A fény Abszorpciós fotometria Fluoreszcencia spektroszkópia.
2010. október 19.
Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet
A fény elektromos térerısségvektor hullámhossz
E x B
A fény kettıs természete: Hullám (terjedéskor)
Részecske (kölcsönhatáskor)
• Elhajlás (diffrakció) • Interferencia • Polarizáció
• Fotoeffektus • Compton-effektus
x Transzverzális hullám
Az elektromos és a mágneses térerısség vektorai merılegesek egymásra, valamint a haladási irányra!
A spektrumok megjelenési formái vonalas (atomok (magas hımérséklető, ritka gázok)) széles hullámhossz tartományokat nulla intenzitás jellemez a spektrumvonalak pozíciói a fényt kibocsátó kémiai elemre jellemzıek (kémiai összetevık, koncentráció)
sávos (molekulák) sok, egymáshoz közeli vonal megjelenésük a molekula forgásával, illetve a molekulát alkotó atomok vibrációival (rezgéseivel) kapcsolatos
folytonos (hevített anyagok)
Sir Isaac Newton (1642–1727)
a folytonos spektrumban minden hullámhossz képviselve van, és a szomszédos hullámhosszak intenzitásai folytonosan kapcsolódnak egymáshoz, vagyis a spektrumban nincsenek ugrásszerő intenzitásváltozások Emissziós (kibocsátási) illetve abszorpciós (elnyelési) színképek
Magas hımérsékleten izzó szilárd és folyékony anyagok
Joseph von Fraunhofer (1787–1826) Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a szoláris kromoszférában lévı elemeknek a Nap forró belsejérıl kibocsátott látható sugárzás bizonyos hullámhosszain történı abszorpciója okoz.
Izzó gázok emissziós spektruma
Izzó gázok abszorpciós spektruma http://astro-canada.ca/_en/a3300.html
Néhány elem vonalas (emissziós) spektruma
A spektrum • Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. • Egy intenzitás-jellegő mennyiség ábrázolva egy energiajellegő mennyiség függvényében.
He
energia és azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám)
Ne
intenzitás, beütésszám (pl. radioaktivitás mérése), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD)
abszorpció
Ar
λ (nm)
Fény és anyag kölcsönhatása • Kvantált energiafelvétel (foton) • Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: • visszaverıdhet (reflexió) • elnyelıdhet (abszorpció) • áthaladhat (transzmisszió) a biológiai hatás létrejöttének feltétele!
A fényabszorpció A beesı fénynyaláb elektromos tere az útjába esı kis részecskék töltéseit rezgésre kényszeríti apró oszcillátorok vagy „rádióadók” elektromágneses hullámokat bocsátanak ki Ha ez a rezonanciafrekvencia: a rezgési amplitúdó megnı, „belsı súrlódás” lép fel az oszcillátor energiája lecsökken az anyag részlegesen elnyeli a sugárzást
Transzmisszió Gerjesztı fény f rezonancia
Atomi/molekuláris rendszer I0
Fényintenzitás-változás
I
I0
I
detektor
minta
fényforrás
T = I / I0 Általában százalékban (%) adjuk meg.
Abszorpció
Az abszorpció …
E ≈ OD ≈ A = lg (I0/I) = ε(λ) c x .
I = I0
.10-ε(λ) x c
Lambert-Beer törvény
.
Megjegyzés: a transzmittancia nem additív: ha az egyik komponens átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettı együtt NEM 90%ot fog átengedni!
ε(λλ): az extinkciós koefficiens (anyagi minıségtıl függ), c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz
Miért
ε(λ) és nemcsak ε?
Hogyan mérjük az abszorpciót?
abszorpció
fotometria = abszorpciós spektroszkópia Egy fotométer egyszerő sémája:
fényforrás
monokromátor
minta
Prizma vagy optikai rács + rés
λ (nm) Mert az abszorpció λ függı, így az ε is az kell hogy legyen!
Folytonos fényő, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa
mőanyag, üveg, kvarc küvettákban
detektor
Egy- és két-utas fotométerek
Az emisszió és az abszorpció mérése
A fotométer linearitása; “stray light effect”
Tér bármely irányából!
emisszió
Várható tendencia
abszorpció
Csak lineáris elrendezésben!
ε
abszorpció
Meredekség:
koncentráció
A fotométer linearitása; “stray light effect”
Kicsi abszorpció mellett
A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok!
I0 99% λkiválasztott
Optikai rács
Második, harmadik, stb. felharmónikusok megjelenése!
I minta 89% λkiválasztott
és
és
1% λfelharmónikus
1% λfelharmónikus
Nagy abszorpció mellett
I0
• Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál jelentkezhet a „stray light effect” mellett!
I
minta
99% λkiválasztott
Fényszórás
1% λkiválasztott
és
és
1% λfelharmónikus
1% λfelharmónikus
minta
Ezt is érzékeli a detektor!!!
