Faculteit Farmaceutische, Biomedische en Diergeneeskundige Wetenschappen. door: Eleni Vanden Eede

Faculteit Farmaceutische, Biomedische en Diergeneeskundige Wetenschappen Onderwijscommissie Biomedische Wetenschappen

Vroege detectie en longitudinale opvolging van het ontstaan van calcificaties in de aorta van ratten met chronische nierinsufficiëntie: een microtomografische studie in vivo door:

Eleni Vanden Eede Eindverhandeling voorgelegd tot het behalen van de graad van Licentiaat in de Biomedische Wetenschappen

29/06/2007 Academiejaar 2006-2007

Promotoren: Veerle Persy, Nora De clerck Co-promotor: Andrei Postnov, Patrick D’Haese Begeleider: Ellen Neven

Adres van het laboratorium en departement waar de eindverhandeling tot stand gekomen is

Eleni Vanden Eede

Dankwoord

Eleni Vanden Eede

Inhoudstafel

1. INLEIDING ........................................................................................................................... 1 1.1. De correlatie tussen vasculaire calcificaties en cardiovasculaire complicaties............... 1 1.2. Pathofysiologie van de nier ............................................................................................. 2 1.2.1. De calciumhomeostase............................................................................................. 2 1.2.2. De fosfaathomeostase............................................................................................... 3 1.2.3. Evolutie tot chronische nierinsufficiëntie ................................................................ 3 1.2.4. De behandeling van chronische nierinsufficiëntie ................................................... 5 1.3. Moleculaire achtergrond ................................................................................................. 6 1.4. Adenine-geïnduceerde nierinsufficiëntie ........................................................................ 7 1.4.1. Adenine-pathway ..................................................................................................... 7 1.4.2. Proefdiermodel ......................................................................................................... 8 1.4.3. De relevantie van een proefdiermodel ..................................................................... 8 1.5. Doelstelling ..................................................................................................................... 9 2. MATERIALEN EN METHODEN ...................................................................................... 10 2.1. Micro CT ....................................................................................................................... 10 2.1.1. Basisprincipe micro-CT ......................................................................................... 10 2.1.1.1. X-stralen bron.................................................................................................. 11 2.1.1.2. Interactie tussen X-stralen en weefsel ............................................................. 12 2.1.1.2.1. Lineaire attenuatie coëfficiënt.................................................................. 12 2.1.1.2.2. X-straal attenuatie .................................................................................... 12 2.1.1.3. De detector ...................................................................................................... 13 2.1.2. Data Acquisitie en Experimenteel protocol ........................................................... 14 2.1.3. Data Reconstructie ................................................................................................. 15 2.1.3.1. Basisprincipe ................................................................................................... 15 2.1.3.2. Reconstructie van de in vivo en in vitro dataset.............................................. 16 2.1.4. Data Analyse: scoring van de gereconstrueerde beelden ....................................... 16 2.2. Proefdiermodel .............................................................................................................. 17 2.2.1. Proefdierprotocol.................................................................................................... 17 2.2.2. Keuze van het proefdier en huisvesting ................................................................. 18 2.2.3. Voeding .................................................................................................................. 18 2.2.4. Anesthesie .............................................................................................................. 18 2.2.5. Bloedname.............................................................................................................. 19 2.2.6. Urinecollectie ......................................................................................................... 19 2.2.7. Opoffering .............................................................................................................. 19 2.2.8. Microscopie + scoring............................................................................................ 19 2.2.9. Bepaling van de calcium inhoud: Atomaire absorptie ........................................... 20 2.2.10. Statistiek ............................................................................................................... 20 3. RESULTATEN .................................................................................................................... 21 3.1. Mortaliteit...................................................................................................................... 21 3.2. Voedselconsumptie ....................................................................................................... 21 3.3. Lichaamsgewicht........................................................................................................... 22 3.4. Analyse van serumwaarden........................................................................................... 22 3.5. Evaluatie van de micro-CT datasets.............................................................................. 27 3.5.1. Scoring van de in vivo datasets .............................................................................. 27 3.5.2. Scoring van de in vitro datasets.............................................................................. 28 3.6. Calcium bulk bepalingen............................................................................................... 30 3.7. Evaluatie van de microscopische coupes ...................................................................... 31 4. DISCUSSIE.......................................................................................................................... 35

Eleni Vanden Eede

Lijst met afkortingen

APRT

Adenine fosforibosyltransferase

Cbfa-1

Core-binding factor 1

CCD

charged coupled device

CNI

Chronische nierinsufficiëntie

CRF

Chronic renal failure

CT

Computed tomography

FNB

Formaline neutral buffered

GFR

Glomerular filtration rate

HE

Haematoxyline-eosine

KO

knock out

MGP

matrix-Gla-proteïne

NPC Pit-1

Natrium-fosfaat cotransporter Pit-1

PTH

Parathyroïd homoon

PWV

Pulse wave velocity

ROI

Region of intrest

XDH

Xanthine dehydrogenase

Eleni Vanden Eede

Lijst met figuren en tabellen Fig.1.1.: De regulatie van de calciumhomeostase in normale fysiologische omstandigheden onder invloed van PTH, calcitonine en calcitriol.........................................…….....................................................................................2 Fig. 1.2: De regulatie van de fosfaathomeostase door PTH, calcitonine en calcitriol via inwerking ter hoogte van de nier, bot en gastro-intestinale tractus.....................………….................................................................................3 Fig. 1.3 : Het ontstaan van hyperfosfatemie met secundaire hyperparathyroïdie tengevolge van chronische nierinsufficiëntie..................................................................................................………............................................4 Fig. 1.4: Het ontstaan van hypocalcemie als reactie op de hyperfosfatemie die veroorzaakt wordt door chronische nierinsufficiëntie.........................................................................................………….................................................5 Fig. 1.5: Omvorming van vasculaire gladde spiercellen tot osteoblast-achtige cellen...................................….........6 Fig. 1.6: Chronische nierinsufficiëntie geïnduceerd door een adenine rijk dieet…………………….………...…....8 Fig. 2.1: Theoretische voorstelling van een pixel en een voxel.......…………..........................................................10 Fig. 2.2: Theoretische werking van de micro-CT................................……..............................................................10 Fig. 2.3: Bij micro-CT worden schaduwbeelden gecreërd doordat de X-stralen bron en detector beeldinformatie over het te scannen object bekomen vanuit meerdere hoeken............................................………………………...11 Fig. 2.4: Voorstelling van een X-stralen bron die een polychromatische X-stralen bundel genereerd.....................11 Fig. 2.5: De positie van de Brehmsstrahlung en de karakterisitieke X-stralen in het golflengtegebied en de relatieve intensiteit van de X-stralen in functie van de golflengte.........................………………………..............................11 Fig. 2.6: Lokalisatie van de door micro-CT gegenereerde polychromatische X-stralen bundel binnen het golflengtespectrum van X-stralen.....................................................…………….....................................................12 Fig. 2.7: Theoretische voorstelling van de detector…………………………………………………...….............13 Fig. 2.8: Scoutview of klassiek X-stralen beeld geeft een duidelijk beeld van de te scannen regio.........................14 Fig.2.9: Een virtuele snede bestaande uit 265 grijswaarden...................................................................................15 Fig. 2.10: De opzet van het proefdiermodel………..……………………………………………………………….17 Fig. 2.11: De microscopische coupes werden aangekleurd met behulp van een Von Kossa kleuring. Alle coupes kregen een score toegekend tussen 0 en 3 gecorreleerd met de ernst van calcificatie...........................................20 Fig. 3.1: Wekelijkse opvolging van de voedselconsumptie (g/dag)..........................................................................21 Fig. 3.2: Wekelijkse opvolging van het lichaamsgewicht (g)....................................................................................22 Fig. 3.3: De creatinineconcentraties in het serum......................................................................................................23 Fig. 3.4: De ureumconcentraties in het serum...........................................................................................................24 Fig. 3.5: De fosfaatconcentraties in het serum...........................................................................................................25 Fig. 3.6: De calciumconcentraties in het serum………………………………………………………………….…25

Eleni Vanden Eede

Fig. 3.7: De serumwaarden voor het Calcium x fosfaat product................................................................................26 Fig. 3.8: Longitudinale opvolging van het ontstaan en de evolutie van calcificaties in de aorta bij ratten met behulp van micro-CT.............................................................................................................................................................27 Fig. 3.9: 3D reconstructie van een in vivo gescande aorta.........................................................................................28 Fig. 3.10: Scoring van de in vitro datasets.................................................................................................................29 Fig. 3.11: Calcium bulk analyse van de thoracale aorta, de a. femoralis en de a. carotis met Atomaire absorptie...30 Fig. 3.12: Calcium bulk analyse van het hart, de linker nier en de lever met Atomaire absorptie…………………31 Fig. 3.13: Microscopische evaluatie van de ernst van calcificatie na Von Kossa kleuring………………...………32 Fig. 3.14: Evaluatie van de microscopische scoring van het adenine + laag eiwit dieet in vergelijking met beide controlediëten, het laag eiwit dieet en het adenine dieet...........................................................................................33

Tabel 1: Visuele score van de in vivo datasets...........................................................................................................27 Tabel 2: Visuele scoring van de in vitro datasets van de aorta’s bij opoffering........................................................29

Eleni Vanden Eede

Samenvatting

Samenvatting Chronische nierinsufficiëntie (CNI) wordt geassocieerd met een 10 tot 20 keer hoger risico op cardiovasculaire aandoeningen, welke verantwoordelijk zijn voor ongeveer 50% van de mortaliteit bij hemodialysepatiënten. Deze cardiovasculaire aandoeningen zijn bij patiënten met CNI sterk gerelateerd aan het optreden van vasculaire calcificaties of ectopische afzettingen van calcium- en fosfaatmineraal, voornamelijk ter hoogte van de coronairen en de aorta. In voorgaande proefdieronderzoeken werd aangetoond dat een adenine-rijk dieet chronische nierinsufficiëntie (CNI) induceert. Gevolg hiervan is het ontstaan van media calcificaties in de aorta, welke eerder reeds gevisualiseerd konden worden met behulp van hoge resolutie Xstraal micro-tomografie (micro CT). In de huidige studie hebben we 2 proefdiermodellen voor CNI na toediening van een adenine-rijk dieet en een adenine dieet gecombineerd met een lage concentratie aan eiwitten wekelijks longitudinaal opgevolgd gedurende 4 opeenvolgende weken met een hoge resolutie micro CT. De doelstelling van dit onderzoek was enerzijds na te gaan of het verlagen van de eiwitconcentratie in de voeding invloed heeft op het ontstaan en de progressie van vasculaire calcificaties. Anderzijds wilden we onderzoeken of het mogelijk is om met behulp van micro-CT het ontstaan en de evolutie van de media calcificaties longitudinaal op te volgen. Uit dit onderzoek blijkt dat micro-CT inderdaad een gevoelige methode in voor het detecteren van vasculaire calcificaties. Reeds 4 weken na het induceren van chronische nierinsufficiëntie was het mogelijk om beginnende calcificaties aan te tonen, zowel in vivo als in vitro. Ook konden we de progressie van deze calcificaties longitudinaal op te volgen. Deze studie is ook de enige tot nu toe waarbij proefdieren 4 x opeenvolgend gescand werden over een periode van 4 weken met zeer lage mortaliteit. Ook hebben we vastgesteld dat het adenine + laag eiwit model vroeger (week 3) in de tijd calcificaties induceert dan het klassieke adenine model en dat de calcificaties die ontstaan veel ernstiger zijn. Dit werd aangetoond door visualisatie met behulp van micro-CT, een bepaling van de calciuminhoud in weefsels met atomaire absorptie en tenslotte een lichtmicroscopische evaluatie na opoffering. Tenslotte kunnen we besluiten dat micro-CT geschikt is voor longitudinale opvolging van de progressie van mediacalcificaties en dat een adenine dieet gecombineerd met een lage concentratie aan eiwitten een ernstigere graad van nierinsufficiëntie induceert, wat uiteindelijk resulteert in het optreden van meer verspreide calcificaties met een hogere densiteit. Toekomstgericht kunnen deze bevindingen een aanwinst zijn bij preventiestudies en reversibiliteitsstudies. We weten nu dat calcificatie optreedt vanaf week 3 en snel progresseert naar week 8 toe en dat het mogelijk is om de proefdieren meerdere malen achtereenvolgens te scannen zonder een toegenomen mortaliteit.

Eleni Vanden Eede

Abstract

Abstract Chronic renal failure (CRF) is associated with a 10- to 20-fold increase in cardiovascular risk, which is responsible for 50% of the mortality in hemodialysis patients. These cardiovascular diseases are strongly related to the appearance of vascular media calcifications or ectopic deposition of calcium- and phosphate mineral, mainly in the aorta or in both the coronary arteries. Previous animal research has proven that a diet containing 0.75% adenine induces CRF in rats. This results in the development of vascular calcification, which can be visualized by means of high-resolution micro-CT. In the present study, we evaluated two animal diets for inducing CRF, a diet containing adenine and a diet that contains adenine combined with a low protein concentration. We monitored the rats longitudinally for 4 succeeding weeks with a highresolution micro-CT. Initially, this study aimed to monitor the onset and development of vascular calcification with repetitive in vivo micro-CT scans for both adenine-containing diets. Secondly we investigated whether lowering the protein content affects the onset and progression of vascular calcification in comparison to the classical adenine diet. This research has proven that micro-CT is a very sensitive method for detecting early stage calcification. Four weeks after inducing CRF light calcification could be detected visually, as well in vivo as in vitro. We were able to follow-up the progression of calcification longitudinally, by scanning the animals 4 times over a period of 4 weeks. We determined that the adenine diet combined with a low protein concentration induces calcification as early as 3 weeks, while the classical adenine diet only causes calcification at week 6. The adenine + low protein diet not only induces calcification faster, but the calcifications that occur are also much more severe. This was concluded by visualization with micro-CT, determination of the calcium content by atomic absorption and microscopical evaluation after sacrifice. We can conclude that micro-CT is suitable for longitudinal visualization of the progression of media calcification and that an adenine diet with low protein content induces a more severe degree of CRF, which results in an increased extent of calcification with a higher density. These findings open new perspectives for prevention and reversibility research. We have shown that calcification starts at week 3 and rapidly progresses by week 8. It is also possible to follow up animals by scanning them 4 times, without increasing the mortality.

