Mi a fluoreszcencia

1/ Mi a ﬂuoreszcencia

1 of 5

http://www.laskay.hu/Fluorhandout2008.html

1/ Mi a fluoreszcencia? Mint jelenség: egy anyag gerjesztés hatására bekövetkező fénykibocsátása. Mint módszer: a gerjesztés hatására kibocsátott fény tulajdonságainak (intenzitás, energia) vizsgálata. A fluoreszcencia a spektroszkópiai módszerek közé tartozik. A spektroszkópia az elektromágneses sugárzások színképeinek elemzésével foglalkozó, és főként azok energiájáról információt adó paramétereket (hullámhossz, rezgésszám) vizsgáló tudományág. A kromofór az a molekula, vagy egy molekulának az a része, amely felelős a fény elnyeléséért, fluorofór az a molekula, vagy egy molekulának az a része, amely felelős a fény kibocsátásáért. A fluoreszcencia 4 lépése: a fluorofór egy fotont abszorbeál, az abszorbeált foton energiájának terhére „gerjesztett” állapotba kerül”, majd molekuláris ütközések következtében veszít a gerjesztési energiájából, végül a gerjesztett állapotú fluorofór úgy tér vissza az alapállapotba, hogy közben kibocsát egy fotont. A fluoreszcencia feltételei: a fluoreszkáló anyagok külső elektronhéjában kell, hogy legyen „gerjeszthető” elektron, a „gerjesztő” foton energiája összemérhető kell, hogy legyen az illető elektron alapállapota és gerjesztett állapota közötti energiakülönbséggel. A gerjesztett állapot élettartama 10-9 s (1 ns). Ez alatt az idő alatt a fluorofór molekuláris kölcsönhatásba kerül környezetével, emiatt veszít energiájából. Az emittált foton energiája tehát mindig kisebb, hullámhossza pedig nagyobb, mint a gerjesztő fotoné (Stokes-törvény). A fluoreszcencia jellemző paraméterei. Színkép: valamely paraméter hullámhosszfüggését leíró görbe. Abszorpciós színkép: valamely színes anyag fényelnyelésének hullámhossz-függése. Megmutatja, hogy adott színű fénykomponensből az anyag mennyit nyel el. Fluoreszcencia színkép: az emittált fény színképi összetétele. Gerjesztési színkép: a fluoreszcenciát kiváltó gerjesztő fény színképi összetétele. A gerjesztési színkép egybeesik az anyag abszorpciós színképével.

2/ A fluoreszcencia előnyei: non-invazív: élő sejtekben, szövetekben is alkalmazható, rendkívül érzékeny: akár 1 milliárd molekula között is meglátom azt az egyet, amelyik fényt bocsát ki, rendkívül szelektív: 1 milliárd molekula között is csak azt az egyet látom meg, amelyik fényt bocsát ki, kvantifikálható: a fluoreszcencia intenzitás egyenesen arányos a fluorofór koncentrációjával, egyszerű: viszonylag könnyen kivitelezhető és elsajátítható, gyors: a kísérletező azonnali információt kap, analóg vagy digitális formában. Miért alkalmas a fluoreszcencia a sejtbiológiai események nyomonkövetésére? A sejtben levő molekuláknak csak elenyészően kis hányada fluoreszkál, így a sejtbe bejuttatott fluoreszkáló jelzőmolekulákat (festékek vagy próbák) könnyűszerrel detektálni lehet. Ezek vagy egy adott sejtbiológiai állapotról (statikus paraméter) vagy egy jelenségről (dinamikus paraméter) tájékoztatnak és az alacsony koncentráció miatt kevéssé toxikusak. Tanulmányozhatunk citoplazmikus ionkoncentrációkat, szignál-transzdukciós eseményeket, ioncsatornák működését, a nyugalmi membrán-potenciált, a sejtek életképességét, elkülöníthetjük a nekrotikus és apoptótikus sejteket, valamint nyomon követhetjük gének expresszióját.

