PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID PADA ENAM TANAMAN
NIKEN WIDYASTUTI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK NIKEN WIDYASTUTI. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman. Dibimbing oleh ELLY SURADIKUSUMAH dan MOHAMAD RAFI. Keadaan stres oksidatif merupakan keadaan ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan yang dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan dari 6 tanaman obat dan menentukan hubungan antara aktivitas antioksidan dan kandungan fenol serta flavonoidnya. Penelitian ini dilakukan menggunakan beberapa tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung. Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan 3 metode yaitu CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), dan FRAP (ferric reducing antioxidant power). Dari hasil penelitian diketahui bahwa semua tanaman tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP berbeda nyata secara statistika. Walaupun demikian metode CUPRAC dan FRAP menghasilkan urutan aktivitas antioksidan yang sama dari 6 tanaman. Kandungan total fenol berkorelasi kuat dan searah dengan aktivitas antioksidan tetapi tidak memiliki korelasi dengan flavonoid. Jadi, aktivitas antioksidan tidak hanya bersumber dari golongan flavonoid.
ABSTRACT NIKEN WIDYASTUTI. Measurement of Antioxidant Activity CUPRAC, DPPH, and FRAP Method and their Correlation with Phenol and Flavonoids in Six Herbs. Under direction of ELLY SURADIKUSUMAH and MOHAMAD RAFI. Oxidative stress is the imbalance condition between free radical and antioxidants that can cause oxidative damage in cell, tissues, organ, accelerates the aging process, and emergence of diseases. This study aims to determine the antioxidant capacity of 6 herbs, and the relationship between phenol and flavonoids content with their antioxidant activity and relationship between phenol and flavonoids content in the ethanol extract of some Indonesian herb, there are Orthosiphon stamineus, Sonchus avensis, Sida rhombifolia, Guazuma umifolia, Andrographis paniculata, and Parkia biglobosa. The measurement of antioxidant activity use 3 methods, that are CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-diphenyl-1-pickrylhidrazyl), and FRAP (ferric reducing antioxidant power). The research of the six herbs showed antioxidant activity. Statistic test from three method antioxidant showed that measurement antioxidant activity with CUPRAC, DPPH, and FRAP gave a significantly different result, but CUPRAC and FRAP give the same response of the six herbs. The phenol has no correlation with flavonoids content but have highly correlation with their antioxidant activity. Flavonoids have no correlation with antioxidant activity.
PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID PADA ENAM TANAMAN
NIKEN WIDYASTUTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
Judul Skripsi Nama NIM
:
Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman : Niken Widyastuti : G44076004
Disetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Ir. Elly Suradikusumah, MS NIP 19450214 197010 2 001
Mohamad Rafi, S.Si, MSi NIP 19770316 200604 1 010
Mengetahui, Ketua Departemen
Prof.Dr. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah berjudul Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Mei sampai Agustus 2009 dan bertempat di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Ir. Elly Suradikusumah, MS dan Bapak Mohamad Rafi, S.Si, MSi selaku pembimbing. Ungkapan terimakasih juga penulis haturkan kepada Abah, Mamah, Mas Kris, Mbak Dypus, Teh Diah, dan Mas Wahyu. Selain itu ucapan terima kasih diperuntukan kepada seluruh staf Laboratorium Uji Pusat Studi Biofarmaka, Ibu Nunu, Ibu Salina, Ka Agung, Endi, Nio, Mbak Wiwi, dan Pak Mul serta semua teman-teman. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Desember 2009 Niken Widyastuti
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 14 September 1984 sebagai anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Iman Warsito dan Ida Mardiyah. Tahun 2002, penulis lulus seleksi masuk Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor melalui jalur seleksi rapor. Pada tahun 2005, penulis berkesempatan mengikuti praktik kerja lapangan di Balai Pengujian Mutu Produk Perternakan, Bogor. Akhir tahun 2005 penulis lulus dari Akademi Kimia Analisis dan tahun 2006 bekerja di Orang Tua group Divisi Sweet Water Product. Tahun 2007, penulis melanjutkan pendidikan S1 kimia di IPB melalui jalur S1 Kimia Penyelenggaraan Khusus. Selama perkuliahan, penulis pernah mengajar di bimbingan belajar BTA 8 dan bimbingan belajar Math Magic School. Agustus 2009, Penulis juga berkesempatan untuk menjadi asisten praktikum pada program keahlian Analisis Kimia di Diploma IPB.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR .................................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................. vii PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1 TINJAUAN PUSTAKA Radikal Bebas dan Antioksidan .......................................................................... Uji Aktivitas Antioksidan .................................................................................. Fenol dan Flavonoid .......................................................................................... Kumis Kucing ..................................................................................................... Tempuyung ........................................................................................................ Sidaguri .............................................................................................................. Jati Belanda ........................................................................................................ Sambiloto ............................................................................................................ Kedaung ............................................................................................................. Troloks ................................................................................................................
1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ................................................................................................... 4 Metode ............................................................................................................... 4 Analisis Data ...................................................................................................... 5 PEMBAHASAN Ekstrak Tanaman ................................................................................................ Aktivitas Antioksidan ......................................................................................... Kandungan Total Fenol ...................................................................................... Kandungan Total Flavonoid ............................................................................... Hasil Uji Korelasi ...............................................................................................
5 5 7 7 8
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................................. 9 Saran ................................................................................................................... 9 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 10 LAMPIRAN .................................................................................................................. 12
vi
DAFTAR TABEL Halaman 1. Kapasitas antioksidan metode CUPRAC .................................................................. 5 2. Kapasitas antioksidan metode DPPH ........................................................................ 6 3. Kapasitas antioksidan metode FRAP ........................................................................ 6 4. Kandungan total fenol ............................................................................................... 7 5. Kandungan total flavonoid ........................................................................................ 7
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Stuktur dasar flavonoid ........................................................................................... 2 2. Tanaman kumis kucing ........................................................................................... 2 3. Tanaman tempuyung .............................................................................................. 2 4. Tanaman sidaguri ................................................................................................... 3 5. Tanaman jati belanda .............................................................................................. 3 6. Tanaman sambiloto ................................................................................................. 3 7. Tanaman kedaung ................................................................................................... 3 8. Stuktur troloks ........................................................................................................ 4 9. Hubungan total fenol dengan kapasitas antioksidan ............................................... 8 10. Hubungan total flavonoid dengan kapasitas antioksidan ........................................ 9 11. Hubungan total fenol dengan total flavonoid .......................................................... 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1.
Bagan alir penelitian .............................................................................................. 13
2.
Penentuan kadar air ................................................................................................ 14
3.
Rendemen ekstrak kering ....................................................................................... 15
4.
Kapasitas antioksidan metode CUPRAC ............................................................... 16
5.
Kapasitas antioksidan metode DPPH ..................................................................... 17
6.
Kapasitas antioksidan metode FRAP ..................................................................... 18
7.
Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran kapasitas antioksidan .......................... 19
8.
Penentuan total fenol .............................................................................................. 22
9.