Eleni Vanden Eede

Inleiding

1. INLEIDING Chronische nierinsufficiëntie (CNI) wordt geassocieerd met een 10 tot 20 keer hoger risico op cardiovasculaire aandoeningen, welke verantwoordelijk zijn voor ongeveer 50% van de mortaliteit bij hemodialysepatiënten (Foley et al, 2005). Deze cardiovasculaire aandoeningen zijn bij patiënten met CNI sterk gerelateerd aan het optreden van vasculaire calcificaties of ectopische afzettingen van calcium- en fosfaatmineraal, voornamelijk ter hoogte van de coronairen en de aorta. Vasculaire calcificaties kunnen reeds optreden bij jonge patiënten met CNI en de progressie ervan is sterk gecorreleerd met de behandelingsduur met hemodialyse (Goodman et al, 2000). Recent werd een proefdiermodel beschreven waarbij, op basis van een adenine-rijk dieet, CNI met bijhorende vasculaire calcificaties kan geïnduceerd worden bij ratten (Katsumata et al, 2003). Bovendien heeft men in een voorgaand onderzoek aangetoond dat in vivo hoge resolutie X-stralen microtomografie (micro-CT) een uitstekende methode is voor het visualiseren van deze vasculaire calcificaties (Persy et al, 2006). Micro-CT is uitermate geschikt om harde weefsels te analyseren, bij voorkeur bot en gecalcifieerd weefsel. Eerder heeft men met deze techniek de architectuur van botstructuren (Postnov et al, 2003), vasculaire calcificaties (Persy et al, 2006) en tal van andere gecalcifieerde structuren onderzocht. Recent heeft men succesvol longtumoren kunnen onderzoeken, wat aantoont dat micro-CT ook geschikt is voor het visualiseren van zachte weefsels (De Clerck et al, 2003). 1.1. De correlatie tussen vasculaire calcificaties en cardiovasculaire complicaties Er bestaan twee soorten vasculaire calcificaties, namelijk calcificaties van de intima of van de media van de vaatwand. Intimacalcificaties zijn geassocieerd met veralgemeende atherosclerose en ze ontstaan ter hoogte van de verspreide atherosclerotische plaques. Ze worden geïnduceerd ten gevolge van een inflammatoire respons op geoxideerd LDL cholesterol en zijn geassocieerd met accumulatie van lipiden en infiltratie van inflammatoire cellen waaronder macrofagen en Tcellen. Het is niet geweten of deze calcificaties de plaques stabiliseren of juist verergeren. Wel wordt calcificatie van de coronairen als maat genomen om de atherosclerotische belasting van de patiënt te evalueren. Atherosclerotische veroorzaken een vernauwing van het lumen. Hierdoor geven ze aanleiding tot het ontstaan van stenose met eventueel ischemische complicaties zoals myocardinfarct. Media calcificatie van elastische en musculaire arteriën (Mönckeberg’s arteriosclerose) daarentegen zijn reeds lang gekend bij ouderen, diabetici en dialysepatiënten. Ze kunnnen ook voorkomen bij patiënten zonder conventionele risicofactoren voor atherosclerose en zijn bij nierpatiënten sterk afhankelijk van de hemodialyse behandeling en duur (Raggi et al, 2002). Gevolg is het verstijven van voornamelijk de aorta en de coronairen ten gevolge van de toegenomen calcium inhoud en uitgebreide calcificaties (London, 2003). Er treedt geen occlusie van het lumen op, maar de vaatwand remodeleert en de Windkessel functie zal verloren gaan. Dit leidt tot een afname van de diastolische druk en een toename van de systolische druk. De meest voorkomende complicaties zijn enerzijds hypertrofie van het linker ventrikel en anderzijds hypoperfusie van de coronairen tijdens diastole (Guérin et al, 2000). Deze hemodynamische veranderingen uiten zich in een toename in polsdruk, pulse wave velocity (PWV) en diameter van de aorta (London et al, 2003). Men heeft statistisch kunnen aantonen dat er een verband bestaat tussen een toename van de bovenvermelde parameters en een verhoogd risico op cardiovasculaire mortaliteit (Blacher et al, 2001).

1

Eleni Vanden Eede

Inleiding

1.2. Pathofysiologie van de nier De nieren zijn retroperitoneaal gelegen organen met verscheidene levensbelangrijke functies. Zo staan ze in voor de zuivering van afvalstoffen uit het bloed door glomerulaire filtratie, de bloeddrukregulatie via het renine-angiotensine-aldosteron systeem, de aanmaak van de rode bloedcellijn door de productie van erythropoïetine, behoud van de elektrolytenbalans van onder meer natrium en kalium, de calcium en fosfaat homeostase en de regulering van het intravasculair volume. Onder normale fysiologische omstandigheden worden de calcium- en fosfaatconcentratie in het plasma gereguleerd door het parathyroïd hormoon, calcitonine en calcitriol. Zij zullen inwerken ter hoogte van de darm, de nieren en het bot. Het bot bevat de grootse reserve aan calcium en fosfaat, die opgeslagen zijn onder een minerale vorm, zoals bijvoorbeeld hydroxyapatiet. De darm vormt een barrière waar de inname van calcium en fosfaat afkomstig uit het dieet gereguleerd kan worden en de nieren bepalen hoeveel calcium en fosfaat er geëxcreteerd kan worden. Dit maakt dat deze organen de ideale aangrijpingspunten zijn om de calcium- en fosfaat balans te regelen. 1.2.1. De calciumhomeostase Het parathyroïdhormoon (PTH) wordt geproduceerd door de bijschildklieren. Het induceert ter hoogte van de nier een verhoogde calciumreabsorptie en ter hoogte van het bot een verhoogde botresorptie. Calcitonine wordt aangemaakt door parafolliculaire cellen die gelokaliseerd zijn in de schildklier. Net zoals PTH stimuleert het de calciumreabsorptie ter hoogte van de nier en veroorzaakt het een toegenomen botresorptie. Onder invloed van zonlicht wordt ter hoogte van de huid vitamine D3 gevormt. Dit vitamine D3 wordt een eerste keer in de lever gehydroxyleerd tot 25-OH-vitamine D3 (calcifediol) en later een tweede keer in de nier tot 1,25-dihydroxy vitamine D3 (calcitriol), de actieve metaboliet van vitamine D3, door het 1α-hydroxylase. Dit calcitriol verhoogt de calciumreabsorptie in de nier en de calciumabsorptie ter hoogte van de darm.

Fig.1.1: De regulatie van de calciumhomeostase in normale fysiologische omstandigheden onder invloed van PTH, calcitonine en calcitriol.

2

Eleni Vanden Eede

Inleiding

1.2.2. De fosfaathomeostase Net zoals bij de calciumhomeostase staan PTH, calcitriol en calcitonine centraal in voor de regulatie van de circulerende fosfaatpool in het plasma. Calcitriol (de actieve metaboliet van vitamine D3) veroorzaakt een toegenomen fosfaatabsorptie ter hoogte van de darm en de nier. PTH en calcitonine induceren anders dan bij de calcumhomeostase een verhoogde botresorptie, maar ook een toegenomen fosfaat excretie ter hoogte van de nier. De werking van PTH veroorzaakt enerzijds een toegenomen fosfaat concentratie door stimulatie van de botresorptie, maar tegelijkertijd ook een afname van de circulerende fosfaatpool door in te werken op de nierexcretie. Deze fosfaat excretie overstijgt de toename in fosfaat waardoor er netto een verlies aan fosfaat geïnduceerd wordt.

Fig. 1.2: De regulatie van de fosfaathomeostase door PTH, calcitonine en calcitriol via inwerking ter hoogte van de nier, bot en gastro-intestinale tractus.

1.2.3. Evolutie tot chronische nierinsufficiëntie Chronische nierinsufficiëntie is een aandoening waarbij er een irreversiebel verlies aan nefronen optreedt. De overige nefronen zullen trachten de nierfunctie zo lang mogelijk constant te houden waardoor de glomerulaire filtratiedruk toeneemt en er hyperfiltratie optreedt. Deze hyperfiltratie zal uiteindelijk aanleiding geven tot het ontstaan van fibrose, met littekenvorming (glomerulaire sclerosis) als gevolg, waardoor het verlies aan functionele nefronen steeds meer zal toenemen en uiteindelijk tot nierfalen zal leiden. Indien meer den 50% van het functioneel nierweefsel verloren gaat zal de glomerulaire filtratie snelheid (GFR) afnemen. Hierdoor zullen minder moleculen geklaard worden ter hoogte van de nier en zal hun serumconcentratie toenemen. In een eerste stadium van nierinsufficiëntie stijgen de serum creatininewaarden en treden er veranderingen in het ionen-evenewicht op, waardoor onder meer hyperkaliëmie ontstaat. Indien de nierfunctie meer achteruit gaat zal uremie (verhoogde serumconcentratie ureum) optreden en zal het mineraalmetabolisme aangetast worden. Dit geeft aanleiding tot het ontstaan van stoornissen in de calcium- en fosfaathomeostase, botafwijkingen en uiteindelijk eventueel vasculaire calcificaties.

3

Eleni Vanden Eede

Inleiding

Indien de klaring van fosfaat in het gedrang komt, zal er hyperfosfatemie ontstaan. Deze hyperfosfatemie zet de bijschildklier aan tot een verhoogde productie van PTH, dat een verhoogde botresorptie en fosfaatexcretie zal induceren. De nieren functioneren niet meer goed waardoor in dit geval de hoeveelheid fosfaat die uit het bot geresorbeerd wordt groter is dan de hoeveelheid die geëxcreteerd kan worden door de nieren. De werking van PTH zal op deze manier de hyperfosfatemie verder in de hand werken. Tengevolge van de nierinsufficiëntie zijn de nieren enerzijds niet meer in staat alle calcifediol afkomstig van de lever te hydroxyleren, waardoor er minder actieve metabolieten van vitamine D3 worden aangemaakt. Anderzijds zal de hyperfosfatemie een inhiberende werking uitoefenen op de productie van actief vitamine D3.

Fig. 1.3 : Het ontstaan van hyperfosfatemie met secundaire hyperparathyroïdie tengevolge van chronische nierinsufficiëntie.

Een afname van de absorptie van fosfaat ter hoogte van de darm zal een reductie van de opname van fosfaat bewerkstelligen en zo een positief effect uitoefenen op de ontstane hyperfosfatemie. Tegelijkertijd neemt de absorptie van calcium echter ook af. Hierdoor zal er tengevolge van de inadequate calciumabsorptie hypocalcemie ontstaan. Door deze hypocalcemie wordt de bijschildklier gestimuleerd tot productie van PTH. Dit PTH zal opnieuw de botresorptie verhogen om te compenseren voor de afname in calcium, maar zal hierdoor ook de hyperfosfatemie opnieuw in de hand werken. Samengevat ontstaat er een ernstige hyperfosfatemie met een secundaire hyperparathyroïdie die de hoge fosfaatlevels zal blijven onderhouden. Deze aanhoudende toename in serum PTH concentratie kan aanleiding geven tot het ontstaan van ernstige botafwijkingen.

4

Eleni Vanden Eede

Inleiding

Fig. 1.4: Het ontstaan van hypocalcemie als reactie op de hyperfosfatemie die veroorzaakt wordt door chronische nierinsufficiëntie.

1.2.4. De behandeling van chronische nierinsufficiëntie De behandeling van chronische nierinsufficiëntie is er in de eerste plaats op gericht om de concentratie aan circulerend fosfaat binnen bepaalde grenzen te houden om te vermijden dat secundaire hyperfosfatemie met bijhorende botafwijkingen kunnen optreden. Hierdoor zullen fosfaatbinders, zoals calciumcarbonaat en calciumacetaat, voorgeschreven worden die verhinderen dat fosfaat geabsorbeerd wordt ter hoogte van de darm om zo de inname van fosfaat afkomstig uit het dieet te reduceren (Qunibi et al, 2002). Bij patiënten met vergevorderd nierfalen en verspreide ectopische calcificaties kan geopteerd worden voor alternatieve fosfaatbinders die geen calcium bevatten, waaronder sevelamer en lanthaan. Zij worden verondersteld het optreden van vasculaire calcificaties te reduceren (Cozzolino et al, 2003). Indien de patiënt bij het opstarten van de behandeling reeds een secundaire hyper-parathyroïdie heeft wordt een behandeling met vitamine D3 op punt gesteld. Het nadeel is dat vitamine D3 de resorptie van zowel calcium als fosfaat bevordert ter hoogte van de darm waardoor het calcium x fosfaat product verhoogd wordt en de calcificaties in de hand gewerkt kunnen worden (Wolisi et al, 2005). Als alternatief werden vitamine D3 analogen ontwikkeld die geen verhoogde resorptie van calcium en fosfaat teweeg brengen. Indien de nierfunctie volledig verloren is gegaan wordt een 3 x wekelijkse behandeling met hemodialyse voorgeschreven.

