PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID PADA ENAM TANAMAN
NIKEN WIDYASTUTI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK NIKEN WIDYASTUTI. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman. Dibimbing oleh ELLY SURADIKUSUMAH dan MOHAMAD RAFI. Keadaan stres oksidatif merupakan keadaan ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan yang dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan dari 6 tanaman obat dan menentukan hubungan antara aktivitas antioksidan dan kandungan fenol serta flavonoidnya. Penelitian ini dilakukan menggunakan beberapa tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung. Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan 3 metode yaitu CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), dan FRAP (ferric reducing antioxidant power). Dari hasil penelitian diketahui bahwa semua tanaman tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP berbeda nyata secara statistika. Walaupun demikian metode CUPRAC dan FRAP menghasilkan urutan aktivitas antioksidan yang sama dari 6 tanaman. Kandungan total fenol berkorelasi kuat dan searah dengan aktivitas antioksidan tetapi tidak memiliki korelasi dengan flavonoid. Jadi, aktivitas antioksidan tidak hanya bersumber dari golongan flavonoid.
ABSTRACT NIKEN WIDYASTUTI. Measurement of Antioxidant Activity CUPRAC, DPPH, and FRAP Method and their Correlation with Phenol and Flavonoids in Six Herbs. Under direction of ELLY SURADIKUSUMAH and MOHAMAD RAFI. Oxidative stress is the imbalance condition between free radical and antioxidants that can cause oxidative damage in cell, tissues, organ, accelerates the aging process, and emergence of diseases. This study aims to determine the antioxidant capacity of 6 herbs, and the relationship between phenol and flavonoids content with their antioxidant activity and relationship between phenol and flavonoids content in the ethanol extract of some Indonesian herb, there are Orthosiphon stamineus, Sonchus avensis, Sida rhombifolia, Guazuma umifolia, Andrographis paniculata, and Parkia biglobosa. The measurement of antioxidant activity use 3 methods, that are CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-diphenyl-1-pickrylhidrazyl), and FRAP (ferric reducing antioxidant power). The research of the six herbs showed antioxidant activity. Statistic test from three method antioxidant showed that measurement antioxidant activity with CUPRAC, DPPH, and FRAP gave a significantly different result, but CUPRAC and FRAP give the same response of the six herbs. The phenol has no correlation with flavonoids content but have highly correlation with their antioxidant activity. Flavonoids have no correlation with antioxidant activity.
PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID PADA ENAM TANAMAN
NIKEN WIDYASTUTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul Skripsi Nama NIM
:
Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman : Niken Widyastuti : G44076004
Disetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Ir. Elly Suradikusumah, MS NIP 19450214 197010 2 001
Mohamad Rafi, S.Si, MSi NIP 19770316 200604 1 010
Mengetahui, Ketua Departemen
Prof.Dr. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah berjudul Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Mei sampai Agustus 2009 dan bertempat di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Ir. Elly Suradikusumah, MS dan Bapak Mohamad Rafi, S.Si, MSi selaku pembimbing. Ungkapan terimakasih juga penulis haturkan kepada Abah, Mamah, Mas Kris, Mbak Dypus, Teh Diah, dan Mas Wahyu. Selain itu ucapan terima kasih diperuntukan kepada seluruh staf Laboratorium Uji Pusat Studi Biofarmaka, Ibu Nunu, Ibu Salina, Ka Agung, Endi, Nio, Mbak Wiwi, dan Pak Mul serta semua teman-teman. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Desember 2009 Niken Widyastuti
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 14 September 1984 sebagai anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Iman Warsito dan Ida Mardiyah. Tahun 2002, penulis lulus seleksi masuk Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor melalui jalur seleksi rapor. Pada tahun 2005, penulis berkesempatan mengikuti praktik kerja lapangan di Balai Pengujian Mutu Produk Perternakan, Bogor. Akhir tahun 2005 penulis lulus dari Akademi Kimia Analisis dan tahun 2006 bekerja di Orang Tua group Divisi Sweet Water Product. Tahun 2007, penulis melanjutkan pendidikan S1 kimia di IPB melalui jalur S1 Kimia Penyelenggaraan Khusus. Selama perkuliahan, penulis pernah mengajar di bimbingan belajar BTA 8 dan bimbingan belajar Math Magic School. Agustus 2009, Penulis juga berkesempatan untuk menjadi asisten praktikum pada program keahlian Analisis Kimia di Diploma IPB.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR .................................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................. vii PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1 TINJAUAN PUSTAKA Radikal Bebas dan Antioksidan .......................................................................... Uji Aktivitas Antioksidan .................................................................................. Fenol dan Flavonoid .......................................................................................... Kumis Kucing ..................................................................................................... Tempuyung ........................................................................................................ Sidaguri .............................................................................................................. Jati Belanda ........................................................................................................ Sambiloto ............................................................................................................ Kedaung ............................................................................................................. Troloks ................................................................................................................