Kandungan total flavonoid ..................................................................................... 23
vii
PENDAHULUAN Antioksidan adalah zat penghambat reaksi oksidasi akibat radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan asam lemak tak jenuh, membran dinding sel, pembuluh darah, basa DNA, dan jaringan lipid sehingga menimbulkan penyakit (Subeki 1998). Suatu tanaman dapat memiliki aktivitas antioksidan apabila mengandung senyawaan yang mampu menangkal radikal bebas seperti fenol dan flavonoid. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk melihat hubungan antara kandungan fenol, flavonoid, dan aktivitas antioksidan. Hasil penelitian Kao et al. (2007) menunjukkan bahwa kandungan fenol dan flavonoid dalam blackberry berbanding lurus dengan aktivitas antioksidan. Sementara Khamsah et al. (2006) dalam penelitiannya menyatakan bahwa aktivitas antioksidan tidak hanya bergantung pada kandungan total fenol tetapi juga dipengaruhi oleh senyawa lain, seperti asam ursolat, asam betulinat, dan asam oleat yang terdapat dalam Orthosiphon stamineus. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan beberapa tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, kedaung, dan sambiloto. Ekstrak etanol dari tanaman tersebut diukur nilai kandungan fenol, flavonoid, dan aktivitas antioksidannya. Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan 3 metode, yaitu DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil), FRAP (ferric reducing antioxidant power) dan CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan dari 6 tanaman obat. Selain itu, hubungan antara kandungan fenol, total flavonoid dan aktivitas antioksidannya juga ditentukan. Diduga terdapat keterkaitan hubungan antara kandungan total fenol, total flavonoid, dan aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol beberapa tanaman obat Indonesia.
TINJAUAN PUSTAKA Radikal Bebas dan Antioksidan Radikal bebas adalah suatu molekul atau atom yang mempunyai 1 atau lebih elektron tidak berpasangan. Radikal ini dapat berasal dari atom hidrogen, molekul oksigen, atau ion logam transisi. Senyawa radikal bebas sangat reaktif dan selalu berusaha mencari pasangan elektron agar kondisinya stabil (Subeki 1998).
Radikal dapat terbentuk secara endogen dan eksogen. Radikal endogen terbentuk dalam tubuh melalui proses metabolism normal di dalam tubuh. Sementara radikal eksogen berasal dari bahan pencemar yang masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan, pencernaan, dan penyerapan kulit (Miller 1996). Radikal bebas dalam jumlah normal bermanfaat bagi kesehatan misalnya, memerangi peradangan, membunuh bakteri, dan mengendalikan tonus otot polos pembuluh darah serta organ-organ dalam tubuh (Yuwono 2009). Sementara dalam jumlah berlebih mengakibatkan stress oksidatif. Keadaan tersebut dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh yang mempercepat terjadinya proses penuaan dan munculnya penyakit (Yuwono 2009). Oleh karena itu, antioksidan dibutuhkan untuk dapat menunda atau menghambat reaksi oksidasi oleh radikal bebas. Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibedakan menjadi antioksidan endogen dan eksogen. Antioksidan endogen terdapat secara alamiah dari dalam tubuh sedangkan antiosidan eksogen dari luar tubuh Percival (1998). Antioksidan eksogen sendiri dibedakan menjadi antioksidan alami dan sintetik (Miller 1996). Uji Aktivitas Antioksidan Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode di antaranya CUPRAC, DPPH, dan FRAP. Metode CUPRAC (Apak et al. 2007) menggunakan bis(neokuproin) tembaga(II) (Cu(Nc)22+) sebagai pereaksi kromogenik. Pereaksi Cu(Nc)22+ yang berwarna biru akan mengalami reduksi menjadi Cu(Nc)2+ yang berwarna kuning dengan reaksi: n Cu(Nc)2 2+ + AR(OH)n → n Cu(Nc)2+ + AR(=O)n + n H+ Metode DPPH menggunakan 2,2difenil-1pikrilhidrazil sebagai sumber radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan dengan reaksi sebagai berikut:
2
Metode FRAP (Benzie & Strain 1996) menggunakan Fe(TPTZ)23+ kompleks besiligan 2,4,6-tripiridil-triazin sebagai pereaksi. Kompleks biru Fe(TPTZ)23+ akan berfungsi sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi Fe(TPTZ)22+ yang berwarna kuning dengan reaksi berikut: Fe(TPTZ)2 3+ + AROH → Fe(TPTZ)22+ + H+ + AR=O
Kumis kucing mengandung saponin, kalium (Wirakusumah & Setyowati 1994), asam rosmarinat, diterpenoid, triterpenoid (Matkowski 2008), asam oleat, asam ursolat, asam betulinat, 3-hidroksi flavon, 3’,4’dihidroksiflavon, dan 2’,3’-dihidroksiflavon (Khamsah et al. 2006).
Fenol dan Flavonoid Senyawaan fenol biasanya terdapat dalam berbagai jenis sayuran, buah-buahan dan tanaman. Turunan senyawaan fenol merupakan metabolit sekunder terbesar yang diproduksi oleh tanaman. Senyawaan ini diproduksi dalam tanaman melalui jalur sikimat dan metabolisme fenil propanoid. Senyawaan fenol dapat memiliki aktivitas antioksidan, antitumor, antiviral, dan antibiotik (Apak et al. 2007). Diantara senyawaan fenol alami yang telah diketahui lebih dari seribu stuktur, flavonoid merupakan golongan terbesar (Subeki 1998). Flavonoid merupakan senyawa dengan bobot melekul rendah dan memiliki stuktur dasar C6C3C6, yaitu terdiri atas 2 buah cincin benzena yang dihubungkan dengan 3 karbon (Gambar 1). Flavonoid terbagi menjadi 7 kelompok, yaitu antosianin, proantosianin, isoflavon, flavonon, flavonol, flavanol, dan flavon. Flavonoid memiliki aktivitas antioksidan di dalam tubuh sehingga disebut bioflavonoid.
Gambar 2 Tanaman kumis kucing. Tempuyung Tempuyung (Sonchus avensis) termasuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa Asterales, suku Asteraceae, genus Sonchus, spesies avensis. Tempuyung merupakan tanaman menahun yang tumbuh liar pada tanah lembap dan cukup sinar matahari (Gambar 3). Tempuyung mengandung kandungan senyawa kimia seperti flavonoid (kaemferol, luteolin-7-Oglukosida, dan apigenin-7-O-glukosida), kumarin, dan asam fenolat bebas (Sriningsih et al. 2002).
Gambar 1 Stuktur dasar flavonoid (Apak et al. 2007). Gambar 3 Tanaman tempuyung. Kumis Kucing Kumis kucing (Orthosiphon stamineus) merupakan tanaman obat yang berasal dari wilayah Afrika tropis dan kemudian menyebar ke Asia dan Australia. Kumis kucing masuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo Lamiales, suku Lamiaceae, genus Orthosiphon, spesies stamieus. Kumis kucing merupakan tanaman tahunan dengan tinggi 50-100 cm (Gambar 2).
Sidaguri Sidaguri (Sida rhombifolia) merupakan tanaman liar yang tersebar di seluruh daerah tropis. Tanaman ini dapat mencapai tinggi 2 m (Gambar 4). Sidaguri masuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo Malvaves, suku Malvaceae, genus Sida, spesies rhombifolia. Daun tanaman ini mengandung alkaloid, steroid, kalsium
3 oksalat, saponin, fenol dan asam amino (Khalil et al. 2006).
Sambiloto termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa Scrophulariales, suku Acanthaceae, marga Andrographis, spesies paniculata. Kedaung
Gambar 4 Tanaman sidaguri. Jati Belanda Jati belanda (Guazuma umifolia) termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa Malvaves, suku Stercuiaceae, genus Guazuma, spesies ulmifolia. Jati belanda merupakan tanaman liar yang tingginya dapat mencapai 2,2 m (Gambar 5). Kulit batang tanaman ini mengandung glukosa dan asam damar (Wirakusumah & Setyowati 1994). Daunnya mengandung flavonoid, steroid, triterpenoid, saponin, dan tanin (Umar 2008).