5

Eleni Vanden Eede

Inleiding

1.3. Moleculaire achtergrond Bij patiënten met CNI zal de klaring van fosfaat als één van de eersten in het gedrang komen. De regulatie van calcium en fosfaat heeft als doel het calcium x fosfaat product in het plasma zo lang mogelijk constant te houden. Indien één van beide parameters toeneemt, zal de andere afnemen zodat de balans tussen beiden gelijk blijft. Lange tijd heeft men aangenomen dat dit neerslaan van calcium en fosfaat passief verliep. Talrijke recente onderzoeken hebben echter aangetoond dat de ectopische media calcificaties ontstaan tengevolge van een zeer ingewikkeld actief gereguleerd proces, gelijkend op de osteogenese, met expressie van verschillende bot- en mineralisatie factoren in de gecalcifieerde lesies (Qunibi et al, 2002). Men heeft vastgesteld dat op de eerste plaats een onevenwicht in de homeostase van fosfaat verantwoordelijk is voor het ontstaan van ectopische calcificaties. Fosfaat werkt in op de gladde spiercellen van de arteriën en zet hen aan tot fenotypische veranderingen waardoor ze meer vatbaar worden voor calcificatie. Centraal in deze pathway bevindt zich een natrium-fosfaat cotransporter (NPC) Pit-1 die instaat voor de opname van het extracellulaire fosfaat ter hoogte van de gladde spiercellen. Indien er een extracellulaire hyperfosfatemie bestaat, zal er enerzijds meer fosfaat naar intracellulair getransporteerd worden en anderzijds wordt de expressie van de NPC Pit-1 verhoogd. Het intracellulair fosfaat veroorzaakt een verminderde expressie van specifieke genen die instaan voor de differentiatie van gladde spiercellen enerzijds en expressie van osteogene transcriptiefactoren zoals Cbfa-1 (core-binding factor 1), osteopontine en osteocalcine anderzijds. Resultaat is een toegenomen secretie van matrix vesikels, calciumbindende proteïnen, alkalisch fosfatase en collageenrijke extracellulaire matrix. Hierdoor worden de gladde spiercellen omgezet tot osteoblast-achtige cellen. Dit heeft men kunnen aantonen zowel in cultuur (Giachelli, 2003) als bij mensen (Moe et al, 2002) (Moe et al, 2003). Bij de door adenine geïnduceerde nierinsufficiënte ratten bestaat de minerale fase voornamelijk uit hydroxyapatiet (Verberckmoes et al, 2007).

Fig. 1.5: Omvorming van vasculaire gladde spiercellen tot osteoblast-achtige cellen onder invloed van een verhoogde extracellulaire fosfaatconcentratie, met productie van alkalisch fosfatase, matrixvesikels, collegeen type II en calcium-bindende proteïnen.

Recent heeft men aangetoond dat calcium ook kan inwerken op de NPC Pit-1 en zo de gladde spiercellen kan aanzetten tot transformatie in osteoblast-achtige cellen (Yang et al, 2004) (Lomashvili et al, 2006).

6

Eleni Vanden Eede

Inleiding

De aanwezigheid van osteoblasten en chondrocyt-achtige cellen in gecalcifieerde atherosclerotische plaques werden reeds bij mensen (Bobryshev, 2005) en knock-out muizen (Rattazzi et al, 2005) aangetoond. Dit bewijst dat intima calcificaties zeker deels ontstaan ten gevolge van een proces dat gelijkt op endochondrale botvorming, waarbij kraakbeen vervangen wordt door bot. Wat media calcificaties betreft heeft men steeds gedacht dat deze ontstaan ten gevolge van een proces dat gelijkt op intramembraneuze osteogenese, waarbij mesenchymale cellen rechtstreeks omgezet worden in bot zonder optreden van intermediair kraakbeen. Deze veronderstelling blijkt incorrect, daar men de aanwezigheid van zowel chondrocyten (Neven et al, 2007) als osteoclasten (Bostrom et al, 2000) heeft kunnen aantonen ter hoogte van media calcificaties in aorta’s bij proefdieren en mensen. Dit alles leidt tot het besluit dat het optreden van vasculaire calcificaties een zeer ingewikkeld proces is dat de botmineralisatie met bijhorende botremodeling evenaart. Een tweede belangrijke bevinding is een afname in concentratie van natuurlijk aanwezige inhibitoren van calcificatie, waaronder fetuin-A, matrix-Gla proteïne en pyrofosfaat. Fetuin-A is een negatief acute fase eiwit dat geproduceerd wordt in de lever en in het serum circuleert. Het inhibeert de productie van hydroxyapatiet kristallen (Heiss et al, 2003) en matrixvesikels (Reynolds et al, 2005). Een afname in fetuin-A werd eerder gerelateerd aan een toename in vasculaire calcificatie (Schäfer et al, 2003) en een verhoogde cardiovasculaire mortaliteit (Ketteler et al, 2003). Matrix Gla-proteïne (MGP) is een proteïne dat geproduceerd wordt door chondrocyten en vasculaire gladde spiercellen. Het kan calcium binden in zachte weefsels en osteogene differentiatie inhiberen (Luo et al, 1997). KO muizen met een MGP-deficiëntie ontwikkelen zeer uitgebreide media calcificaties en kraakbeen metaplasie. Er kon tot nu toe nog geen duidelijke correlatie aangetoond worden tussen de concentratie aan MGP en het ontstaan van vasculaire media calcificaties, maar men heeft wel vastgesteld dat in gecalcifieerde regio’s de concentratie aan MGP afgenomen is (Shanahan et al, 1999). Pyrofosfaat is een anion dat zich bevindt in het weefsel dat de vasculaire gladde spiercellen omringt. Reeds decennia lang weet men dat pyrofosfaat de vorming van hydroxyapatiet inhibeert en zo het ontstaan van calcificaties tegenwerkt (Fleisch et al,1966)(Meyer, 1984). Recent heeft men ontdekt dat alkalisch fosfatse een invloed heeft op de werking van pyrofosfaat. Vasculaire gladde spiercellen die omgevormd werden tot osteoblast-achtige cellen vertonen een verhoogde productie van alkalisch fosfatase, wat het pyrofosfaat in het weefsel eromheen hydrolyseert. Hierdoor valt de inhibitie weg en kan de calcificatie verder ontwikkelen (Mazhar et al, 2001). 1.4. Adenine-geïnduceerde nierinsufficiëntie 1.4.1. Adenine-pathway Men heeft experimenteel aangetoond dat het toedienen van een adenine-rijk dieet (0.75% adenine) een matige tot ernstige nierinsufficiëntie veroorzaakt bij ratten. Onder normale fysiologische omstandigheden wordt adenine samen met fosforibosylpyrofosfaat omgezet tot AMP door het adenine fosforibosyltransferase (APRT). Dit enzym is de snelheidsbeperkende stap in deze pathway. Indien de inname van adenine de normale fysiologische waarden overschrijdt, zal het APRT dit niet meer kunnen verwerken en wordt een alternatieve route aangesproken. Het overtollige adenine wordt dan door het xanthine dehydrogenase (XDH) omgezet in 2,8- dihydroxyadenine, wat neerslaat en kristallen zal vormen ter hoogte van het nierweefsel. Gevolg is het ontstaan van kristalurie, nefrondestructie en interstitiële fibrose, welke uiteindelijk aanleiding geven tot nierfalen (Yokozawa T et al, 1986).

7

Eleni Vanden Eede

Inleiding

Fig. 1.6: Chronische nierinsufficiëntie geïnduceerd door een adenine rijk dieet. Tengevolge van een overtollige inname aan adenine worden kristallen gevormd ter hoogte van het nierweefsel die nierinsufficiëntie veroorzaken.

1.4.2. Proefdiermodel Er werden twee proefdiermodellen voor CNI opgesteld gebaseerd op de werking van adenine. Het eerste model is het klassieke adenine model, waarbij het adenine-rijk dieet 0.75% adenine bevat. De dieren krijgen eerst gedurende een periode van 2 weken een hoog fosfaat dieet (1,03% fosfaat). Dit fosfaat-rijk dieet zal hen vatbaar maken voor het ontstaan van vasculaire calcificaties. Nadien worden ze gedurende 4 weken op het adenine-dieet gezet om de nierinsufficiëntie te induceren (Katsumata et al, 2003). Er wordt voor een periode van 4 weken geopteerd omdat eerder onderzoek heeft uitgewezen dat 4 weken de ideale tijdsduur is voor het induceren van calcificaties (Okada et al, 1999). Geweten is dat van alle dieren die op een adenine-rijk dieet gezet worden, ongeveer de helft ernstig genoeg calcifieert om te kunnen visualiseren met behulp van de micro-CT na 6 weken (Persy V et al, 2006). Het tweede proefdiermodel is een variant op het klassieke adenine-dieet waarbij bovenop het toegevoegd adenine de concentratie aan eiwitten verlaagd werd van de standaard 25% tot 2.5%, het adenine-laag eiwit dieet. Hierdoor zouden de frequentie aan calcificaties en de uitbreiding ervan enorm toenemen, zodat alle dieren gecalcifieerd zouden moeten zijn na 4 weken (Price et al, 2006). 1.4.3. De relevantie van een proefdiermodel Moleculair onderzoek op basis van in vitro experimenten is noodzakelijk om de achterliggende mechanismen voor het ontstaan van calcificaties te ontrafelen. Toch geeft het geen reëel beeld over de ontwikkeling van de calcificaties binnen een levend organisme. Klinische studies betreffende CNI hebben twee nadelen ten opzichte van proefdieronderzoek. Eerst en vooral worden ze uitgevoerd binnen een zeer heterogene populatie. Patiënten met CNI krijgen een individueel therapieplan afhankelijk van de achterliggende pathologie die het nierfalen veroorzaken. Er zijn onderling grote verschillen in leeftijd, geslacht, type fosfaatbinder, dialyse duur, ionenconcentratie van het dialysaat enzovoort. Het is heel moeilijk om uit dit soort populaties eenzijdige conclusies te trekken betreffende het ontstaan en verloop van de calcificaties. De twee proefdiermodelen waarmee wij zullen werken zullen CNI, gelijkend op dat bij mensen, induceren in een homogene populatie proefdieren waardoor veel beïnvloedbare factoren geëlimineerd worden. Ten tweede worden de calcificaties bij mensen gevisualiseerd met behulp van een elektronbeam CT scanner of een spiraal CT scanner. Deze kunnen geen onderscheid maken tussen intima of media calcificaties. In dit onderzoek zijn we geïnteresseerd in media calcificaties die specifiek ontstaan ten gevolge van nierinsufficiëntie, niet in het ontstaan van, aan

8

Eleni Vanden Eede

Inleiding

atherosclerose gerelateerde, initma calcificaties. Hiervoor zullen we proefdieren gebruiken waarvan geweten is dat ze enkel calcifiëren ter hoogte van de media, namelijk ratten. Ratten, net zoals een aantal andere knaagdieren, ontwikkelen geen atherosclerose en dus ook geen intima calcificaties. Indien we bij deze dieren de calcificaties kunnen visualiseren, weten we zeker dat alle calcificaties enkel de media omvatten. 1.5. Doelstelling Voor beide proefdiermodellen heeft men eerder kunnen aantonen dat de dieren calcifiëren ter hoogte van de aorta (Persy et al, 2006). Er is enkel nog niet geweten wanneer deze calcificaties zich voor het eerst instellen, hoe snel ze evolueren in de tijd en welk van beide diëten het snelst calcificaties oplevert. De calcificaties kunnen gevisualiseerd worden met een hoge resolutie Xstralen microtomografie scanner (Micro-CT, Skyscan 1076, Aartselaar) die specifiek aangepast werd voor proefdieronderzoek. De micro-CT heeft talrijke voordelen, waaronder als voornaamste het niet-invasieve karakter. Zo kunnen we de dieren longitudinaal opvolgen, waarbij elk dier als zijn eigen controle optreedt. Dit biedt ons de mogelijkheid om met minder proefdieren te werken en toch meer accurate gegevens te verkrijgen. De doelstelling van deze thesis is het in-vivo longitudinaal opvolgen van het ontstaan en evolutie van media calcificaties ter hoogte van de aorta bij ratten, met behulp van een hoge resolutie micro-CT.

9

Eleni Vanden Eede

Materialen & Methoden

2. MATERIALEN EN METHODEN 2.1. Micro CT ‘Computer gestuurde microtomografie’ wordt gedefinieerd als een radiografische methode om interne structuren zichtbaar te maken binnen een geselecteerd vlak van het lichaam. Het is dus een niet-invasieve methode om interne structuren van een dier of een object virtueel voor te stellen. De term tomografie is afkomstig van het Griekse woord ‘tomos’, wat snede of slice betekent. Met behulp van X-stralen kan uiteindelijk een 3D beeld bekomen worden van een object wat opgebouwd is uit volume elementen. Naar analogie met “pixel” (picture element) in 2D wordt hier de term “voxel” (volumetrische pixel) gebruikt. Een voxel is het kleinste kubusvormig element in een 3D beeld, de eenheid van grafische informatie die een punt in een driedimensionale ruimte bepaalt. Een voxel kan verschillende grijswaarden bevatten. Met deze informatie en speciale 3D-software is het dan mogelijk om doorsneden vanuit verschillende invalshoeken te genereren.

Fig. 2.1: Theoretische voorstelling van een pixel of ‘picture element’ (wit vierkant) en een voxel of ‘volumetrische pixel’ (donker grijze kubus).

2.1.1. Basisprincipe micro-CT In een X-stralen bron wordt een polychromatische X-stralen bundel gegenereerd die tijdens het passeren van een dier of object wordt geabsorbeerd of geattenueerd. Een detector registreert deze geattenueerde X-stralen, versterkt ze en stuurt de gegevens door naar de computer. De Xstralen bron en de detector bevinden zich steeds op één lijn en op een vaste afstand van elkaar. Beide roteren over een hoek van 180° rond het object, om zo beelden te bekomen vanuit verschillende hoeken.

