Abszorpciós fotometria

Definíciók, törvények

Abszorpciós fotometria

• FÉNYTANI ALAPOK – ISMÉTLÉS -

Elektron-spektroszkópia alapjai

• FOTOMETRIA -

Biofizika II. szemeszter

Fehér fény, spektrum, intenzitás Detektálás, PMT, Abszorbancia (optikai denzitás, extinkció), transzmittancia, extinkciós koefficiens Lambert-Beer törvény, additivitás Atomok energiaszintje, foton energia → rezonancia feltétel,

• MOLEKULÁK (FEHÉRJÉK) SPEKTRUMA -

Orbán József PTE ÁOK Biofizikai Intézet

2013 január

Elektromágneses sugárzás, kettős természet, foton, elektromos/mágneses térerősség Fény-anyag kölcsönhatás típusok Spektrum típusok (abszorbciós/emissziós és vonalas/sávos/folytonos)

Sávos színkép és magyarázata, molekuláris energiarendszer → Jablonsky termséma

Fény – elektromágneses sugárzás

Ismétlés

foton (fénykvantum), energiája: E = h f

A fény kettős természete: Elektromágneses hullám ( j dé k ) (terjedéskor)

Részecske (k l (kölcsönhatáskor) h ák )

• Elhajlás (diffrakció) • Interferencia • Polarizáció

• Fotoeffektus • Compton-effektus

A b sz o r p c i ó R e f l e x i ó

Elektromágneses hullám terjedése

Elektromágneses hullám terjedése Elektromos térerősségvektor

mágneses mező elektromos mező

E

x

x

ha  = 600 nm, akkor f =  = 5·1014 Hz

terjedési irány

B

mágneses mező elektromos mező

hullámhossz

c = f

Mágneses térerősségvektor x x

transzverzális Az elektromos, és a mágneses térerősség vektorai hullám mindig merőlegesek egymásra és a haladási irányra!

1

Az elektromágneses sugárzások teljes spektruma

Fény és anyag kölcsönhatása Energia, frekvencia (E=hf

Hullámhossz (=c/f)

Sugárzás – anyag kölcsönhatás elektromágneses (vagy radioaktív) sugárzás

Gamma

Mikroh llá hullám

Röntgen

Rádió sugárzás g

Látható tartomány

Hogyan mérjük az abszorpciót?

Az alapelv

Egy fotométer működésének elméleti sémája Fényforrás fényforrás

monokromátor (rács v. prizma)

Referencia csatorna

Minta

Detektor 1

Referencia (blank)

Detektor 2

Fény Elektromos jel

PMT

Diffrakciós rács

Minta

Rés

Kiértékelés (PC)

A mérés során hullámhosszonként határozzuk meg az abszorbancia értékét egy széles (spektrális) tartományban.

Fotoelektron sokszorozó (cső)

Fény detektálás: Elektromágneses sugárzás átalakítása elektromos jellé (feszültségváltozássá).

Sugárzás – anyag kölcsönhatás

Photomultiplier tube (PMT)

fotokatód

anyag

I

dinódák Ha: 1 → 2 H akkor az erősítés:

I~n n: fotonszám

J E L

elektron n

foton

I0 (kezdeti intenzitás) Fotoeffektus (foton lök ki elektront, ionizáció!)

2n (n: dinódaszám)

gyorsító nagyfeszültség elektron lök ki (1-6) elektront

áram/feszültségmérő

Erősítés: 1 foton (fotoelektron) → 1-10 millió elektron!

Reflexió Transzmisszió Abszorpció Szórás – Rayleigh-féle

Mi határozza meg az elnyelés mértékét?

2

A fény elnyelődése anyagban

Abszorbció - elnyelés anyag

fényforrás

I0

I

Exponenciális függvény!!!

I0’

minta

I0 1 2 3

vastagság

Inteenzitás

I0

homogén

I

I

A reflexió mértéke általában elhanyagolható! I0 = I’0

Abszorbancia definíciója

Transzmittancia fényforrás

I0

I

I0

T

I I0

anyag

I

DETEKTOR

I = I0 e-x

Lambert-Beer törvény (híg oldatok)

I = I0 10-() c x

, általában százalékban (%) adják meg. Miért () és nem csak  ?

A szórás mértéke alacsony koncentráción elhanyagolható! A megfelelő higítás fontos!

fényforrás

minta

DETEKTOR általános egyenlet:

fényforrás

úthossz (vastagság)

x

I ( x )  I 0  e  x

intenzitás:

• reflektált: R = I0’-I0 • abszorbált: A = I0-I • transzmittált : T = I

Melyik függvény írja le a csökkenést?

