Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen. Academiejaar

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015

Ontwikkelen van een analytische methode voor de kwantificatie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen en geoxideerde derivaten in Taxus baccata bladeren

Fé Van der Elst Promotor: Prof. dr. ir. Herman Van Langenhove Promotor: dr. ir. Christophe Walgraeve Tutor: dr. ir. Christophe Walgraeve

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Milieutechnologie

De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van deze scriptie.

The author and promotors give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject tot the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.

Gent, juni 2015

De promotoren:

Prof.dr.ir. Herman Van Langenhove

dr.ir. Christophe Walgraeve

De auteur:

Fé Van der Elst

Woord vooraf Het werk dat u voor zich heeft is het resultaat van een jaar labo, schrijf- en denkwerk. Een thesis schrijven leert je verschillende dingen. Zo leert het je geduldig zijn en de moed niet te verliezen wanneer een toestel in het labo voor onbepaalde duur stilligt, wanneer je hetzelfde experiment voor de (ik overdrijf niet) 200 e keer uitvoert, wanneer je laptop ineens ‘zijn kuren’ krijgt en je dreigt alles te verliezen want ‘die back-up ging je net maken, ja ja’. Het leert je sociaal en open zijn en het versterkt duidelijk je communicatieve vaardigheden. Een thesis schrijven helpt je om te leren overleggen, te leren plannen en alle hersencellen in je brein tot het uiterste te ontwikkelen en gebruiken, want ja, je wil een meesterwerk afleveren in juni. Eigenlijk leer je jezelf ten voeten uit kennen doorheen dit laatste jaar van deze uiterst interessante studie, en daarbij ook een heleboel nieuwe vrienden waaronder Microsoft Word en Excel, daar sprak ik elke dag mee af! Zo’n werk komt er natuurlijk niet van zelf, daarom wil ik een aantal mensen bedanken. Allereerst dank aan Prof. dr. ir. Herman Van Langenhove voor de vrijheid, het vertrouwen en de op tijd en stond welgekomen wijze raad en ideeën. Verder durf ik zeggen dat ik het ongelofelijk getroffen had met mijn tutor, Dr. ir. Christophe Walgraeve. Altijd te vinden voor een (soms minder) goede grap en frietjes in de Frietketel. Steeds nieuwe ideeën en nieuwe experimenten om me te helpen een zo goed mogelijk werk af te leveren. Alles verliep met een lach op het gezicht, zelfs het voor de vijfde keer lezen van mijn literatuurstudie. Topbegeleider! Dank aan Prof. dr. ir. Van Labeke voor het ter beschikking stellen van haar lab en de assistentie bij het ontwikkelen van de microscopische Taxus baccata preparaten. Een ongelofelijke dankjewel aan de vier ander thesissers bij EnVOC: Lynn, Stefanie, Jonas en Dori. Jonas met zijn net-nog-door-de-beugel-kunnend-kattekwaad en meestal té grappige moppen, Dori met de meest gevatte opmerkingen, Stefanie met haar aanstekelijke lach en speelse jeugdigheid en Lynn met de fantastische eigenschap ‘Bio-ingenieur bestie’, maakten de dagen op EnVOC de aangenaamste van het voorbije jaar. Alexandra en Inez, danku om me op tijd en stond uit het thesiswerk te trekken en me er op te wijzen dat het nachtleven in Gent óók leuk is! En bedankt aan Gert die dit werk heeft zien groeien van baby-alinea tot printklaar boek. Je stond altijd klaar om te lezen, (streng!) te verbeteren en nieuwe input te geven. Het aangename thesisjaar is ook te wijten aan de leuke personeelsgroep op EnVOC. Steeds in de mood voor een fris pintje (of al eens iets straffers) in de Koe na het werk. Bedankt aan de hele EnVOC groep om de thesisstudenten zo fantastisch op te nemen in de groep dankzij allerlei activiteiten en pauzes om 15 u. Mama en papa, een oprechte dankjewel voor jullie zorg, steun en vertrouwen in mijn niet-altijd-evidente keuzes. Amarant(j)e, mijn liefste (en tevens enige) zus, bedankt voor het smeren van mijn boterhammetjes en het afleveren van lekkere dessertjes op EnVOC, als ik weer eens te lang in het lab stond. Jullie zijn helden! Fé Van der Elst Gent, 4 juni 2015

i

Inhoudsopgave 1.

Literatuurstudie ............................................................................................................... 1 1.1. 1.2. 1.3.

Inleiding ................................................................................................................................................ 1 Biomonitoring...................................................................................................................................... 4 Analyse van PAKs en derivaten in plantmatrices .......................................................................... 5 1.3.1. Staalname ............................................................................................................................... 5 1.3.2. Staalvoorbereiding.............................................................................................................. 13 1.3.3. Extractie................................................................................................................................ 15 1.3.4. Extract zuivering ................................................................................................................. 22

1.4.

Scheiding & Detectie ......................................................................................................................... 27 1.4.1. Gas chromatografie ............................................................................................................. 27 1.4.2. Hoge performantie vloeistof chromatografie ................................................................ 27 1.4.3. Detectielimieten .................................................................................................................. 28

1.5.

Concentratieniveau van PAKs in plantspecies ............................................................................. 31

2.

Doelstellingen ................................................................................................................ 37

3.

Materiaal & Methoden .................................................................................................. 39 3.1.

Methodeontwikkeling voor kwantificatie van PAKs en Oxy-PAKs in Taxus baccata bladeren .............................................................................................................................................. 39 3.1.1. Chemicaliën.......................................................................................................................... 39 3.1.2. Standaarden ......................................................................................................................... 41 3.1.3. Analytische sequentie ........................................................................................................ 42 3.1.4. Scheiding & Detectie........................................................................................................... 46

3.2.

Microscopische opname Taxus baccata .......................................................................................... 50 3.2.1. Staalname ............................................................................................................................. 50 3.2.2. Fixatie.................................................................................................................................... 50 3.2.3. Dehydratatie ........................................................................................................................ 50 3.2.4. Snijden .................................................................................................................................. 51 3.2.5. Kleuring ................................................................................................................................ 51

4.

Resultaten & Discussie .................................................................................................. 53 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5.

Microscopische opname Taxus baccata .......................................................................................... 53 Optimalisatie: verhoogde druk vloeistofextractie ....................................................................... 54 Optimalisatie: extract zuivering ..................................................................................................... 63 Geoptimaliseerde methode: Recovery en Matrixeffecten .......................................................... 67 Toepassing: concentratieniveau van PAKs en Oxy-PAKs in Taxus baccata bladeren uit Gent ..................................................................................................................................................... 68

5.

Conclusie ........................................................................................................................ 73

6.

Referenties ..................................................................................................................... 75

iii

Lijst met afkortingen CH DCM DMF D-PAK DSASE EMEP eV FID FLD F-PAK GC GPC HMW HPLC HRGC HRMS ID iLOD LMW LTRAP MAE ME MID mLOD MMW MS Oxy-PAK PAK PFK PLE POPs PTFE PTV REC SCAN SIM SIS SPE TOF UNECE USE US-EPA UV VMM

Cyclohexaan Dichloormethaan Dimethylformamide Gedeuteerde polycyclische aromatische koolwaterstoffen Dynamische ultrasoon geassisteerde solvent extractie Europees monitoring en evaluatie programma Electronvolt Vlam ionisatie detector (Flame Ionisation Detector) Fluorescentie detector (Fluorescence Detector) Gefluoreerde polycyclische aromatische koolwaterstoffen Gas chromatografie Gel permeatie chromatografie (Gel Permeation Chromatography) Hoog moleculair gewicht Hoge performantie vloeistof chromatografie (High Pressure Liquid Chromatography) Hoge resolutie gas chromatografie Hoge resolutie massa spectrometrie Interne diameter Instrumentele detectielimiet Laag moleculair gewicht Long-Range Transboundary Air Pollution Microgolf geassisteerde extractie Matrixeffecten Multiple ion detection Methode detectielimiet Medium moleculair gewicht Massa spectrometer Geoxideerde polycyclische aromatische koolwaterstoffen Polycyclische aromatische koolwaterstoffen Perfluorkerosine Verhoogde druk vloeistof extractie (Pressurized Liquid Extraction) Persistente organische polluenten Polytetrafluorethyleen Programmed Temperature Vaporisator Injector Recovery Scanning mode Single ion monitoring Single ion storage Vaste fase extractie Time- of- flight massa spectrometer United Nations Commission for Europe Ultrasone extractie United States - Environmental Protection Agency Ultraviolet Vlaamse Milieumaatschappij v

Samenvatting Een uitgebreide literatuurstudie over alle in Web of Science geïndexeerde literatuur in de periode 2004-2014 betreffende de kwantificatie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAKs) in plantspecies werd uitgevoerd. PAKs en hun afgeleiden komen in het milieu verspreid voor door de aanwezigheid van tal van verschillende natuurlijke en antropogene bronnen. Deze persistente organische polluenten zijn schadelijk voor mens en milieu. Enkel niet-gesubstitueerde PAKs worden gemonitord in Vlaanderen. Dit betreft een actieve bemonsteringstechniek van fijn stof waarop deze polluenten gesorbeerd zitten. Deze bemonstering is duur, vergt veel tijd en is arbeidsintensief. Een alternatieve techniek t.o.v. de conventionele technieken is biomonitoring. Plantspecies worden hierbij aangewend om een indicatie te geven van de concentratie van polluenten in de lucht. Vluchtige polluenten worden geabsorbeerd, terwijl minder vluchtige polluenten door fysische depositie op de plant worden afgezet, hierdoor kunnen beide groepen gemonitord worden bij analyse van plantmateriaal. Een analytische methode voor de extractie en kwantificatie van 16 prioritaire USEPA polycyclische aromatische koolwaterstoffen én 12 geoxideerde polycyclische aromatische koolwaterstoffen in Taxus baccata bladeren werd in deze masterthesis ontwikkeld en geoptimaliseerd. Dit is de eerste methode die zowel PAKs als Oxy-PAKs samen kan kwantificeren in een plantspecies. Een verhoogde druk vloeistofextractie werd aangewend met dichloormethaan als extractiesolvent. De extractietemperatuur (50-100-150-200 °C) en de mogelijkheid tot in-cell clean-up met Florisil (0-15-7,5 g) werden geëvalueerd. Op basis van recovery en matrixeffecten werd een extractietemperatuur van 200 °C en 1 g Florisil in de cel geselecteerd als optimale conditie. Als opzuiveringsstap werd een elutie over een vaste fase extractie cartridge van 2 g Florisil geselecteerd. Deze elutie kon niet uitgevoerd worden met dichloormethaan wegens het optreden van doorbraak van interfererende matrixcomponenten.

Experimenten

maakten

duidelijk

dat

een

elutie

met

30

mL

dichloormethaan:cyclohexaan in een 1:1 verhouding over een vaste fase extractie cartridge van 2 g Florisil geen doorbraak en aanvaardbare recoveries opleverde. Dit gezuiverde extract werd geanalyseerd m.b.v. GC-HRMS. Recoveries van 61 % (fluoreen) tot 95 % (naftaleen) voor PAKs en van 6 % (1,8-naftaleenzuuranhydride) tot 88 % (antraceen-9,10-dion) voor Oxy-PAKs werden bekomen. Matrixeffecten werden bepaald en lagen voor PAKs in een bereik van 75 % (benzo[a]pyreen) tot 214 % (acenaftyleen) en varieerden voor Oxy-PAKs van 78 % (10H-antraceen-9-on) tot 248 % (naftaleen-1,4dion). De eerste biomonitoringstudie in Gent werd uitgevoerd. Zes stalen op zes verschillende locaties werden verzameld en geanalyseerd m.b.v. de optimale methode. Het concentratieniveau over de zes sites varieerde van 146 ng/g dw tot 298 ng/g dw voor PAKs en van 105 ng/g dw tot 678 ng/g dw voor Oxy-PAKs. Methodedetectielimieten lagen in een bereik van 0,03 ng/g dw tot 6,98 ng/g dw. De aanwezigheid van een significante hoeveelheid Oxy-PAKs wordt aldus bevestigd. Dit betekent dat Oxy-PAKs zouden moeten worden opgenomen in luchtpollutiemetingen. De emissiebron van de 16 US-EPA PAKs werd achterhaald m.b.v. diagnostische ratio’s. Deze ratio’s toonden aan dat de doelcomponenten van pyrogene oorsprong zijn en dat verkeersemissies een sterke bijdrage leveren.

vii

Abstract First of all, a profound literature study was conducted of all literature, concerning the quantification of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in plantspecies. Only studies indexed in the Web of Science library in the period 2004-2014 were considered. PAHs and their derivatives are widespread in the environment due to the presence of diverse natural and anthropogenic sources. These persistent organic pollutants are harmful for the environment as well as for humans. In Flanders, only non-substituted PAHs are monitored on particulate matter. High volume sampling of particulate matter is expensive, time consuming and labour intensive. An alternative with respect to the conventional techniques is biomonitoring. Hereby, plant species are applied to give an indication about pollutant concentrations in the atmosphere. Volatile pollutants are absorbed, while less volatile compounds are physically deposited on the plant surface. An analytical method for the extraction and quantification of 16 priority US-EPA PAHs and 12 oxygenated PAHs in Taxus baccata leaves was developed and optimized in this thesis. This is the first method ever developed, which is able to quantify PAHs and Oxy-PAHs in a plant species at the same time. Pressurized liquid extraction (PLE) with dichloromethane as extraction solvent was applied. Different extraction temperatures (50-100150-200 °C) and the possibility for in-cell clean-up with Florisil (0-1-5-7.5 g) were evaluated. Based on recovery and matrix effects, an extraction temperature of 200 °C using 1 g Florisil in the cell was selected as optimal condition. For the purification step, elution over a solid phase extraction cartridge of 2 g Florisil was selected. This elution couldn’t be executed with dichloromethane as eluens because of the appearance of breakthrough of the interfering matrix compounds. No breakthrough and acceptable recoveries were found when using 30 mL dichloromethane:cyclohexane (1:1) as eluens. This purified extract was analysed with GC-HRMS. Recoveries of 61 % (fluorene) to 95 % (naphtalene) for PAHs and of 6 % (1,8-naphtalic anhydride) to 88 % (antracene-9,10-dion) for Oxy-PAHs were found. Matrix effects were determined and varied for PAHs from 75 % (benzo[a]pyrene) to 214 % (acenaphtylene) and ranged from 78 % (10H-antracene-9-on) to 248 % (naphtalene-1,4-dion) for OxyPAHs. The method was applied for different Taxus baccata samples from 6 sampling locations in Ghent (First biomonitoring study in Ghent). The concentration level for the six sites varied from 146 ng/g dw to 298 ng/g dw for PAHs and from 105 ng/g dw to 678 ng/g dw for Oxy-PAHs. Method LODs ranged from 0.03 ng/g dw to 6.98 ng/g dw. The presence of significant amounts of Oxy-PAHs in Taxus baccata was consequently confirmed. This means that these oxygenated PAHs should be monitored in airpollution studies as well. Diagnostic ratio’s showed the 16 US-EPA PAHs were the result of pyrogenic processes and traffic emissions in particular.

ix

1. Literatuurstudie PAKs en Oxy-PAKs hebben carcinogene eigenschappen en worden verspreid in het milieu. Wegens hun persistentie en bioaccumulatiepotentieel is het van belang de verspreiding van deze componenten in kaart te brengen. Conventionele bemonstering kan hiervoor aangevuld worden met biomonitoring als complementaire techniek. Deze literatuurstudie geeft een algemeen overzicht van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAKs) en geoxideerde PAKs (Oxy-PAKs). De emissiebronnen, fysicochemische eigenschappen en de Europese wetgeving rond PAKs worden besproken. Het belang van biomonitoring met voor- en nadelen wordt toegelicht. Een uitgebreide literatuurstudie van in Web of Science geïndexeerde wetenschappelijke literatuur (2004 – 2014) over de bepaling van PAKs in plantmateriaal werd uitgevoerd. De verschillende stappen in het analytisch proces: staalname, staalvoorbereiding, extractietechniek, zuiveringsstap, scheiding en detectie worden in detail besproken. De concentratieniveaus van PAKs in planten worden besproken. Literatuur over Oxy-PAKs in plantmateriaal werd echter niet teruggevonden.

1.1.

Inleiding

Polycyclische aromatische koolwaterstoffen zijn een belangrijke klasse van persistente organische polluenten (POPs). Ze bestaan uit minstens twee geanneleerde benzeenringen. PAKs hebben door de jaren heen aan belang gewonnen als gevolg van hun schadelijke effecten op mens en milieu. Zowel individueel als in een mengsel staan ze gekend om hun carcinogene en mutagene eigenschappen (Byeong-Kyu, 2010). Het United States Environmental Protection Agency (US-EPA) heeft 16 PAKs vooropgesteld als prioritair te onderzoeken: naftaleen, acenaftyleen, acenafteen, fluoreen, fenantreen, antraceen, fluoranteen, pyreen, benzo[a]antraceen, chryseen, benzo[b]fluoranteen, benzo[k]fluoranteen, benzo[a]pyreen, dibenz[ah]anthraceen, benzo[ghi]peryleen en indeno[1,2,3cd]pyreen. Acht hiervan worden door het US-EPA erkend als mogelijk carcinogeen: benzo[a]antraceen,

chryseen,

benzo[b]fluorantheen,

benzo[k]fluorantheen,

benzo[a]pyreen,

dibenzo[ah]antraceen, indeno[1,2,3-cd]pyreen en benzo[ghi]peryleen (Harmens et al., 2013). Hiervan verdient benzo[a]pyreen de meeste aandacht, daar deze sterkst carcinogeen is (Wang et al., 2002). De bronnen van PAKs kunnen zowel van antropogene als natuurlijke oorsprong zijn (Harmens et al., 2013). Vulkaanuitbarstingen, bosbranden en degradatie van organisch materiaal dragen bij tot de natuurlijke verspreiding van PAKs in het milieu (Augusto et al., 2010; Byeong-Kyu, 2010). Deze processen dragen slechts voor een klein deel bij aan de totale emissie van PAKs (Boitsov et al., 2009). Voornamelijk antropogene bronnen dragen bij tot hun verspreiding in het milieu. PAKs worden gevormd tijdens onvolledige verbranding van vb. biomassa of chemische producten. Industriële activiteiten omvatten primaire verwerkingsprocessen, onvolledige verbranding en pyrolyse van organische materialen (Doiegowska and Migaszewski, 2011). Verkeersemissies zijn een belangrijke bron. 1

PAKs hebben een lage wateroplosbaarheid en zijn sterk lipofiel. Wanneer ze in het milieu terechtkomen verdelen ze zich tussen de gas- en deeltjesfase afhankelijk van hun moleculair gewicht. Drie groepen kunnen onderscheiden worden: vluchtige, semi-vluchtige en niet-vluchtige PAKs. PAKs met een laag moleculair gewicht (tussen 128 (naftaleen) en 178 g/mol (antraceen)) bevinden zich voornamelijk in de gasfase (Palm et al., 2011). Deze bestaan uit twee of drie geanneleerde benzeenringen. Deze PAKs kunnen zich over lange afstanden verplaatsen in de atmosfeer vanwege hun hoge dampspanning. (Cabrerizo et al., 2012). Deze dampspanning varieert van 11,33 Pa (naftaleen) tot 0,016 Pa (fluoreen) (National Center for Biotechnology Information, 2015). PAKs met een hoog moleculair gewicht (tussen 252 (benzo[b]fluoranteen) en 278 (dibenz[ah]antraceen) g/mol) zullen zich voornamelijk binden aan stofdeeltjes (< 10 µm) en zijn aldus niet-vluchtig (Palm et al., 2011). Deze bestaan uit 5 tot 7 geanneleerde aromatische ringen. Afhankelijk van de atmosferische condities worden deze stofdeeltjes traag afgezet of getransporteerd over lange afstanden. Op deze laatste manier kunnen afgelegen gebieden gecontamineerd raken met deze polluenten (Srogi, 2007). PAKs met een gemiddeld moleculair gewicht, dit is een gewicht van 202 g/mol (fluoranteen) tot 228 g/mol (chryseen) (Palm et al., 2011), verdelen zich tussen beide fasen en zijn aldus semi-vluchtig (Sienra et al., 2005). Deze bestaan uit vier geanneleerde aromatische ringen. Hun verdeling in de atmosfeer is afhankelijk van de atmosferische condities (Srogi, 2007). Algemeen kan gesteld worden dat PAKs meer lipofiel, minder water oplosbaar en minder vluchtig worden met toenemend moleculair gewicht (Goldfard and Suuberg, 2008; Zohair et al., 2006). In de atmosfeer nemen PAKs deel in allerlei reacties. Primaire PAKs kunnen een biologische transformatie, foto-oxidatie of chemische oxidatie met hydroxyl- en NO3-radicalen, N2O5 en ozon ondergaan. Op deze manier worden de primaire species omgevormd naar meer polaire secundaire species zoals Oxy-PAKs en nitro-PAKs (Jariyasopit et al., 2014). Oxy-PAKs en nitro-PAKs worden tevens gevormd bij een onvolledige verbranding. Oxy-PAKs worden gedefinieerd als PAKs met één of meerdere carbonylgroepen gesubstitueerd op de benzeenringen. In sommige gevallen kunnen eveneens alkylgroepen en hydroxylgroepen aanwezig. De additie van een van deze functionele groepen zorgt ervoor dat de dampdruk van deze Oxy-PAKs lager is dan deze van de primaire PAK (Goldfard and Suuberg, 2008). Dankzij de aanwezigheid van de carbonylgroep zijn Oxy-PAKs meer polair, minder lipofiel en meer water oplosbaar dan PAKs. Dit betekent dat ze een verhoogde mobiliteit in het milieu kennen. Hierdoor kunnen ze zich gemakkelijker verspreiden in de omgeving evenals hun risico op schadelijke effecten. Dit wordt aangetoond door de octanol-water partitiecoëfficiënt Kow van Oxy-PAKs en nietgesubstitueerde PAKs te vergelijken (Lundtsted et al., 2007). Deze Kow is een maat voor het lipofiel karakter van een component. Hoe hoger deze waarde, hoe lipofieler de component (Tabel 1). Tabel 1: Log(Kow) waarde van enkele prioritair te onderzoeken niet-gesubstitueerde PAKs en geoxideerde PAKs (Lundtsted et al., 2007). PAK

Log(Kow)

Oxy-PAK

Log(Kow)

Acenafteen

3,92

Acenafteen-1-on

2,79

Acenaftyleen

3,94

Acenaftyleen-1,2-dion

1,95

Fluoreen

4,18

9H-Fluoreen-9-on

3,58

Antraceen

4,45

Antraceen-9,10-dion

3,39

2

Als gevolg van hun toxiciteit, bioaccumulatiepotentieel en persistentie in het milieu zijn PAKs, samen met een hele reeks andere POPs, opgenomen in de Convention on Long-Range Transboundary Air Pollution (LRTAP, Augusto et al., 2013; Harmens et al., 2013; LRTAP, 1998). Hierin staat dat deze onopzettelijk geproduceerd worden en hun emissies gereduceerd moeten worden. Deze LRTAP Conventie geldt enkel voor de United Nations Commission for Europe (UNECE). UNECE omvat 50 landen waaronder voornamelijk Europese en Canada en de Verenigde Staten van Amerika. In Europa worden de emissies en afzetting van POPs opgevolgd door het European Monitoring and Evaluation Programme (EMEP). De EMEP heeft modellen opgesteld tot het bepalen van de concentratie van POPs in lucht, het transport en de depositie uit de atmosfeer. Actieve bemonsteringstechnieken werden aangewend ter validatie van deze modellen (Harmens et al., 2013). Van de zestien prioritair te onderzoeken componenten is benzo[a]pyreen de enige die gereguleerd wordt door het Europese Directive 2004/107/EC. De atmosferische concentratie van deze component mag maximaal 1 ng/m³ bedragen (Europese Unie, 2004). In Vlaanderen wordt de concentratie benzo[a]pyreen in de omgevingslucht opgevolgd door de Vlaamse Milieumaatschappij (VMM). In het jaarrapport van 2013 staat vermeld dat op geen enkele meetpost dit jaargemiddelde van benzo[a]pyreen (1 ng/m³) overschreden werd. Figuur 1 geeft de trend weer van concentratie PAKs in omgevingslucht, gemonitord door de VMM, sinds 2000 t.e.m. 2012 (Vlaamse Milieumaatschappij, 2013). De doelstelling van 2012, < 1 ng/m³, is reeds behaald. Er bestaan nog geen reguleringen rond Oxy-PAKs. Hierdoor worden ze zo goed als niet onderzocht in monitoringstudies en risicokarakterisatiestudies. Daar Oxy-PAKs schadelijke effecten hebben op mens en milieu zouden deze componenten wel moeten worden opgenomen in deze studies. Deze schadelijke effecten omvatten het induceren van oxidatieve stress, endocriene verstoringseffecten, genotoxische effecten en cytotoxische effecten in zoogdieren. Deze effecten kunnen schadelijker zijn dan deze veroorzaakt door de primaire PAK (Wei et al., 2015). Het meest alarmerende schadelijke effect is hun mutagene werking in zowel cellen van zoogdieren als bacteriën (Lundtsted et al., 2007).

Figuur 1: PAK concentratie in de omgevingslucht in Vlaanderen, gemonitord door de Vlaamse Milieumaatschappij in de periode 2000 - 2011. * Geen methodologisch vergelijkbare metingen in 2010 en 2011; ** vanaf 2009 geen metingen in Aarschot maar in Houtem (Aarschot is niet langer als achtergrond te beschouwen, Houtem wel). Aangepaste Figuur uit het Jaarrapport van 2013 over PAKs van de VMM (Vlaamse Milieumaatschappij, 2013).

3

1.2.

Biomonitoring

De conventionele bemonsteringstechniek van polluenten als PAKs in omgevingslucht betreft een actieve bemonstering. Hiervoor wordt een high volume sampler aangewend die aan een bepaald debiet (0,5 – 1 m³/min) lucht aanzuigt. Na zo’n 24 u bemonsteren is een voldoende hoeveelheid stof gecollecteerd om de componenten te kwantificeren m.b.v. een analytische methode. Tevens vereist dit toestel veel onderhoud, is het duur en is de bemonstering een tijdsintensief werk (Foan et al., 2010; Noth et al., 2013). Daarom is het moeilijk om dergelijke meetstrategieën aan te wenden om inzicht te verkrijgen in de geografische spreiding van polluenten in een bepaalde regio. Het gebruik van planten als biomonitoringspecies kan een alternatieve bemonsteringstechniek zijn. Deze passieve monitoring is minder tijdsintensief (het vergaren van het plantenmateriaal), vereist geen pompen en onderhoudswerk, is goedkoop en kan overal toegepast worden (Foan and Simon, 2012; Foan et al., 2010). De opnameprocessen van polluenten zorgen ervoor dat planten de ideale manier zijn om een beeld te vormen van de spatiale verdeling van deze componenten (Noth et al., 2013). Het concentratieniveau van zowel PAKs als Oxy-PAKs in het plant species geeft een indicatie van de blootstelling. Accumulatie van PAKs in planten is afhankelijk van de fysicochemische eigenschappen van de component zelf, van het plantspecies en van de omgevingsomstandigheden. Zo spelen meteorologische condities (relatieve vochtigheid van de atmosfeer, de temperatuur, regenval) en atmosferische stabiliteit een rol. Verschillende plantspecies hebben verschillende kenmerken: aantal huidmondjes, al dan niet aanwezig zijn van haren en de oppervlaktewaslaag op de bladeren. Bepaalde plantspecies hebben aldus betere eigenschappen voor het accumuleren van specifieke POPs (SanzLandaluze et al., 2010). Daar PAKs hydrofobe stoffen zijn, accumuleren ze in lipofiele weefsels. Een groot deel van alle planten heeft een relatief groot bladoppervlak bedekt met een lipofiele waslaag. De primaire route waarlangs PAKs planten binnentreden is via depositie van partikels uit lucht op het blad, gevolgd door absorptie in de waslaag of opname via de huidmondjes en verdere translocatie via het floeëm (Sanz-Landaluze et al., 2010). Componenten die zich in de gasfase bevinden, (LMW componenten) kunnen direct geabsorbeerd worden en diffunderen naar de binnenstructuur van de naald, terwijl de partikelgebonden PAKs accumuleren op het naaldoppervlak. Regenval en wind kunnen ervoor zorgen dat een deel van deze geabsorbeerde en op het oppervlak gebonden componenten verwijderd worden uit het plantmateriaal (Lehndorff and Schwark, 2004). Bij bepaalde boomsoorten kan PAK opname via de wortels echter een significant deel uitmaken van de totale PAK concentratie (De Nicola et al., 2013b). De vetrijke waslaag kent evenwel een nadeel bij de captatie van PAKs daar een hoge vetconcentratie de analyse van de stalen bemoeilijkt (Sanz-Landaluze et al., 2010). Biomonitoring van planten is een complementaire manier die bodem- en luchtanalyses aanvult (Augusto et al., 2013). De uitdaging is het vinden van een geschikte methode om deze componenten uit het plantspecies te kwantificeren. Hierop wordt uitvoerig ingegaan in Sectie 3.

4

1.3.

Analyse van PAKs en derivaten in plantmatrices

1.3.1. Staalname In 1866 werd een van de eerste studies gepubliceerd over het gebruik van mossen als bio-indicator van de atmosferische luchtkwaliteit (Nylander, 1866). Sindsdien kent het gebruik van planten als biomonitoringmedium verschillende toepassingen. Biomonitoring met planten wordt ondertussen uitgevoerd over de hele wereld. Er wordt steeds gekozen voor een plantspecies dat veelvoorkomend is in de geselecteerde regio. Dit zijn zowel terrestrische bomen, mossen en grassen als aquatische mossen. Tabel 2 geeft een overzicht van alle terrestrische plantspecies die gebruikt zijn in biomonitoringstudies in de periode 2004-2014 (70 studies). In 41 % van de onderzochte studies werd gebruik gemaakt van Pinus species (Gorshkov, 2008; Hwang and Wade, 2008; Lehndorff and Schwark, 2004; Liu et al., 2006; Noth et al., 2013; Piccardo et al., 2005; Ratola et al., 2010a, 2010b, 2009, 2006, 2012, 2011a, 2011b, 2011c; Rodriguez et al., 2012; Sun et al., 2010; Tian et al., 2008; Tomashuk et al., 2012). De aanwezigheid van een waslaag op de naalden bevordert de accumulatie van PAKs. Er kan een onderscheid gemaakt worden in de concentratie PAKs in de buitenste waslaag, in de binnenstructuur van de naald of in de volledige naald. De PAKs die zich bevinden in de buitenste waslaag van het blad zijn meer onderhevig aan fotolyse en fotodegradatie vergeleken met de PAKs in de binnenstructuur van de naald. De PAK concentratie in de binnenstructuur van de naald (kan bepaald worden na verwijderen buitenste waslaag) is de minst variabele concentratie. Er kan tevens een onderscheid gemaakt worden tussen de ouderdom van de dennennaalden. De naald kan jong zijn, i.e. jonger dan 1 jaar, 2 jaar oud of 3 jaar oud. Wanneer driejarige naalden vergeleken worden met tweejarige naalden wordt vastgesteld dat de oudere naalden een hogere PAK concentratie bevatten (Lehndorff and Schwark, 2009; Piccardo et al., 2005). Dit wordt verklaard door het langer accumuleren van PAKs gedurende het levensverloop van de naald (Ratola et al., 2011a). Dit moet echter genuanceerd worden door de eventueel nadelige effecten van oudere naalden. Zo kan het zijn dat bij oudere naalden reeds een deel van hun cuticula (waslaag) afgebroken of zelfs ‘verdwenen’ is waardoor verlies van PAKs kan optreden en aldus een lagere concentratie PAKs waargenomen wordt ten opzicht van jongere naalden. Tevens speelt de gezondheid van de naald een rol. Daar de natuurlijke functie van een waslaag het beschermen van de plant tegen droogte, UV straling en infecties is, kan het optreden van droogte of de aanwezigheid van schimmels leiden tot een reductie van de concentratie PAKs. Natuurlijke veroudering van de naald induceert hetzelfde effect. Daarom kan het zijn dat een oud en eventueel ziek blad een lagere concentratie PAKs bevat dan een jong, gezond blad. Piccardo et al. (2005) stelt vast dat naalden van eenzelfde leeftijd geselecteerd moeten worden. Tevens wordt vastgesteld dat 1 jaar oude naalden meest geschikt zijn om biomonitoring mee uit te voeren, daar ze minder vatbaar zijn voor ziektes en ze slechts een jaar seizoensgebonden variaties integreren. Een andere factor die vaak in rekening gebracht wordt is de hoogte waarop de naalden/mossen geplukt worden. Het mos Hypnum cupressiforme werd in zo’n 10 % van de studies gebruikt (De Nicola et al., 2013a; Domeno et al., 2012; Foan and Simon, 2012; Foan et al., 2010; Holoubek et al., 2007; Krommer et al., 2007; Otvos et al., 2004). Daar mossen geen wortelsysteem hebben, nemen ze alle nutriënten op uit 5

de atmosfeer. Dit gebeurt aan de hand van zowel natte als droge depositie. Omdat mossen geen waslaag hebben kunnen ionen gebonden worden aan de anionische polysachariden in de celwand (De Nicola et al., 2013b). Hun hoge kationuitwisselingscapaciteit en hoog specifiek oppervlak bevorderen de opname van atmosferische polluenten sterk. Er is gebleken dat H. cupressiforme een sterkere PAK accumulatie kent dan andere mos species door het aanwezig zijn van biflavonoïden, fenyl gesubstitueerde aromadendrine derivaten en kaemferol. Deze componenten kennen een grote affiniteit voor PAKs (Otvos et al., 2004). Spar species (Picea species) werden aangewend in 7 % van de onderzochte studies (Howe et al., 2004; Ratola et al., 2011a; St-Amand et al., 2008; Zhu et al., 2008). Quercus ilex (bladbehoudend) werd gebruikt in zo’n 10 % van de studies (Alfani et al., 2005; De Nicola et al., 2013a, 2013b, 2011, 2008, 2005; Orecchio, 2007). De Nicola et al. (2011) stelden vast dat de ouderdom van het blad van Q. ilex L. geen invloed heeft op de concentratie PAKs. De andere species vermeld in Tabel 1 worden in minder dan 1 % van de studies gebruikt.

