5/11/2015
forrás: ld utolsó dia
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR
www.aok.pte.hu
MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK 1
FÉNYMIKROSZKÓPIA FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA
BIOFIZIKA 2. 2015. március 18. Dr. Bugyi Beáta Biofizikai Intézet
humán tüdőszövet (hisztológia)
mikrosebészet
mitózis, tengericsillag petesejt aktin, mikrotubulus, kromoszómák (3D konfokális mikroszkópia)
sejtmozgás (fázis kontraszt mikroszkópia)
egyedi molekulák formin, aktin (TIRFM)
mitózis aktin, mikrotubulus (konfokális mikroszkópia)
véráram élő egér májában dextran, hepatociták (intravitális mikroszkópia)
Áttekintés
Mikroszkópia, fénymikroszkópia
KÉPALKOTÓ MÓDSZEREK
MIKROSZKÓPIA = MIKROS (kicsi) + SZKOPEIN (nézni)
MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK • FÉNYMIKROSZKÓPIA » a fénymikroszkóp képalkotásának alapelvei fény-anyag kölcsönhatása: REFRAKCIÓ, DIFFRAKCIÓ NAGYÍTÁS, FELBONTÁS, KONTRASZT
– FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA » speciális komponensek a fluoreszcencia
-
az emberi szem számára „láthatatlan” objektumok láthatóvá tétele
-
különbözõ mérettartományba esõ biológiai objektumok megfigyelése: szervektõl (cm 10-2m) egyedi molekulákig (nm 10-9m).
PÁSZTÁZÓ PRÓBA MIKROSZKÓPIA ELEKTRON MIKROSZKÓPIA FÉNYMIKROSZKÓPIA A képalkotáshoz látható fényt (400 – 800 nm) és üvegbõl készült lencséket alkalmaz.
mikroszkópban
A fénymikroszkóp képalkotásának alapelvei
A fénymikroszkóp képalkotásának alapelvei
NAGYÍTÁS
NAGYÍTÁS a kis objektumoknak elég nagynak kell lenniük, hogy az emberi szem számára láthatóvá váljanak
FELBONTÁS
FELBONTÁS
KONTRASZT
KONTRASZT
…a fentiek megvalósítása a legkisebb torzítás nélkül
…a fentiek megvalósítása a legkisebb torzítás nélkül
1
5/11/2015
Az „egyszerû” fénymikroszkóp képalkotása 1x nagyító
Az „összetett” fénymikroszkóp képalkotása 2x nagyító
megfigyelő
megfigyelő
GYŰJTŐLENCSE olvasókő (~ 810-887 B.C. Abbas Ibn Firnas)
T
K1
OBJEKTÍV
OKULÁR
gyűjtőlencse közelebb a tárgyhoz
gyűjtőlencse közelebb a megfigyelőhöz
K2 T
NAGYÍTOTT valós fordított állású
K1
NAGYÍTOTT valódi fordított állású NAGYÍTOTT látszólagos fordított állású
Hans & Zacharias Jansen (~ 1590 holland üvegműves, optikus)
von Leeuwenhoek (1632-1723 holland zoológus, mikrobiológus)
Lencserendszerek a modern fénymikroszkópban
A fénymikroszkóp nagyítása í á! "
#é% &é'( ( á' &é'( (
ó " í ∗ á KONDENZOR egyenletes megvilágítás Köhler
OKULÁR
OBJEKTÍV lencse: í ~ 2.5 150 OKULÁR lencse: á ~10 25
ó ~20 1000
OBJEKTÍV
http://www.olympusmicro.com/primer/virtual/magnifying/index.html
Lencsék, lencserendszerek numerikus apertúra NUMERIKUS APERTÚRA (NA) egy optikai lencse(rendszer) fénygyűjtő képessége NA ↑ több fényt gyűjt össze
NA " n ∗ sinα
n: a lencse és a tárgy közötti közeg törésmutatója α: apertúra szög, a lencse által összegyűjtött fénykúp félnyílásszöge
Ha korlátlan nagyítású lencserendszert használnánk, akkor korlátlanul kis dolgokat is láthatóvá tudnánk tenni? NEM A fény hullámtermészetét is figyelembe kell vennünk! DIFFRAKCIÓ, INTERFERENCIA (korábban: EM hullámok, RTG-diffrakció elõadás)
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/oilimmersionrefractiveindex/indexflash.html http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasna.html
2
5/11/2015
A fénymikroszkóp képalkotásának alapelvei
A fénymikroszkóp felbontóképessége
NAGYÍTÁS
