűrők)
Interferencia szűrők:
Bandpass filterek (Sáv szűrők)
Akkor használjuk, ha a folytonos színképű fényből viszonylag keskeny sávot akarunk kiválasztani. Vonalas színképű gerjesztő fényből meghatározott hullámhosszúságnál fellépő vonalat kell elkülönítenünk. Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ.
Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek. Rövidebb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Dikroikus tükrök excitációs filterek-ként használatosak.
Előző kettő kombinációja. Általában alacsonyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél. A kiválasztott intervallumon kívül teljesen blokkol minden más hullámhosszú fényt.
6
Optikai szűrők
Monokromátorok
Polarizációs filterek (Polarizátorok)
A detektor Fotoelektron-sokszorozó cső (Photomultiplier tube)
A beeső fény polarizációja alapján szűrnek A: Fényforrás B: Rés C: Kollimátor D: Prizma vagy rács E: Tükör F: Excitációs rés G: Minta
Nagyon szenzitív érzékelők az ultraibolyától a közeli infravörös tartományig.
A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei: - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluoreszcencia érzékeny a környezetre
7
