Spektroszkópia - Színképvizsgálat
Abszorpciós fotometria
Spektro-: görög; jelentése kép/szín -szkópia: görög; nézés/látás/vizsgálat
abszorpció
Ujfalusi Zoltán PTE ÁOK Biofizikai Intézet
(nm)
2012. február
Vizsgálatok EM sugarakkal (pl. fény)
Anyag kvalitatív és/vagy kvantitatív megismerése: Anyagi minőség – összetétel: karakterisztikus, „ujjlenyomat” Szerkezet
A spektrum • Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. • Egy intenzitás-jellegű mennyiség ábrázolva egy energiajellegű mennyiség függvényében.
Az anyag időbeli változásának nyomon követése:
energia és azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám)
(időbontásos spektroszkópia)
Anyagi minőségbeli változás (pl. kémiai reakció hatására), Szerkezeti változások követése (gyors kinetikai folyamatok vizsgálatára is alkalmas)
Nem látjuk a molekulát, hanem a spektrum (változása) alapján, fizikai ismereteink segítségével következtetünk a szerkezetre (ill. a módosulásra)!
Folytonos emissziós spektrum:
intenzitás, beütésszám (pl. radioaktivitás mérése), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD)
abszorpció
A spektroszkópia célja
(nm)
Joseph von Fraunhofer (1787–1826)
Magas hőmérsékleten izzó szilárd és folyékony anyagok.
Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a szoláris kromoszférában lévő elemeknek a Nap forró belsejéről kibocsátott látható sugárzás bizonyos hullámhosszain történő abszorpciója okoz.
Vonalas emissziós spektrum: Meleg gázok emissziós spektruma.
Vonalas abszorpciós spektrum: Hideg gázok abszorpciós spektruma. http://astro-canada.ca/_en/a3300.html
1
Fontos fizikai mennyiségek, összefüggések Frekvencia:
vagy f
(1/s)
Hullámhossz: (m)
c f
Hullámszám: (cm-1)
1
Energia:
E (J)
h.f
Einstein: foton (fénykvantum) energiája
Fény és anyag kölcsönhatása • Kvantált energiafelvétel (foton) • Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: • visszaverődhet (reflexió) A biológiai hatás létrejöttének • elnyelődhet (abszorpció) feltétele! • áthaladhat (transzmisszió)
Extinkc. koeff.: (M-1cm-1 vagy (mg/ml)-1cm-1)
Az energia felbontása
Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs Az energiatípusok nagyságrendje: Eelektron ~ 1,000 * Evibrációs ~ 1,000,000 * Erotációs
Abszorpció
Az abszorpció … - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - additív
E ≈ OD ≈ A = - log (I / I0) = () c x .
I = I0 .10-
()
xc
.
Lambert-Beer törvény
(): az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz
2
Számítási feladat I.
Miért
Adott: E(450) = 0,45
E(450) = (450) * c * x
(450) = 2,25 (mg/ml)-1cm-1 Optikai úthossz (x) = 1 cm
c = E(450)/((450)* x)
abszorpció
Határozza meg egy ismeretlen oldat koncentrációját!
() és nemcsak ?
•c=?
(nm)
c = 0,45 / (2,25 (mg/ml)-1cm-1 * 1 cm)
Mert az abszorpció függő, így az is az kell hogy legyen!
c = 0,2 mg/ml
Számítási feladat II/A
Számítási feladat II/B
Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját mM-ban (=280 és 290 nm-en)!
Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját mM-ban (=280 és 290 nm-en)!
Adott:
Adott:
•
E(280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték !!!)
•
E(290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték !!!)
•
(280) = 1,11 ml*mg-1*cm-1
•
(290) = 0,63 ml*mg-1*cm-1
•
Optikai úthossz (x) = 1 cm
0,1867 * 11 = 2,0537 E(290) = (290) * c * x c = E(290)/((290)* x) c = 3,2598 mg/ml
•c=?
E(280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték !!!)
•
E(290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték !!!)
