Fluoreszcencia spektroszkópia
A fény: elektromágneses hullám
Huber Tamás
Biofizika szeminárium
PTE ÁOK Biofizikai Intézet
2014. február 04-06.
1
Elektromágneses spektrum
Lumineszcencia: gerjesztett állapotú rendszer fény kibocsátása.
Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük.
2
A lumineszcencia típusai
Kemilumineszcencia - Fotolumineszcencia
1. Kemilumineszcencia • olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott kémiai reakció során felszabaduló energiából adódik pl.: foszfor (P) oxidáció útján való világítása • alkalmas anyagcsere folyamatok vizsgálatára • kis intenzitású • fiziológiás viszonyoktól függő
3
Biolumineszcencia: a kemilumineszcencia egyik típusa, amikor a gerjesztő energiát biztosító kémiai reakció élő organizmusban játszódik le. pl.: szentjánosbogár, mélytengeri halak, medúzák, polipok, baktériumok, planktonok
2. Fotolumineszcencia • olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott hullámhosszú (frekvenciájú, energiájú) fény besugárzásából adódik • alkalmas molekuláris rendszerek vizsgálatára, mert jelentős információt hordoz a molekula tulajdonságairól, kölcsönhatásairól, környezetével való kapcsolatáról
1.
A luciferáz katalizálja a luciferin oxidációját.
2. Inaktív oxyluciferin és fény (h ) keletkezik. 3. A további luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik.
Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek • két típusa: fluoreszcencia, foszforeszcencia
4
Jablonski-féle termséma
Kasha-szabály bizonyítéka:
Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik.
Alap és gerjesztett állapot természetétől függően: Fluoreszcencia: a molekula szingulett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba
http://www.olympusmicro.com/primer/java/jablonski/jabintro/
Foszforeszcencia: a molekula triplett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba Megkülönböztetésük: - spektrumuk alakja, - gerjesztett állapot időtartama szerint.
5
A lumineszkáló anyagot jellemzi:
Az S1-S0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában:
a. Fluoreszcencia
Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba Lecsengése: 10-9 - 10-6 s nagyságrendű
b. Foszforeszcencia
S1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T1 triplett állapotba kerül ebből sugárzási energia kibocsátásával kerül S0 alapállapotba (tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínűséggel) Lecsengése: 10-6-10 s
Sugárzás kvantumhatásfoka
Gerjesztett állapot élettartama
c. Késleltetett fluoreszcencia
T1 állapotból termikus gerjesztéssel S1 állapotba, majd onnan S0ba („magas hőmérsékletű foszforeszcencia”)
Abszorpciós spektruma, valamint fluoreszcencia, foszforeszcencia gerjesztési és emissziós spektruma
Emisszió polarizációfoka (anizotrópiája)
6
A fluoreszcencia mérésének alapelvei
1. Az észlelés iránya merőleges a gerjesztés irányára.
Legfontosabb probléma: a gerjesztő fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése.
•
A gerjesztési és észlelési irányok célszerű megválasztása
•
Három elrendezési lehetőség
2. Az gerjesztés és az észlelés iránya „párhuzamos”. A minta elülső oldaláról kilépő fluoreszcenciát érzékeljük.
3. A minta gerjesztésével szemközti oldalon, azaz lineárisan detektálunk. !! Fényszűrők, monokromátorok!!
7
A gerjesztési spektrum
Hogyan mérünk fluoreszcenciát? (‘steady-state’ eset)
•
Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk.
•
Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik.
•
fényforrás
hullámhossz választás
minta
Gerjesztés
hullámhossz választás
detektor Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok
Sir George Gabriel Stokes, 1st Baronet (1819–1903)
8
Az emissziós spektrum
Kémiai denaturáció hatása a gerjesztési és emissziós spektrumra
Az első szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjéről az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik.
GuHCl
Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszeréről.
9
Foszforeszcencia emissziós spektrum
Fluoreszcencia élettartam Az az időtartam, amely alatt a gerjesztett állapotban található molekulák száma e-ad részére csökken.
= 1 / (kf + kössz) f : fluoreszcencia össz : f + vibr. + rot. (azaz f + non-radiatív)
• • •
Az első triplett gerjesztett állapotból a szinglett állapotba való átalakuláskor. Szobahőmérsékleten csak kristályos anyagokon. (oldatban: kioltók pl. O2) A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltolódott.
10
Kvantumhatásfok
Fluoreszcencia élettartam mérése • „idő-függő” mérés /time domain measurement/
fluoreszcencia során kibocsátott és elnyelt fotonok számának hányadosa.
Q= Nemitt / Nabsz < 1 - kifejezhető a sebességi állandók hányadosaként is:
Q = kf / (kf + kössz)
• rövid gerjesztő impulzusok (~ fs) • Fotonok detektálása időablakokban
Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz.
11
PEVK11 IAEDANS
1000
Fluoreszcencia élettartam mérése • „frekvencia-függő” mérés („frequency domain measurement”)
100
Intenzitás
Fluoreszcencia intenzitás (cps)
Időkorrelált egy-foton számlálás /TCSPC/
10
1
PEVK21 IAEDANS
1000
Modulált gerjesztés (frekvencia ~20 / 80 MHz)
100
Eltelt idő
10
Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz. 1 0
20
40
60
80
100
Idő (ns)
12
Fluoreszcencia élettartam mérése • „frekvencia-függő” mérés („frequency domain measurement”)
Fluoreszcens festékek • natív vagy intrinsic fluorofórok: Triptofán, tirozin, fenilalanin Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.
Intenzitás
Demoduláció (modulációs mélység) Fáziskülönbség
Emisszió – rövid élettartamé (pl. 1 ns) Emisszió – hosszú élettartamé (pl. 10 ns) Modulált gerjesztés (50 MHz)
Eltelt idő
13
Extrinsic (külső) fluorofórok Direkt jelölés festékekkel: Danzil Rodamin IAEDANS IAF FITC Fluoreszcensen jelölt toxinokkal: Falloidin B-skorpiótoxin A-bungarotoxin Makrofágok Aktin jelölve falloidinAlexa 568-cal (Piros) Magok: DAPI (Kék) Streptococcus aureus (Zöld)
14
A fehérjék fluoreszcens jelölése
Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémiai jelölés)
- A jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - Így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.
Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert molekula felszínéhez (epitóp) Monoklonális és poliklonális antitestek
Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens
Indirekt jelölés: az elődleges antitest
festék van kötve
jelöletlen, a másodlagos antitest van megjelölve
15
Foszforeszcencia mérése
•
A gerjesztő fény a foszforeszcencia fénytől időben elkülönüljön Az intenzitás időbeli változása is mérhető legyen
•
Mindig alacsony hőmérsékleten kell mérni
•
Foszforoszkóp alkalmazása:
•
A foszforoszkóp A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztő fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át
A mintát gerjesztés után optikai ernyővel eltakarjuk , ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény.
Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik függ: • a forgási sebességtől • a nyílások számától
Gyakorlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű
Negyedfordulat után a gerjesztő fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén
16
A minta •
• • • • •
• • •
Általában oldat (fehérje, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió) A küvetta anyaga ne fluoreszkáljon! Üvegküvetta (látható tartomány) Speciális üvegküvetta (λ > 300 nm) Műanyag küvetta Speciális kvarcküvetta (fluoreszcencia mérésre)
Küvetta tartó berendezések: Temperálható (több féle módon) Több (ált. 4) minta, forgatható
Gerjesztő fényforrások
A mesterséges fényforrások által kibocsátott fény lehet:
Folytonos-, (magas hőmérsékletre hevített anyag) Halogéntöltésű izzószálas lámpák. Nagy nyomású gázokkal töltött lámpák. •
Vonalas-, (atomok) Intenzív, monokromatikus fény állítható elő. Alacsony nyomású higanygőzzel töltött gázkisülési cső. •
•
Stb.
17
Optikai szűrők
Optikai szűrők
Szelektivitás bizonyos hullámhosszúságú fényre
Ultraibolya (UV) filterek:
Abszorpciós filterek Általában üvegből készülnek. Szerves vagy szervetlen összetevőket tartalmaznak, emiatt bizonyos hullámhosszúságú fénysugarakat átengednek, míg másokat nem. Műanyag (olcsóbb, könnyebb)
Az ultraibolya-fényt nem engedik át, de hosszabb hullámhosszúakat igen.
Neutrális szűrők: Transzmissziójuk széles színképtartományban a hullámhosszúságtól független. A gerjesztő fény intenzitásától függő fotokémiai, fotobiológiai folyamatok tanulmányozhatók.
Interferencia szűrők:
Dikroikus tükrök
Akkor használjuk, ha a folytonos színképű fényből viszonylag keskeny sávot akarunk kiválasztani. Vonalas színképű gerjesztő fényből meghatározott hullámhosszúságnál fellépő vonalat kell elkülönítenünk. Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ.
18
Optikai szűrők Longpass-filterek (Felüláteresztő szűrők)
Optikai szűrők
Magasabb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Általában éles csúcs jellemzi őket. Fluoreszcens mikroszkópiában a dikroikus tükrök emissziós filterekként használatosak.
Shortpass filterek (Aluláteresztő szűrők) Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek. Rövidebb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Dikroikus tükrök excitációs filterek-ként használatosak.
Bandpass filterek (Sáv szűrők) Előző kettő kombinációja. Általában alacsonyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél. A kiválasztott intervallumon kívül teljesen blokkol minden más hullámhosszú fényt.
19
Monokromátorok
A detektor Fotoelektron-sokszorozó cső (Photomultiplier tube)
A: Fényforrás
Nagyon szenzitív érzékelők az ultraibolyától a közeli infravörös tartományig.
B: Rés C: Kollimátor D: Prizma vagy rács E: Tükör F: Excitációs rés G: Minta
A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei: - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető
- a fluoreszcencia érzékeny a környezetre
20
Köszönöm a figyelmet!
21