3/ Fluoreszcenciás műszertípusok:Fluoriméter: oldatok, elegyek, sejtszuszpenziók vizsgálatára alkalmas. A gerjesztő fényt monokromátorral felbontja hullámhossz szerinti komponensekre és a megfelelő hullámhosszú fényt ráengedi a mintára. A fluorofór által az emittált (fluoreszcens) fényt ugyancsak felbontja egy másik monokromátorral hullámhossz szerinti komponensekre és méri azok intenzitását. Áramlási citométer: sejtszuszpenziók vizsgálatára alkalmas. Nagyszámú sejtmintát (10-20 ezer sejt) lemérhetünk néhány perc alatt. A fényforrás (laser) minden sejtet külön-külön megvilágít és a benne levő fluorofórt gerjeszti, és a detektor minden sejtből érkező fluoreszcencia-fény intenzitását külön-külön megméri. Hisztogram: a sejtszámot a fluoreszcencia-intenzitás függvényében feltüntető diagram. FluorescenceActivatedCellSorter (FACS): a sejteket a fluoreszcencia-fény hullámhossza (színe) vagy intenzitása alapján szétválogatja, azokat külön tartályba összegyűjti. Azokkal, mint tiszta populációkkal, további kísérleteket végezhetünk. Fluoreszcenciás mikroszkóp:sejt-monolayerek, szöveti metszetek (pl. agyszeletek) vizsgálatára alkalmas. Szűrős hullámhossz-szelekció: a fluorofórspektrális tulajdonságainak megfelelő gerjesztési és emissziós hullámhosszú fényt nem monokromátorokkal, hanem üvegszűrőkkel állítjuk elő. Detektorként digitális kamerát használunk. És a műszer fel van szerelve termosztálható tárgyasztallal, speciális mintatartókkal, és kínálja a számítógépes adatfeldolgozás és tárolás minden 09/19/2011 10:37 AM


2 of 5


előnyét. Konfokális mikroszkóp: egyetlen sejtről optikaisorozatmetszetet készít úgy, hogy a lencse fókusztávolságát finoman állítja felvételenként. A „metszést” több, egymással párhuzamos síkban is elvégezheti, és a mérés végén az egyes síkokban kapott intenzitás-értékekből 2D vagy 3D képet készít. Az intenzitás-értékekből készített 2D sejtkontúrt rávihetjük ugyanazon sejt ELMI képére, és így a fluorofórintracellulárisan lokalizálható. A fluoreszcencia intenzitásokhoz színskálát is hozzárendelhetünk, ez a pszeudokolor (ál-szín) technika.

4/ Citoplazmikus ionkoncentrációk vizsgálatához ion-szenzitív fluoreszkáló festékeket használunk. Ezek preferenciálisan egy adott ionhoz kötődnek és a kötődést követően megváltozik a fluoreszcencia fény hullámhossza (színe) vagy intenzitása. Léteznek intenzitás-festékek és „ratiometrikus” festékek. Az intenzitás-festékeknél a ligandhoz történő kötődés megnöveli az emittált fluoreszcencia intenzitását, amely így kvantitatív méréseket is lehetővé tesz. Például ilyen festék a Ca2+-érzékeny Fluo-3. Az intenzitásfestékek hátránya viszont, hogy a fluoreszcencia intenzitás nem csak a ligandhoz történő kötődéstől függ. Azt befolyásolhatja a festék koncentrációja és a festék esetleges kölcsönhatása sejtenbelüli molekulákkal (pl. fehérjék). A „ratiometrikus” festékeknél a ligandhoz történő kötődést követően megváltozik a fluoreszcencia fény gerjesztési vagy emissziós hullámhossza. Ez annak a következménye, hogy ezekben a festékekben a szabad festék és a ligandhoz kötött festék más hullámhosszon abszorbeál (gerjeszthető) vagy fluoreszkál, így egyszerre egymás mellett latjuk a szabad és a ligandhoz kötött festéket és detektálhatjuk azok fluoreszcenciáját egymástól függetlenül. A ratiometrikus festékek nagy előnye, hogy a két hullámhossznál mért fluoreszcencia-intenzitások aránya független egyéb zavaró tényezőktől és közvetlenül arányos a ligand koncentrációjával, így a ratiometrikus festékek kiküszöbölik az intenzitás-festékek hátrányait.

