Emissziós fotometria (lángfotometria)
Az emissziós fotometria alapjai • Alkáli fémek és alkáli földfémek mérési eljárása oldatokból, a termikus gerjesztés hatására kibocsátott karakterisztikus hullámhosszúságú sugárzás alapján. • A színtelen láng elszíneződik azáltal, hogy a lángban található anyagok hőenergia hatására „gerjesztett” állapotba kerülnek amennyiben elektronjaik átmenetileg egy külső elektronhéjra jutnak. Amikor az elektron visszatér eredeti elektronhéjára a gerjesztéssel felvett energiát fénysugárzás formájában leadja. • A kibocsátott fény hullámhossza, így színe jellemző a különböző fémekre.
• • •
Ha egy elem a lángban atomos formában található vonalas színképet szolgáltat (pl. alkálifémek Na, K). Az alkáli földfémek (Ca) szélesebb alapú emissziós sávban sugároznak. A lángnak van háttérsugárzása is.
Lángfotométer
Lángfotometriás ion meghatározások • Na, K, Ca • A vizsgálati anyagnak csak mintegy 1-5%-a kerül a lángba (érzékenység) • A szükséges energia nagysága függ a meghatározandó anyagtól. Túl magas hőmérsékletben az anyagok ionizálódnak, az ionok nem gerjeszthetők, csak az atomok. • Fontos a mért anyag koncentrációja a mintában, ettől függ a hígítás mértéke: Na-nál a hígítás 200-szoros. • A fény emissziót egy ismert oldat koncentrációjával hasonlítjuk össze (standard). • A standard oldatokban az ionösszetétel hasonló kell, hogy legyen a széruméhoz
Nátrium • A lángfotometriás meghatározásra az 589 nmes Na-vonal szolgál • A vizsgálathoz a szérumot erősen hígítani kell: 1:200 arányban • Normálérték: 135-145 mmol/l • A Cl- és HCO3 mérésekkel együtt jó felvilágosítást az a plazma ozmolalitásáról • A vese disztális tubulusban az aldoszteron fübbvényében szívódik vissza
Hipernatrémia • Csökkent folyadékbevitel és fokozott vízvesztés • Diabetes insipidus (centrális, renális) • Primér és szekunder hiperaldoszteronizmus
Hiponatrémia • Excesszív folyadékbevitel só nélkül • Ödéma (szívelégtelenség) • Aldoszteron hiány • Pszeudohiponatrémia – sok lipid vagy fehérje felszaporodás a vérben
Kálium • 97%-a intracelluláris és csak 3%-a az extracelluláris • A disztális tubulusban a kiválasztás az aldoszteron és az aciditás függvénye: aldoszteron fokozza, az acidózis csökkenti a kiválasztást a vesében
Kálium meghatározása • Lángfotometria és ionszelektív elektródok • Lángfotometria: 768 nm K-vonal • Szérumból 1:20-as hígítással • Normálérték: 3,5-5,0 mmol/l • Már csekély hemolízis növeli a mért értéket • Trombociták tartalmazzák, trombocitózis esetén akár 3 mmol/l-el is nőhet a mért koncentráció
Hiperkalémia • Akut és krónikus veseelégtelenség • Aldoszteron hiány • Inzulin hiány • Szívglikozid mérgezés (Na/K ATPáz gátlás) • Acidózis (a vér pH csökkenése 0,1-el 0,4-1,2 mmol/l-nyi emelkedéssel jár • Sejtpusztulás
Hipokalémia • Gasztrointesztinális K vesztés (pl. hasmenés) • Aldoszteron túlprodukció • Májcirrhosis (Aldo lebontása csökkent) • Renális tubuláris acidózis
Kálcium • 1%-a van az extracelluláris térben • Plazmában: 50%-a ionizált, 40%-a fehérjéhez kötött, 10%-a komplexeket alkot (citrát-, foszfát-, hidrogénkarbonát-, laktát-, stb.) • Acidózisban csökken a fehérjéhez kötött mennyiség, ekkor még alacsony koncentráció mellett sem alakulnak ki izomgörcsök • Anyagcseréje kapcsolódik a foszfátéhoz ezért azzal együtt kell vizsgálni mind a szérumban, mind a vizeletben • A PTH és a D3 emeli a szérum koncentrációt, a kalcitonin csökkenti