FELBONTÁSI HATÁR az a legkisebb távolság, amelyre eső két különálló tárgypont két különálló pontként jelenik meg a képen (d)
FELBONTÁS a tárgy minél apróbb részletei is elkülöníthetõk legyenek egymástól
KONTRASZT
…a fentiek megvalósítása a legkisebb torzítás nélkül
Diffrakció a fénymikroszkópban
A kép, mint diffrakciós mintázat John Herschel (1792-1871, angol csillagász), George Biddell Airy (1801-1892, angol csillagász)
∆! " 3!4 5 " #6
SZÉTSZÓRT A TÉRBEN
KÉP észlelhető fényhatás/diffrakciós kép elhajlási rendek: # " 0, 11, 12
AIRY MINTÁZAT: egyetlen pontszerű tárgy diffrakció limitált képe 3D3D-ban: PSF (POINT SPREAD FUNCTION)
DESTRUKTÍV
objektív hátsó fókuszsíkja
minimum - sötét
KONSTRUKTÍV maximum - világos
INTERFERENCIA
5
DIFFRAKCIÓ TÁRGY optikai rács
fényforrás
3
rácsállandó: d periodikus optikai sajátságok
INFORMÁCIÓ XY irány – laterális Z irány – axiális
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/imageformation.html
Richard W Cole et al Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control Nature Protocols (2011)
A felbontás Abbe-féle határa
A fénymikroszkóp felbontóképessége diffrakciós limit
Ernst Abbe (1840-1905)
Képformálás: A 0. rendű maximum mellett legalább az 1. rendű maximum is részt vesz a képalkotásban.
XY irány – laterális
A maximumok elhajlási irányaira (5):
3?,@ " 0.61
∆! " 3!4 5 " #6
6 ~200 & BC
Z irány – axiális
# " 0, 11, 12
objektív
#"0 # " 71
# " 1 58 58
Részt vesz a képalkotásban: # " 1 esetre: 6 3" !4 58 Össze kell gyűjteni: 6 6 3" " 29:;9< 2=>
3 " 2 Rayleigh-feltétel: Az egyik pont képének főmaximuma a másik pont képének első mellékmaximumára essen.
6 BC
D ~800 &
λ: a megvilágító fény hullámhossza NA: a lencserendszer numerikus apertúrája
3
5/11/2015
„Klasszikus” felbontás növelési lehetõségek λ: a megvilágító fény hullámhosszának csökkentése hullámhossz (nm) NA= 0.8
1877 diffrakciós határ
2014 Nobel díj
Ernst Abbe, Carl Zeiss
Stefan Hell, Eric Betzig és William Moerner
dx,y (nm)
400
250
500
312.5
600
375
700
437
"for the development of super-resolved fluorescence microscopy"
NA: NA a lencserendszer numerikus apertúrájának növelése növelése – IMMERZIÓS KÖZEG
immerziós közeg
törésmutató
levegő
1.000
víz
1.333
glicerin
1.469
olaj
1.515
A fénymikroszkóp képalkotásának alapelvei NAGYÍTÁS
FELBONTÁS KONTRASZT a tárgy minden érdekes része elkülönüljön a környezetétõl
…a fentiek megvalósítása a legkisebb torzítás nélkül
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2 014/
Ernst Abbe emlékmű, Jena
Kontraszt Probléma: a legtöbb élő minta (szövet/sejt…) vékony és optikailag transzparens, így nehéz láthatóvá tenni átesőfény mikroszkópiával. A vizsgált objektum OPTIKAI INHOMOGENITÁSA (azon sajátsága, ami megkülönbözteti a környezetétől) fényelnyelés törésmutató alak „szín”… a mintán áthaladó FÉNY SAJÁTSÁGAINAK MEGVÁLTOZÁSÁT eredményezi irány sebesség fázis polaritás hullámhossz…
Kontrasztnövelő technikák: fázis-kontraszt-, differenciális interferencia kontraszt (DIC), Hoffman-modulációs kontraszt-, sötétlátóterű-, polarizációs-, fluoreszcencia mikroszkópia… mikroszkópia
Fluoreszcencia mikroszkópia
Hogyan tehetjük fluoreszcenssé a vizsgált mintát? standard fluorofórok
FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA
BELSŐ (INTRINSIC) FLUOROFÓRÓK: FLUOROFÓRÓK autofluoreszcencia, limitált
fénymikroszkópia + fluoreszcencia
KÜLSŐ (EXTRINSIC) FLUOROFÓRÓK: FLUOROFÓRÓK spektrális flexibilitás
A képalkotáshoz látható fényt (400 – 800 nm) és üvegbõl készült lencséket alkalmaz.