5/ Az intracelluláris Ca2+-koncentráció mérésének alapjai. A Fura-2 egy negatív töltéseket hordozó molekula, mivel 5 COOH csoportot tartalmaz, amelyek a citoplazma pH-jándisszociálnak. Ezek a negatív töltések szükségesek ahhoz, hogy a ligand (Ca2+ ionok) kötődhessenek a festékhez, viszont gyakorlatilag lehetetlenné teszik a festék bejutását az élő sejtbe. E dilemma megoldására a festéket észterré alakítják, amely elektromosan semleges. A semleges molekulák könnyen bejutnak a sejtbe, ahol citoplazmikusészterázok elbontják az észterkötéseket, a negatív töltések újra érvényre jutnak, a festékmolekulák kapcsolódhatnak a Ca2+ ionokkal és kezdődhet a kísérlet. Az intracelluláris pH mérésére leggyakrabban a BCECF-et, egy pH-érzékeny ratiometrikus fluoreszkáló festéket használnak. Ez a festék a fluoreszcein származéka, amelynek abszorpciója (gerjesztési színképe) pH-függő. A festék 510 nm-nél fluoreszkál, és a 440, valamint 495 nm-es gerjesztési hullámhosszaknál mért fluoreszcencia-intenzitások aránya közvetlenül a citoplazmikuspH-ról ad tájékoztatást. A BCECF kalibrálásához (a fluoreszcencia arány pH egységekké történő átszámításához)egy K+/H+ionofórt, a nigericint használják. Először is olyan közeget hozunk létre, melyben az extracelluláris K+ koncentráció megegyezik a citoplazmikus értékkel (140 mM). Ha ekkor a sejteket különböző pH-jú közegekbe tesszük, akkor a nigericin révén a citoplazmikus pH fel fogja venni az extracelluláris pH értékét. Tehát, nincs más teendőnk, mint a sejteket különböző pH-jú közegekbe tenni és nigericin jelenlétében megmérni a BCECF 495/440fluoreszcencia arányát.

6/ Apoptózis detektálása a PS észlelése alapján. Az apoptotikus sejtekben a plazmamembrán lipidösszetétele megváltozik, a foszfatidil-szerin (PS) a belső membránfélből átkerül a külsőbe. PS-specifikus fluoreszkáló festékkel az apoptotikus sejtek vizualizálhatók. Az Annexin V egy olyan fehérje, amely specifikusan kötődik a PS-hez. AnnexinV-höz kapcsolt fluoreszkáló festékkel a PS lokalizálható. Nekrózis detektálása. A nekrotikus sejtekben a plazmamembrán integritása károsodik, nagy molekulájú anyagok is bejutnak a sejtbe, és a sejtmagba is. A propidium jodid (PI) egy DNS-hez kötődő, de a membránon áthatolni nem tudó (non-permeant) festék, amely akkor fluoreszkál, ha kötődik a DNS-hez. Az Annexin V és a propidium jodid együttes alkalmazásával (doublelabelling) az apoptótikus és nekrotikus 09/19/2011 10:37 AM