A szérum kalcium szint meghatározása • (Lángfotometria) és ion szelektív elektródokkal • Megbízható eredményt ad az atomabszorpciós fotometria is. • Normálérték: 2,2-2,6 mmol/l • Nem megfelelően elöblített üvegedények miatt felülmérjük (a csapvíz sok kálciumot tartalmaz)
Elektrolit meghatározások ionszelektív elektródokkal
potenciometria
Ionszelektív elektródok • Mindig tartalmazzák a mérendő iont • Üveg vagy műanyag alapúak • Mérő és vonatkozási elektródok • Mérhető ionok: Na+, K+, Ca++, Cl• H+ szelektív elektród – pH mérés
Valinomicin – K+ érzékeny üvegelektróda
Ionizált kálcium meghatározása • A mérőelektróda polivinilklorid membrán, amiben ioncserélőként hosszú szénláncú zsírsavakat alkalmaznak • Normálérték: 1,1-1,3 mmol/l • Zavaró mérési tényezők: – Ha a minta EDTA-t tartalmaz – A minta ionerőssége nő
Hidrogén ion meghatározás pH mérő
pH mérő elektrokémiai sémája az elektrokémiai változások a fázisok felületén jelentkeznek
mérendő anyag
M – fém (metal) ML – vonatkozási elektród MR - mérő elektród S – különböző fázisok S1 – telített KCl oldat S2 – mérendő anyag fázisa
Savak és bázisok definíciója •
Savak olyan vegyületek, melyek H+ ionokat képesek leadni (protondonátorok). A bázisok olyan vegyületek, melyek H+ ionokat képesek felvenni (protonakceptorok)
•
Pufferek – gyenge savat és a hozzá tartozó bázist tartalmazzák
•
Puffer-egyenlet
Henderson Hasselbach egyenlet: [A-] pH = pK’a + log -------[HA] A pK’a a gyenge sav disszociációs konstansának negatív logaritmusa. A szénsav-bikarbonát puffer esetében az értéke 6,10 [HCO3-] pH = pK’a + log -------------- = 7,40 [H2CO3]
A vér pufferrendszerei • • • • • •
Plazma hidrogénkarbonát Vvt hidrogénkarbonát Hbg és oxi-Hbg Plazma fehérjék Szerves foszfátok Szervetlen foszfátok
35% 18% 355 7% 3% 2%
Vér pH és sav-bázis egyensúly mérése •
A pH mérés és a sav-bázis egyensúly mérése kapilláris üvegelektróddal történik 30-100 l vér vagy puffer felszívása után
•
A pCO2 mérése – Lehet pCO2 elektróddal, ami széndioxidot érzékelő H+ elektród – Közvetett módszer a Siggard-Andersen módszer • A vért két különböző szén-dioxid parciális nyomású gázzal equilibrálja a készülék és méri a megfelelő pH értékeket • Ebből kiszámíthatók: pCO2, a plazma szabad bikarbonát koncentrációja, és a bázisfelesleg
•
A pO2 mérése: Clark elektróddal: az oxigén platina elektródon redukálódik, ami potenciál változást hoz létre, ami azonos az oxigén tenzióval
•
Normális vérgáz és pH értékek: – pH
7,35-7,44
– pCO2
35-45 Hgmm
– Standard bikarbonát
22-26 mmol/l plazma
– Bázisfelesleg
-2 - +2 mmol/l teljes vér
– pO2
75-100 Hgmm
lángfotometria
Atomabszopciós fotometria összehasonlítva a lángfotometriával Atomabszopciós fotometria esetén a fényforrás a vájt-katód lámpa, mely ua. fémből készül mint amelyik fém koncentrációját mérni akarjuk. Ez a fémre jellemző rezonancia vonalat (fotont) bocsát ki.
atomabsz. fotometria
A rezonancia vonalnak megfelelő fotont a lángban atomossá vált fém elnyeli tehát gyengül a besugárzott fény intenzitása (fotometria) a gyakorlatban mért fémek: - ólom - réz - aluminium - nikkel (- Mg, Ca) - a szérum Fe mérésére nem aslkalmas, mert a nyomokban előforduló Hbg zavar
Atomabszopciós fotometria •
Az atomok gázállapotba kerülnek magas hőmérsékleten
•
Az abszorpció méréséhez olyan hullámhosszúságú sugárzás szükséges, amelyet a vizsgálandó elem termikusan gerjesztett állapotban kisugároz. Pl. az aluminium meghatározásához aluminium vájtkatódos lámpa szükséges.