1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ................................................................................................... 4 Metode ............................................................................................................... 4 Analisis Data ...................................................................................................... 5 PEMBAHASAN Ekstrak Tanaman ................................................................................................ Aktivitas Antioksidan ......................................................................................... Kandungan Total Fenol ...................................................................................... Kandungan Total Flavonoid ............................................................................... Hasil Uji Korelasi ...............................................................................................
5 5 7 7 8
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................................. 9 Saran ................................................................................................................... 9 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 10 LAMPIRAN .................................................................................................................. 12
vi
DAFTAR TABEL Halaman 1. Kapasitas antioksidan metode CUPRAC .................................................................. 5 2. Kapasitas antioksidan metode DPPH ........................................................................ 6 3. Kapasitas antioksidan metode FRAP ........................................................................ 6 4. Kandungan total fenol ............................................................................................... 7 5. Kandungan total flavonoid ........................................................................................ 7
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Stuktur dasar flavonoid ........................................................................................... 2 2. Tanaman kumis kucing ........................................................................................... 2 3. Tanaman tempuyung .............................................................................................. 2 4. Tanaman sidaguri ................................................................................................... 3 5. Tanaman jati belanda .............................................................................................. 3 6. Tanaman sambiloto ................................................................................................. 3 7. Tanaman kedaung ................................................................................................... 3 8. Stuktur troloks ........................................................................................................ 4 9. Hubungan total fenol dengan kapasitas antioksidan ............................................... 8 10. Hubungan total flavonoid dengan kapasitas antioksidan ........................................ 9 11. Hubungan total fenol dengan total flavonoid .......................................................... 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1.
Bagan alir penelitian .............................................................................................. 13
2.
Penentuan kadar air ................................................................................................ 14
3.
Rendemen ekstrak kering ....................................................................................... 15
4.
Kapasitas antioksidan metode CUPRAC ............................................................... 16
5.
Kapasitas antioksidan metode DPPH ..................................................................... 17
6.
Kapasitas antioksidan metode FRAP ..................................................................... 18
7.
Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran kapasitas antioksidan .......................... 19
8.
Penentuan total fenol .............................................................................................. 22
9.
Kandungan total flavonoid ..................................................................................... 23
vii
PENDAHULUAN Antioksidan adalah zat penghambat reaksi oksidasi akibat radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan asam lemak tak jenuh, membran dinding sel, pembuluh darah, basa DNA, dan jaringan lipid sehingga menimbulkan penyakit (Subeki 1998). Suatu tanaman dapat memiliki aktivitas antioksidan apabila mengandung senyawaan yang mampu menangkal radikal bebas seperti fenol dan flavonoid. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk melihat hubungan antara kandungan fenol, flavonoid, dan aktivitas antioksidan. Hasil penelitian Kao et al. (2007) menunjukkan bahwa kandungan fenol dan flavonoid dalam blackberry berbanding lurus dengan aktivitas antioksidan. Sementara Khamsah et al. (2006) dalam penelitiannya menyatakan bahwa aktivitas antioksidan tidak hanya bergantung pada kandungan total fenol tetapi juga dipengaruhi oleh senyawa lain, seperti asam ursolat, asam betulinat, dan asam oleat yang terdapat dalam Orthosiphon stamineus. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan beberapa tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, kedaung, dan sambiloto. Ekstrak etanol dari tanaman tersebut diukur nilai kandungan fenol, flavonoid, dan aktivitas antioksidannya. Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan 3 metode, yaitu DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil), FRAP (ferric reducing antioxidant power) dan CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan dari 6 tanaman obat. Selain itu, hubungan antara kandungan fenol, total flavonoid dan aktivitas antioksidannya juga ditentukan. Diduga terdapat keterkaitan hubungan antara kandungan total fenol, total flavonoid, dan aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol beberapa tanaman obat Indonesia.
TINJAUAN PUSTAKA Radikal Bebas dan Antioksidan Radikal bebas adalah suatu molekul atau atom yang mempunyai 1 atau lebih elektron tidak berpasangan. Radikal ini dapat berasal dari atom hidrogen, molekul oksigen, atau ion logam transisi. Senyawa radikal bebas sangat reaktif dan selalu berusaha mencari pasangan elektron agar kondisinya stabil (Subeki 1998).