3 of 5


sejtek elkülöníthetők. A kettős festésre áramlási citométert is használhatunk. Ilyenkor két fényforrást (laser) és két detektort alkalmazunk. A fényforrások mindkét fluorofórt gerjesztik, a detektorok pedig mindkét fluorofórról érkező fény intenzitását megmérik minden sejtben. Dot-plot: az egyik fluorofór fluoreszcencia intenzitása a másik függvényében. Apoptózis detektálása DNS-festékekkel: Hoechst festékek (33258 és 33342): membránon átjutó (membrane-permeant) DNS-festékek, amelyek preferenciálisan a DNS AT bázispárjaihoz kötődnek. Minél több az AT-pár, annál intenzívebb a fluoreszcencia. Mivel az apoptotikus sejtekben gyakran következik be a kromatin kondenzációja, az AT-párok száma pedig arányos a kromatin kondenzáció mértékével,a Hoechst festékek fluoreszcenciájának növekedése apoptózisra utal. Apoptózis detektálása DNS lánc-törések alapján: TUNEL módszer. Az apoptózis során aktiválódó endonukleáz működése következtében keletkező DNS darabok (breaks) sok szabad 3´-OH csoportot tartalmaznak. Ezekre az OH-csoportokranukleotidok kapcsolhatók a Terminális dezoxinukleotidTranszferáz (TdT) enzim által, amelynek működéséhez nem kell DNS-templát. A szabad végek megjelölhetők, ha egy nukleotid-analógot, pl. az 5-bróm-2´-dezoxiuridin 5´-trifoszfátot (BrdUTP) kapcsoljuk a szabad 3’ OH-hoz. Ha a BrdU beépült, annak jelenléte anti-BrdU antitesttel könnyen detektálható. Ezt a módszert hívják Terminal DeoxynucleotideTransferasedUTPNickEndLabeling, vagy TUNEL módszernek

7/Apoptózis detektálása kaszpáz-aktivitás alapján. A kaszpázok egy proteolitikus fehérjecsalád, amelyek az apoptótikus gépezet fontos komponensei. Az aktív centrumukban Cys található, hasítási helyük pedig Asp mellett van. Ezt a helyet az Asp előtt elhelyezkedő 3-4 aminosav alapján ismerik fel: Asp-Glu-Val-Asp (DEVD). A DEVD tetrapeptidet kovalensen egy fluoreszkáló feték (rodamin 110) amino-csoportjához kötik, amely így nem fluoreszkál. A tetrapeptid elhasítása a fluoreszcencia megjelenését váltja ki. Apoptózis detektálása mitokondrium-specifikus festékekkel. Mitokondriális membránpotenciál (?m): a belső membrán két oldala között mérhető feszültség. A JC-1 festék a ?m nagyságától függően akkumulálódik a mitokondriumokban, eközben az emissziós maximuma 529 nm-ről (zöld) 690 nm-re (vörös) tolódik. A vörös/zöld fluoreszcencia arány tájékoztat a mitokondriális membránpotenciál értékéről, a zöld fluoreszcencia növekedése depolarizációt (és így apoptózist) jelez. Apoptózis detektálása a citokróm C észlelésével. A citokróm-C egy olyan mitokondriális fehérje, amely apoptózis során kijut a citoplazmába. Ennek citoplazmikus jelenlétét ki lehet mutatni fixált sejtekben. A citokróm C ellen egy antitestet termeltetnek, amelyhez fluoreszkákó festéket kapcsolnak. Mikroszkóp alatt a fluoreszcens és az áteső fényes felvételek egymásra helyezésével tudjuk a citokróm C-t lokalizálni. Apoptózis detektálása a mitokondriális pórus észlelésével. Az apoptózis során a mitokondriumküső membránján egy pórus alakul ki. Ha a sejteket CalceinAM-mel jelölik, az egyenletesen eloszlik a citoplazmában és bejut a MK-okba is. Mind a citoplazmikus, mind a mitokondriálisészterázok lehasítják az AM csoportot, így a Calcein molekula fluoreszkálni kezd. A citoplazmából érkező fluoreszcencia kioltható CoCl2-dal, ami bejut a citoplazmába, de nem jut be a MK-ba. Kontrollként ezekhez a sejtekhez ionomicint (Ca2+-ionofór) adhatunk, amely megnöveli a citoszolikus Ca2+ koncentrációt, így kinyitja a mitokondriális pórust. Az ionomicin hatása gátolható ciklosporin A-val, amely viszont megakadályozza a pórus kialakulását.

8/ A sejtek életképességének tanulmányozása. A korábban rendelkezésre álló módszerek: festék-kizárásos tesztek (pl. tripán-kék), enzimek megjelenése az extracelluláris közegben (pl. LDH-aktivitás), a sejtek redukálóképességének mérése (pl. MTT-teszt). Ezek hátrányai: a festék-kizárásos tesztet gyorsan (legfeljebb 5-6 perc alatt) kell elvégezni, azLDH-aktivitás már igen nagyfokú membránkárosodásról tudósít, az MTT-teszt végén a sejteket el kell pusztítani. A modern fluoreszcenciás módszerek célpontja a citoplazma észteráz-aktivitása. Az acetoxi-metil (AM) észterek hidrolízisének sebessége arányos az észterázaktivitással. Egyik lehetőség a pH-érzékeny BCECF festékkel egy hullámhossznál (izobesztikus pontban) végzett mérés. Izobesztikus pont: az a gerjesztési hullámhossz, ahol a BCECF fluoreszcenciája nem függ a pH-tól, ebben a pontban gerjesztve tehát a fluoreszcencia intenzitás csak attól függ, hogy az észteresített

09/19/2011 10:37 AM


4 of 5


BCECF molekulák (amelyek nem fluoreszkálnak) hányadrésze vált fluoreszkálóvá, azaz hányadrészét bontották a citoplazmikusészterázok. A fluoreszcencia növekedésének időfüggéséből azészteráz-aktivitás sebességére (a citoplazma funkcionális aktivitására) következtethetünk. A másik, gyakran alklamzott életképességi festék a Calcein-AM. Ez a festék észteresített formában nem fluoreszkál, de az észterkötések hasítása után a fluoreszcencia megjelenik, és mivel negatív töltések is megjelennek a molekulán, az sokáig az élő sejtben marad, az elpusztult sejtekből azonban kidiffundál. További előny, hogy a fluoreszcenciaintenzitás független az ionikus és pH-viszonyoktól. Sejtproliferáció kimutatása: az osztódó sejtek detektálásának legérzékenyebb módszere a sejtciklus S fázisában újonnan szintetizálódó DNS kimutatása. Ennek egyik módszere a timidin-analóg5-bróm-2´-dezoxiuridin (BrdU) használata, ami beépül az újonnan szintetizálódó DNS-be. A beépült BrdU később detektálható egy anti-BrdU antitesttel.

9/ Szabadgyökök (ROS) kimutatása fluoreszkáló festékekkel. A leggyakrabban használt festék a 2',7'dichlorodihydrofluoresceindiacetate (H2DCFDA). Észteresített formában juttatjuk be a sejtekbe, ahol azacetilcsoportok lehasításakor negatív töltések kerülnek a molekulára, így az a citoplazmában marad. Szabad-gyökök hatására bekövetkező oxidáció a nem-fluoreszkáló analógot fluoreszkáló festékké alakítja. A cis-parinársav (CPA) egy konjugált kettőskötés-rendszerrel rendelkező zsírsav, amely élő sejtek membránjaiban a zsírsavláncok közé ékelődik. A konjugált kettőskötés-rendszer miatt a festék intenzíven fluoreszkál, de amennyiben szabadgyökök támadják meg és valamelyik kettőskötést oxidálják, a festék fluoreszcenciája kioltódik. Így ez a festék alkalmas a lipid-peroxidáció detektálására és mértékének megállapítására. NO kimutatása fluoreszkáló festékekkel. A leggyakrabban a 4,5-diaminofluoreszceindiacetátot (DAF-2 DA) és származékait használják, amelyek könnyen áthaladnak a PM-on, és az intracellulárisészterázok lehasítják az acetát-csoportokat (deacetilálás). A fluoreszcencia akkor jelenik meg, ha a festék nitrosonium kationhoz (NO+) kötődik, amely a NO spontán oxidációs terméke.