A fehérjék abszorpciójának értelmezése
Az abszorpciós fotometria alkalmazásai • Különbözı oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása • híg oldatok esetén használatos (az oldatban lévı molekulák nem befolyásolják egymás energiaszintjeit) • Idıfüggı változások nyomon követése • Elektroforetikus minták kiértékelése
Abszorpció egyéb alkalmazása
Idıfüggı mérések
SDS-PAGE minták kiértékelése 0,2 0,0
Abszorpció
Anyagi, minıségbeli, szerkezeti változások követése (pl. kémiai reakciók hatására)
-0,2 -0,4 0
1000
2000
idõ (s)
3000
4000
Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hımérséklet miatt világít („hideg emisszió”). Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia. Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük.
Lumineszcencia alapjelensé alapjelenségek, paramé paraméterek
o Ha S0 alapállapotú molekulát E= h*n energiával gerjesztünk, 10-15 s alatt S1 gerjesztett állapotba kerül (igen ritkán: S2 állapotba)
Gerjesztés módjai ofotonabszorpció (fotolumineszcencia) okémiai reakció (kemilumineszcencia) obiokémiai reakció (biolumineszcencia) oradioaktív bomlás energiája (radiolumineszcencia)
Az energiaszintek felhasadnak: Vibrá Vibráció ciós szintekre (atommagok rezgı rezgı mozgá mozgása) Ezek tová tovább rotá rotáció ciós szintekre (atommagok tengely kö körüli forgá forgásából)
o A foton-abszorpció során az elektron spin állapota nem változik meg
1,51,5-IAEDANS
Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettıs kötéseket tartalmazó győrőkkel rendelkeznek
Termikus relaxáció: A „forró” molekula és a környezete közti hıcsere (Vibrációs relaxáció: a vibrációs energia hıvé alakul)
Fotoemisszió: A gerjesztett molekula alapállapotba kerül egy foton kisugárzása révén
Kasha-szabály: A fluoreszcencia-emisszió az elsı gerjesztett állapot legalacsonyabb vibrációs szintjérıl történik Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik
o A rendszer alapállapotra törekszik: A molekula olyan vibrációs szinten van, ami nem felel meg a környezettel való termikus egyensúlynak • S2-S1 átalakulás: 10-12 s alatt • S1-S0 átalakulás: 10-8 s alatt
S1-S0 nem spintiltott (internal conversion=IC) conversion=IC) S 1 - T1 átalakulá talakulás: spintiltott folyamat (spinvá spinváltó ltó átmenet, intersystem crossing=ISC) crossing=ISC)
Az S1-S0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában:
a. Fluoreszcencia Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba Lecsengése: nanoszekundumos (10-9) nagyságrendő
b. Foszforeszcencia S1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T1 triplett állapotba kerül ebbıl sugárzási energia kibocsátásával kerül S0 alapállapotba (tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínőséggel) Lecsengése: 10-6-10 s
c. Késleltetett fluoreszcencia T1 állapotból termikus gerjesztéssel S1 állapotba, majd onnan S0ba („magas hımérséklető foszforeszcencia”)
A lumineszká lumineszkáló anyagot jellemzi: Abszorpció Abszorpciós-, fluoreszcenciafluoreszcencia-, foszforeszcencia gerjeszté gerjesztési és emisszió emissziós spektruma Sugá Sugárzá rzás kvantumhatá kvantumhatásfoka Gerjesztett állapot élettartama Emisszió Emisszió polarizá polarizáció ciófoka (anizotró (anizotrópiá piája)
Fluoreszcencia emissziós spektrum Az elsı szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjérıl az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik. Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszerérıl.
Foszforeszcencia emissziós spektrum Az elsı triplett gerjesztett állapotból a szingulett állapotba való átalakuláskor keletkezik. Szobahımérsékleten csak kristályos anyagokon (oldatban: kioltók pl. O2) figyelhetı meg. A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltoldódott.
Az emissziós spektrum A kisugárzott fény teljesítménysőrőségének hullámhossztól való függését kifejezı függvény:
∆JE / ∆λ (λ) Azt a sugárzási intenzitást jelöli, mely egy adott hullámhossz ∆λ környezetében mérhetı. A ∆λ intervallumot a rés szélessége határozza meg.
Gerjesztési spektrum o Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk. o Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. o Függvényalakja az abszorpciós spektruméval egyezik meg, de csak az adott hullámhosszon emittáló komponensre jellemzı.
Stokes-eltolódás
A mérés alapelvei Legfontosabb probléma: a gerjesztı fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése
I. Fluoreszcencia mérésénél: A gerjesztési és észlelési irányok célszerő megválasztása Három elrendezés
1. Az észlelés iránya merıleges a gerjesztés irányára
2. Az gerjesztés és az észlelés iránya „párhuzamos” A minta elülsı oldaláról kilépı fluoreszcenciát érzékeljük
3. A minta gerjesztéssel ellenkezı irányú, hátsó oldaláról detektálunk
II. Foszforeszcencia mérésénél A gerjesztı fény a foszforeszcenciafénytıl idıben elkülönüljön Az intenzitás idıbeli változása is mérhetı legyen Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyıvel eltakarjuk Ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény Az az idı, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik: függ a forgási sebességtıl függ a nyílások számától Gyakorlatilag elérhetı legrövidebb idı: 10-5 s nagyságrendő Mindig alacsony hımérsékleten kell mérni
!! Fényszőrık, monokromátorok!!
A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztı fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át
Köszönöm a figyelmet!
Negyedfordulat után a gerjesztı fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén
