A fény
Abszorpciós fotometria Barkó Szilvia PTE ÁOK Biofizikai Intézet
2011. február
A fény elektromos térerősségvektor hullámhossz
E x B
A fény kettős természete: Hullám (terjedéskor)
Részecske (kölcsönhatáskor)
• Elhajlás (diffrakció) • Interferencia • Polarizáció
• Fotoeffektus • Compton-effektus
x Transzverzális hullám
Az elektromos és a mágneses térerősség vektorai merőlegesek egymásra, valamint a haladási irányra!
Vizsgált sugárzás színképre (spektrum) bontható.
A spektrumok megjelenési formái vonalas (atomok (magas hőmérsékletű, ritka gázok)) széles hullámhossz tartományokat nulla intenzitás jellemez a spektrumvonalak pozíciói a fényt kibocsátó kémiai elemre jellemzőek (kémiai összetevők, koncentráció)
sávos (molekulák)
sok, egymáshoz közeli vonal megjelenésük a molekula forgásával, illetve a molekulát alkotó atomok vibrációival (rezgéseivel) kapcsolatos
folytonos (hevített anyagok)
Sir Isaac Newton (1642–1727)
a folytos spektrumban minden hullámhossz képviselve van, és a szomszédos hullámhosszak intenzitásai folytonosan kapcsolódnak egymáshoz, vagyis a spektrumban nincsenek ugrásszerű intenzitásváltozások Emissziós (kibocsátási) illetve abszorpciós (elnyelési) színképek
1
Magas hőmérsékleten izzó szilárd és folyékony anyagok
Joseph von Fraunhofer (1787–1826) Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a szoláris kromoszférában lévő elemeknek a Nap forró belsejéről kibocsátott látható sugárzás bizonyos hullámhosszain történő abszorpciója okoz.
Izzó gázok emissziós spektruma
Izzó gázok abszorpciós spektruma http://astro-canada.ca/_en/a3300.html
Néhány elem vonalas (emissziós) spektruma
A spektrum • Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. • Egy intenzitás-jellegű mennyiség ábrázolva egy energiajellegű mennyiség függvényében.
He
energia és azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám)
Ne
intenzitás, beütésszám (pl. radioaktivitás mérése), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD)
abszorpció
Ar
(nm)
Fény és anyag kölcsönhatása • Kvantált energiafelvétel (foton) • Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: • visszaverődhet (reflexió) • elnyelődhet (abszorpció) • áthaladhat (transzmisszió) a biológiai hatás létrejöttének feltétele!
A fényabszorpció A beeső fénynyaláb elektromos tere az útjába eső kis részecskék töltéseit rezgésre kényszeríti apró oszcillátorok vagy „rádióadók” elektromágneses hullámokat bocsátanak ki Ha ez a rezonanciafrekvencia: a rezgési amplitúdó megnő, „belső súrlódás” lép fel az oszcillátor energiája lecsökken az anyag részlegesen elnyeli a sugárzást
2
Transzmisszió Gerjesztő fény f rezonancia
Atomi/molekuláris rendszer I0
Fényintenzitás-változás
I
I0
I
detektor
minta
fényforrás
T = I / I0 Általában százalékban (%) adjuk meg.
Abszorpció
Az abszorpció … - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - legyen additív
E ≈ OD ≈ A = - log (I / I0) =
I = I0 .10-
( )
xc
az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz
és nemcsak ?
abszorpció
( )
.
Megjegyzés: a transzmittancia (T=I/I0) nem additív: ha az egyik komponens átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettő együtt NEM 90%-ot fog átengedni!
Hogyan mérjük az abszorpciót?
fotometria = abszorpciós spektroszkópia Egy fotométer egyszerű sémája:
fényforrás
függő, így az
monokromátor
minta
detektor
Prizma vagy optikai rács + rés
(nm) Mert az abszorpció
c x
Lambert-Beer törvény
( ):
Miért
( ).
is az kell hogy legyen!
Folytonos fényű, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa
műanyag, üveg, kvarc küvettákban
3
Egy- és két-utas fotométerek
A fotométer linearitása;
Az emisszió és az abszorpció mérése
“stray light effect”
Tér bármely irányából!
emisszió
Várható tendencia
abszorpció
Csak lineáris elrendezésben!
abszorpció
Meredekség:
koncentráció
A fotométer linearitása; “stray light effect”
Kicsi abszorpció mellett
A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok!
I0 99%
Optikai rács
Második, harmadik, stb. felharmónikusok!
kiválasztott
I
minta 89%
és 1%
felharmónikus
kiválasztott
és 1%
felharmónikus
4
Nagy abszorpció mellett I0 99%
kiválasztott
1%
kiválasztott
1%
felharmónikus
és 1%
felharmónikus
• Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál jelentkezhet a „stray light effect” mellett!
I
minta
Fényszórás
és
minta
Ezt is érzékeli a detektor!!!
Az abszorpciós fotometria alkalmazásai
A fehérjék abszorpciója
• Különböző oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása • híg oldatok esetén használatos (az oldatban lévő molekulák nem befolyásolják egymás energiaszintjeit) • Időfüggő változások nyomonkövetése • Elektroforézis minták kiértékelése
A fehérjék abszorpciójának értelmezése
Fehérjék abszorpciójának mérése Az alapvonal (baseline) jelentősége
Fehérje PUFFER!!!
5
Fehérjék abszorpciójának mérése
Fehérjék abszorpciójának mérése
Additivitás
Fehérjék abszorpciójának mérése
abszorpció
Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása
fluoreszcens próba
fehérje
(nm)
Időfüggő mérések 0,2 0,0
Abszorpció
Anyagi, minőségbeli, szerkezeti változások követése (pl. kémiai reakciók hatására)
-0,2 -0,4 0
1000
2000 idõ (s)
3000
4000
6