10/ Immunfluoreszcencia: a fluoreszkáló festéket egy fehérjetermészetű ellenanyag-molekulához kötik. Mivel az ellenanyag specifikusan kötődik az antigénhez, a számunkra érdekes antigén topológiailag vizualizálható. Az intracelluláris vizsgálatokhoz a sejteket fixálni és „permeabilizálni” kell. Az immunfluoreszcencia és FACS együttes alkalmazása forradalmasította a daganat-diagnosztikát. A leukémiák különböző fajtái különböző sejttípusokban bekövetkező genetikai károsodás eredményei, amelyek igen sokfélék lehetnek. A hatékony intervencióhoz a sejttípus gyors felismerése elengedhetetlen. Ez korábban csak hisztokémiai festékekkel volt lehetséges, amely lassú és pontatlan módszer volt. Az immunfluoreszcencia és a FACS együttes használatával percek alatt nagyszámú sejtmintát tudunk megvizsgálni és ezzel az egyes leukémiák tipizálása felgyorsult és pontosabbá vált. A citoszkeleton jelölése fluoreszkáló festékekkel. A citoszkeleton a sejtek szerkezetének egyik fontos komponenese. A citoszkeletoninvivo dinamikája tanulmányozható. Az F-aktin jelölhető fluoreszkáló festékkel jelölt phallotoxinokkal. A phallotoxinok (phalloidin és phallacidin) ciklikus peptidek, amelyeketa Gyilkos galócából (Amanitaphalloides) izoláltak. Ezek pecifikusan kötődnek az F-aktinhoz és fluoreszkáló festékek köthetők hozzájuk. A G-aktin molekulák jelölésére fluoreszkáló DNázI-et használnak. A dezoxiribonukleáz I (DNáz I) specifikusan kötődik a monomer G-aktinhoz, és fluoreszkáló festékek köthetők hozzá. A tubulin molekulák jelölése egyrészt fluoreszkáló paclitaxel-lel, másrészt fluoreszkáló vinblasztin-nal oldható meg. Mind a paclitaxel (taxol), mind a Vinca alkaloidok közé tartozó vinblasztin specifikusan kötődik a tubulinhoz. Mindkét anyag gátolja a sejtosztódást, és mindkét anyag ismert rákellenes gyógyszer.

11/ Biolumineszcencia: olyan jelenség, amikor egy élő szervezet kémiai reakció eredményeként termelődött fényt bocsát ki. A rekcióhoz minimálisan két típusú anyagra van szükség: luciferin(ek)re, azaz a fényt kibocsátó anyag(ok)ra, valamint luciferáz(ok)ra, azaz a kémiai reakciót katalizáló enzim(ek)re. A katalízis 09/19/2011 10:37 AM


5 of 5


során a luciferin oxidálódik, inaktív "oxiluciferin”-né alakul, amit fénykibocsátás követ. Több száz (általában tengeri) faj képes biolumineszcenciára, az z egyik legismertebb a szentjánosbogár (Lampyrisnoctiluca) biolumineszcenciája. Ez egy további ko-faktort (ATP) is igényel, ezért kétlépéses a folyamat. 1: luciferin + ATP ? luciferiladenilát + PPi. 2: luciferiladenilát + O2 ? oxiluciferin + AMP + fény. A luciferáz (LUC) gén beépíthető más fajok (főleg növények) genomjába. Ezek a transzgénikus növények akkor fognak világítani luciferin jelenlétében, ha expresszálják a LUC gént. Ezzel könnyen tanulmányozható különböző gének expressziójának szabályozása. Fotoprotein: a luciferin, a luciferáz és az oxigén által alkotott hármas egység. Ez a molekula csak akkor fog fényt kibocsátani, ha bizonyos ionok (pl. Ca2+) kapcsolódnak hozzá. Az első megismertfotoprotein az aequorin volt, amelyet 1961-ben izolálták az Aequoreavictoria medúzafajból. Két részből áll: egy apoproteinből (apoaequorin, 22 kD) és egyprosztetikus csoport (coelenterazin), utóbbi a luciferin-család tagja. Oxigén jelenlétében a két komponens működőképes egységgé áll össze, melyen Ca2+-kötőhelyek vannak. Ha Ca2+ ionok kötődnek ezekhez a helyekhez, a fehérje konformációja megváltozik, és a coelenterazinból oxidációval coelenteramidot és CO2 -t képez. A coelenteramid gerjesztett állapotban van, alapállapotba történő visszatérése során kék foton emittálódik. Az aequorin által emittált fény intenzitása arányos a Ca2+ koncentrációval, így yakran használják a citoplazmikus Ca2+ tanulmányozására. Az aequorinmikroinjektálással is bejuttatható a sejtekbe, ilyenkor a coelenterazint pótolni kell, de hidrofób karaktere miatt könnyen átdiffundál a plazmamembránon.

