Kiselőadás! Hogyan számolja ki egy foton energiáját és impulzusát?
Milyen függvény szerint csökken a fény intenzitása optikailag homogén közegben?
Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP
Mi az abszorpció definíciója?
Mi a különbség fluoreszcencia és foszforeszcencia között?
Mia különbség a gerjesztési és az abszoprciós spektrum között?
Mi a kvantumhatásfok?
2011.02.14.
Elektromágneses hullámok Polarizált fény, polarizáció
Polarizáció fogalma • Az elektromágneses sugárzás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatározott görbe mentén mozog (térbeli irányultság!).
Polarizáció Lineáris polarizáció: adott pont rezgésének orientációja egy egyenesbe esik Cirkuláris polarizáció: adott pont rezgésének iránya egyenletesen körbejár
• Ha a görbe egyenes: lineáris v. sík polarizáció • Ha a görbe kör: cirkuláris polarizáció
Megjelenés fotózáskor!
• (Ha a görbe elipszis: elliptikus polarizáció)
• A polarizálatlan fényben a polarizációs síkok keverednek.
Miért van ilyen hatása?
• A polarizált fényben a polarizációs síkok összhangban vannak (azonosak).
1
Polarizált fény
Síkban polarizált fény
A polarizátor
Polarizátor elve
• Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen.
I = I max cos 2 Θ
Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Optikai aktivitás: poláros fény sikját elforgatják
α = ⎡⎣α λt ⎤⎦ lc
Fényforrás
Hol találkoztunk már polarizátorral? Polarizátor Mintatartó Analizátor Megfigyelő
• királis molekulák • nem kell gerjeszteni!
Polariméter
2
Polarizáció, intenzitások
Teljes visszaverődés
Intenzitás egy adott irányban:
Ι = Ι max cos 2 Θ Polarizátor
Mila Zinkova:
Párhuzamos állás: Θ = 0°, I = Imax Merőleges állás: Θ = 90°, I = 0
Minta (víz) Tárgylemez (üveg) Teljes belső visszaverődés mikroszkópia (TIRF)
A fény abszorpciója z
Fotoszelekció
MA = abszorpciós vektor
θA
Nincs abszorpció (θ= 90o)
E y gerjesztés
Maximális abszorpció (θ= 0o)
x
Abszorpció ~ cos2θA (max=1)
θA
abszorpciós vektor: megszabja a foton abszorpciójának valószínűségét.
A fotoszelekció eredménye
Fluoreszcencia emisszió ME = emissziós vektor
z
r E
ME ~ Intenzitás
IZ θ E gerjesztés E IZ = IV
IX x
IY
y
Detektor
Isum = IZ + IX + IY
Ix = IH
Isum = IV + IH + IH
IY = IH
Isum = IZ + 2IH
emissziós vektor: megszabja a foton emissziójának valószínűségét.
3
Fluoreszcencia polarizáció Fluoreszcencia polarizáció
p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) G = IHV / IHH
• dimenzió nélküli • nem függ a fluorofór koncentrációjától • a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja • nem additív !!! • értéke 0-tól 1-ig változhat
Emissziós anizotrópia Emissziós anizotrópia
r = (IVV - GIVH) / (IVV + 2GIVH) G = IHV / IHH
• dimenzió nélküli • nem függ a fluorofór koncentrációjától • a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja • additív !!! • értéke 0-tól 1-ig változhat
Fluoreszcencia emisszió Az anizotrópia jelentése és alkalmazásai
z
z
Polarizált fény
τ
IZ θ E IX
IY
y
IZ θ E IX
IY
y
x
x
Részben polarizált fény
Rotációs diffúzió
4
Határérték anizotrópia (r0)
Francis Perrin - 1926
A teljes mozdulatlan, „fagyott” fluorofór anizotrópiája.
2 ⎛ 3 cos 2 β − 1 ⎞ ⎟ r0 = ⎜ ⎜ ⎟ 5⎝ 2 ⎠
ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ ⇒ flureszcencia depolarizáció Abszorpciós vektor
z
β
r=
β: az abszorpciós és emissziós vektor által bezárt szög.
y β
r0
0
0.4
45
0.1
54.7
0
90
-0.2
határérték anizotrópia
Perrin egyenlet:
Emissziós vektor
r0 1+
x
τ
=
r0 1 + 6 Dτ
diffúziós állandó
Θ Rotációs korrelációs idő
Θ=
ηV RT
Perrin egyenlet
r=
r0 1+
τ Θ
=
r0 1 + 6 Dτ
r~ • r0 • 1/τ • Θ • 1/D
Az anizotrópia időfüggése I(t) = I0 exp-t/τ r
r (t ) = r0 ∑ ai exp( −t / θ ) t Mire emlékeztet az időfüggés?
Alkalmazások Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata • Fehérje denaturáció nyomonkövetése • Protein-ligand kölcsönhatás vizsgálata • Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (pH, ionok) változásának függvényében
Példa alkalmazásra
Dinamikus tulajdonságok vizsgálata • Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról •Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról
5
De novo polymerisation of actin
A forminok domé domén szerkezete
Actin filament
Actin monomer
GBD
FH3
Depolymerisation
FH2
DAD
Mammalian Diaphanous-related formins
Formin homology (FH) domains: FH1, FH2, FH3
Dimer
Rho-GTPase binding domain (GBD): Elongation
Nucleation
FH1
Autoregulation
Diaphanous Autoregulatory domén (DAD):
Trimer T. D. Pollard: Cell, 112, 453-465, 2003.