Kedaung (Parkia biglobosa) merupakan tanaman liar yang tingginya dapat mencapai 45 m (Gambar 7). Biji tanaman ini mengandung glukosida, damar, tanin, dan garam-garam alkali (Wirakusumah & Setyowati 1994). Daun kedaung mengandung asam oksalat dan asam hidroksinamat (Alabi et al. 2005). Tanaman ini termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae) bangsa Fabales, suku Fabaceae, genus Parkia, spesies biglobosa.
Gambar 7 Tanaman kedaung. Troloks Gambar 5 Tanaman jati belanda. Sambiloto Sambiloto (Andrographis paniculata) merupakan tanaman liar yang tingginya dapat mencapai 80 cm (Gambar 6). Tanaman ini banyak mengandung kalium dan garam natrium (Wirakusumah & Setyowati 1994).
Gambar 6 Tanaman sambiloto.
Troloks atau senyawa 6-hidroksi-2,5,7,8tetrametilkroman-2-asam karboksilat dengan bobot molekul 250,32 g/mol merupakan antioksidan sintetik (Gambar 8). Secara stuktur troloks serupa dengan α-tokoferol kecuali penggantian rantai samping hidrokarbon dengan gugus COOH. Troloks berupa bubuk berwarna putih sampai kuning dan memiliki titik leleh 189-195 °C. Senyawa ini stabil selama 2 bulan pada suhu 22-45 °C dan mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan α-tokoferol, BHA, serta BHT (Belitz 1999). Troloks sering dipergunakan sebagai standar dalam pengukuran antioksidan. Koefisien TEAC (troloks equivalent antioxidant capacity) adalah konsentrasi troloks yang memiliki kapasitas antioksidan yang ekuivalen dengan sampel yang dianalisis. Kapasitas antioksidan dari setiap metode dinyatakan dalam µmol troloks/g ekstrak etanol tanaman.
Ekstraksi Etanol (Macari et al. 2006) Serbuk tanaman dimaserasi dalam etanol 70% selama 3 x 24 jam dengan nisbah serbuk kering-etanol 1:13 (g/ml). Ekstrak dipekatkan dengan penguap putar dan dikeringkan dengan pengering beku kemudian ditimbang untuk menentukan rendemen. Gambar 8 Stuktur troloks®.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah daun dan batang dari 6 jenis tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung, DPPH, Neokuproin alkoholik, TPTZ , kuersetin, asam galat, dan troloks produksi Aldrich, CuCl2·2H2O, FeCl3·6H2O, Folin-Ciocalteu, dan AlCl3 produksi Merck. Peralatan yang digunakan adalah spektrofotometer Shimadzu UV 2700. Metode Diagram alir penelitian ditunjukkan pada Lampiran 1. Analisis dilakukan pada ekstrak etanol dari daun kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung yang meliputi analisis kuantitatif total fenol, analisis kuantitatif total flavonoid, dan uji aktivitas antioksidan menggunakan 3 metode, yaitu CUPRAC, DPPH, dan FRAP. Preparasi Sampel Daun dan batang tanaman dikeringkan kemudian dihancurkan dan diayak dengan ukuran 100 mesh. Bahan ini kemudian dipergunakan untuk pengujian selanjutnya. Penentuan Kadar Air (AOAC No 934.01 1998) Sebanyak 1 g serbuk tanaman dimasukkan dalam cawan porselen yang telah dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C selama 30 menit. Cawan porselen yang telah berisi simplisia tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C selama 3 jam, didinginkan dalam eksikator, lalu ditimbang bobotnya. Penimbangan dilakukan sampai diperoleh bobot tetap.
Analisis Kuantitatif Total Fenol (Slinkard & Singleton 1977) Sebanyak 0,1 ml ekstrak etanol tanaman ditambahkan 3,9 ml akuades dan 0,5 ml pereaksi Folin-Ciocalteu (1:10 dalam akuades). Larutan tersebut didiamkan selama 3 menit kemudian ditambahkan 2 ml Na2CO3 20% dan diukur nilai absorbansnya pada 756,5 nm. Larutan asam galat digunakan sebagai zat untuk membuat kurva kalibrasi. Kandungan total fenol dalam ekstrak etanol diekspresikan sebagai mg asam galat ekuivalen/g serbuk kering. Analisis Kuantitatif Total Flavonoid (Pourmorad et al. 2006) Sebanyak 0,5 ml ekstrak yang telah diencerkan (1:10 g/ml etanol) ditambahkan 1,5 ml etanol; 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml natrium asetat 1 M; dan 2,8 ml akuades. Campuran larutan tersebut dibiarkan selama 30 menit dan diukur absorbansnya pada 417 nm. Kuersetin digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. Kandungan total flavonoid dalam ekstrak etanol diekspresikan sebagai mg kuersetin /g serbuk kering. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC (Apak et al. 2007) Sebanyak 1 ml ekstrak dilarutkan dalam etanol 96% ditambahkan 1 ml CuCl2·2H2O 0,01 M; 1 ml neokuproin etanolik 0,0075 M; 1 ml bufer amonium asetat pH 7 1M; dan 0.1 ml akuades. Larutan didiamkan selama 30 menit dan diukur absorbansnya pada 453,4 nm. Sebagai blangko digunakan campuran larutan tanpa ekstrak. Kurva kalibrasi dibuat menggunakan larutan troloks dengan berbagai konsentrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam µmol troloks/g serbuk kering.
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) Sebanyak 1 ml larutan DPPH 1 mM (dalam metanol) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ekstrak etanol tanaman dilarutkan dalam metanol lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi hingga volume larutan tepat 5 ml. Larutan tersebut didiamkan selama 30 menit dan diukur absorbansnya pada 515,5 nm. Larutan troloks dengan berbagai konsentrasi digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam µmol troloks/g serbuk kering. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode FRAP (Benzie & Strain 1996) Pereaksi FRAP dibuat dengan campuran bufer asetat 300 mM pH 3,6; TPTZ 10 mM dalam 40 mM HCl; dan 20 mM FeCl3·6H2O dengan nisbah 10:1:1. Sebanyak 150 µl ekstrak ditambahkan 4,5 ml pereaksi FRAP kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu 30 °C dan diukur absorbansnya pada 598 nm. Larutan troloks dengan berbagai konsentrasi digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam µmol troloks/g serbuk kering. Analisis Data Data hasil penelitian diolah untuk melihat korelasi total fenol, flavonoid dan aktivitas antioksidan dengan CUPRAC, DPPH, dan FRAP. Data kemudian diolah dengan rancangan acak lengkap untuk melihat pengaruh metode pengukuran terhadap nilai aktivitas antioksidan.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak Tanaman Semua serbuk tanaman terlebih dahulu ditentukan kadar airnya. Pengukuran kadar air dilakukan untuk mengetahui daya simpan suatu bahan. Kadar air kedaung, kumis kucing, jati belanda, tempuyung, sambiloto, dan sidaguri secara berurut adalah 8,35; 11,34; 8,32; 10,31; 11,13; dan 6,93% (b/b) (Lampiran 2). Ekstraksi dilakukan dengan etanol karena merupakan pelarut yang aman digunakan dalam obat-obatan, sesuai dengan lisensi Badan POM. Sementara penggunaan etanol 70% didasarkan hasil penelitian Macari et al. (2006), yaitu pengujian antioksidan