12/ GFP. Az Aequoreavictoria zöld fényt bocsát ki, az aequorin tisztítása során bukkantak rá egy másik fehérjére, amely az aequorin kék fényét abszorbeálja és zöld fluoreszcencia-fényt bocsát ki. Zöld Fluoreszkáló Fehérjének (GreenFluorescent Protein) nevezték el. A GFP egy 238-aminosavat tartalmazó, 27-kDa-os fehérje, fluorofórja három egymást követő aminosav: Ser-65, Tyr-66, and Gly-67 közötti kölcsönhatások révén alakul ki. Kék (475nm) és UV (396 nm) fénnyel egyaránt gerjeszthető, 508 nm-es zöld fényt bocsát ki. A gfp gén a fehérjét és a fluorofórt egyaránt kódolja. A gfpcDNS-ét 1992-ben klónozták, majd sikeresen expresszálták a legkülönbözőbb szervezetekben: baktériumokban, Caenorhabditisban,Saccharomyces-ben, Drosophila-ban, állati, növény- és gombasejtekben. A gfpcDNStranszfekciója során a gént közvetlenül egy számunkra érdekes fehérje stop-kodonja elé építjük be, így amikor a fehérjét kódoló gén átíródik, a GFP-t kódolón gén is át fog íródni, és a sejtben UV-gerjesztéssel meg fog jelenni a zöld fluoreszcencia. A fluoreszcencia megléte tehát a számomra érdekes fehérjét kófoló gén sikeres expressziójának bizonyítéka. Azok a sejtek, amelyek expresszálják a gfp gént, egy olyan fehérjét termelnek, amely UV-gerjeszést követően zöld színben fluoreszkál. Ez lehetővé teszi a gfp-expresszáló sejtek non-destruktív detektálását. A GFP emiatt a génexpresszió egyik legmegbízhatóbb markerévé vált. Sőt, ha a gfpcDNS-t egy promóter régió mellé építik be, a GFP mindig megjelenik, amikor a promóter aktiválódik. Ezzel egy számomra fontos gén expressziójának szabályozását is tanulmányozni lehet. A gfp gén expressziója bármely sejtben olyan fluoreszcenciát vált ki, amely nem igényel szubsztrátot, nem fajspecifikus és non-invazív módszerekkel detektálható A GFP fluorofórját alkotó három aminosav „manipulációjával” különböző színben fluoreszkáló GFP fehérjéket állítottak elő.

13/ FRET: FluorescenceResonanceEnergyTransfer. A módszer két fluorofór, egy donor és egy akceptor használatára épül. Ha a donor és akceptor elég közel van egymáshoz fizikailag, a donorról a gerjesztési energia sugárzásmentesen átadódik az akceptorra, így ebben az esetben elérhető, hogy a donor gerjesztése során az akceptor fluoreszcenciája jelenik meg. Mindebből molekulák relatív távolságára (közelségére) lehet következtetni. FRAP: FluorescenceRecoveryAfterPhotobleaching. Erős fényintenzitás a fluorofórok fluoreszcenciáját „kioltja”. Sejtfelszíni fehérjékhez valamilyen fluorofórt kapcsolunk. Egy bizonyos régióban (pl. mikroszkóp látótere) Laser-rel kioltjuk a fluoreszcenciát. Figyeljük a fluoreszcencia helyreállását, ami a laterális diffúzió sebességével arányos. Ebből a membránalkotók mozgási szabadságára és a membrán fluiditására következtethetünk.

09/19/2011 10:37 AM

Mi a fluoreszcencia

Recommend Documents