A fény
Abszorpciós fotometria Ujfalusi Zoltán PTE ÁOK Biofizikai Intézet
2013. január
Elektromágneses hullám elektromos térerősségvektor hullámhossz
Transzverzális hullám
E x
mágneses térerősségvektor
B Az elektromos és a mágneses térerősség vektorai merőlegesek egymásra, valamint a haladási irányra!
x
• James Clerk Maxwell (1864) • Heinrich Rudolf (1888) elméleti szinten igazolta létezésüket. létezésüket kísérletesen bizonyította.
Spektroszkópia - Színképvizsgálat Spektro-: görög; jelentése kép/szín -szkópia: görög; nézés/látás/vizsgálat
A spektroszkópia célja Anyag kvalitatív és/vagy kvantitatív megismerése: Anyagi minőség – összetétel: karakterisztikus, „ujjlenyomat” Szerkezet
abszorpció
Az anyag időbeli változásának nyomon követése: (időbontásos spektroszkópia) Anyagi minőségbeli változás (pl. kémiai reakció hatására), Szerkezeti változások követése (gyors kinetikai folyamatok vizsgálatára is alkalmas)
(nm) Vizsgálatok EM sugarakkal (pl. fény)
Nem látjuk a molekulát, hanem a spektrum (változása) alapján, fizikai ismereteink segítségével következtetünk a szerkezetre (ill. a módosulásra)!
1
A spektrum
Folytonos emissziós spektrum:
Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. Egy intenzitás-jellegű mennyiség ábrázolva egy energia-jellegű mennyiség függvényében.
abszorpció
intenzitás, beütésszám (pl. radioaktivitás mérése), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD)
energia és azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám)
Magas hőmérsékleten izzó szilárd és folyékony anyagok.
Vonalas emissziós spektrum: Meleg gázok emissziós spektruma.
Vonalas abszorpciós spektrum: (nm)
Hideg gázok abszorpciós spektruma. http://astro-canada.ca/_en/a3300.html
Fény és anyag kölcsönhatása
Fontos fizikai mennyiségek, összefüggések
Kvantált energiafelvétel (foton)
Frekvencia: vagy f (1/s)
c f
Hullámhossz: (m)
Hullámszám:
visszaverődhet (reflexió) elnyelődhet (abszorpció)
1
(cm-1)
Energia:
Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás:
áthaladhat (transzmisszió)
E (J)
h.f
A biológiai hatás létrejöttének feltétele!
Einstein: foton (fénykvantum) energiája
Extinkc. koeff.: (M-1cm-1 vagy (mg/ml)-1cm-1)
Aktin molekula sávos (abszorpciós) spektruma 2.5
molekuláris rendszer 0 S2
Az atomok vonalas és a molekulák sávos színképe karakterisztikus (az anyagi minőségtől függ)!
1.5 1.0 0.5
S1 h
Abszorpció
aktin
S0
0.0 260
270
280
290
300
310
320
1. Excitáció (gerjesztés) Abszorpció (elnyelés) A gerjesztés/abszorpció feltétele:
Energia
2.0
Abszorbancia vagy OD
Jabłonsky-féle termséma
DE = h (rezonancia feltétel)
A foton energiájától függően létrejöhet: • elektromos • vibrációs • rotációs átmenet • ezek keveréke
Hullámhossz (nm)
2
Miért sávos a molekulák színképe?
Abszorpció
molekuláris rendszer 0 S2
Energia
rotációs szintek S1
S0
vibrációs szintek
I = I0 .10-
vibrációs szintek
()
xc
Lambert-Beer törvény
(): az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz
elektromos szintek: S0, S1, S2
Számítási feladat I.
Az abszorpció … - legyen könnyen érthető
Határozza meg egy ismeretlen oldat koncentrációját!
- legyen jól mérhető Adott:
- additív
E(450) = 0,45
E ≈ OD ≈ A = - log (I / I0) = () c x .
.
E(450) = (450) · c · x
(450) = 2,25 (mg/ml)-1cm-1 Optikai úthossz (x) = 1 cm
c = E(450)/((450)· x)
•c=? c = 0,45 / (2,25 (mg/ml)-1cm-1 · 1 cm)
c = 0,2 mg/ml
Miért () és nemcsak ?
Számítási feladat II/A Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját μM-ban (λ=280 és 290 nm-en)!
abszorpció
Adott:
(nm) Mert az abszorpció függő, így az is az kell hogy legyen!
•
E(280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték !!!)
•
E(290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték !!!)