tanaman obat dalam etanol 70% menunjukkan aktivitas yang tinggi dibandingkan dengan dalam konsentrasi ataupun beberapa pelarut lainnya. Sementara maserasi atau perendaman dalam pelarut tanpa adanya pemanasan bertujuan agar senyawaan yang terkandung dalam contoh tidak rusak. Proses ini dilakukan selama 3 hari kemudian dilanjutkan dengan pemekatan dan pengeringan ekstrak. Pengeringan ekstrak dilakukan dengan pengering beku pada suhu -70 °C. Rendemen hasil ekstraksi untuk kedaung, kumis kucing, jati belanda, tempuyung, sambiloto dan sidaguri secara berurut adalah 15,13; 15,44; 14,87; 11,57; 7,11; dan 7,16% (Lampiran 3). Nilai rendemen ini berbeda untuk setiap jenis tanaman bergantung pada kandungan senyawa setiap tanaman itu sendiri. Aktivitas Antioksidan Metode CUPRAC Pada metode CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), kompleks bisneokuproin-tembaga(II) akan mengoksidasi senyawaan antioksidan dalam ekstrak tanaman dan mengalami reduksi membentuk kompleks bis-neokuproin-tembaga(I). Secara visual hal ini dapat dilihat dari perubahan warna kompleks larutan dari biru toska menjadi kuning. Pereaksi CUPRAC merupakan pereaksi yang selektif karena memiliki nilai potensial reduksi yang rendah, yaitu sebesar 0,17 V (Apak et al. 2007). Hasil pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode CUPRAC ditunjukkan pada Tabel 1. Data selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 4. Tabel
1
Kapasitas antioksidan metode CUPRAC Kapasitas Antioksidan Jenis Tanaman (μmol troloks/g serbuk kering) Sidaguri 11,8879 Sambiloto 17,2824 Tempuyung 45,8327 Jati belanda 194,9299 Kumis kucing 209,4936 Kedaung 548,9904
Kapasitas antioksidan kedaung > kumis kucing > jati belanda > tempuyung > sambiloto > sidaguri. Kedaung dari data di atas memiliki aktivitas antioksidan paling
6
tinggi yang diduga mengandung asam hidroksinamat (Alabi et al. 2005). Asam hidrosinamat termasuk golongan polifenol dan dapat berperan sebagai zat antioksidan karena memiliki atom hidrogen dari gugus hidroksil yang dapat disumbangkan pada radikal bebas. Metode DPPH Metode DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil) merupakan senyawa radikal nitrogen. DPPH akan mengambil atom hidrogen yang terdapat dalam suatu senyawa, misalnya senyawaan fenol. Mekanisme terjadinya reaksi DPPH ini berlangsung melalui transfer elektron. Larutan DPPH yang berwarna ungu memberikan serapan absorbans maksimum pada 515,5 nm. Larutan DPPH ini akan mengoksidasi senyawa dalam ekstrak tanaman. Proses ini ditandai dengan memudarnya warna larutan dari ungu menjadi kuning. Hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dapat dilihat pada Tabel 2 sementara data selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 5. Tabel 2 Kapasitas antioksidan metode DPPH Kapasitas Antioksidan Jenis Tanaman (μmol troloks/g serbuk kering) Sidaguri Sambiloto Tempuyung Jati belanda Kumis kucing Kedaung
17,9414 16,1915 71,4714 126,5693 192,3260 450,5449
Kapasitas antioksidan kedaung > kumis kucing > jati belanda > tempuyung > sidaguri > sambiloto. Hasil pengukuran ini berbeda dengan pengukuran metode CUPRAC, yang diduga karena perbedaan pelarut dan sensitivitas metode. DPPH menggunakan pelarut metanol sehingga kemungkinan senyawa hidrofilik yang terekstrak dalam metanol lebih banyak dibandingkan dalam pelarut etanol. Metode DPPH ini mudah digunakan, cepat, cukup teliti (Prakash 2001), dan baik digunakan dalam pelarut organik, khususnya alkohol (Apak et al. 2007). Metode ini juga sensitif untuk menguji aktivitas antioksidan dalam ekstrak tanaman (Pourmorad et al. 2006). Akan tetapi, metode DPPH kurang sensitif untuk mengukur
aktivitas antioksidan selain dari senyawaan fenol (Apak et al. 2007) Metode FRAP Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FRAP (ferric reducing antioxidant power) didasarkan atas kemampuan senyawa antioksidan dalam mereduksi senyawa besi(III)-tripiridil-triazin menjadi besi(II)tripiridil triazin pada pH 3,6. Hasil pengujian dengan FRAP ditunjukkan pada Tabel 3 sedangkan data selengkapnya di Lampiran 6. Tabel 3 Kapasitas antioksidan metode FRAP Kapasitas Antioksidan Jenis Tanaman (μmol Troloks/g serbuk kering) Sidaguri Sambiloto Tempuyung Jati belanda Kumis kucing Kedaung
3,8515 5,4021 10,2304 14,3581 23,7300 90,1591
Kapasitas antioksidan kedaung > kumis kucing > jati belanda > tempuyung > sambiloto > sidaguri. Pengukuran FRAP memberikan urutan respons yang sama dengan metode CUPRAC. Namun hasilnya menunjukkan aktivitas yang lebih kecil dibandingkan dengan data pengujian CUPRAC ataupun DPPH. Hal ini diduga karena larutan FRAP bersifat kurang stabil sehingga harus dibuat secara in time dan harus segera dipergunakan (Then et al. 2003). Menurut Ou et al. (2002), pengukuran antioksidan dengan metode FRAP dapat berjalan akurat apabila dilakukan pada senyawaan antioksidan yang bisa mereduksi Fe(III)TPTZ pada kodisi reaksi secara termodinamika dan memiliki laju reaksi yang cukup cepat. Selain itu, antioksidan yang teroksidasi dan semua produk reaksi sekundernya harus tidak memiliki serapan maksimum pada absorbansi 598 nm atau serapan Fe(II)TPTZ. Pada kenyataannya kondisi ini sulit ditemui dan tidak realistis (Apak et al. 2007), Menurut Ou et al. (2002), hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu karena nilai potensial reduksi standar dari Fe (III)/Fe(II) adalah 0.77 V sehingga senyawa apapun dengan nilai potensial reduksi dibawah 0.77 V dapat mereduksi Fe(III) menjadi Fe(II) dan memberikan kontribusi pada pengukuran
7
antioksidan dengan metode FRAP. Selain itu, tidak semua antioksidan dapat mereduksi Fe(III) dengan waktu yang sesuai dengan waktu inkubasi. Menurut Pulido et al. (2000), absorbans dari beberapa senyawaan fenol seperti asam kafeat, asam ferulat, kuersetin, dan tanin tidak stabil dalam pengukuran FRAP karena waktu inkubasi yang dibutuhkan lebih lama dibandingkan dengan waktu inkubasi FRAP. Senyawaan antioksidan tipe-S seperti glutation juga membutuhkan waktu reaksi yang lebih lama sehingga tidak dapat diukur dengan metode FRAP (Ou et al. 2002). Penyebab lainnya, senyawaan pengganggu dapat memiliki serapan absorbans maksimum pada daerah pengukuran FRAP. Hal ini berlaku untuk contoh bahan alam yang memiliki banyak senyawa pengganggu sehingga FRAP tidak cocok untuk diaplikasikan pada contoh biologis. Uji-F dan Uji-t Pengukuran aktivitas antioksidan metode CUPRAC, DPPH dan FRAP pada enam tanaman obat memberikan hasil yang berbeda sehingga perlukan uji-F dan uji-t. Berdasarkan perhitungan nilai uji-F didapatkan nilai Fhitung untuk setiap jenis tanaman lebih besar dari F0,05(2,6) artinya minimal ada sepasang metode yang memberikan hasil berbeda nyata. Oleh karena itu, dilakukan uji lanjutan, yaitu uji-t yang menunjukkan bahwa setiap tanaman pada ketiga metode memberikan hasil yang berbeda nyata (Lampiran 7). Kandungan Total Fenol Pengukuran kandungan total fenol dilakukan dengan penambahan pereaksi Folin-Ciocalteau. Folin-Ciocalteau adalah pereaksi anorganik yang dapat membentuk larutan kompleks dengan senyawaan fenol. Warna yang terbentuk dapat dideteksi oleh sinar tampak pada panjang gelombang 756,5 nm. Senyawa fenol sebagai metabolit sekunder dalam tanaman berpotensi sebagai zat antioksidan. Hal ini disebabkan oleh keberadaan gugus hidroksil dalam senyawaan fenol. Gugus hidroksil dapat berfungsi sebagai penyumbang atom hidrogen ketika bereaksi dengan senyawa radikal melalui mekanisme transfer elektron sehingga proses oksidasi dihambat. Hasil pengukuran total fenol ditunjukkan pada Tabel 4.