N ( x )  N 0  e x

fotonszám:

Mindig igaz, hogy: I0’ ≥ I0 > I

Abszorbancia definíciója I0 I minta

Lambert-Beer törvény (oldatok)

DETEKTOR

I = I0 10-() c x

E= OD = A = - log10 (I / I0) = - log10 T = () · c · x extinkció abszorbancia optikai denzitás

Mértékegység nélküli, additív mennyiség!

(): az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől és hullámhossztól függ), c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz

Megjegyzés: Hasonló abszorpciós jelenség figyelhető meg a radioaktív sugárzás anyagba hatolásakor is.

Példa • 10 % transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = OD = - log (I/I0) = - log (0,1) = 1 • 50 % transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = 0,301 • 1 % transzmittancia (99% abszorbeált) A=2 • Ha a 10 % és az 1 % transzmittanciájú anyagot együtt használjuk, mennyi az eredő transzmittancia és abszorbancia? A = 2+1 = 3, T = 0,01·0,1 = 0,001 = 0,1 %

3

Abszorpció és Emisszió atomoknál 1. abszorpció

Színképek - spektrumok állapot:

alapállapot

gerjesztett állapot

e-

Hidrogén

e-

e-

Eabs = h

+

+

+

Nátrium

Hélium

folyamat:

(foton) Abszorpció

Neon

(elektron) Excitáció (gerjesztés)

Higany

A foton abszorpciója és az elektron gerjesztése egyszerre zajlik le!

Hullámhossz (nm) (vonalas emissziós spektrumok)

Atomok energiaszint-rendszere Bohr illetve kvantummechanikai atommodell szerint energia (szintek)

energia különbség

Energiaszintek – H-atom RH = -13,6 eV E n  RH 

Rydberg állandó

1 n2

1 eV = 1,6·10-19 J,

Az elektronok kvantált (meghatározott) energiával rendelkeznek. → energiaszintek! Az ábra csak szemléltetés!

Energiaszintek – H-atom RH = -13,6 eV En  RH 

1 n2

Számoljuk ki a 2. pálya energiáját!

E2  RH 

1 13,6   3,4 eV 22 4

1 eV = ? J mert qe = -1,6·10-19 C

Mit mond Bohr posztulátuma az energiakibocsátásról / elnyelésről?

Energiaszintek – H-atom RH = -13,6 eV E  E2  E1  3,4  (13,6)  10,2 eV Milyen hullámhosszú a fény, amit elnyel / kibocsát a H-atom?

Mekkora energiájú fotont tud elnyelni / kibocsátani a H-atom az 1-es 2-es pályák közötti átmenetkor?

E foton  h  f és c  f  

E  E2  E1  3,4  (13,6)  10,2 eV

1 eV = 1,6·10-19 J

Milyen hullámhosszú a fény, amit elnyel / kibocsát a H-atom?

ahol c ≈ 3·108 m/s

10,2 eV  16,32 10 19 J 



λ=121 nm

hc 6,6 10 34  3 108   1,21 10 7 m UV!!! E 16,32 10 19

4

Spektrum - színkép

A spektrumok megjelenési formái I. Típusok: • vonalas (atomok) • sávos (molekulák) • folytonos (magas hőmérsékletre hevített anyagok, pl.

Spektrum: • (fény)intenzitás v. azzal analóg mennyiség • hullámhossz vagy frekvencia függvényében

abszolút fekete test, test csillagok) I

I

I



  Folytonos sugárzások vizsgálata és leírása: Planck

Fehérjék abszorpciós spektruma

A spektrumok megjelenési formái II. I

emissziós 

T abszorpiós



Folytonos emissziós Vonalas emissziós

Biofizika II. szemeszter

Vonalas abszorpciós

Orbán József PTE ÁOK Biofizikai Intézet

(folytonos alapon)

Aktin molekula sávos (abszorpciós) spektruma Abszorbanc ia vagy OD Absorption

2,5

Ez melyik típusú színkép? Hogyan alakul ki?

2,0

Az atomok vonalas- és a molekulák sávos színképe k k i ik ! (az karakterisztikus! ( anyagii minőségtől függ)

1,5

1,0

0,5

aktin 0,0 260

270

280

290

300

Wavelength (nm) hullámhossz (nm)

310

320

2013 január

Fehérjék abszorpciója - aminosavak A három fontos aminosav, amelyek UV-ban mért abszorpciója segítségével szokták pl. az oldatok fehérje koncentrációját meghatározni.

extink kció

Kép forrása: http://csep10.phys.utk.edu/astr162/lect/light/absorption.html

(Feltételezve azt, hogy az extinkció mértéke egyenesen arányos a fehérje koncentrációjával.) 

hullámhossz

5

Molekulák színképe

Molekuláris mozgások

A Born-Oppenheimer közelítés: Az elektronok mozgása sokkal gyorsabb az atommagokénál, mert az atommagok nehezek, ezért a molekuláris mozgások modellezésénél a molekulát klasszikus rendszernek tekinthetjük: rugókkal összekötött, töltéssel rendelkező tömegpontok.