Alkalmazott mó módszerek
Kutatási kérdés
Fehé Fehérjé rjék (formin, miozin miozin,, ak aktin, tropomiozin tropomiozin)) prepar álása. prepará sa.
Hogyan változik meg az aktin filamentumok szerkezete a forminok kötődésének hatására?
Mérések fluoreszcencia anizotró anizotrópia lecsengé lecsengés módszeré dszerével.
A mérések alapelve
Anisotrópia lecsengés mérése
monomer rotation
segmental motion
600 400
5 4
30
A
3 2 1 0
half angle (degree)
bending
shorter rotational correlation time (ns)
twisting
longer rotational correlation time (ns)
800
0 1 2 3 4 5 [mDia1-FH2] (μM)
200 0
0
1
2
3
[mDia1-FH2] (μM)
4
5
25
20
15
C 0
1
2
3
4
5
[mDia1-FH2] (μM)
A forminok megnövelték az aktin filamentumok flexibilitását.
6
Hogyan értelmezhetjük az eredményeket?
FRAP („Fluorescence Recovery After Photobleaching”)
Side - binding
3,0 o
flexibility (arb. units)
T = 30 C 2,5 2,0 1,5 1,0
End - binding
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
• cél: membrán-fehérjék laterális diffúziójának (DL) vizsgálata • • Fehérjék szelektív jelölése fluorofórral • • Fényforrás: lézer • • Mikroszkóp a fluoreszcencia detektálására • • „Photobleaching” = fotohalványodás (kifehéredés)
1,0
[mDia1-FH2+linker] : [actin]
A „Photobleaching” fogalma
Módszer
fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója gerjesztő fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát 1. Fluoreszcens minta elkerülése: • anti-photobleaching oldat (pl. glükóz oxidáz – kataláz – merkaptoetanol)
2. Meghatározott terület „kiégetése” (pl. lézerrel)
• pulzusszerű gerjesztés
3. Fluoreszcencia helyreállás
• alacsonyabb intenzitású gerjesztő fény • ellenállóbb fluorofor (pl. Alexa)
használata:
4. Egyensúly beállta (általában: y < x)
• háttér eliminálása
Lippincott-Schwartz, 2003
Photobleach
Relativ fluoreszcencia (%)
• expoziciós idő csökkentése
I0
I0 2
x
y
• autoquenching • FLIP, FRAP
www.microscopyu.com
Alkalmazás
0 t1/2
Idő
Példák (mozik)
• Membránkomponensek laterális diffúziója • Monomer turnover / beépülés • Fehérje motilitás • Diffúziós konstans meghatározás
D=
ω2 4t1/2
7
A polarizátorok típusai • Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen.
• Típusai: – Prizmás (Nicol; Glan-Thomson; GlanTaylor) – Film-polarizátor (kinyújtott polimer háló – nagy tűrőképesség – lézerekben gyakran előfordul)
A polarizátorok működése
Refrakció és teljes visszaverődés
Snellius –Descart törvény levegő
v2 β
sin Θ1
=
n2
sin Θ 2
n1
=
c1
sin α v1 = = n21 sin β v2
n2 n1
α v 1
n1
Θ1
Snellius-Descartes törvény
víz
n2
levegő
Θ2
c2
v2
Teljes visszaverődés
sin α h = n21
n2 αh
v1
n1 víz
Teljes visszaverődés sin Θ1
=
sin Θ 2 sin Θ1
n1 =
sin 90 o sin Θ1
1. komponens
n2
n2
68°
n1 =
1
Θ 1 = arc sin
76.94° 90°
n2
n2
n2
13.06°
90°
22°
Θ2
n1
22°
CaCO3
n1
Θ1
90°
n1
Θ1 = arc sin
1.55 1.658
Θ1 = 69.2 o
Θ1 = arc sin
1.55 1.486
Θ 1 =!?!
sin Θ 2 =
sin Θ 1 n1 n2
nlevegő=1.00028 nNicol1=1.658 nNicol2=1.486 nKanada-balzsam=1.555
8
2. komponens
Nicol-prizma Kettős törés!! Határszög!!
68°
75.4° 90°
ordinárius sugár
22°
CaCO3 14.6°
90°
22.37° 67.63°
68°
67.63°
extra ordinárius sugár
CaCO3
75.4°
22°
90°
CaCO3
sin Θ 2 =
sin Θ 1 n1
nlevegő=1.00028 nNicol1=1.658 nNicol2=1.486 nKanada-balzsam=1.555
n2
Glan-Thomson prizma
Kanada-balzsam William Nicol (1768 – 1851) Skót fizikus, geológus, a Nicol prizma megalkotója (1828).
Glan-Taylor prizma
extra ordinárius sugár
ordinárius sugár
extra ordinárius sugár
kötőanyag ordinárius sugár
levegő
Összefoglalás
-Polarizált fény; -Fotoszelekció; -Fluoreszcencia polarizáció és anizotrópia; -FRAP Segédanyagok: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/index.html http://chemistry.rutgers.edu http://calvino.polito.it http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence
9