Tabel 4 Kandungan Total Fenol Jenis Total fenol Tanaman (mg as galat/ g serbuk kering) Sidaguri 4,9318 Sambiloto 5,2348 Tempuyung 12,0633 Jati belanda 20,2204 Kumis kucing 24,5345 Kedaung 57,2686 Data kandungan total fenol selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 8. Dari hasil percobaan diketahui kandungan total fenol kedaung > kumis kucing > jati belanda > tempuyung > sambiloto > sidaguri. Kedaung memiliki kandungan total fenol yang paling besar di antara 5 tanaman herbal lainnya Kandungan Total Flavonoid Kandungan total flavonoid diukur berdasarkan keberadaan kuersetin di dalam ekstrak tanaman. Analisis kandungan flavonoid dilakukan dengan penambahan pereaksi AlCl3. Sebagai asam lewis, AlCl3 akan membentuk ikatan kompleks dengan gugus hidroksil dari senyawaan flavonoid. Perubahan ini diidentifikasi melalui absorbans pada daerah sinar tampak melalui alat spektofotometer. Semakin banyak kandungan senyawa flavonoid dalam suatu ekstrak maka secara visual warna kuning yang terbentuk akan semakin pekat. Kandungan total flavonoid dari setiap tanaman ditunjukkan pada Tabel 5. Data kandungan total flavonoid selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 9. Tabel 5 Kandungan Total Flavonoid Total flavonoid Jenis Tanaman (mg kuersetin/g serbuk kering) Sidaguri 0,4153 Sambiloto 0,4598 Kumis kucing 0,6600 Tempuyung 0,7537 Kedaung 2,0835 Jati belanda 3,0480 Berdasarkan data tersebut kandungan total flavonoid jati belanda > kedaung > tempuyung > kumis kucing > sambiloto > sidaguri. Urutan ini tidak sama dengan urutan kandungan total fenol, berarti tingginya kandungan total fenol tidak hanya disebabkan oleh golongan flavonoid. Perbedaan ini
8
kemungkinan disebabkan oleh ketidaksensitifan metode ini dalam menguji semua golongan flavonoid. Menurut Apak et al. (2007), metode pengujian dengan menggunakan AlCl3 memiliki kekurangan. AlCl3 juga dapat mengkompleks beberapa kelompok dari flavonoid seperti flavon (krisin, apigenin, dan luteolin) dan flavonol (kuersetin, mirisetin, morin, dan rutin) tetapi tidak dapat mengkompleks golongan flavanon dan flavanonol.
(b) y = 8,353x – 27,15 r = 0,998 R2= 0,996
Hasil Uji Korelasi Total Fenol dengan Aktivitas Antioksidan Senyawaan fenol adalah senyawaan kimia yang berpotensi sebagai antioksidan, tetapi aktivitas antioksidan tidak hanya disebabkan oleh senyawaan fenol. Senyawaan triterpena pentasiklik, vitamin C, zat warna seperti klorofil, senyawaan sulfur, ataupun nitrogen dapat berperan sebagai zat antioksidan (Khamsah et al. 2006). Analisis korelasi antara total fenol dan aktivitas antioksidan menggunakan metode CUPRAC, DPPH, serta FRAP bertujuan untuk menentukan kedekatan hubungan antara total fenol dan aktivitas antioksidan. Hasil analisis korelasi ditunjukkan pada Gambar 9. Dari analisis korelasi tersebut didapatkan nilai korelasi untuk kandungan total fenol terhadap aktivitas antioksidan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP adalah sebesar 0,995; 0,998; dan 0,978. Hal ini berarti terlihat hubungan korelasi yang positif dan kuat antara total fenol dan aktivitas antioksidan dengan ketiga metode tersebut. Dari hasil tersebut dapat dinyatakan bahwa aktivitas antioksidan disebabkan oleh kandungan total fenol dari suatu tanaman.
(a) y = 10,40x – 44,12 r = 0,995 R2= 0,989
(c) y = 1,643x – 9,418 r = 0,978 R2= 0,956
Keterangan: 1) sidaguri, 2) sambiloto, 3) tempuyung, 4) jati belanda, 5) kumis kucing, dan 6) kedaung.
Gambar 9
Hubungan total fenol dengan aktivitas antioksidan (a) metode CUPRAC, (b) metode DPPH, dan (c) metode FRAP.
Total Flavonoid dengan Aktivitas Antioksidan Senyawaan flavonoid dapat memiliki aktivitas antioksidan sehingga dilakukan uji korelasi. Hasil korelasi ditunjukkan pada Gambar 10. Hasil uji korelasi (r) total flavonoid dengan aktivitas antioksidan metode CUPRAC, DPPH dan FRAP masingmasing sebesar 0,589; 0,495; dan 0,430. Nilai (r) ini mendekati nol sehingga dapat dinyatakan bahwa total flavonoid tidak berkorelasi dengan aktivitas antioksidan
(a)
y = 111,5x + 33,42 r = 0,589 R2= 0,347
memiliki hubungan yang linear dengan total flavonoid karena nilai r mendekati nol (Mattjik dan Sumertajaya 2006). Hal ini menunjukkan bahwa untuk setiap jenis tanaman tingginya kandungan fenol dari setiap tanaman tidak selalu bersumber pada golongan flavonoid.
y = 0,029x + 0,619 r = 0,539 R2= 0,290
(b)
y = 74,97x + 53,11 r = 0,495 R2= 0,244
keterangan: 1) sidaguri, 2) sambiloto, 3) tempuyung, 4) jati belanda, 5)kumis kucing, dan 6) kedaung.
Gambar 11 Hubungan total fenol dengan total flavonoid.
(c)
y = 13,07x + 8,456 r = 0,430 R2= 0,184
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Keterangan: 1)sidaguri, 2) sambiloto, 3) kumis kucing, 4)tempuyung, 5)kedaung, dan 6) jati belanda.
Gambar 10 Hubungan total flavonoid dengan aktivitas antioksidan (a) metode CUPRAC, (b) metode DPPH, dan (c) metode FRAP. Total Fenol dengan Total Flavonoid Diketahui bahwa flavonoid merupakan golongan terbesar senyawaan fenol (Subeki 1998). Dengan menghubungkan kandungan total fenol dengan kandungan flavonoid didapatkan nilai korelasi (r) sebesar 0,539 (Gambar 11). Hal ini berarti total fenol tidak
Dari ekstrak etanol 70% 6 jenis tanaman obat, yaitu, kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung diketahui bahwa semua tanaman tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP berbeda nyata secara statistika. Walaupun demikian metode CUPRAC dan FRAP memberikan urutan aktivitas antioksidan yang sama dari enam tanaman. Kandungan total fenol tidak memiliki memiliki korelasi dengan total flavonoidnya tetapi memiliki korelasi yang kuat dan searah dengan aktivitas antioksidannya. Kandungan total flavonoid tidak memiki korelasi dengan aktivitas antioksidan berarti aktivitas antioksidan tidak hanya bersumber dari golongan flavonoid. Saran Sebaiknya dilakukan penelitian lanjutan dengan memperbanyak jumlah sampel dan populasi dari berbagai jenis tanaman obat Indonesia lainnya.