•
A gerjesztő és a rezonanciasugárzás hullámhossza azonos
•
A fotometriához hasonlóan itt is fénygyengülést mérünk
•
Ólom meghatározás: ólommérgezés gyanúja
•
Réz meghatározás: Wilson kór gyanúja
•
Aluminium meghatározás: veseelégtelenségben felhalmozódik és lerakódik a szövetekben. Alumíniumot tartalmazó gyógyszer szedése tilos (pl. foszfátkötő gyógyszerek)
Fluoriméter
excitáció
fluoreszcencia „quenching” spontán leépülés
foszforencencia
emisszió
fluoreszcencia • Excitációs (gerjesztő) fény versus emissziós (másodlagos) fény – mindkettő jellemző a vizsgált molekulára • A másodlagos fény hullámhossza mindig nagyobb a gerjesztő fényénél • A másodlagos fény intenzitása egyenesen arányos az anyag koncentrációjával
Fluorimetriás módszerek alkalmazása a klinikai kémiában • Ott alkalmazzák, ahol nem áll rendelkezésre megbízható fotometriás tesz, mert nagyon érzékeny a szennyeződésekre (ionok, detergensek). – Porfirinek: uro- kopro- protoporfirinek – Katecholaminok: adrenalin, noradrenalin
• Fluoreszcencia immun-meghatározások
Coulometria • A reakcióhoz a titráló ionokat elektromos árammal generáljuk, pl. a Cl- ion koncentráció meghatározásához ezüst elektródáról Ag+ ionokat. Tehát a fogyott elektromos töltés mennyiségét mérjük • A generált titráló anyag felszabadításához szükséges elektromos áram mennyisége (tötése) mérhető • A Cl- ion meghatározására használják szérumból, vizeletből és liquorból. A Cl- ion koncentrációja a szérumban: 98-110 mmol/l • Az Ag+ ion a brómot és a jodidot is precipitálja, de ezek mennyisége a testnedvekben elhanyagolható • A vvt-től gyorsan el kell választani a szérumot (plazmát) mert a hidrokarbonát ion a vvt-ből Cl- ionra cserélődik ki és csökken a szérum Cl- ion tartalma
A cerebrospinális folyadék és a lumbálpunkció
Anatómia és fiziológia Az agyat és a gerincvelőt 3 réteg veszi körül: - dura mater - bolyhos arachnoidea - pia mater
• •
• •
A CSF plazma ultrafiltrátum, a fehérjék 80%-a transzudátum, míg 20%-a helyben képződik A CSF tiszta folyadék, kb. 140 ml. Naponta 500 ml képződik, ennek 70%- a plexus chorioideusokban, 30%-a a kapillárisokból és a metabolikus vízből származik BBB (vér-agy gát), BCB (vér-CSF gát) CSF összetétel: vvt nincs, pár fehérsejt, a fehérjék az ultrafiltrációnak megfelelően molekulaméretükkel fordított arányban vannak, glukóz konc. a vér 60%-a
A CSF eltérései Mikroszkópos vizsgálat • Nagyszámú leukocita figyelhető meg fertőzés és malignitás esetén • A neutrofilek magas aránya (>800/ml) bakteriális meningitisre utal • Mononukleáris sejtszaporulat jellemző a krónikus meningitisre, vírusos meningoencephalitisekre, részben gyógyult bakteriális meningitisre, krónikus gyulladásra és malignus meningeális infiltrációra • Vvt szubarachnoideális vérzésre vagy traumára utal. A xanthochromia megerősíti a szubarachnoideális vérzés gyanuját.
A CSF eltérései glukóz • Lényegesen csökken (<1mmol/l) akut bakteriális meningitisben és meningitis tuberculosában • Enyhébb glukóz szint csökkenés észlelhető vírusos infekcióknál, részben gyógyult bakteriális meningitisnél, és malignus meningitisben
összfehérje • Emelkedett ha sejtszaporulat van • Ha nincs sejtszaporulat és mégis emelkedett: gyulladásos neuropátiák, CSF elfolyási zavar
Speciális vizsgálatok • Oligoklonális csíkok – IgG fokozott koncentráció • Polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction, PCR): herpes simplex, tuberkulózis • Antigén immundetektálása pl. bakteriális meningitis, ha a tenyésztés negatív • Spektrofotometria – vér bomlástermékeinek mérése
Az LP gyakorlati kivitele