Eössz = Eelektromos + Evibrációs + Erotációs.

Molekula energiája – sávos színkép

Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszer

Eössz = Eelektromos + Evibrációs + Erotációs

0

Az egyes energiaszintek közötti átmenetek egymástól függetlenül mehetnek végbe. A szintek közötti energiakülönbség összegeződik: Két meghatározott elektromos energiaszinthez sok vibrációs és sok rotációs energiaszint tartozhat, ezért a molekulák színképe nem vonalas, hanem kiszélesedett sáv!

Energgia

Eössz = Eelektromos + Evibrációs + Erotációs.

• Az egyes energiaszintek a nullaszint alatt vannak. • Minden vízszintes vonal a molekula egy jól definiált energiával rendelkező állapotát reprezentálja Az elektromos, az azokra épülő vibrációs, valamint rotációs energiaszintek sematikus ábrája látható. • Alapállapotban: az e- az S0 valamely vibrációs szintjén helyezkedik el.

S2 rotációs szintek S1

vibrációs szintek

Az energiakülönbségek nagyságrendje: Eelektromos ~ 1000 * Evibrációs ~ 1000000 * Erotációs

S0

elektromos szintek: S0, S1, S2

Jabłonsky-féle termséma

Miért sávos a molekulák színképe?

molekuláris rendszer

S2

1. Excitáció (gerjesztés) Abszorpció (elnyelés)

Enerrgia

A gerjesztés/abszorpció feltétele:

S1 h

Abszorpció S0

E = h (rezonancia feltétel)

A foton energiájától függően létrejöhet: • elektromos • vibrációs • rotációs átmenet • ezek keveréke

molekuláris rendszer 0 S2 Energ gia

0

rotációs szintek S1

S0

vibrációs szintek

vibrációs szintek

elektromos szintek: S0, S1, S2

6

Miért jó az Abszorbancia additivitása?

Példa fehérjekoncentráció meghatározása

abszzorbancia

Szükség van egy ‘referencia’ számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: 

 szokásos egységei:

M-1cm-1, vagy (mg/ml)-1cm-1

Ha A = 0,55 és  = 1,1 (mg/ml)-1cm-1 c = (A/ ) mg/ml-ben megadva

fehérje

Fluoreszcens jelölő

 (nm)

c = 0,5 mg/ml

Kiszámolható a fehérje és a jelölő koncentrációja és így a jelölési arány.

Kiegészítés

Kiegészítés

Reflexió által meghatározott FELÜLETI SZÍN

A fehér fényt színösszetevőire bonthatjuk egy prizma, vagy optikai rács segítségével.

Vörös Narancs Sárga Zöld Kék Ibolya

V N S Z K I

A környezetünk sokszínűségét megérthetjük, ha észben tartjuk, hogy a dolgok színét a szemünkbe jutó fotonok energiája (színe) határozza meg. Csak az érzékelt fotonoké!

Milyen színű az alábbi tárgy? Vörös Narancs Sárga Zöld Kék Ibolya

Keress a következő kifejezésre: Additív / konstruktív színkeverés pl.: bútorok, falak, tinta, papír, haj, szivárványhártya színe

Kiegészítés Abszorpció (transzmisszió) által meghatározott TEST SZÍN

Vörös Narancs Sárga Zöld Kék Ibolya

Milyen színű az alábbi tárgy?

pl.: vörös vértestek, falevelek, ólomüveg ablakok színe

7

A fotométer linearitása:

A fotométer linearitása;

“stray light effect”

“stray light effect”

Megfigyelés:

A probléma eredete: nem tökéletesek a monokromátorok! Várható tendencia Meredekség: g 

abszorpció

Második harmadik Második, harmadik… felharmonikusok!

Optikai rács Koncentráció

Az anyag csak a kiválasztott (alapharmonikus) hullámhosszon nyel el!

Nagy abszorbció mellett.

A detektor pedig az összes hullámhosszon mér!

I

I0 99% választott anyag

és 1% felharmonikus

89% választott

99% választott

és

és

1% felharmonikus

1% felharmonikus

Kicsi abszorbció mellett.

I

I0 anyag

1% választott és 1% felharmonikus

Az arányok jelentősen eltolódnak!

Az átmenő (transzmittált) fény: a mért érték és valódi érték aránya Kicsi abszorbció mellett: I / I0 = 90 / 100 = 0.9 valódi érték = 89 / 99 ~ 0.9 A mért és a valós érték közel azonos! Relatív hiba ~ 0,1% Nagy abszorbció mellett: I / I0 = 2 / 100 = 0.02 valódi érték = 1 / 99 ~ 0.01 Az eltérés nagy! Relatív hiba 200% !!!

8