DAFTAR PUSTAKA Alabi DA, Akinsulire OR, Sanyaolu MA. 2005. Qualitative determination of chemical and nutritional compotition of Parkia Biglobosa (Jacq) Benth. Afr J Biotechnol 4:812-815. Apak R et al. 2007. Comparative evaluation of various total antioxidant capacity assay applied to phenolic compounds with the CUPRAC assay. Molecules 12:1496-1547. [AOAC] Association of Official Analytical Chemistry. 1998. Official Methods of Analysis of AOAC International. Ed-16. Volume ke-2. Maryland: AOAC International. Belitz HD, Grosch W. 1999. Food Chemistry. Jerman: Springer. Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measurement of ‘antioxidant power’ : the FRAP assay. Anal Biochem 239:70-76. Femi-Ola TO, Ajibade VA, Avolabi A. 2008. Chemical composition and termicidal properties of Parkia Biglobosa (Jacq) Benth. J Bio Sci 8:494-497. Hanani E, Mun’im A, Sekarini R. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callispongia sp dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian 2:127133. Kamiloglu O et al. 2009. Total Phenolic and antioxidant activity of jujube (Zyziphus Jujube Mill.) genotypes selected from turkey. Afr J Biotechol 8:302-307. Kao MS et al. 2007. Phenolic content and antioxidant capacities of Alabama-Grown thornless blackberries. Int J Fruit Sci 7:3346. Khalil NM, Sperotto JS, Manfron MP. 2006. Anti-inflmmatory of the hydroalcoholyc extracts of leaves of Sida rhombifolia L (Malvaceae). Act Farm Bon 25:260-261. Khamsah SM, Akowah G, Zhari I. 2006. Antioxidant activity and phenolic content of orhosiphon stamineus Benth from different geofraphical origin. J Sust Sci Management 1:14-20.
Macari PdAT, Portela CN, Polhit AM. 2006. Antioxidant, cycotoxic, and UVBabsorbing activity of Maytenus guyanensisi Klotzch (celastaceae) bark extracts. Acta Amazonica 36:513-518. Matkowski A. 2008. Antioxidant activity of extracts and different solvent of Glechoma hederacea L and Orhosiphon stamineus (Benth) Kudo. Adv Clin Exp Med 17:615624. Miller AL. 1996. Antioxidant flavonoid: structure, function and clinical usage. [terhubung berkala] http://public.carnet.hr/acphee/42305.pdf [ 24 Feb 09] Ou B, et al. 2002. Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay: A comparative study. J Agric Food Chem 50:3122-3128. Percival.M.1998.Antioxidants. [terhubung berkala] http://acudoc.com/Antioxidants .pdf [19 Feb 09]. Pourmorad F, Hosseinimehr SJ, Shahabimajd N. 2006. Antioxidant activity, phenol, and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants. Afr J Biotechnol 5:1142-1145. Pulido R, Bravo L, Saura-Calixo F. 2000. Antioxidant Activity of dietary polyphenols as determined by modified ferric reducing antioxidant power assay. J Agric Food Chem 48:3396-3402. Prakash A. 2001. Antioxidant activity. Analitical progress 19:2. Slinkard, K dan Singleton VL. 1977. Total phenol analysis: automation and comparison with manual methods. Am J Enol Victic 28:49-55. Sriningsih et al. 2002. Analisa senyawa golongan flavonoid herba tempuyung (Soncus Arvensis L). Pusat Teknologi Farmasi BPPT. Subeki. 1998. Pengaruh cara pemasakan terhadap kandungan antioksidan beberapa macam sayuran serta daya serap dan retensinya pada tikus percobaan [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
11
Then M, Szentmihalyi K, Sarkőzi A, Varga IS. 2003. Examination on antioxidant activity in greater celadine (Celidonium majus L) extracts by FRAP method. Acta Bio szegediensis 47:115-117. Umar F. 2008. Optimasi ekstraksi flavonoid total daun jati belanda [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Wirakusumah ES, Setyowati RN. 1994. Cantik dan Bugar dengan Ramuan Nabati. Jakarta: Penebar Swadaya. Yuwono A. 2009. Antioxidant and health disease. [terhubung berkala] http://farmacology.org/specialistmedic/inte rnist [ 2 Maret 2009]
LAMPIRAN
13 Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Sampel daun atau batang tanaman
Kadar Air
Preparasi Sampel
Ekstrak Etanol
Uji Total Fenol
Uji Total Flavonoid
• • •
Uji Antioksidan Metode CUPRAC Metode DPPH Metode FRAP
Analisis Korelasi Total Fenol, Flavonoid dan Aktivitas Antioksidan
14 Lampiran 2 Penentuan kadar air Jenis Tanaman Kedaung
Sambiloto
Tempuyung
Sidaguri
Kumis Kucing
Jati Belanda
Ulangan
Bobot Awal (g)
Bobot Akhir (g)
Kadar Air (% [b/b])
1
0,9991
0,9153
8,39
2
0,9980
0,9156
8,26
8,35
0,95
3 1 2
0,9988 0,9999 0,9994
0,9149 0,8874 0,8886
8,40 11,25 11,09
11,13
0,97
3 1 2 3 1
1,0001 0,9956 0,9968 0,9985 0,9934
0,8896 0,8916 0,8940 0,8970 0,9248
11,05 10,45 10,31 10,17 6,91
10,31
1,36
2 3 1 2 3
0,9978 0,9988 0,9965 0,9976 0,9970
0,9292 0,9289 0,8824 0,8845 0,8851
6,88 7,00 11,45 11,34 11,22
6,93
0,93
11,34
1,00
1
1,0054
0,9220
8,30
2
0,9968
0,9144
8,27
8,32
0,93
3
0,9961
0,9123
8,41
# Kadar Air (%) = bobot awal – bobot akhir x 100% bobot awal Kadar Air (%) = 0,9991- 0,9153 x 100% = 8,39% 0,9991 # Simpangan Baku Rerata (%SBR) n ## Rerata (x) = ∑xi = (8,39 + 8,26 + 8,40) = 8,35% i=1 3 n n ## Standar Deviasi (s2) = ∑ (xi – x)2 i=1 n-1 s2 = (8,39 – 8,35)2 + (8,26 – 8,35)2 + (8,40 – 8,35)2 = 0,0781 3-1 ## %SBR = s2 x 100% = 0,0781 x 100% = 0,95% X 8,35
Rerata (% [b/b])
SBR (%)
15
Lampiran 3 Rendemen ekstrak kering Jenis Tanaman Kedaung
Sambiloto
Tempuyung
Sidaguri
Kumis Kucing
Jati Belanda
# Rendemen (%) =
Ulangan
Bobot Awal (g)
Bobot Akhir(g)
Rendemen (% [b/b])
1
38,4550
5,6136
15,93
2
38,4562
5,1951
14,74
3 1 2 3
38,4591 38,4556 38,4535 38,4602
5,1893 2,4870 2,1817 2,6176
14,72 7,28 6,38 7,66
1 2 3 1
38,4820 38,3928 38,4671 14,9920
4,1194 3,8977 3,9503 0,9235
11,94 11,32 11,45 6,62
2 3 1 2 3
14,9915 14,9967 38,4565 38,4656 38,4668
1,0795 0,9946 5,3340 5,1490 5,3107
7,74 7,13 15,64 15,10 15,57
1
38,4563
5,2043
14,76
2
38,4460
5,3240
15,11
3
38,4603
5,1988
14,74
bobot akhir x 100% = bobot awal x(1-kadar air)