•
(280) = 1,11 ml*mg-1*cm-1
•
(290) = 0,63 ml*mg-1*cm-1
•
Optikai úthossz (x) = 1 cm
0,3289 * 11 = 3,6179 E(280) = (280) * c * x c = E(280)/((280)* x) c = 3,2598 mg/ml
•c=?
Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mM anyagmennyiségnek felel meg:
c = ~ 75 mM
I
I0 minta T = I / I0
Általában százalékban (%) adjuk meg.
Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mM anyagmennyiségnek felel meg:
c = ~ 75 mM
Számítási feladat III.
Transzmisszió
fényforrás
•
detektor
• 10% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = OD = - log (I/I0) = - log (0,1) = 1 • 50% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = 0,301 • Ha a 10% és az 1% transzmittanciájú anyagot együtt használjuk, mennyi lesz az eredő transzmittancia és abszorbancia? A = 2+1 = 3, T = 0,01·0,1 = 0,001 = 0,1 %
Megjegyzés: a transzmittancia (T=I/I0) nem additív!
3
Hogyan mérjük az abszorpciót?
Az alapelv
Egy fotométer működésének elméleti sémája Folytonos fényű, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa
Prizma + rés vagy optikai rács + rés Rés mérete változtatható!
Fényforrás
műanyag, üveg, kvarc küvettákban
PMT monokromátor
fényforrás
Diffrakciós rács
Minta
Detektor 1
Minta
Rés Referencia csatorna
Referencia (blank)
Detektor 2
Időbeli instabilitások (például a lámpáé) kiküszöbölődnek.
Fény Elektromos jel
Kiértékelés (PC)
Az emisszió és az abszorpció mérése
Fény detektálás: Elektromágneses sugárzás átalakítása elektromos jellé (feszültségváltozássá).
A fotométer linearitása; “stray light effect”
Tér bármely irányából!
emisszió
Várható tendencia
abszorpció
Csak lineáris elrendezésben!
abszorpció
Meredekség:
koncentráció
A fotométer linearitása; “stray light effect”
Kicsi abszorpció mellett
A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok!
I0 99% kiválasztott
Optikai rács
Második, harmadik, stb. felharmónikusok!
minta
I 89% kiválasztott
és
és
1% felharmónikus
1% felharmónikus
4
Nagy abszorpció mellett I0
minta
99% kiválasztott
Fényszórás • Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál már számottevő lehet a „stray light effect” mellett!
I 1% kiválasztott
és
és
1% felharmónikus
1% felharmónikus
minta
Ezt is érzékeli a detektor!!!
Az abszorpciós fotometria alkalmazásai
Fehérjék abszorpciójának mérése Az alapvonal (baseline) jelentősége
• Különböző oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása
Fehérje PUFFER!!!
• Időfüggő változások nyomonkövetése • Elektroforézis minták kiértékelése
Időfüggő mérések
Abszorpció egyéb alkalmazása Elektroforézis minták kiértékelésénél
0,2 0,0
Abszorpció
Anyagi, minőségbeli, szerkezeti változások követése (pl. kémiai reakciók hatására)
-0,2 -0,4 0
1000
2000
idõ (s)
3000
4000
5
Additivitás Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása
Számítási feladat IV. Határozza meg egy fluoreszcensen (IAEDANS) jelölt ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját mM-ban és jelöltségének arányát %-ban kifejezve!
abszorpció
Adott: • E(290) = 0,269 (21x-esen hígított érték !!!) • E(336) = 0,047 (21x-esen hígított érték !!!)
fluoreszcens próba
fehérje
• (290) = 0,63 ml*mg-1*cm-1
• c(aktin) = ? • Jelöltség = ?
E(korr.) = 0,259
c(aktin) = 198,5 mM
• Optikai úthossz (x) = 1 cm
• c(IAEDANS) = ?
E(korr.) = E(290)-0,21*E(336)
E = () * c * x
• (336) = 6100 M-1*cm-1
(nm)
Korrigálni kell a 290 nm-en mért abszorpcióra!!!
c(IAEDANS) =
81,5 %
0,047 * 21*106 6100
c(IAEDANS) = 161,8 mM
6