Fig. 2.2: Theoretische werking van de Skyscan 1076 micro-CT, waarbij een X-stralen bron en een detector op een vaste lijn over een hoek van 180° rond een vast object heen draaien.

10

Eleni Vanden Eede


De computer registreert alle gegevens afkomstig van de detector en reconstrueert ze tot een virtueel beeld bestaande uit grijswaarden.

Fig. 2.3: Bij micro-CT worden schaduwbeelden gecreërd doordat de X-stralen bron en detector beeldinformatie over het te scannen object bekomen vanuit meerdere hoeken.

2.1.1.1. X-stralen bron Een X-stralen bron bestaat uit een filament en een stuk metaal (in ons geval wolfraam of tungsten) waartussen een spanning wordt aangelegd van 100kV. Het geheel bevindt zich in een vacuüm buis. Wanneer het filament verwarmd wordt zullen er elektronen vrijkomen. Onder invloed van de aangelegde spanning zullen deze elektronen versneld worden en tegen het metaal aanbotsen.

Fig. 2.4: Voorstelling van een X-stralen bron die een polychromatische X-stralen bundel genereerd door versnelde elektronen op een wolfram metaal te laten aanbotsen.

Er kunnen 2 soorten X-stralen gegenereerd worden met verschillende energie-inhoud: Brehmsstrahlung of continue straling en karakteristieke X-stralen.

Fig. 2.5: De positie van de Brehmsstrahlung en de karakterisitieke X-stralen in het golflengtegebied en de relatieve intensiteit van de X-stralen in functie van de golflengte.

11

Eleni Vanden Eede


De X-stralen bundel die geproduceerd wordt is polychromatisch, wat wil zeggen dat de afzonderlijke X-stralen niet allemaal een gelijke golflengte bezitten.

Fig. 2.6: Lokalisatie van de door micro-CT gegenereerde polychromatische X-stralen bundel binnen het golflengtespectrum van X-stralen.

De energie-inhoud van de uitgezonden X-straal fotonen wordt vastgesteld volgens de Hypothese van Planck, welke stelt dat: E = h.c/λ met E de energie-inhoud (Joule), h de constante van Planck (6,625. 10-34 J.s), c de lichtsnelheid (3,108 m/s) en λ de golflengte (m). Hieruit volgt dat er een omgekeerd evenredig verband bestaat tussen de energie-inhoud van de X-straal fotonen en de golflengte. 2.1.1.2. Interactie tussen X-stralen en weefsel 2.1.1.2.1. Lineaire attenuatie coëfficiënt Een X-stralen foton dat op een bepaald soort weefsel invalt, zal geabsorbeerd worden of door het weefsel passeren. Verschillende weefsels zullen X-stralen anders absorberen, afhankelijk van de energie-inhoud van het X-straal kwantum en de lineaire attenuatie coëfficiënt. De lineaire attenuatie coëfficiënt voor een bepaalde energie (E) wordt gedefinieerd als dN/N = -µ(E)dx, met N het aantal fotonen, µ de lineaire attenuatiecoëfficiënt en dx de afgelegde weg door het weefsel. Een equivalente definitie voor (E): µ(E) = -lnρ, waarbij ρ de probabiliteit voorstelt dat een X-straal foton geabsorbeerd wordt binnen een bepaalde weg door het weefsel. Lineaire attenuatie coëfficiënten worden gemeten in inverse lengte (m-1). 2.1.1.2.2. X-straal attenuatie De absorptie van X-stralen door materie voldoet aan de Wet van Lambert-Beer, welke stelt dat: I = I0. e-µx Een X-straal met een initiële energie-intensiteit I0 valt in op materie met lineaire attenuatie coëfficiënt µ, passeert door de materie over een lengte x, en zal opnieuw uit de materie komen met een afgenomen intensiteit I.

12

Eleni Vanden Eede


Bovenstaande formule geldt enkel voor een monochromatische X-stralen bundel die door homogeen weefsel gaat. Om de uitgezonden energie I beter te definiëren moet men ook rekening houden met het emissie spectrum van de X-stralen bron. De formule kan dan geschreven worden als: I = I0 ∫ s(E).e-µ(E)xdE met s(E) als spectrum van de X-stralen bron. De absorptie van X-stralen is niet afhankelijk van de moleculaire structuur van het weefsel, maar wordt enkel beïnvloed door de elementaire compositie. Verschillende organische materialen zullen geen sterk verschil in X-straal absorptie vertonen aangezien ze allen voornamelijk opgebouwd zijn uit atomen met een laag atoomnummer (Z), bijvoorbeeld H, O, N, C. Indien het atoomnummer stijgt, zal de lineaire attenuatie coëfficiënt ook enorm toenemen. Dit is het geval bij bot en gecalcifieerd weefsel, wat voornamelijk uit calcium bestaat. 2.1.1.3. De detector Na passage door het object worden de geattenueerde X-stralen geregistreerd door een detector. Deze bestaat uit een scintillator, een laag gebundelde optische glasvezels en een CCD camera die gekoppeld is aan een computer.

Fig. 2.7: Theoretische voorstelling van de detector, met als voornaamste onderdeel een CCD camera bestaande uit pixels die de beeldinformatie ontvangt en doorstuurt naar de computer voor verdere analyse.

De functie van een scintillator bestaat erin de X-straal fotonen die bij passage door het weefsel niet geabsorbeerd werden, op te vangen en te converteren in zichtbaar licht, wat dan verder doorgestuurd wordt naar de CCD camera. Ze bestaan uit een laag kristallen en hun werking is temperatuursafhankelijk. Bij de CCD-camera bevindt zich in het brandvlak een chip bestaande uit zeer veel kleine pixels (picture-elements, 2D) die in een blokpatroon gelegen zijn. Elk van deze pixels legt afzonderlijk de helderheid van het opvallende licht vast. De CCD camera produceert elektronen in verhouding tot het aantal fotonen dat hij ontvangt per pixel. Deze informatie wordt dan digitaal opgeslagen en verwerkt.

13

Eleni Vanden Eede


2.1.2. Data Acquisitie en experimenteel protocol De X-stralen bundel van onze micro-CT scanner (Skyscan 1076, Aartselaar, België) heeft een energiebereik van 20-100 keV (0-250 µA) en een focale spot van 5 µm. We werken met een CCD camera van 2.3kx4k of 10 megapixel (2300 x 4000 pixels). Meer technische informatie hierover is terug te vinden op www.skyscan.be. De rat werd in een scanbed (Ø = 68 mm, l = 200 mm) geplaatst en werd geïmmobiliseerd met behulp van een stukje kleefband met als doel de rat te fixeren en de ademhaling in de regio van de thorax te minimaliseren om beweginsartefacten te reduceren. Eerst werd een klassiek X-stralen beeld of “scout view” genomen waarop de rat volledig zichtbaar was, om een duidelijker anatomisch beeld te krijgen en de te scannen regio te selecteren.

Fig. 2.8: Scoutview of klassiek X-stralen beeld geeft een duidelijk beeld van de te scannen regio, in ons geval vertrekkende van de onderzijde van de 4e rib.

Wij hebben alle dieren gescand over een lengte van 1,8 cm vertrekkende van de bovenzijdevan de 4e rib. De scoutview werd genomen met behulp van een aluminium filter (1,0 mm), terwijl het scannen zelf gebeurde met een titanium filter (0,025 mm). Elk type filter absorbeert een bepaald deel van de X-stralen bundel. De keuze van de filter wordt dus bepaald door het type weefsel dat men wil visualiseren. Hierna moesten er 2 parameters ingesteld worden die invloed hebben op de uiteindelijke scanduur en beeldkwaliteit. Een eerste belangrijke parameter is de pixel grootte. Hoe hoger de pixel grootte waarmee we scannen, hoe langer de scan duurt. Aangezien we in vivo werkten, moesten we rekening houden met de duur van de anesthesie en de gezondheid van de dieren. Wij hebben ervoor gekozen om te scannen met een pixel grootte van 35µm x µm, waarbij de beeldkwaliteit betrekkelijk hoog blijft terwijl de scanduur aanzienlijk korter wordt. De tweede parameter die ingesteld moest worden is het aantal frames of beelden er genomen worden per camerapositie. Er wordt een gemiddelde genomen van alle frames, dus hoe hoger het aantal frames, hoe nauwkeuriger het gemiddelde en hoe meer details zichtbaar worden. Meer frames leidt tot een beter beeld, maar ook tot een toegenomen scanduur. Wij hebben gescand met 8 frames per camerapositie om, evenals bij de pixel grootte, de scanduur te minimaliseren.

14

Eleni Vanden Eede


Uiteindelijk werd een scanduur bekomen van 21 minuten per dier. Nadat we de dieren opgeofferd hadden, werden de thoracale aorta’s opnieuw in vitro gescand om deze met de resultaten van de in vivo scans te vergelijken. Deze in vitro scans werden uitgevoerd met andere parameters: 9 frames, scanbed diameter (Ø = 35 mm, l = 200 mm), pixel grootte 35 µm x µm en aluminium filter (0.5 mm).Dit resulteerde in een scanduur van slechts 18 minuten. 2.1.3. Data Reconstructie 2.1.3.1. Basisprincipe Theoretisch wordt verondersteld dat de X-stralen bundel bestaat uit parallel lopende, monochromatische X-stralen, terwijl deze in de praktijk kegelvormig of konisch en polychromatisch zijn. Hiervoor is een corrigerende functie in de reconstructiesoftware ingebouwd. Na uitvoeren van een reconstructie algoritme wordt een virtuele snede bekomen van de gescande regio van het object (Feldkamp et al, 1984). Bij micro-CT worden later de enkele virtuele sneden bestaande uit pixels of 2D elementen samengevoegd tot een 3D beeld bestaande uit voxels of 3D elementen. Deze 3D modellen werden gereconstrueerd met ANT software (Skyscan). De gedetailleerde theoretische achtergrond van de reconstructie methode valt buiten het bestek van deze thesis Het virtuele beeld bestaat uit 256 grijswaarden genummerd van 0 (zwart) tot 255 (wit), wat overeenkomt met de kleurschakeringen die het menselijke oog kan waarnemen. Elke grijswaarde komt overeen met het aantal X-straal fotonen die de detector opvangt per pixel. Wanneer een X-stralen bundel op een object valt zal een deel van de X-stralen geabsorbeerd worden en een deel het weefsel passeren. Een materie met een hogere densiteit, bijvoorbeeld calcificaties, zal meer X-straal fotonen absorberen dan een minder dense materie, minder fotonen doorlaten naar de detector en resulteren in een meer donkere grijswaarde.

Fig.2.9: Een virtuele snede bestaande uit 256 grijswaarden waarop een gecalcifieerde aorta zichtbaar is.

15

Eleni Vanden Eede


2.1.3.2. Reconstructie van de in vivo en in vitro dataset Nadat de dieren gescand waren, moesten alle beelden gereconstrueerd worden. Dit houdt in dat alle afzonderlijke data die werden bekomen vanuit de verschillende cameraposities op elke doorsnede gebundeld moest worden tot virtuele snede met daarop een accuraat beeld van de gescande regio. Eerst werd een ‘region of intrest’ (ROI) gekozen zodat niet de volledige dataset gereconstrueerd moest worden. Wij waren enkel geïnteresseerd in het visualiseren van vasculaire calcificaties in de aorta, dus onze ROI werd zo kozen dat enkel het deel waarin de aorta kon liggen gereconstrueerd werd met daarin als referentiepunt de wervelkolom. Op deze manier kan later een eventueel een densiteitsanalyse uitgevoerd worden waarbij de densiteit van de calcificaties vergeleken kan worden met deze van bot. 2.1.4. Data Analyse: scoring van de gereconstrueerde beelden Alle gereconstrueerde beelden gescoord op basis van de ernst van calcificatie. - Score 0: een negatieve score indien geen calcificaties aangetoond konden worden - Score 1: het optreden van meerdere verspreide calcificaties met een zeer lage densiteit - Score 2: concentrische calcificaties over de volledige lengte van de gescande regio met een lage densiteit in vergelijking met de botdensiteit - Score 3: concentrische calcificaties over de volledige lengte van de gescande regio met een hoge densiteit in vergelijking met de botdensiteit

16

Eleni Vanden Eede


2.2. Proefdiermodel 2.2.1. Proefdierprotocol We werken met 58 ♂ ratten die onderverdeeld werden in 5 groepen (A, B, C, D, E). Alle dieren kregen eerst gedurende 2 weken (week –2 tot week 0) een hoog-fosfaat dieet (1.03% Pi), daarna gedurende 4 weken (week 0 tot week 4) een adenine-rijk dieet (0.75% adenine) of een controle dieet met een lage concentartie aan eiwitten (2.5% eiwit) en uiteindelijk opnieuw een hoog-fosfaat dieet (1.03% Pi) tot aan opoffering. De opzet van het proefdiermodel werd in onderstaande figuur geïllustreerd.

Fig. 2.10: De opzet van het proefdiermodel. Met behulp van micro-CT werden in een groep met een adenine dieet en met een adenine + laag eiwit dieet wekelijks gedurende 4 opeenvolgende weken het ontstaan en de evolutie van calcificaties visueel opgevolgd. Verder werden er van een groep dieren met het adenine + laag eiwit dieet wekelijks een aantal dieren opgeofferd zodat later microscopisch en met behulp van atomaire absorptie een correlatie met de bekomen resultaten van de micro-CT nagegaan kan worden. Twee groepen, een controle groep met een laag eiwit dieet en een groep met het adenine + laag eiwit dieet worden gebruikt om elke 2 weken serumstalen te nemen waarvan de evolutie van standaardparameters onderzocht wordt in functie van de tijd en het soort dieet.