Rerata (% [b/b]) 15,13
7,11
11,57
7,16
15,44
14,87
5,6136 x 100% = 15,13% 38,4550 (1-0,0835)
16 Lampiran 4 Kapasitas antioksidan metode CUPRAC # Pembuatan Kurva kalibrasi Larutan troloks (μM)
Absorbans
25 50 75 100 150 200
0,049 0,166 0,276 0,416 0,692 1,044
Gambar Kurva standar troloks # Pengukuran Kapasitas Antioksidan Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g ekstrak kering)
Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g serbuk kering)
183,0541
3690,6071
558,3889
0,893
180,0468
3572,3577
540,4977
25 25
0,895 0,266
180,4006 69,1311
3622,5025 1360,8487
548,0846 210,1150
20
25
0,263
68,6004
1355,7394
209,3262
25,4 24,3
20 20
25 25
0,264 0,237
68,7773 64,0010
1353,8841 1316,8938
209,0397 195,8221
24,5
20
25
0,236
63,8241
1302,5335
193,6867
24,3
20
25
0,236
63,8241
1313,2539
195,2809
25,4
2
25
1,01
200,7440
395,1654
45,7206
25,7
2
25
1,013
201,2747
391,5851
45,3064
25,1
2
25
1,015
201,6285
401,6504
46,4710
25,2
5
25
0,156
49,6722
246,3900
17,5183
25,2
5
25
0,156
49,6722
246,3900
17,5183
25,7
5
25
0,150
48,6108
236,4340
16,8105
24,4
-
25
0,799
163,4183
167,4368
11,9885
24,4
-
25
0,795
162,7107
166,7118
11,9366
25
-
25
0,802
163,9490
163,9490
11,7387
Jenis Tanaman
Bobot Contoh (mg)
Kedaung
Kumis Kucing Jati Belanda Tempuyung
Sambiloto
Sidaguri
fp
Vcontoh (ml)
Abs
C-contoh (μM troloks)
24,8
20
25
0,91
25,2
20
25
24,9 25,4
20 20
25,3
Rerata (μmol troloks/g serbuk kering)
% SBR
548,9904
1,64
209,4936
0,31
194,9299
0,59
45,8327
1,29
17,2824
2,36
11,8879
1,11
17
Lampiran 5 Kapasitas antioksidan metode DPPH # Pembuatan Kurva kalibrasi Larutan troloks (μM) Absorbans Blanko 1,218
Δ Absorbans 0,000
2,5 5 7,5 10
1,186 1,136 1,093 1,061
0,032 0,082 0,125 0,157
12,5 15 20 25 50
1,041 0,983 0,785 0,749 0,337
0,177 0,235 0,433 0,469 0,881
100
0,050
1,168
Gambar Kurva Standar troloks
# Pengukuran Aktivitas Antioksidan Jenis Tanaman
Blanko Kedaung
Kumis Kucing Jati Belanda Tempuyu ng Sambiloto
Sidaguri
Bobot Contoh (mg)
fp
Volume contoh (ml)
Abs
Δ Abs
C-contoh (μM troloks)
Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g ekstrak kering)
Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g serbuk kering)
Rerata (μmol troloks/g serbuk kering)
% SBR
450,5449
0,68
192,3260
1,53
126,5693
2,52
71,4714
0,42
16,1915
3,85
17,9414
0,49
1,218 25,0 25,2
50 50
25 25
0,420 0,417
0,798 0,801
59,4470 59,6936
2972,3503 2960,9925
449,7166 447,9982
24,7 25,0 24,7 25,5 24,7
50 50 50 50 40
25 25 25 25 25
0,422 0,835 0,845 0,838 0,880
0,796 0,383 0,373 0,380 0,338
59,2826 25,3336 24,5116 25,0870 21,6346
3000,1317 1266,6813 1240,4665 1229,7561 875,8941
453,9199 195,5756 191,5280 189,8743 130,2455
25,6 25,2 24,4 24,6 25,5
40 40 10 10 10
25 25 25 25 25
0,882 0,886 0,411 0,406 0,373
0,336 0,332 0,807 0,812 0,845
21,4702 21,1414 60,1868 60,5978 63,3104
838,6790 838,9436 616,6682 615,8315 620,6907
124,7116 124,7509 71,3485 71,2517 71,8139
25,3 24,6 25,0 25,5
40 40 40 10
25 25 25 25
1,071 1,078 1,073 0,834
0,147 0,140 0,145 0,384
5,9342 5,3588 5,7698 25,4158
234,5538 217,8376 230,7924 249,1748
16,6768 15,4883 16,4093 17,8409
25,7
10
25
0,829
0,389
25,8268
251,2338
17,9883
25,2
10
25
0,835
0,383
25,3336
251,3257
17,9949
18
Lampiran 6 Kapsitas antioksidan metode FRAP # Pembuatan Kurva kalibrasi Larutan troloks (μM)
Absorbans
25 50 75 100 150 200 300
0,016 0,067 0,079 0,097 0,264 0,403 0,596
y = 0,002x – 0,066 R2= 0,979
Gambar kurva kalibrasi troloks
# Pengukuran Aktivitas Antioksidan
Abs
C-contoh (μM Troloks)
Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g ekstrak kering)
Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g serbuk kering)
25
0,59
297,0818
598,9553
90,6219
2
25
0,589
296,6294
588,5505
89,0477
24,9 25,7 25,5 25,4
2 -
25 25 25 25
0,594 0,279 0,281 0,284
298,8913 155,6323 156,7716 158,4805
600,1833 151,3933 153,6976 155,9847
90,8077 23,3751 23,7309 24,0840
24,3 24,5 24,3 25,3 24,8 24,6 24,2 24,8 24,2 24,4 24,4 24,4
-
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
0,169 0,172 0,172 0,156 0,162 0,163 0,134 0,142 0,132 0,05 0,049 0,049
92,9720 94,6809 94,6809 85,5667 88,9846 89,5542 73,0347 77,5918 71,8954 52,8029 52,3506 52,3506
95,6502 96,6132 97,4084 84,5521 89,7022 91,0104 75,4490 78,2175 74,2721 54,1014 53,6379 53,6379
14,2232 14,3664 14,4846 9,7827 10,3785 10,5299 5,3644 5,5613 5,2807 3,8737 3,8405 3,8405
Jenis Tanaman
Bobot Contoh (mg)
Kedaung
Kumis Kucing Jati Belanda Tempuyung
Sambiloto
Sidaguri
fp
Vcontoh (ml)
24,8
2
25,2
Rerata (μmol troloks/g serbuk kering)
% SBR
90,1591
1,07
23,7300
1,49
14,3581
0,91
10,2304
3,86
5,4021
2,67
3,8515
0,50
19
Lampiran 7 Uji F dan Uji t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan 1. Kedaung Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung Keragaman Kuadrat Tengah Perlakuan 2 668083749,86 334041874,93 5780,02 Galat 6 346755,28 57792,55 Total 8 668430505,14 F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’
F 0,05 (2,6) 5,143
# Uji t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √57792,55/3 = 138,80 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 138,80 = 480,23 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 138,80 = 496,90 Tabel Analisis Ragam Jenis μmolTroloks/ g serbuk kering Kesimpulan
FRAP 3938,5087 A
DPPH 19681,5917 B
CUPRAC 23982,0828 C
2. Kumis Kucing Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung Keragaman Kuadrat Tengah Perlakuan 2 111254206,26 55627103,13 10491,97 Galat 6 31811,25 5301,88 Total 8 111286017,51 F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √5301,88/ 3 = 42,04 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 42,04 = 145,46 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 42,04 = 150,50 Tabel Analisis Ragam Jenis μmolTroloks/ g serbuk kering Kesimpulan
FRAP 995,4138 A
DPPH 8067,5817 B
CUPRAC 8787,7207 C
