A fluoreszcencia orvosibiológiai alkalmazásai A fluoresczencia orvosbiológiai alkalmazásai
Néhány példa: Fluoreszcencia mikroszkópia DNS szekvenálás (lánc terminációs módszer) DNS festés (EtBr) DNS microarray technológia Immunfluoreszcencia Fluoreszcencia-aktivált sejt válogatás (FACS)
Kellermayer Miklós
Förster rezonancia energia transzfer (FRET) “Fluorescence recovery after photoleaching” (FRAP) Fluoreszcens fehérje-konjugációs technikák Jelölés kvantum pontokkal (quantum dots) stb...
Fluoreszcencia alkalmazások •
Fluoreszcencia forrása
• •
Gerjesztett állapot lecsengési mechanizmusai
•
Speciális alkalmazások
•
Mikroszkópiák
Fluoreszcencia forrása I. fluorofór (rodamin)
Intrinsic (belső) fluorofórok: Pl. triptofán, tirozin fehérjékben (konjugált kettőskötés-rendszert tartalmazó aminosavak)
Intrinsic, extrinsic (jelölések, konjugációk)
Spektroszkópiás alkalmazások FRET
FACS, FRAP
TIRF, konfokális, kétfoton fluoreszcencia, szuperrezolució
Extrinsic (külső) fluorofórok: Kívülről bevitt festékmolekulák Módszer - "fluoreszcens jelölés" Problémák: kémiai specificitás és célozhatóság, térbeli specificitás és mobilitás
Fluoreszcens jelölés szempontjai: 1. spektrális tulajdonságok (pl. gerjesztési spektrum helye, szélessége, távolsága az emissziós maximumtól, emissziós spektrum helye a látható tartományban) 2. kvantumhatásfok 3. stabilitás (fotokifehéredési hajlam) 4. pislogás (blinking)
TMRIA
keresztkötő (jódacetamid)
Egyedi kvantumpont pislogás (“blinking”)
Fluoreszcencia forrása II.
Fluoreszcencia forrása III.
Fluoreszcens fehérjékkel való konjugálás
Kvantumpontokkal való jelölés (félvezető nanokristályok)
1. Zöld fluoreszcens fehérje (Green Fluorescent Protein, GFP) Méret: ~27 kDa, 238 aa
Mag (CdSe)
Szerkezet: 11-szálú β-hordó
Héj (ZnS)
Kromofór: a központi hélix Ser65-Tyr66-Gly67 oldalláncaiból
Polimer burok (kémiai aktiválás) Streptavidin (biotint köt kapcsolás)
20 nm
Fluoreszcencia 3D szerkezet intaktságától függ Tandem fúziós konstrukció a GFP és a vizsgált fehérje génjeiből Előnyök: in vivo mérések, mutánsokból spektrális variánsok állíthatók elő, melyek több különböző konstrukció együttes vizsgálatát is lehetővé teszik . Intenzitás (a.u.)
GFP-egér
Hullámhossz (nm)
Gerjesztés során elnyelt energia sorsa
Rendszerek közötti átmenet S→T
kisc
Fluoreszcencia kioltás (“quenching”)
Kvantumponttal konjugált ellenanyagokkal jelölt egér bélhám (vörös: aktin, zöld: laminin, kék: sejtmag)
Förster Rezonancia Energia Transzfer (FRET) Általánosan: •A gerjesztett állapotban lévő molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre.
ENERGIA
kf Fluoreszcencia (ns) Foszforeszcencia (ms)
kQ
rendkívül ellenállóak
• Pislogásra (blinking) hajlamosak
Emissziós spektrum
2. A GFP egyéb színű (kék, sárga, vörös) mutánsai 3. Fotoaktiválható GFP analóg 4. Kaede: korallból származó fluoreszcens fehérje, mely UV-indukálható zöld-vörös fotokonverziót mutat
kic
(részecske méretétől függ)
• Fotokifehéredéssel szemben
Gerjesztési spektrum
Hátrányok: pislogás, csak terminális (N vagy C) jelölés, a GFP a célfehérje működését szterikusan befolyásolhatja.
Belső konverzió (hő)
• Széles gerjesztési spektrum • Hangolható emissziós spektrum
kFRET Förster Rezonancia Energia Transzfer (FRET)
Sugárzásos és nem sugárzásos átmenetek!
•
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET): ha az energiatranszfer szereplői fluorofórok.
A FRET mechanizmusa
A FRET feltételei
A gerjesztett donor (D) relaxációjához hozzájárul az akceptor (A) molekula emissziója!
hν
+
-
D
E ~ kFRET ~ 1/R6
A -
+
Spektrális átfedés (átfedési integrál)
Fl intenzitás ill. OD
hν
hν
•Fluoreszcens donor (D) és akceptor (A) molekula. •A donor és akceptor molekula közötti távolság (R) 2-10 nm! •Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között.