Twee groepen (A en B) werden 1 x per week gedurende 4 opeenvolgende weken gescand. De eerste groep kreeg een adenine dieet en werd gescand vanaf week 3 tem week 6. De tweede groep kreeg een adenine + laag eiwit dieet en werd 1 x wekelijks gescand vanaf week 3. De dieren uit beide groepen werden opgeofferd na de laatste scan. Er werd tweemaal bloed genomen: op week 0 voor het aanpassen van de voeding en op de dag van opoffering.

17

Eleni Vanden Eede


Een derde groep (C) kreeg het adenine + laag eiwit dieet en gold als de histologische controle van de groep met adenine + laag eiwit dieet die wekelijks gescand werd. Uit deze groep werden wekelijks 4 dieren opgeofferd, in overeenstemming met een scan die genomen werd bij de andere groep. Op deze manier kan er een correlatie onderzocht worden tussen de micro-CT beelden en histologische coupes. De laatste twee groepen (D en E) werden gebruikt om de invloed van de verschillende diëten op het ontstaan van calcificaties te karakteriseren. Groep D kreeg het adenine + laag eiwit dieet, groep E een laag eiwit dieet. Bij hen werden elke twee weken (week 0, 2, 4, 6 en 8) bloed- en urinecollecties genomen om de invloed van de verschillende diëten op een aantal standaard parameters te analyseren. De groep met het adenine + laag eiwit dieet werd tweemaal gescand, op week 6 en week 8. Beide groepen dieren werden opgeofferd op week 8. 2.2.2. Keuze van het proefdier en huisvesting Onze studie werd uitgevoerd met 58 mannelijke Wistar ratten (Iffa Credo, Brussel) die bij aanvang van de studie een lichaamsgewicht hadden tussen 200-250g. De dieren werden per twee gehuisvest in plastieken kooien en er werd een dag/nacht ritme aangehouden van 12 uur. Voedsel en drinken waren ad libitum beschikbaar. Rekening houdend met het feit dat de dieren ten gevolge van de nierinsufficiëntie leden aan polyurie en polydypsie, werden extra voorzorgsmaatregelen getroffen om ervoor te zorgen dat ze steeds toegang hadden tot voldoende drinkwater. De dieren werden wekelijks gewogen en elke 2 tot 3 dagen werd hun voedselconsumptie bijgehouden. 2.2.3. Voeding Er werd met vier verschillende diëten in pellet vorm gewerkt die allen besteld werden bij SSNIFF Spezialdiäten (Soest, Duitsland). 1) Hoog fosfaat dieet: Dit dieet bevatte 1.03% fosfaat en 1.06% calcium. 2) Adenine dieet: 0.75% adenine, 0.92% fosfaat en 1.0% calcium 3) Laag eiwit dieet Een normaal dieet bevat 25% eiwiten, die in dit dieet gereduceerd werden tot 2,5%. 4) Adenine + laag eiwit dieet Hierbij werd 7,5 g zetmeelkorrels verwijderd uit het laag eiwit dieet en vervangen door adenine, om een 0,75% adenine dieet te bekomen. De diëten met een lage eiwitconcentratie moesten synthetisch aangemaakt worden. 2.2.4. Anesthesie De ratten werden intraveneus verdoofd in de staartvene met 35 mg/kg lichaamsgewicht Nembutal (Natrium pentobarbital, CEVA Santé Animale, Frankrijk).

18

Eleni Vanden Eede


2.2.5. Bloedname Er werd bloed genomen uit de staartvene na het immobiliseren van de ratten in een plastieken koker. Het bloed werd gestold op ijs en nadien gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 5000 rpm. Het bekomen serum werd onderverdeeld in 2 fracties Sa en Sb, welke respectievelijk 200 µl en 1000 µl bevatten en bewaard werden bij –20°C en –80°C. 2.2.6. Urinecollectie Er werd urine bekomen door de dieren 24 uur in een metabole kooi te plaatsen. Hierop werd een dipstick test uitgevoerd, waarbij de waarden voor pH, proteïnurie, hematurie en glucose onderzocht werden. De urine werd evenals het bloed opgedeeld in 2 fracties, Ua en Ub, en beiden werden bewaard bij –20°C. 2.2.7. Opoffering De dieren werden intraperitoneaal verdoofd met 60 mg/kg lichaamsgewicht Nembutal dat aangelengd werd tot 1 ml met fysiologische oplossing. Er werd bloed genomen door, met behulp van een capillair, de vaten die achter het oog gelegen zijn aan te prikken. Op dit bloed werd een i-STAT meting uitgevoerd, welke de concentratie van geïoniseerd calcium (mg/dl) bepaalde. Eerst werden bij elk dier nieren, lever, longen en hart gewogen. Volgende weefsels werden uitgedissecteerd: beide carotiden, beide arteriae femoralis, aortaboog, thoracale aorta (proximaal en distaal), abdominale aorta (proximaal en distaal), tibiae, linker femur. Verder werden ook twee stukjes van het hart, de linker nier en de lever genomen. Één stukje van elk orgaan, linker femur, rechter arteria carotis, rechter arteria femoralis en de proximaal deel van de thoracale aorta werden onmiddelijk na dissectie gewogen. Ze werden droog bewaard en later vernietigd om de calcium-inhoud te bepalen met behulp van atomaire absorptie. Het tweede stukje van elk orgaan, linker arteria carotis, linker arteria femoralis, proximaal deel van de abdominale aorta, aortaboog, distaal deel van de thoracale aorta werden in FNB (Neutraal gebufferd formaline) gefixeerd. Deze weefsels werden later microscopische bekeken. Het distale deel van de abdominale aorta werd bewaard bij –80°C in vloeibare stikstof. 2.2.8. Microscopie + scoring De vaten die in FNB werden bewaard na opoffering, werden in gelijke stukjes verdeeld en rechtopstaand ingebed in paraffine. Hierdoor konden er coupes genomen worden waarbij in elke coupe meerdere doorsneden zichtbaar werden. Alle coupes werden aangekleurd met een Von Kossa en HE kleuring. Bij een Von Kossa kleuring ontstaat een zilverneerslag op plaatsen met calciumafzetting. Hierdoor zullen gecalcifieerde weefsels zwart aankleuren. Alle coupes werden bekeken met een vergroting 100X en visueel gescoord op de aanwezigheid van calcificatie. - score 0: een negatieve score, geen calcificatie kon aangetoond worden - score 1: focale spots van calcificatie, die minder dan 1/5 van de oppervlakte van de vaatwand innemen - score 2: partiële concentrische calcificaties die meer dan 1/5 en minder dan 4/5 van de oppervlakte van de vaatwand innemen - score 3: de calcificatie omvat meer dan 4/5 van de oppervlakte van de vaatwand 19

Eleni Vanden Eede


Fig. 2.11: De microscopische coupes werden aangekleurd met behulp van een Von Kossa kleuring. Alle coupes kregen een score toegekend tussen 0 en 3 gecorreleerd met de ernst van calcificatie.

2.2.9. Bepaling van de calcium inhoud: Atomaire absorptie De weefsels die droog bewaard werden moesten eerst opgelost worden. De stukken hart, nier, lever en de linker femur werden opgelost in 500 µl salpeterzuur (65%), de vaten in 250 µl salpeterzuur (65%). Alle stalen werden overnacht op 62°C gehouden in een broedstoof. Nadien werden de organen en femur aangelengd tot een totaalvolume van 5 ml en de vaten tot een totaalvolume van 2.5 ml met 0.1% lanthanum(III)nitraat hexohydraat (LaN3O9.6H2O). Vanuit elk staal werden verdunningen gemaakt waar aan HCl werd toegevoegd, met als doel het calcium in oplossing te houden. Het toestel werd eerst gekalibreerd met 0.1% lanthaan en nadien werden de absorpties van de stalen gemeten bij 423 nm en vergeleken met deze van een gekende standaardreeks welke stalen met 0.625, 1.25, 2.5 en 5 mg calcium/l bevatte. De gemeten absorpties werden omgezet in concentratie (mg calcium/l). Rekening houdend met het oorspronkelijke gewicht van de weefsels en de verdunning waarbij gemeten werd, konden deze waarden omgezet worden in mg calcium/g weefsel. 2.2.10. Statistiek De significantie van de bekomen resultaten werd geanalyseerd met behulp van SPSS 12.0 software. Een Kruskal-Wallis test werd uitgevoerd voor elk tijdstip en elke variabele om de invloed tengevolge van de drie verschillende diëten na te gaan. Indien een significant verschil werd aangetoond tussen de 3 diëten voor een variabele, werd nadien een Mann-Whitney U test met Bonferroni correctie uitgevoerd. Verschillen werden als significant aanvaard indien de p < 0.05. De verschillen tussen meerdere tijdspunten voor een variabele werden met behulp van een Friedman’s test nagegaan voor elk dieet. Indien een significant verschil kon aangetoond worden, werd een Wilcoxon signed ranks test uitgevoerd waarbij het verschil werd geanalyseerd tussen een bepaald tijdspunt in vergelijking met tijdspunt 0. Verschillen werden als significant aanvaard indien de p < 0.05.

20

Eleni Vanden Eede

Resultaten

3. RESULTATEN 3.1. Mortaliteit Voor de beide adenine modellen was de mortaliteit zeer laag. Bij het adenine dieet stierven 4/20 dieren, waarvan 2 dieren op week 2, een derde op week 4 en de vierde op week 5. De rat die op week 5 stierf was reeds vanaf week 3 sterk gecalcifieerd en is waarschijnlijk gestorven tengevolge van ernstige calcificaties. Bij de overige drie ratten is de doodsoorzaak onbekend. Bij het adenine + laag eiwit dieet stierven 4/18 dieren, waarvan de eerste op week 1 tengevolge van de anesthesie. De andere drie stierven respectievelijk op week 4, 5 en 6 tengevolge van ernstige calcificatie. 3.2. Voedselconsumptie Alle dieren kregen een hoog-fosfaat dieet tot aan week 0 en opnieuw vanaf week 4. De oorspronkelijke voedselinname voor elk dier bedroeg gemiddeld 30 ± 0.74 g/dag.

Fig. 3.1: Wekelijkse opvolging van de voedselconsumptie (g/dag). Wanneer adenine aan het dieet wordt toegevoegd op week 0 zal de voedselinname per dag enorm sterk afnemen. Indien nadien opnieuw een hoogfosfaat dieet gegeven wordt op week 4 zal deze voedselconsumptie zich niet herstellen tot de oorspronkelijke voedselinnane aangezien op dit moment de dieren reeds nierinsufficiënt zijn.

De dieren die een laag eiwit kregen zonder supplementair adenine bleef de voedselinname gedurende het hele verloop van de studie min of meer constant. Bij de dieren die een adenine dieet of een adenine + laag eiwit dieet kregen op week 0 werd deze voedselinname sterk gereduceerd met een minimum van 8 ± 2.35 g/dag gedurende de eerste week. We veronderstellen dat het adenine niet goed smaakt en dat de dieren hierdoor minder eten. Wanneer voor de tweede maal een hoog-fosfaat dieet gegeven werd nam deze voedselconsumptie in lichte mate toe, maar herstelde zich niet tot de oorspronkelijke 30 ± 0.74 g/dag. De oorzaak hiervan is dat deze dieren op week 4 reeds nierinsufficiënt waren en tengevolge van hun ziekte niet meer goed aten. Statistisch bestond er vanaf week 0 tot en met week 8 een significant verschil in voedselinname tussen enerzijds de dieren met een laag eiwit dieet en anderzijds de dieren met een adenine-rijk dieet.

21

Eleni Vanden Eede

Resultaten

3.3. Lichaamsgewicht Het lichaamsgewicht, dat bij aanvang van de studie 200-250 g bedroeg, werd wekelijks opgevolgd. Bij de dieren die een adenine + laag eiwit dieet kregen werd het studieprotocol om praktische redenen 1 week later ingezet dan bij de andere dieren. Gevolg is dat deze dieren met het adenine dieet 1 week ouder zijn en vanaf het begin van de studie een hoger lichaamsgewicht bezaten. De verschillen in lichaamsgewicht tussen de drie diëten onderling die statistisch aangetoond werden op de weken –2 en –1 zijn bijgevolg niet relevant voor onze studie.

Fig. 3.2: Wekelijkse opvolging van het lichaamsgewicht (g). Het laag eiwit dieet remt de toename in lichaamsgewicht tijdelijk af, terwijl het adenine en het adenine + laag eiwit dieet een afname in lichaamsgewicht induceren. Indien opnieuw een hoog-fosfaat dieet gegeven wordt op week 4 zal het lichaamsgewicht opnieuw zwak toenemen, maar niet in dezelfde mate als bij de dieren die geen adenine hadden gekregen.

Bij de controle dieren werd de toename in lichaamsgewicht afgeremd en werd een plateau bereikt vanaf de inname van het laag eiwit dieet op week 0, maar wanneer op week 4 opnieuw een hoog fosfaat dieet gegeven werd nam het lichaamsgewicht opnieuw toe. Bij de dieren die een adenine of adenine + laag eiwit dieet kregen zagen we een sterke afname in lichaamsgewicht die zich niet volledig herstelde indien op week 4 opnieuw een hoog fosfaat dieet gegeven werd. Dit kan verklaard worden door het feit dat deze dieren op week 4 reeds nierinsufficiënt waren en hierdoor gewicht verloren. 3.4. Analyse van serumwaarden Voor het adenine + laag eiwit model werden elke 2 weken bloedstalen geanalyseerd zodat de verandering van de creatinine-, ureum-, fosfaat- en calciumconcentraties opgevolgd konden worden in de tijd. Bij het adenine model werd enkel een bloedstaal geanalyseerd op week 0 en week 6. In een voorgaande studie werd de evolutie van de serumwaarden voor het adenine model reeds bepaald. Deze waarden zullen worden gebruikt om de het verschil tussen beide adenine-modellen aan te tonen (Neven et al, 2007).