F 0,05 (2,6) 5,143
20 Lampiran 7 Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan (lanjutan) 3. Jati Belanda Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung Keragaman Kuadrat Tengah Perlakuan 2 102000375,64 51000187,82 6570,36 Galat 6 46572,95 7762,16 Total 8 102046948,58 F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’
F 0,05 (2,6) 5,143
# Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √7762,16/ 3 = 50,87 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 50,87= 176,00 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 50,87 = 182,12 Tabel Analisis Ragam Jenis μmolTroloks/ g serbuk kering Kesimpulan
FRAP 649,3428 A
DPPH 5724,0906 B
CUPRAC 8815,6943 C
4. Tempuyung Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung Keragaman Kuadrat Tengah Perlakuan 2 31670683,70 15835341,85 14311,01 Galat 6 6639,09 1106,51 Total 8 31677322,79 F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √6639,09/ 3 = 47,04 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 47,04 = 162,77 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 47,04 = 168,40 Tabel Analisis Ragam Jenis FRAP CUPRAC DPPH μmolTroloks/ g serbuk kering 764,2311 3423,7997 5339,0675 Kesimpulan A B C Lampiran 7 Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan (lanjutan)
F 0,05 (2,6) 5,143
21 5. Sambiloto Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung Keragaman Kuadrat Tengah Perlakuan 2 10124730,02 5062365,01 673,19 Galat 6 45119,55 7519,92 Total 8 10169849,57 F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’
F 0,05 (2,6) 5,143
# Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √7519,92/ 3 = 50,07 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 50,07 = 173,23 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 50,07 = 179,25 Tabel Analisis Ragam Jenis μmolTroloks/ g serbuk kering Kesimpulan
FRAP 1068,6293 A
DPPH 3202,9242 B
CUPRAC 3418,7241 B
6. Sidaguri Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung Keragaman Kuadrat Tengah Perlakuan 2 11405391,02 5702695,51 17761,89 Galat 6 1926,38 321,06 Total 8 11407317,40 F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √1926,38/ 3 = 25,34 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,,46 x 25,34 = 87,68 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 25,34 = 90,72 Tabel Analisis Ragam Jenis μmolTroloks/ g serbuk kering Kesimpulan
FRAP 751,2899 A
CUPRAC 2318,8902 B
DPPH 3499,6937 C
F 0,05 (2,6) 5,143
22
1.2
Lampiran 8 Penentuan total fenol Absorbans
12,5 25 50 75 100 150 200
0,058 0,127 0,262
1 Absorbansi
Larutan asam galat (mg/L)
0,417 0,535 0,801 1,033
0.8 0.6
yy == 0.0052x + 0.0037 0,0052x + 0,0037
0.4
= 0.9985 R2=R20,9985
0.2 0 0
50
100
150
200
250
m g/L asam galat
Gambar Kurva Standar Asam Galat
Kandungan Total Fenol Jenis Tanaman
Kedaung
Kumis Kucing Jati Belanda Tempuyung
Sambiloto
Sidaguri
Bobot Contoh (mg)
fp
V-contoh (ml)
Abs
C-contoh (mg/L)
Total fenol (mg ekuivalen as galat/g ekstrak kering)
25,2 24,8 25,3 24,8 26,0 25,6 24,8 25,1 25,2 24,9 24,8 24,8 24,7 24,7 26,2 25,6 24,9 25,4
10 10 10 -
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
0,211 0,199 0,198 0,826 0,873 0,855 0,711 0,720 0,719 0,549 0,543 0,546 0,380 0,387 0,410 0,369 0,364 0,373
39,5936 37,3020 37,1110 157,0406 166,0163 162,5788 135,0790 136,7977 136,6068 104,1417 102,9959 103,5688 71,8677 73,2045 77,5968 69,7670 68,8122 70,5309
392,7940 376,0280 366,7096 158,3071 159,6310 158,7684 136,1684 136,2527 135,5226 104,5600 103,8265 104,4041 72,7406 74,0936 74,0428 68,1318 69,0885 69,4202
Konsentrasi contoh ekuivalen dengan asam galat y = 0,0052x + 0,0037 0,211 = 0,0052x + 0,0037 x = 39,5936 mg/L Total fenol = Vcontoh (l)x Ccontoh(mg/l) x fp Bobot Contoh (g) Total fenol = 25 ml x 39,5936 mg/l x 10 x 10¯ ³l/ml 25,2 mg x 10¯ ³ g/mg Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat/ g ekstrak kering Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat/ g ekstrak kering x rendemen Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat x 1g ekstrak kering g ekstrak kering (1/0,1513) g serbuk kering Total fenol = 59,4229 mg ekuivalen as,galat/ g serbuk kering
Total fenol (mg ekuivalen as galat/g serbuk kering) 59,4297 56,8930 55,4832 24,4426 24,6470 24,5138 20,2482 20,2608 20,1522 12,0976 12,0127 12,0796 5,1719 5,2681 5,2644 4,8782 4,9467 4,9705
Rerata (mg ekuivalen as galat/g serbuk kering)
% SBR
57,2686
3,49
24,5345
0,42
20,2204
0,29
12,0633
0,37
5,2348
1,04
4,9318
0,97
23
0.9
Lampiran 9 Kandungan total flavonoid Larutan Kuersetin Absorbans (mg/L)
0.7
0,022 0,042 0,091
Absorbansi
3,125 6,25 12,5 25
0.8
0,187
50 75 100
0.6 0.5 0.4
y =y0,0081x – -0,008 = 0.0081x 0.008 R2= 0,9997 R 2 = 0.9997
0.3 0.2
0,402 0,605 0,798
0.1 0 0
20
40
60
80
100
120
mg/L kuersetin
Gambar Kurva standar kuersetin Kandungan Total Flavonoid Jenis Tanaman Kedaung
Kumis Kucing
Jati Belanda
Tempuyung
Sambiloto
Sidaguri
Bobot Contoh (mg)
Vcontoh (ml)
Abs
C-contoh (mg/L)
Total flavonoid (mg kuersetin/g ekstrak kering)
Total flavonoid (mg kuersetin/g serbuk kering)
25
25
0,103
13,6990
13,6990
2,0727
25,1
25
0,103
13,6990
13,6444
2,0644
25,4
25
0,107
14,1926
13,9691
2,1135
25,8 24,9
25 25
0,029 0,026
4,5667 4,1965
4,4251 4,2133
0,6832 0,6505
25,8 25,6 24,3 25,2 24,4 24,6 24,9 24,6 25,6 25,2 25,5 25,7 25,4
25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
0,027 0,160 0,151 0,164 0,044 0,044 0,044 0,044 0,045 0,045 0,040 0,041 0,039
4,3199 20,7333 19,6227 21,2270 6,4178 6,4178 6,4178 6,4178 6,5413 6,5413 5,9242 6,0476 5,8008
4,1859 20,2474 20,1879 21,0585 6,5757 6,5222 6,4436 6,5222 6,3879 6,4893 5,8080 5,8829 5,7094
0,6463 3,0108 3,0019 3,1314 0,7608 0,7546 0,7455 0,4637 0,4542 0,4614 0,4159 0,4212 0,4088
Rerata (mg kuersetin/g serbuk kering)
% SBR
2,0835
1,26
0,6600
3,06
3,0480
2,37
0,7537
1,02
0,4598
1,08
0,4153
1,50