R
Hullámhossz (nm)
A FRET távolságfüggése Förster-távolság
R06 E= 6 R0 + R 6
(Az a távolság melyen a FRET hatásfok felére csökken: transzferhatásfok 0.5)
A FRET alkalmazása • Molekuláris mérőszalag: távolságmérés a nm-es (10-9m) tartományban. • Nagyon érzékeny (lásd hatvány összefüggés)! • Alkalmazás: – Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása. – Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.
E
FRET mikroszkópia Donor emisszió
A fluorofórok (D-A) közötti aktuális távolság Transzfer hatásfok
R0
D-A Távolság
Akceptor emisszió
Fluorescence activated cell sorter (FACS)
Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
Fluoreszcencia aktivált sejtválogatás; Áramlási citometria (flow cytometry) • Fluoreszcensen fajlagosan megjelölt sejtszuszpenziót sejtenként analizálunk • Sok paramétert mérünk (fluoreszcencia intenzitás különböző hullámhosszokon, kis- és nagyszögű szórás) • Statisztikai analízist végzünk • Szükség esetén a sejteket szétválogathatjuk a paraméterek alapján Sejtszuszpenzió
Folyadékköpeny
Sejtmembrán, benne diffundáló fluoreszkáló molekulák
Citometriás statisztika
Megvilágítás intenzív lézerfénnyel
Kifehérítés előtti kép
Áramló sejtek
Diffúzió, fluoreszcencia intenzitás nő
Szűrők
w2 D= 4t D
Detektor Közel teljesen visszatért fluoreszcencia
Fókuszáló optika
Detektor
Dikroikus tükör
Sejtszorter
Szferikus sejtek
Kifehérítést azonnal követő kép Intenzitás (a.u.)
Lézer
Diffúziós állandó meghatározható a fluoreszcencia intenzitás visszatérésének időbeli lefutásából:
Lencsék és szűrők
D = diffúziós állandó w = kifehérített terület átmérője tD = időállandó
Idő (s)
Ovoid sejtek
Fluoreszcencia visszatérése
Lézer pásztázó konfokális mikroszkópia
Érzékenyített video mikroszkópia Izom Izomrost
Pásztázás Y
Miofibrillum
X
Szarkomer
“Konfokális elv” Objektív lencse Fókuszsíkból érkező nyaláb
50 μm Detektor
Rodamin-jelölt aktin filamentumok motilitása érzékenyített epifluoreszcencia videomikroszkópia
Minta
Vastag filamentum Szubsztrát Fókuszsíkon kívülről érkező nyaláb
“Pinhole”
Zöld: mikrotubulusok; Vörös: aktin; Kék: sejtmag
Teljes belső visszaverődés fluoreszcencia mikroszkópia (TIRFM) “Evaneszcens mező”
Egyedi enzimmolekulák TIRFM képe Foszfoglicerát kináz (PGK)
Kimogram
sejt
Üveglemez
Objektív lencse
Idő
Lézernyaláb
Flagelláris rotor
Alexa532-vel jelölt bakteriális flagellumok
50 μm
Intenzitás (a.u.)
Baktérium flagellum rendszere
Fotokifehéredés egy lépésben (sokaságban exponenciális függvény!)
PGK molekulák Alexa488-cal jelölve, TIRF mikroszkópia Idő (s)
Multifoton mikroszkópia
Szuperfelbontású mikroszkópia Kémiai Nobel-díj, 2014
•Két (vagy több) foton energiája összeadódik a gerjesztéskor •Gerjesztés (következésképp emisszió) csak a fókuszpontban (limitált fotokárosítás) •Gerjesztés nagy (közeli IR) hullámhosszú, rövid (fs) fényimpulzusokkal •Nagy hullámhossz miatt mély optikai behatolás (akár 2 mm)
A feloldási problémát pozíciómeghatározási problémává alakítjuk Feloldási probléma (Abbé-elv)
Pozíciómeghatározási probléma
“Sztochasztikus” adatgyűjtés egyedi fluorofórokról
(pontosság a fotonszámtól függ)
d
Fényemisszió
Gerjesztés
Gerjesztés
Fényemisszió
d=
λ=800 nm
λ=400 nm
x2
STORM (“stochastic optical reconstruction microscopy”); PALM (“photoactivated localization microscopy”)
Foton
Foton
0.61λ n sinα
ALAPÁLLAPOT
Mikrotubulusok
Egyfoton fluoreszcencia
Bekapcsolt fluorofórok 1
Bekapcsolt fluorofórok 2
Kétfoton fluoreszcencia Agykérgi piramissejtek
Zöld: proximális vesetubulusok; Vörös: albumin (plazma) Adatgyűjtési folyamat
Bekapcsolt fluorofórok 3
Bekapcsolt fluorofórok 4
Pozíciókból számított kép
Mikrotubuláris rendszer