Radikal dapat terbentuk secara endogen dan eksogen. Radikal endogen terbentuk dalam tubuh melalui proses metabolism normal di dalam tubuh. Sementara radikal eksogen berasal dari bahan pencemar yang masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan, pencernaan, dan penyerapan kulit (Miller 1996). Radikal bebas dalam jumlah normal bermanfaat bagi kesehatan misalnya, memerangi peradangan, membunuh bakteri, dan mengendalikan tonus otot polos pembuluh darah serta organ-organ dalam tubuh (Yuwono 2009). Sementara dalam jumlah berlebih mengakibatkan stress oksidatif. Keadaan tersebut dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh yang mempercepat terjadinya proses penuaan dan munculnya penyakit (Yuwono 2009). Oleh karena itu, antioksidan dibutuhkan untuk dapat menunda atau menghambat reaksi oksidasi oleh radikal bebas. Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibedakan menjadi antioksidan endogen dan eksogen. Antioksidan endogen terdapat secara alamiah dari dalam tubuh sedangkan antiosidan eksogen dari luar tubuh Percival (1998). Antioksidan eksogen sendiri dibedakan menjadi antioksidan alami dan sintetik (Miller 1996). Uji Aktivitas Antioksidan Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode di antaranya CUPRAC, DPPH, dan FRAP. Metode CUPRAC (Apak et al. 2007) menggunakan bis(neokuproin) tembaga(II) (Cu(Nc)22+) sebagai pereaksi kromogenik. Pereaksi Cu(Nc)22+ yang berwarna biru akan mengalami reduksi menjadi Cu(Nc)2+ yang berwarna kuning dengan reaksi: n Cu(Nc)2 2+ + AR(OH)n → n Cu(Nc)2+ + AR(=O)n + n H+ Metode DPPH menggunakan 2,2difenil-1pikrilhidrazil sebagai sumber radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan dengan reaksi sebagai berikut:
2
Metode FRAP (Benzie & Strain 1996) menggunakan Fe(TPTZ)23+ kompleks besiligan 2,4,6-tripiridil-triazin sebagai pereaksi. Kompleks biru Fe(TPTZ)23+ akan berfungsi sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi Fe(TPTZ)22+ yang berwarna kuning dengan reaksi berikut: Fe(TPTZ)2 3+ + AROH → Fe(TPTZ)22+ + H+ + AR=O
Kumis kucing mengandung saponin, kalium (Wirakusumah & Setyowati 1994), asam rosmarinat, diterpenoid, triterpenoid (Matkowski 2008), asam oleat, asam ursolat, asam betulinat, 3-hidroksi flavon, 3’,4’dihidroksiflavon, dan 2’,3’-dihidroksiflavon (Khamsah et al. 2006).
Fenol dan Flavonoid Senyawaan fenol biasanya terdapat dalam berbagai jenis sayuran, buah-buahan dan tanaman. Turunan senyawaan fenol merupakan metabolit sekunder terbesar yang diproduksi oleh tanaman. Senyawaan ini diproduksi dalam tanaman melalui jalur sikimat dan metabolisme fenil propanoid. Senyawaan fenol dapat memiliki aktivitas antioksidan, antitumor, antiviral, dan antibiotik (Apak et al. 2007). Diantara senyawaan fenol alami yang telah diketahui lebih dari seribu stuktur, flavonoid merupakan golongan terbesar (Subeki 1998). Flavonoid merupakan senyawa dengan bobot melekul rendah dan memiliki stuktur dasar C6C3C6, yaitu terdiri atas 2 buah cincin benzena yang dihubungkan dengan 3 karbon (Gambar 1). Flavonoid terbagi menjadi 7 kelompok, yaitu antosianin, proantosianin, isoflavon, flavonon, flavonol, flavanol, dan flavon. Flavonoid memiliki aktivitas antioksidan di dalam tubuh sehingga disebut bioflavonoid.
Gambar 2 Tanaman kumis kucing. Tempuyung Tempuyung (Sonchus avensis) termasuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa Asterales, suku Asteraceae, genus Sonchus, spesies avensis. Tempuyung merupakan tanaman menahun yang tumbuh liar pada tanah lembap dan cukup sinar matahari (Gambar 3). Tempuyung mengandung kandungan senyawa kimia seperti flavonoid (kaemferol, luteolin-7-Oglukosida, dan apigenin-7-O-glukosida), kumarin, dan asam fenolat bebas (Sriningsih et al. 2002).
Gambar 1 Stuktur dasar flavonoid (Apak et al. 2007). Gambar 3 Tanaman tempuyung. Kumis Kucing Kumis kucing (Orthosiphon stamineus) merupakan tanaman obat yang berasal dari wilayah Afrika tropis dan kemudian menyebar ke Asia dan Australia. Kumis kucing masuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo Lamiales, suku Lamiaceae, genus Orthosiphon, spesies stamieus. Kumis kucing merupakan tanaman tahunan dengan tinggi 50-100 cm (Gambar 2).
Sidaguri Sidaguri (Sida rhombifolia) merupakan tanaman liar yang tersebar di seluruh daerah tropis. Tanaman ini dapat mencapai tinggi 2 m (Gambar 4). Sidaguri masuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo Malvaves, suku Malvaceae, genus Sida, spesies rhombifolia. Daun tanaman ini mengandung alkaloid, steroid, kalsium