22

Eleni Vanden Eede

Resultaten

3.4.1. Creatinine Chronische nierinsufficiëntie wordt gekarakteriseerd door een sterke toename van de serumconcentraties van creatinine.

Fig. 3.3: De creatinineconcentraties in het serum bleken voor het adenine + laag eiwit dieet enorme hoge waarden te bereiken die duidelijk aantonen dat in dit model een nierinfufficiëntie geïnduceerd werd die ernstiger is dan deze die door het adenine dieet bereikt wordt. c = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden op tijdstip 0 binnen dezelfde groep e = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van de controlegroep op hetzelfde tijdstip

De controlegroep behield tijdens het hele verloop van de studie een concentratie van gemiddeld 0,4 ± 0.1 mg creatinine/dl, wat overeenkomt met de normale waarden bij gezonde dieren. De creatinineconcentraties van de groep met het adenine + laag eiwit dieet vertoonden een enorme toename met een maximum van 4.1 ± 1.2 mg creatinine/dl op week 4. Vanaf week 4 kregen de dieren opnieuw een hoog-fosfaat dieet en daalde de creatinine concentratie tot een gemiddelde van 2 ± 0.6 mg creatinine/dl. Bij de dieren die een adenine dieet kregen werd op week 6 een gemiddelde waarde van 2.1 ± 0.4 mg creatinine/dl bekomen, wat significant verhoogd was ten opzichte van de basale waarde op tijdstip 0. In een voorgaand onderzoek heeft men aangetoond dat de creatinine concentratie bij het adenine dieet een maximale waarde heeft van 2.61 ± 0.52 mg/dl op week 4, wat veel lager is dan de waarden die we voor het adenine + laag eiwit dieet bekomen (Neven et al, 2007). 3.4.2. Ureum Ureum is een afbraakproduct van het stikstof metabolisme, waarvan de serumwaarden sterk toenemen bij nierinsufficiëntie en aanleiding geven tot het ontstaan van uremie.

23

Eleni Vanden Eede

Resultaten

Fig. 3.4: De serumconcentraties voor ureum bij het adenine + laag eiwit model waren reeds op week 2 significant hoger dan de basale waarden op week 0. Bij de controlegroep wordt een afname in ureumconcentratie vastgesteld gedurende de periode dat ze een laag eiwit dieet kregen. c = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden op tijdstip 0 binnen dezelfde groep d = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van het adenine model op hetzelfde tijdstip e = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van de controlegroep op hetzelfde tijdstip

Bij de controle groep veroorzaakte het laag eiwit dieet (week 0 tot week 4) een afname van de ureum concentratie vertrekkende van gemiddeld 31.3 ± 6.3 mg/dl tot een gemiddelde van 9.5 ± 3.7 mg/dl. Wanneer op week 4 het hoog-fosfaat dieet gegeven werd stegen deze waarden opnieuw tot een gemiddelde van 48.8 ± 3.3 mg/dl op week 6. Door de inname van eiwitten te reduceren, worden minder eiwitten afgebroken en zal de concentratie aan ureum afnemen. De dieren uit de controlegroep lijden niet aan nierinsufficiëntie, dus wanneer opnieuw een hoogfosfaat dieet wordt ingenomen zullen deze ureumconcentraties zich snel herstellen tot de normale waarden. Bij de dieren met het adenine + laag eiwit dieet werd een maximum van 253.3 ± 32.9 mg/dl bereikt op week 3 en week 6, het vijfvoud van de basale waarden. De ureum concentratie van de dieren met een adenine dieet bedroeg op week 6 gemiddeld 207.3 ± 61.2 mg/dl, wat aanzienlijk lager is dan de concentraties bij het adenine + laag eiwit dieet op week 6. Er werd op tijdstip 0 een significant verschil in ureum concentratie aangetoond tussen de het adenine model en het adenine + laag eiwit model. Dit is te wijten aan het verschil in leeftijd. 3.4.3. Fosfaat Chronische nierinsufficiëntie gaat gepaard met het ontstaan van hyperfosfatemie, welke mede verantwoordelijk is voor het induceren van ectopische vasculaire calcificaties. Bij de controle groep met het laag eiwit dieet bleven de fosfaatconcentraties relatief constant gedurende het volledige verloop van de studie.

24

Eleni Vanden Eede

Resultaten

Fig. 3.5: De toename van de fosfaatconcentraties in het serum bevestigen dat de dieren tengevolge van de adeninerijke diëten nierinsufficiënt worden. De fosfaatconcentraties in de controlegroep blijven constant, terwijl deze bij de adneine + laag eiwit groep reeds vanaf week 3 significant hoger zijn dan de basale waarden. c = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden op tijdstip 0 binnen dezelfde groep d = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van het adenine model op hetzelfde tijdstip e = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van de controlegroep op hetzelfde tijdstip

Een sterke toename in de concentratie van fosfaat werd vastgesteld bij de dieren met een adenine + laag eiwit dieet, met een maximum van 23.8 ± 3.1 mg/dl op week 4. Uit de resultaten die in voorgaande studies bekomen werden, weten we dat bij het adenine model de fosfaatconcentratie een maximale waarde bereikt werd van 9.2 ± 1.83 mg/dl die nadien opnieuw afnam wanneer een hoog-fosfaat dieet gegeven werd (Neven et al, 2007). Dit is aanzienlijk lager dan de waarden die we voor het adenine + laag eiwit model bekomen. Het adenine + laag eiwit model induceert een ernstigere hyperfosfatemie dan het adenine model. 3.4.4. Calcium Bij chronische nierinsufficiëntie zal tengevolge van een gebrekkige werking van vitamine D3 een hypocalcemie ontstaan.

Fig. 3.6: De calciumconcentraties in het serum zijn bij het adenine model sterk afgenomen op week 6. Dit is niet het geval bij het adenine + laag eiwit dieet, waarbij de calciumconcentratie gedurende een langere periode constant blijft. c = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden op tijdstip 0 binnen dezelfde groep d = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van het adenine model op hetzelfde tijdstip e = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van de controlegroep op hetzelfde tijdstip

25

Eleni Vanden Eede

Resultaten

De controle groep behoudt een basale waarde van gemiddeld 10 ± 0.2 mg/dl over het volledige tijdsverloop van de studie. De calciumconcentratie bij de dieren met het adenine dieet neemt af tot een minimum van 6.5 ± 1.1 mg/dl op week 6. De dieren met het adenine + laag eiwit dieet behouden een relatief constante calciumconcentratie tot op week 3, wat nadien ook afzwakt tot een minimum van 6.8 ± 0.4 mg/dl op week 8. In een voorgaande studie werd bij het adenine dieet op week 8 een calciumconcentratie van 4.05 ± 1.22 mg/dl genoteerd (Neven et al, 2007), wat aanzienlijk lager ligt dan de waarden bij het adenine + laag eiwit model. 3.4.5. Calcium x Fosfaat product Indien nierinsufficiëntie optreedt zal het lichaam trachten het calcium x fosfaat product constant te houden. Als reactie op de hyperfosfatemie zal een hypocalcemie ontstaan, zodat uiteindelijk het Ca x Pi product zo lang mogelijk binnen de fysiologische grenzen blijft.

Fig. 3.7: De serumwaarden voor het Calcium x fosfaat product blijken in het adenine + laag eiwit model niet constant te zijn. Er is een enorme toename van het Ca x Pi product tot aan week 4, wat afneemt op week 6. c = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden op tijdstip 0 binnen dezelfde groep d = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van het adenine model op hetzelfde tijdstip e = er werd een significant verschil aangetoond met de waarden van de controlegroep op hetzelfde tijdstip

De enorme toename van het Ca x Pi product tot aan week 4 en de afname achteraf zijn te verklaren door de tijdsevolutie van de calciumconcentraties in het serum. Bij het adenine model was er een toename van de fosfaatconcentratie en een bijna evenredige afname van de calciumconcentratie. Hierdoor blijft het Ca x Pi product relatief constant gedurende de eerste weken. Bij het adenine + laag eiwit model daarentegen was er een sterkere toename van de fosfaatconcentraties, maar geen evenredige afname van de calciumconcentraties. Dit kan verklaren waarom de dieren met het adenine + laag eiwit dieet op een vroeger tijdstip en sterker gecalcifieerd waren.

26

Eleni Vanden Eede

Resultaten

3.5. Evaluatie van de micro-CT datasets 3.5.1. Scoring van de in vivo datasets In figuur 3.8 werden representatieve voorbeelden afgebeeld van de virtuele doorsneden bekomen met micro-CT ter hoogte van de aorta. De scans afkomstig van dieren die het adenine + laag eiwit dieet kregen werden vergeleken met die van dieren die het adenine dieet werden toegediend op verschillende tijdstippen. Op deze virtuele dwarse doorsneden is duidelijk het bot van de wervelkolom te herkennen (donker grijs) terwijl de zachte weefsels zoals het hart en de bloedvaten moeilijk van elkaar te onderscheiden zijn in normale fysiologische omstandigheden. Indien calcificaties optreden is er echter duidelijk een dense ringstructuur te zien in de aorta.

Fig. 3.8: Longitudinale opvolging van het ontstaan en de evolutie van calcificaties in de aorta bij ratten met behulp van micro-CT. Alle beeldinformatie werd bekomen door de ratten in vivo te scannen met een resolutie van 35 x µm x µm x µm. Bij het adenine model bleken alle scans bij 14/16 ratten negatief (score 0) van week 3 tem week 5. De scan op week 4 is hiervoor representatief. Op week 3 was 1 rat reeds gecalcifieerd, de tweede calcifieerde matig op week 6 (score 2). Alle scans bij het adenine + laag eiwit model waren negatief van week 1 tem week 3. In bovenstaande figuur is de scan op week 3 representatief voor deze negatieve scans. Er is een duidelijke progressie in de ernst van calcificatie zichtbaar van week 4 tem week 8, waarbij de calcificaties op week 8 de densiteit van bot benaderen.

In onze resultaten beschouwen we enkel de dieren die we 4 x opeenvolgend hebben kunnen scannen, niet diegenen die stierven voor het beëindigen van de studie. Proefdiermodel Week 1 Week 2 Week 3 Week 4 Week 5 Week 6 Week 8 Adenine + laag eiwit 0/9 0/9 0/9 4/9 5/5* 5/5* Adenine 1/16 1/16 1/16 2/16 Tabel 1: Visuele score van de in vivo datasets. In het adenine model kon op week 6 bij slechts 2/16 proefdieren calcificatie aangetoond worden, terwijl dit voor het adenine + laag eiwit model op week 4 reeds 4/9 was. *De proefdieren die opgevolgd werden op week 6 en 8 voor het adenine + laag eiwit model zijn niet dezelfde dieren als diegene die gescand werden van week 1 tem week 4. Deze 5 ratten kregen hetzelfde dieet, maar behoorden tijdens het verloop van de studie tot een andere groep.

27

Eleni Vanden Eede

Resultaten

Uit bovenstaande tabel kunnen we afleiden dat bij het adenine + laag eiwit dieet een hoger percentage van de dieren gecalcifieerd was. Deze dieren calcifieerden op een vroeger tijdstip en de progressie van calcificatie werd opvolgd in de tijd. Dit is duidelijk zichtbaar in figuur 3.8. De 4 proefdieren van het adenine + laag eiwit model die gecalcifieerd waren op week 4 vertoonden een milde calcificatie (score 2). Naarmate de tijd vorderde nam de ernst van calcificatie toe zodat op week 8 de aorta’s volledig gecalcifieerd waren. We konden vaststellen dat op week 8 de calcificaties de densiteit van bot benaderden en dat er rupturen in de aortawand ontstonden. Om de maat van calcificatie in de aorta verder te kwantificeren werden 3D modellen gereconstrueerd van de totale dataset aan virtuele dwarse doorsneden. Hierbij wordt in het computerprogramma de selctie van grijswaarden dusdanig ingesteld dat enkel het gecalcifieerde weefsel in het 3D model wordt weergegeven (“thresholding”). Een representatief voorbeeld wordt weergegeven in figuur 3.9. uit deze figuur blijkt duidelijk de toename van de calcificaties op week 8 (geel) vergeleken met week 6 (wit). Het volume dat ingenomen werd door gecalcifieerd weefsels in dit voorbeeld op week 8 bedroeg 7.77 mm3. Dit is een toename van 582% in vergelijking met het gecalcifieerd volume op week 6 dat 1.14 mm3 bedroeg.

Fig. 3.9: 3D reconstructie van een aorta die voor het adenine + laag eiwit model in vivo gescand werd. Op week 6 kan reeds een ernstige calcificatie aangetoond worden die zeer sterk evolueert in de tijd, waarbij op week 8 de aorta volledig is gecalcifieerd.

De calcificaties die op week 8 bij het adenine + laag eiwit model aangetoond konden worden zijn zeer ernstig en nemen de volledige aortawand in. 3.5.2. Scoring van de in vitro datasets Om de resultaten afkomstig van de in vivo scans te valideren werden de aorta’s na opoffering in vitro gescand. Er werd een score systeem toegepast dat volgens dezelfde criteria werkt als bij de in vivo scoring. score 0: negatief, geen calcificatie score 1: focale spots van calcificatie score 2: calcificatie over de volledige lengte van de gescande regio met lage densiteit score 3: calcificatie over de volledige lengte van de gescande regio met hoge densiteit

28

Eleni Vanden Eede

Resultaten

In figuur 3.10 worden representatieve voorbeelden weergegeven van virtuele sneden afkomstig van de in vitro scans. Opgemerkt dient te worden dat in de onderstaande figuur telkens slechts 1 snede werd afgebeeld. Om de datasets te evalueren hebben wij 1 globale score toegekend per gescande aorta, afhankelijk van de meest voorkomende score bij dat bepaald dier. Niet elke snede werd afzondelijk gescoord zoals wel het geval was bij microscopie.

Fig. 3.10: Scoring van de in vitro datasets. Na opoffering werden de aorta’s een tweede keer in vitro gescand met andere parameters om de bekomen resultaten van de in vivo scans te valideren. In deze figuur wordt telkens slechts 1 virtuele snede voorgesteld, terwijl bij het scoren van de gescande aorta’s 1 globale score werd toegekend aan de volledige dataset.

Proefdiermodel Week 4 Week 6 Week 8 Adenine + laag eiwit 8/9 5/5* Adenine 3/16 Tabel 2: Visuele scoring van de in vitro datasets van de aorta’s bij opoffering. In het adenine model kon op week 6 bij 3/16 proefdieren calcificatie aangetoond worden, terwijl dit voor het adenine + laag eiwit model op week 4 reeds 8/9 was.

Uit bovenstaande tabel kunnen we afleiden dat op week 4 voor het adenine model in vitro 8/9 proefdieren gecalcifieerd waren, terwijl dit volgens de in vivo resultaten slechts 4/9 was. We kunnen opmerken dat de 4 proefdieren die in vivo als positief beschouwd werden ernstiger gecalcifieerd waren dan de 5 die achteraf in vitro positief bleken te zijn.

29

Eleni Vanden Eede

Resultaten

3.6. Calcium bulk bepalingen 3.6.1. Calcium inhoud bloedvaten

Fig. 3.11: Calcium bulk analyse van de thoracale aorta, de a. femoralis en de a. carotis met Atomaire absorptie. a = er werd een significant verschil aangetoond tussen de waarden van het adenine + laag model dieet op week 4 en het adenine model op week 6 b = er werd een significant verschil aangetoond tussen de waarden van het adenine + laag eiwit model op week 4 en het laag eiwit model op week 6

Vastgesteld werd dat zowel bij de thoracale aorta als de arteria femoralis en arteria carotis de gemeten calcium waarden hoger liggen bij de dieren die een adenine + laag eiwit dieet kregen dan bij de dieren met een adenine dieet. Reeds vanaf week 3 werd een stijging in de calcium inhoud geconstateerd. Bij de groep met het adenine + laag eiwit dieet werd een lineaire toename in calcium inhoud (mg/g weefsel) bekomen waarvan de waarde op week 4 significant hoger is dan deze op week 6 bij de dieren met het adenine dieet.

30

Eleni Vanden Eede

Resultaten

3.6.2. Calcium inhoud organen

Fig. 3.12: Calcium bulk analyse van het hart, de linker nier en de lever met Atomaire absorptie. a = er werd een significant verschil aangetoond tussen de waarden van het adenine + laag model dieet op week 4 en het adenine model op week 6 b = er werd een significant verschil aangetoond tussen de waarden van het adenine + laag eiwit model op week 4 en het laag eiwit model op week 6

Er werd voor het hart aangetoond dat er een significant verschil bestaat tussen de waarden van het adenine + laag eiwit model op week 4 en die van het adenine model op week 6. In de lever en de nier werd een significant verschil aangetoond tussen de waarden van het adenine + laag eiwit model en de controlegroep met het laag eiwit dieet. 3.7. Evaluatie van de microscopische coupes Van elk dier werden de aortaboog, de a. femoralis en de A. carotis microscopisch geanalyseerd, waarbij gemiddeld 12 doorsneden visueel gescoord werden met een minimum van 4 en een maximum van 35 coupes.

31

Eleni Vanden Eede

Resultaten

Fig. 3.13: Microscopische evaluatie van de ernst van calcificatie na Von Kossa kleuring. Foto’s a – c : Representatief voor 13/16 dieren van het adenine model die op week 6 niet gecalcifieerd waren. Foto’s d – f: Representatief voor 3/16 dieren uit het adenine model die reeds vanaf week 3 ernstig gecalcifieerd waren (score 2 – 3) Foto’s g – i: Representatief voor 12/13 dieren van het adenine + laag eiwit model die op week 4 ernstig gecalcifieerd waren (score 3) Foto’s: j – l: Representatief voor 5/5 dieren die op week 8 zeer ernstig gecalcifieerd waren met het ontstaan van media rupturen (score 3) Foto’s m – o: Representatief voor 4/4 dieren van het controle dieet met laag eiwit die allen negatief waren en geen calcificaties vertoonden (score 0).

32

Eleni Vanden Eede

Resultaten

Percentage gescoorde doorsneden

Aortaboog 100% 80% 60% 40% 20% 0% 1

2

3

4

8

Tijdsverloop (weken)

Laag eiwit week 8

Adenine week 6

Score 3 = circumflexe calcificatie

Score 2 = partieel circumflexe calcificatie

Score 1 = focale spots van calcificatie

Score 0 = geen calcificatie


Femoralis 100% 80% 60% 40% 20% 0% 1

2

3 4 8 Tijdsverloop (weken)

Laag eiwit week 8

Adenine week 6

Score 3 = circumflexe calcificatie

Score 2 = partieel circumflexe calcificatie

Score 1 = focale spots van calcificatie

Score 0 = geen calcificatie


Carotis 100% 80% 60% 40% 20% 0% 1

2

3

4

Tijdsverloop (weken)

Score 3 = circumflexe calcificatie Score 1 = focale spots van calcificatie

8

Laag eiwit week 8

Adenine week 6

Score 2 = partieel circumflexe calcificatie Score 0 = geen calcificatie

Fig. 3.14 : Evaluatie van de microscopische scoring van het adenine + laag eiwit dieet in vergelijking met beide controlediëten, het laag eiwit dieet en het adenine dieet. Per dier en per weefsel werden gemiddeld 12 doorsneden visueel gescoord. In bovenstaande figuur werden de percentages voor elke score, respectievelijk 0 tem 3, weergegeven. In geen van de geanalyseerde weefsels kon calcificatie aangetoond worden voor week 3. Vanaf week 3 is er een toename in de ernst van calcificatie totdat op week 8 voor het adenine dieet bij 80% van de gescoorde doorsneden een score 3 werd toegekend.

33

Eleni Vanden Eede

Resultaten

In figuur 3.14 werd het adenine + laag eiwit dieet vergeleken met enerzijds het laag eiwit dieet en anderzijds het adenine dieet. Per dier werden gemiddeld 12 doorsneden visueel gescoord op de aanwezigheid van calcificatie, van negatief (score 0) tot zeer ernstig gecalcifieerd (score 3). De waarden van de gescoorde doorsneden van alle dieren in elk van de drie verschillende groepen werden samengeteld en er werd een percentage berekend. Hieruit kunnen we opmaken dat reeds op week 4 het aantal doorsneden dat volledig gecalcifieerd was en een score 3 werd toegekend hoger is dan voor het adenine dieet op week 6 voor zowel de aorta als voor de arteria femoralis en de arteria carotis. Dit is in overeenstemming met de gemeten calcium inhouden van de overeenkomstige weefsels.

34

Eleni Vanden Eede

Discussie

4. DISCUSSIE Deze thesis had als doel het ontstaan en de progressie van vasculaire media calcificaties ter hoogte van de aorta longitudinaal in vivo op te volgen met behulp van hoge resolutie micro-CT in ratten waarbij chronische nierinsufficiëntie geïnduceerd werd met behulp van 2 verschillende adenine-rijke diëten, een adenine dieet en een adenine + laag eiwit dieet. De vraag die we ons stelden was op welke tijdstip beginnende calcificaties gevisualiseerd kunnen worden met behulp van micro-CT en of er een verschil in ernst van calcificatie bestaat tussen beide adenine-modellen. In een voorgaand onderzoek heeft men kunnen aantonen dat bij het adenine model op week 8 calcificaties aanwezig zijn die gevisualiseerd kunnen worden met behulp van micro-CT. In dit onderzoek werden de ratten 2 maal gescand met een tussenperiode van 2 weken (Persy et al, 2006). Recent werd een variant ontwikkeld op dit adenine model, waarbij het dieet naast 0,75% adenine ook een lage concentratie aan eiwitten (2,5% in plaats van de standaard 25%) bevat. Hier werd aangetoond dat het verlagen van de concentratie aan eiwitten de frequentie en de verspreiding van calcificaties verhoogd (Price et al, 2006). Een eerste verwezenlijking is dat wij in deze studie onze ratten succesvol 1 maal wekelijks hebben kunnen scannen gedurende 4 opeenvolgende weken met een zeer beperkte mortaliteit. Ook hebben we kunnen aantonen dat met behulp van micro-CT beginnende calcificaties reeds gevisualiseerd kunnen worden vanaf week 4 en dat de progressie ervan opgevolgd kan worden op week 6 en 8. Er werd aangetoond dat er een groot verschil bestaat tussen de beide adenine modellen. Het klassieke adenine model induceerde calcificaties vanaf week 6, terwijl het bij adenine + laag eiwit dieet calcificaties microscopisch konden aangetoond worden vanaf week 3. De calcificaties die ontstonden tengevolge van het adenine + laag eiwit dieet waren meer verspreid en ernstiger. De oorzaak hiervan is dat het adenine + laag eiwit dieet een ernstigere nierinsufficiëntie veroorzaakt, wat ook werd bevestigd door de analyse van de serumwaarden. De serumwaarden voor creatinine en ureum, twee parameters die toenemen tengevolge van nierinsufficiëntie, waren bij het adenine + laag eiwit dieet op week 4 reeds significant hoger dan deze bij het adenine dieet op week 6. Merkwaardig is dat het Ca x Pi product, wat in eerdere studies steeds constant bleef, in onze studie enorm toeneemt tot zelfs tweemaal de normale waarde. De ernst van de calcificatie werd geëvalueerd met behulp van 3 afzonderlijke methoden. De calcificaties werden wekelijks visueel opgevolgd met behulp van micro-CT en na opoffering werd een calcium-bulk analyse en een visuele microscopische analyse uitgevoerd. Met micro-CT werden calcificaties gevisualiseerd vanaf week 4, terwijl microscopisch reeds calcificaties op week 3 werden aangetoond. Dit kan verklaard worden doordat met micro-CT de thoracale aorta gescand werd, terwijl de aortaboog microscopisch geanalyseerd werd. Algemeen is geweten dat de aortaboog sneller en ernstiger calcifieert dan de thoracale aorta. Indien we de aortaboog zouden gescand hebben, hadden we misschien vroeger dan week 4 calcificaties kunnen visualiseren. Dit was echter niet mogelijk omdat er enerzijds geen referentiepunt aanwezig is in de regio van de aortaboog om de dieren longitudinaal op te volgen en wekelijks exact hetzelfde deel te scannen. Anderzijds is de aortaboog niet verankerd en zouden er veel meer bewegingsartefacten opgetreden zijn.

35

Eleni Vanden Eede

Discussie

De Von Kossa kleuring is een zeer gevoelige kleuring waarmee calciumconcentraties tot 2,0 mg/g aangetoond kunnen worden (Lomashvilli et al, 2006). Dit maakt dat microscopie, gecombineerd met de hoge resolutie waarmee geëvalueerd wordt, een zeer gevoelige methode is voor het detecteren van calcificaties. Een nadeel is dat de dieren niet longitudinaal opgevolgd kunnen worden zodat de progressie van calcificaties niet aangetoond kan worden. Er werden meerdere coupes genomen per weefsel (gemiddeld 12) om een representatief beeld te krijgen van de calcificatie, maar toch treedt er steeds een sampling bias op aangezien niet de volledige aorta bekeken wordt. Atomaire absorptie is zeer gevoelig en bepaalt accuraat de globale calciuminhoud in een weefsel. Een nadeel is dat het geen informatie kan bieden over de lokalisatie van de calcificaties en dat kleine focale spots over het hoofd kunnen zien worden indien de densiteit te laag is ten opzichte van het totale weefselgewicht. Micro-CT is een methode waarbij met een hoge resolutie calcificaties gelokaliseerd kunnen worden en een globaal beeld bekomen kan worden van het volledige weefsel. Wanneer gescand wordt met een voxel grootte van 35 µm x µm x µm worden sneden bekomen op elke 35 µm. Hier treedt geen sampling bias op aangezien doorsneden bekeken kunnen worden over de volledige lengte van het gescande weefsel. Een extra voordeel is dat met micro-CT de calcificaties longitudinaal opgevolgd kunnen worden zonder dat een opoffering van de dieren vereist is. Er moest een akkoord bereikt worden tussen de geschikte scanduur die gecorreleerd is met de resolutie en de, voor in vivo, optimale beeldkwaliteit. De scanduur met een voxel grootte van 35 µm x µm x µm bedroeg 21 minuten, een tijdsduur waarin de ratten voldoende diep sliepen zonder te bewegen. Indien we met een hogere resolutie zouden gescand hebben zou deze scanduur aanzienlijk verlengd worden en zou de kans op beweging tijdens het scannen verhogen. Vermeld moet worden dat de uiteindelijke resolutie van de virtuele beelden effectief geen 35 µm bedraagt. Door bewegingsartefacten ten gevolge van onder andere de ademhaling, hartslag en vertering worden de beelden vager en verlaagt de signaal/ruis verhouding. Hierdoor zou maximaal een werkelijke resolutie van ongeveer 200 µm bekomen kunnen worden. Een niet onbelangrijke parameter is de geabsorbeerde stralingsdosis. In de literatuur is geen data beschikbaar over de stralingsdosis die de ratten eventueel zouden kunnen toegediend krijgen door herhaaldelijk gescand te worden. We kunnen echter niet uitsluiten dat deze straling niet interfereert met het calcificatie proces. Het zou mogelijk kunnen zijn dat deze veelvuldige blootstelling op korte tijd invloed heeft op het ontstaan van calcificaties en het proces vertraagt of versnelt. Er werd een verschil in calcificatie opgemerkt tussen dieren met het adenine + laag eiwit dieet die 4 maal gescand werden en dieren met hetzelfde dieet die nooit gescand werden. In een voorgaand onderzoek werd voor het adenine model bij 3/7 dieren calcificatie aangetoond, zowel microscopisch als met micro-CT. In onze studie calcifieerden slechts 3/20 dieren met het adenine + laag eiwit model. Er is geen verklaring voor waarom dit aantal zo laag is voor onze studie. Bij het adenine + laag eiwit model calcifieerden 22/34 dieren, wat dit model meer betrouwbaar maakt dan het klassieke adenine model.

36

Eleni Vanden Eede

Discussie

Toekomstgericht kan het adenine + laag eiwit dieet gecombineerd met de mogelijkheid tot visualisatie met behulp van micro-CT op lange termijn eventuele reversibiliteit van de calcificaties nagaan. Eerst zal het adenine + laag eiwit model moleculair gekarakteriseerd moeten worden zoals eerder al voor het adenine model gebeurde. Dit vraagt om onderzoek naar onder meer een bepaling van de fenotypische veranderingen in de gladde spiercellen en een bepaling van de aanwezigheid van de NPC Pit-1 cotransporter, osteoblasten en chondrocyten. Wel is nu dankzij deze studie geweten dat de calcificaties microscopisch aanwezig zijn vanaf week 3 en gevisualiseerd kunnen worden met behulp van micro-CT vanaf week 4. Indien later blijkt dat de calcificaties moleculair op dezelfde manier ontstaan als bij mensen, weten we nu dat voor interventie studies farmaca dienen toegediend worden voor week 3 om het ontstaan van calcificaties te verhinderen en vanaf week 4 om de reversibiliteit na te gaan.

Hiervoor zouden 2 oorzaken kunnen bestaan. Enerzijds werd in vivo slechts 1,8 cm van de thoracale aorta gescand, terwijl in vitro de volledige aorta werd gescand. Het is best mogelijk dat de calcificaties buiten de gescande regio gelegen waren. Anderzijds zou het kunnen dat in vivo een aantal beginnende calcificaties niet opgemerkt werden aangezien hun densiteit zeer laag was. Het adenine model was gedurende deze studie teleurstellend aangezien enkel 2 dieren gecalcifieerd waren op week 6. In voorgaande studies werd steeds een percentage van gecalcifieerde dieren bekomen van ongeveer 50%, terwijl dit in onze studie slechts 12,5% bedroeg. De oorzaak hiervoor kan zijn dat niet alle ratten even gevoelig zijn voor het ontstaan van calcificatie en dat wij in onze studie gewerkt hebben met proefdieren die geen aanleg hebben voor calcificatie. Een tweede oorzaak kan het dieet zelf zijn. Het adenine dieet is een inmeng dieet waarbij de concentraties aan fosfaat en calcium kunnen variëren. Het is mogelijk dat in één studie de voeding meer fosfaat bevat dan in een andere studie. Het adenine + laag eiwit dieet daarentegen wordt synthetisch aangemaakt. Ongeacht de leverancier zal dit dieet altijd exact dezelfde concentraties aan voedingsstoffen bevatten. Dit maakt dat het adenine + laag eiwit dieet een meer betrouwbaar dieet is. In een voorgaande studie (Price et al, 2006) waren alle dieren met het adenine + laag eiwit dieet gecalcifieerd, terwijl dit bij ons 8/9 bedroeg.

37

Eleni Vanden Eede

5. CONCLUSIE

38

Eleni Vanden Eede Blacher J, Guérin AP, Pannier B, Marchais SJ, London GM (2001) Arterial calcifications, arterial stiffness, and cardiovascular risk in end-stage renal disease. Hypertension. 38, 938-942 Bobryshev YV (2005) Transdifferentiation of smooth muscle cells into chondrocytes in atherosclerotic arteries in situ: implications for diffuse intimal calcification. J Pathol 205(5), 641-650 Bostrom K, Demer LL (2000) Regulatory mechanisms in vascular calcification. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 10, 151-158 Cozzolino M, Staniforth ME, Liapis H, Finch J, Burke SK, Dusso AS, Slatopolsky E (2003) Sevelamer hydrochloride attenuates kidney and cardiovascular calcifications in long-term experimental uremia. Kidney Int. 64, 1653-1661 De Clerck N, Postnov A (to be published in 2007) High resolution X-ray microtomography : applications in biomedical research. In : International textbook of in vivo imaging in vertebrate, Tavitian B, Leroy-Willig A en Ntziachristos V, pp. 59-79 Feldkamp LA, Davis LC, Kress JW (1984) Practical cone-beam algorythm. J. Opt. Soc. Am A. 1(6), 612-619 Fleisch H, Russell GG, Straumann F (1966) Effect of pyrophosphate on hydroxyapatite and its implications in calcium homeostasis. Nature. 212, 901–903 Foley RN, Murray AN, Li S, Herzog CA, McBean AM, Eggers PW, Collins AJ (2005) Chronic kidney disease and the risk for cardiovascular disease, renal replacement, and death in the United States Medicare population, 1998 to 1999. J Am Soc Nephrol. 16, 489-495 Giachelli CM (2003) In vitro evidence for the role of inorganic phosphate. J Am Soc Nephrol. 14, S300-S304 Goodman WG, Goldin J, Kuizon BD, Yoon C, Gales B, Sider D, Wang Y, Chung J, Emerick A, Greaser L, Elashoff RM, Salusky IB (2000) Coronary artery calcification in young adults with ESRD who are undergoing dialysis. N Engl J Med. 342, 1478-1483 Guérin AP, London GM, Marchais SJ, Metivier F (2000) Arterial stiffening and vascular calcifications in endstage renal disease. Nephrol Doal Transplant. 15, 1014-1021 Heiss A, DuChesne A, Denecke B, Grotzinger J, Yamamoto K, Renne T, Jahnen-Dechent W (2003) Structural basis of calcification inhibition by alpha 2-HS glycoprotein/fetuin-A. Formation of colloidal calciprotein particles. J Biol Chem. 278, 13333–13341 Johnson RH, Hu H, Haworth ST, Cho PS, Dawson CA, Linehan JH (1998) Feldkamp and circle-and-line conebeam reconstruction for 3D micro-CT of vascular networks. Phys. Med. Biol. 43, 929-940 Jono S, McKee MD, Murry CE, Shioi A, Nishizawa Y, Mori K, Morii H, Giachelli CM (2000) Phosphate regulation of vascular smooth muscle cell calcification. Circ. Res. 87, 10-17 Katsumata K, Kusano K, Hirata M, Tsunemi K, Nagano N, Burke SK, Fukushima N (2003) Sevelamer hydrochloride prevents ectopic calcification and renal osteodystrophy in chronic renal failure rats. Kidney Int. 64, 441-450 Ketteler M, Bongartz P, Westenfeld R, Wildberger JE, Mahnken AH, Bohm R, Metzger T, Wanner C, JahnenDechent W, Floege J (2003) Association of low fetuin-A (AHSG) concentrations in serum with cardiovascular mortality in patients on dialysis: a cross-sectional study. Lancet. 361, 827–833 Locatelli F, Covic A, Chazot C, Leunissen K, Luño J, Yaqoob M. Optimal composition of the dialysate, with emphasis on its influence on blood pressure. Nephrol Dial Transplant. 19, 785-796 Lomashvili KA, Cobbs S, Hennigar RA, Hardcastle KI, O’Neill WC (2004) Phosphate-Induced Vascular Calcification: Role of Pyrophosphate and Osteopontin. J Am Soc Nephrol. 15, 1392-1401

39

Eleni Vanden Eede Lomashvili KA, Garg P, O’Neill WC (2006) Chemical and hormonal determinants of vascular calcification in vitro. Kidney Int. 69, 1464-1470 London GM (2003) Cardiovascular calcification in uremic patients: clinical impact on cardiovascular function. J Am Soc Nephrol. 14, S305-S309 London GM, Guérin AP, Marchais SJ, Métivier F, Pannier B, Adda H (2003) Arterial media calcification in ESRD: impact on all-cause and cardiovascular mortality. Nephrol Dial Transplant. 18, 1731-1740 Luo G, Ducy P, McKee MD, Pinero GJ, Loyer E, Behringer RR, Karsenty G (1997) Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, 78–81 Mazhar AR, Johnson RJ, Gillen D, Stivelman JC, Ryan MJ, Davis CL, Stehman-Breen C (2001) Risk factors and mortality associated with calciphylaxis in end-stage renal disease. Kidney Int. 60, 324-332 Meyer JL (1984) Can biological calcification occur in the presence of pyrophosphate? Arch Biochem Biophys. 231, 1-8 Moe SM, Duan D, Doehle BP, O'Neill KD, Chen NX (2003) Uremia induces the osteoblast differentiation factor Cbfa1 in human blood vessels. Kidney Int. 63(3),1003-1011 Moe SM, O'Neill KD, Duan D, Ahmed S, Chen NX, Leapman SB, Fineberg N, Kopecky K (2002) Medial artery calcification in ESRD patients is associated with deposition of bone matrix proteins. Kidney Int. 61(2), 638-647 Moe SM, Reslerova M, Ketteler M, O’neill K, Duan D, Koczman J, Westenfeld R, Jahnen-Dechent Y, Chen NX (2005) Role of calcification inhibitors in the pathogenesis of vascular calcification in chronic kidney disease (CKD). Kidney Int. 67, 2295–2304 Odamaki M, Shibata T, Takita T, Kumagai H (2005) Serum fetuin-A and aortic calcification in hemodialysis patients. Kidney Int. 68, 2915 Okada H, Kaneko Y, Yawata T, Uyama H, Ozono S, Motomiya Y, Hirao Y (1999) Reversibility of adenineinduced renal failure in rats. Clin Exp Nephrol. 3, 82-88 Persy V, Postnov A, Neven E, Dams G, De Broe M, D’Haese P, De Clerck N (2006) High-resolution X-ray microtomography is a sensitive method to detect vascular calcification in living rats with chronic renal failure. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26, 2110-2116 Postnov A, De Clerck N, Sasov A, Van Dijck D (2002) 3D in-vivo X-ray microtomography of living snails. Journal of microscopy. 205, 201-204 Postnov A, Vinogradov A, Van Dijck D, Saveliev S, De Clerck N (2003) Quantitative analysis of bone mineral content by x-ray microtomography. Physiol. Meas. 24(1), 165-178 Price PA, Roublick AM, Williamson MK (2006) Artery calcification in uremic rats is increased by a low protein diet and prevented by treatment with ibandronate. Kidney Int. 70, 1577-1583 Qunibi WY, Nolan CA, Ayus JC (2002) Cardiovascular calcification in patients with end-stage renal disease: a century old phenomenon. Kidney Int. 62(suppl 82), S73-S80 Raggi P, Boulay A, Chasan-Taber S, Amin N, Dillon M, Burke SK, chertow GM (2002) Cardiac calcification in adult hemodialysis patients: A link between end-stage renal disease and cardiovascular disease? J Am Coll Cardiol. 39(4), 695-701 Rattazzi M, Bennett BJ, Bea F, Kirk EA, Ricks JL, Speer M, Schwartz SM, Giachelli CM, Rosenfeld ME (2005) Calcification of advanced atherosclerotic lesions in the innominate arteries of ApoE-deficient mice: potential role of chondrocyte-like cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25(7), 1420-1425

40

Eleni Vanden Eede Reynolds JL, Skepper JN, McNair R, Kasama T, Gupta K, Weissberg PL, Jahnen-Dechent W, Shanahan CM (2005) Multifunctional roles for serum protein fetuin-a in inhibition of human vascular smooth muscle cell calcification. J Am Soc Nephrol. 16, 2920–2930 Schäfer C, Heiss A, Schwarz A, Westenfeld R, Ketteler M, Floege J, Muller-Esterl W, Schinke T, JahnenDechent W (2003) The serum protein alpha 2-Heremans-Schmid glycoprotein/fetuin-A is a systemically acting inhibitor of ectopic calcification. J Clin Invest. 112, 357–366 Semat H, Albright JR (1973) X-ray spectra. In: Introduction to atomic and nuclear physics, Chapman and Hall, fifth edition, London, 309-322 Shanahan CM, Cary NRB, Salisbury JR, Proudfoot D, Weissberg PL, Edmonds ME (1999) Medial localization of mineralization-regulating proteins in association with Mönckeberg’s sclerosis. Evidence for smooth muscle cell-mediated vascular calcification. Circulation. 100, 2168-2176 Verberckmoes SC, Persy V, Behets GJ, Neven E, Hufkens A, Zebger-Gong H, Muller D, Haffner D, Querfeld U, Bohic S, De Broe ME, D’Haese PC (2007) Uremia-related vascular calcification: more than apatite deposition. Kidney Int. 71(4), 298-303 Wolisi GO, Moe SM (2005) The role of vitamin D in vascular calcification in chronic kidney disease. Seminars in dialysis. 18(4), 307-314 Yang H, Curinga G, Giachelli CM (2004) Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralisation in vitro. Kidney Int. 66, 2293-2299 Yokozawa T, Zheng PD, Oura H, Koizumi F (1986) Animal model of adenine-induced chronic renal failure in rats. Nephron. 44(3), 230-4

41

Faculteit Farmaceutische, Biomedische en Diergeneeskundige Wetenschappen. door: Eleni Vanden Eede

Recommend Documents