A vizsgált mintát a fluoreszcencia emissziója révén képezi le. Elõnyei:
fluoreszcencia biztosította spektrális flexibilitás
kontraszt
kevéssé invazív
speciális alkalmazások (FRAP, FRET, FLIM)
speciális technikák révén a felbontóképesség javítható
szintetikus festék kvantum gyöngy fluoreszcens fehérje GFP: zöld fluoreszcens fehérje és változatai 2008 Kémiai Nobel díj: Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien „for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP".
antitest, immunofluoreszcencia
4
5/11/2015
Hogyan tehetjük fluoreszcenssé a vizsgált mintát? szabályozható (fotokonvertálható) fluorofórok
Hogyan képezhetjük le a minta fluoreszcenciáját?
STANDARD
FÉNYFORRÁS
trans
ívlámpa lézer
minta
FOTOAKTIVÁLHATÓ
DETEKTOR szem
epi
FOTOKAPCSOLHATÓ
DETEKTOR
SZŐRİK TÜKRÖK
http://www.olympusfluoview.com/applications/opticalhighlighters.html
Hogyan képezhetjük le a minta fluoreszcenciáját? optikai szûrõk, dikroikus tükrök
CCD kamera PMT
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/axioobserver/index.html
Hogyan képezhetjük le a minta fluoreszcenciáját? optikai szûrõk, dikroikus tükrök
(ld. Áramlási citometria)
OPTIKAI SZŐRİK hullámhosszfüggı transzmissziós/abszorpciós sajátságok aluláteresztı felüláteresztı sáv
DETEKTOR emissziós szőrı
dikroikus tükör
OKULÁR
gerjesztési szőrı
EMISSZIÓS SZŐRİ
DIKROIKUS TÜKÖR FÉNYFORRÁS GERJESZTÉSI SZŐRİ OBJEKTÍV
DIKROIKUS TÜKRÖK hullámhosszfüggı reflexiós és transzmissziós/abszorpciós sajátságok
MINTA
VASP-GFP aktin-RFP Shows again the localization of VASP at protruding lamellipodia and filopodia tips in a fish fibroblast expressing VASP-GFP and Actin-RFP. forrás: http://cellix.imba.oeaw.ac.at/motility/nucleationfactors
VASP-GFP aktin-RFP
VASP-GFP aktin-RFP
Shows again the localization of VASP at protruding lamellipodia and filopodia tips in a fish fibroblast expressing VASP-GFP and Actin-RFP. forrás: http://cellix.imba.oeaw.ac.at/motility/nucleationfactors
5
5/11/2015
Fény-, fluoreszcencia mikroszkópia kulcsfogalmak
Javasolt internetes anyagok
A fénymikroszkóp képalkotásának alapelvei: nagyítás, felbontás, kontraszt Lencsék, lencserendszerek képalkotása
http://www.olympusmicro.com/index.html
Numerikus apertúra Airy mintázat, diffrakciós határ Speciális elemek a fluoreszcencia mikroszkópban: fluorofórok, fluorofórok, fényforrások, detektorok, optikai szûrõk, tükrök
http://www.microscopyu.com /
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html
http://www.ibiology.org/ www.aok.pte.hu
www.aok.pte.hu
6
