A fluoreszcencia alapvető paraméterei Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP
• • • • •
Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció
2011.02.15.
Polarizált fény, polarizáció
Elektromágneses hullámok
Polarizáció fogalma
A polarizált fény
Megjelenés fotózáskor!
Miért van ilyen hatása?
• Az elektromágneses sugárzás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatározott görbe mentén mozog (térbeli irányultság!). • Ha a görbe egyenes: lineáris v. sík polarizáció • Ha a görbe kör: cirkuláris polarizáció • (Ha a görbe elipszis: elliptikus polarizáció)
• A polarizálatlan fényben a polarizációs síkok keverednek. • A polarizált fényben a polarizációs síkok összhangban vannak (azonosak).
1
Síkban polarizált fény
A polarizátor • Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen.
Polarizátor működésének elve
Hol találkoztunk már polarizátorral?
Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás
Polarizáció, intenzitások
Optikai aktivitás: poláros fény síkját elforgatják
α = ⎡⎣α λt ⎤⎦ lc
Fényforrás
Intenzitás egy adott irányban:
Θ polarizátor
Polarizátor
Ι = Ι max cos 2 Θ Párhuzamos állás: Θ = 0°, I = Imax
Mintatartó
Merőleges állás: Analizátor
Θ = 90°, I = 0 Megfigyelő
• királis molekulák • nem kell gerjeszteni!
Polariméter
2
Az abszorpciós vektor fogalma z
Fotoszelekció
MA = abszorpciós vektor
θA
Nincs abszorpció (θ= 90o)
E y gerjesztés
Maximális abszorpció (θ= 0o)
x
Abszorpció ~ cos2θA (max=1)
θA
abszorpciós vektor: megszabja a foton abszorpciójának valószínűségét.
A fotoszelekció eredménye
Mi történik a fotoszelekciót követően?
r E
r E
Mozgás: - transzláció; - rotáció.
Minderre τ idő van!
Az emissziós vektor Hogyan jellemezhető ez a rotációs mozgás?
ME = emissziós vektor
z IZ θ E gerjesztés E
IX
IY
y
Detektor
x
emissziós vektor: megszabja a foton emissziójának valószínűségét.
3
Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a z komponens!
z
F
M
S
P 90o
IZ θ E IX
SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA
IZ vs. Isum = IZ + IX + IY
y
IY
x
(A teljes intenzitáshoz tudjuk viszonyítani.)
Vagy vertikálisan, vagy horizontálisan helyezzük el a polarizátorokat: IVV
IVH
IHV
IHH
P M
D
Polarizátorokat alkalmazunk !!!
Így a teljes intenzitás: Isum = IZ + IX + IY
z
Isum = IVV + IVH + IVH
IZ θ E IX
IY
y
Fluoreszcencia polarizáció
Isum = IVV + 2IVH
x
Fluoreszcencia polarizáció p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) • dimenzió nélküli
G = IHV / IHH
p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) Ha τ = 0 lenne: IVV max., IVH = 0, tehát p = 1. Ha τ nagyon hosszú lenne: IVV = IVH , tehát p = 0.
• nem függ a fluorofór koncentrációjától • a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja • nem additív !!!
De nem additív !!!
• értéke 0-tól 1-ig változhat (ld. következő dia).
4
Emissziós anizotrópia Emissziós anizotrópia
r = (IVV - GIVH) / (IVV + 2GIVH) • dimenzió nélküli
G = IHV / IHH
• nem függ a fluorofór koncentrációjától • a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja • additív !!!
Isum = IZ + IX + IY
Emlékezzünk!
Isum = IVV + IVH + IVH Isum = IVV + 2IVH
Mint láttuk, rotációs mozgást ír le!
Az anizotrópia jelentése és alkalmazásai
z
z
Polarizált fény
τ
IZ θ E IX
IY
y
IZ θ E IX
IY
y
x
x
Részben polarizált fény
Rotációs diffúzió
Az anizotrópia időfüggése
Alkalmazások Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata • Fehérje denaturáció nyomonkövetése • Protein-ligand kölcsönhatás vizsgálata • Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (pH, ionok) változásának függvényében
I(t) = I0 exp-t/τ r
r (t ) = r0 ∑ ai exp( −t / θ ) t
Dinamikus tulajdonságok vizsgálata • Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról •Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról
Mire emlékeztet az időfüggés?