•
(280) = 1,11 ml·mg-1·cm-1
•
(290) = 0,63 ml·mg-1·cm-1
•
Optikai úthossz (x) = 1 cm
0,1867 · 11 = 2,0537 E(290) = (290) · c · x c = E(290)/((290)· x) c = 3,2598 mg/ml
•c=? Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mM anyagmennyiségnek felel meg:
c = ~ 75 mM
3
Számítási feladat II/B
Transzmisszió
Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját μM-ban (λ=280 és 290 nm-en)!
•
E(280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték !!!)
•
E(290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték !!!)
•
(280) = 1,11 ml·mg-1·cm-1
•
(290) = 0,63 ml·mg-1·cm-1
•
Optikai úthossz (x) = 1 cm
I
I0
Adott: 0,3289 · 11 = 3,6179 E(280) = (280) · c · x c = E(280)/((280)· x)
detektor
minta
fényforrás
c = 3,2598 mg/ml
T = I / I0 Általában százalékban (%) adjuk meg.
•c=? Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mM anyagmennyiségnek felel meg:
c = ~ 75 mM
Megjegyzés: a transzmittancia (T=I/I0) nem additív!
Hogyan mérjük az abszorpciót?
Számítási feladat III.
Egy fotométer működésének elméleti sémája
A) 10% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = OD = - log (I/I0) = - log (0,1) = 1 B) 50% transzmittanciájú anyag abszorbanciája?
Folytonos fényű, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa
Prizma + rés vagy optikai rács + rés Rés mérete változtatható!
monokromátor
fényforrás
műanyag, üveg, kvarc küvettákban
Minta
Detektor 1
Referencia (blank)
Detektor 2
A = 0,301 C) Ha a 10% és az 1% transzmittanciájú anyagot együtt használjuk, mennyi lesz az eredő transzmittancia és abszorbancia? A = 1+2 = 3,
T = 0,01·0,1 = 0,001 = 0,1 %
Az alapelv
Referencia csatorna
Időbeli instabilitások (például a lámpáé) kiküszöbölődnek.
Fény Elektromos jel
Kiértékelés (PC)
Az emisszió és az abszorpció mérése Fényforrás
PMT
Diffrakciós rács
Minta
emisszió
Tér bármely irányából!
Rés
abszorpció
Csak lineáris elrendezésben!
Fény detektálás: Elektromágneses sugárzás átalakítása elektromos jellé (feszültségváltozássá).
4
A fotométer linearitása; “stray light effect”
A fotométer linearitása; “stray light effect” A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok!
Várható tendencia
abszorpció
Meredekség:
Második, harmadik, stb. felharmónikusok!
Optikai rács koncentráció
Kicsi abszorpció mellett I0
I
Nagy abszorpció mellett I0
minta
I
minta
99% kiválasztott
89% kiválasztott
99% kiválasztott
és
és
és
és
1% felharmónikus
1% felharmónikus
1% felharmónikus
1% felharmónikus
1% kiválasztott
Ezt is érzékeli a detektor!!!
Fényszórás
Az abszorpciós fotometria alkalmazásai
Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál már számottevő lehet a „stray light effect” mellett!
Különböző oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása Időfüggő változások nyomon követése
minta Elektroforézis minták kiértékelése
5
Fehérjék abszorpciójának mérése
Időfüggő mérések
Az alapvonal (baseline) jelentősége
Fehérje
Anyagi, minőségbeli,
PUFFER!!!
szerkezeti változások
Abszorpció
0.2 0.0
-0.2 -0.4
Követése (pl. kémiai reakciók hatására)
0
1000
2000
3000
4000
idő (s)
Additivitás abszorbancia
Elektroforézis minták kiértékelésénél
*
fehérje
Fluoreszcens jelölő
(nm) Kiszámolható a fehérje és a jelölő koncentrációja és így a jelölési arány.
Számítási feladat IV. Határozza meg egy fluoreszcensen (IAEDANS) jelölt ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját μM-ban és jelöltségének arányát %ban kifejezve! Adott: • E(290) = 0,269 (21x-esen hígított érték !!!) • E(336) = 0,047 (21x-esen hígított érték !!!) • (290) = 0,63 ml·mg-1·cm-1
E(korr.) = 0,259
c(aktin) = 198,5 mM
• Optikai úthossz (x) = 1 cm • c(aktin) = ? • Jelöltség = ?
E(korr.) = E(290)-0,21·E(336)
E = () · c · x
• (336) = 6100 M-1·cm-1
• c(IAEDANS) = ?
Korrigálni kell a 290 nm-en mért abszorpcióra!!!
c(IAEDANS) =
81,5 %
0,047 21106 6100
c(IAEDANS) = 161,8 mM
6