5
Az aktin de novo polimerizációja Actin filament
Actin monomer
Példa alkalmazásra
Depolymerisation
Dimer Elongation
Nucleation
Trimer T. D. Pollard: Cell, 112, 453-465, 2003.
A forminok domé domén szerkezete
GBD
FH3
FH1
FH2
Kutatási kérdés
DAD
Mammalian Diaphanous-related formins
Formin homology (FH) domains: FH1, FH2, FH3 Rho-GTPase binding domain (GBD): Diaphanous Autoregulatory domén (DAD):
Hogyan változik meg az aktin filamentumok szerkezete a forminok kötődésének hatására?
Autoregulation
Alkalmazott mó módszerek
A mérések alapelve
Fehé Fehérjé rjék (formin, miozin miozin,, ak aktin, tropomiozin tropomiozin)) prepar álása. prepará sa.
twisting
bending
Mérések fluoreszcencia anizotró anizotrópia lecsengé lecsengés módszeré dszerével.
monomer rotation
segmental motion
6
Hogyan értelmezhetjük az eredményeket?
Az anizotrópia időfüggésének mérése
shorter rotational correlation time (ns)
600 400
5 4
A
3 2 1 0
0 1 2 3 4 5 [mDia1-FH2] (μM)
200 0
3,0 o
T = 30 C
0
1
2
3
[mDia1-FH2] (μM)
4
5
flexibility (arb. units)
longer rotational correlation time (ns)
800
Side - binding
2,5 2,0 1,5 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
3,0
1,0
o
T = 30 C flexibility (arb. units)
[mDia1-FH2+linker] : [actin]
A forminok megnövelték az aktin filamentumok flexibilitását.
2,5 2,0 1,5 1,0
End - binding
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
[mDia1-FH2+linker] : [actin]
Határérték anizotrópia (r0) További fogalmak, összefüggések
A teljes mozdulatlan, „fagyott” fluorofór anizotrópiája.
r0 =
2 ⎛ 3 cos 2 β − 1 ⎞ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ 5⎝ 2 ⎠
Abszorpciós vektor
z
β
Emissziós vektor
β: az abszorpciós és emissziós vektor által bezárt szög.
y β
r0
0
0.4
45
0.1
54.7
0
90
-0.2
x
Francis Perrin - 1926 Mitől függ az anizotrópia értéke?
ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ ⇒ flureszcencia depolarizáció
határérték anizotrópia
Perrin egyenlet:
- A rotációs mozgás gyorsaságától; rotációs diffúzió; - A rendelkezésre álló időtől; fluoreszcencia élettartam!
r=
r0 1+
τ
=
r0 1 + 6 Dτ
diffúziós állandó
Θ Rotációs korrelációs idő
Θ=
ηV RT
7
Perrin egyenlet
r=
r0 1+
τ
=
r~ • r0 • 1/τ • Θ • 1/D
r0 1 + 6 Dτ
Θ
FRAP
A „Photobleaching” fogalma
FRAP („Fluorescence Recovery After Photobleaching”)
fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója gerjesztő fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát elkerülése:
• cél: membrán-fehérjék laterális diffúziójának (DL) vizsgálata • • Fehérjék szelektív jelölése fluorofórral • • Fényforrás: lézer • • Mikroszkóp a fluoreszcencia detektálására • • „Photobleaching” = fotohalványodás (kifehéredés)
• anti-photobleaching oldat (pl. glükóz oxidáz – kataláz – merkaptoetanol) • expoziciós idő csökkentése • pulzusszerű gerjesztés • alacsonyabb intenzitású gerjesztő fény • ellenállóbb fluorofor (pl. Alexa)
használata: • háttér eliminálása • autoquenching • FLIP, FRAP
www.microscopyu.com
Módszer
Alkalmazás
1. Fluoreszcens minta
• Membránkomponensek laterális diffúziója • Monomer turnover / beépülés
2. Meghatározott terület „kiégetése” (pl. lézerrel)
4. Egyensúly beállta (általában: y < x)
Photobleach
• Fehérje motilitás • Diffúziós konstans meghatározás
Relativ fluoreszcencia (%)
3. Fluoreszcencia helyreállás
Lippincott-Schwartz, 2003
I0
I0 2
x
D=
y
0 t1/2
ω2 4t1/2
Idő
8
Összefoglalás
9