6

7

Gemiddelde vervuiling Landbouwgebied Verschillende sites langs Aojiang riviër Oktober 2007 Tropisch regenwoud

NB

Landbouwgebied Landbouwgebied Landbouwgebied Landbouwgebied Na industriële brand Thermische energiefabriek Biologische boerderij Gemiddelde vervuiling NB Landbouwgebied Gemiddelde vervuiling Landbouwgebied NB Biologische boerderij Stedelijk gebied Gemiddelde vervuiling

China China China Brazilië Engeland Spanje Spanje China

China China China China Spanje India Engeland Nigeria Antarctica China China China Antarctica Engeland NB China

Acacia mangium Wild.

Apium graveolens

Artemisia santolina Schrenk

Attalea attaleoides

Autumn Kings carrot (Apiaceae)

Barley (Poaceae)

Beta vulgaris

Black tea

Brassica juncea

Brassica oleracea

Brassica rapa

Brassica rapa (Pekinensis groep)

Cabbage (Brassicacea)

Calotropis gigantea R. BR.

Cara potato (Solanaceae)

Citrullus colocynthis

Colobanthus quitensis

Corandrum sativum

Cunninghamia lanceolata Lamb.

Daucus carota

Deschampsia antarctica

Desiree potato (Solanaceae)

Eriobotrya japonica

Eucalyptus citriodora Hook.

NB Residentieel, stedelijk en industriëel gebied

Biologische boerderij

Gemiddelde vervuiling

China

Acacia auriculaeformis A. Cunn. Ex. Benth.

(Krommer et al., 2007)

Referentie

(Tao et al., 2004)

(Cabrerizo et al., 2012)

(Sojinu et al., 2010)

(Zohair et al., 2006)

(Sharma and Tripathi, 2009)

(Rey-Salgueiro et al., 2008)

(Tao et al., 2004)

(Tao et al., 2004)

(Tao et al., 2004)

(Tao et al., 2004)

(Lin and Zhu, 2004)

(Nadal et al., 2004)

(Sanchez-Brunete et al., 2008)


(Krauss et al., 2005)

(Li et al., 2010)

(Tao et al., 2004)

(Sanz-Landaluze et al., 2010)



(Tao et al., 2004)

Maart- Juni - September- December 2006 (Tian et al., 2008)

NB

NB

Februari 2005 en 2009

September 2002


September 2002


April-Juli

NB

Augustus 2006

September 2006

September 2002

September 2002

September 2002

September 2002

NB

Januari 2002

Oktober 2005 - September 2006

NB

2001 september

September 2002



September 2005

Wienerwald

Oostenrijk

Abietinella abietina

Periode

Karakteristiek staalnameregio

Plaats

Vegetatie

Tabel 2: Staalnamekarakteristieken van 71 studies in de periode 2004-2014. NB = Niet Beschikbaar

Mangifera indica

Major carrot (Apiaceae)

Maize (Poaceae)

Loreya spruceana

Lolium multiflorum

Leptodon smithii

Laguncularia racemosa

Kestrel potato (Solanaceae)

Isothecium myosuroides Brid.

Hypnum plumaeformae

Hypnum cupressiforme Hedw.

Hypnum cupressiforme Hedw.

Hypnum cupressiforme





Hylocomium splendens (Hedw.) B.S.G.



Hylocomium splendens

Green tea; Mate-tea; Black tea; Herbal and fruit tea; White tea

Grape

Ficus benghalensis

Evernia prunastri

Eucalyptus rostrata

Vegetatie

Nigeria

Engeland

Spanje

Brazilië

Brazilië

Italië

NB

Engeland

Spanje

China

Spanje

Spanje

Hongarije

Oostenrijk

Tsjechië

Spanje

Italië

Oostenrijk

Polen

Polen

Polen

NB

Spanje

India

Spanje

Argentinië

Plaats



Na industriële brand

Tropisch regenwoud

Intens vervuilde site

Verschillende sites

Industriële site


Natuurreservaat

Bergketen

Natuurreservaat

Natuurreservaat

Verschillende sites

Wienerwald

Verschillende sites

Bos; open plaatsen

Urban street canyon

In en rond een drukke tunnel

Verschillende sites

Bergketen

Bebost gebied

NB


Stad

Natuur, geen industriegebied

Nabij aluminium smelterij


April-Juli

NB

September 2006

September 2001

April 2009 - Januari 2010

Mei 2009

NB

NB

Juni 2010

Januari 2003

Juni 2010

1879-1881; 1973-1975; 2006-2007

September - November 1997

September 2005

Augustus 1996 -2005

Zomer 2008

Juni 2010 en April 2004

September en Oktober 2003

Juli 2008

Juli 2007

Juli 2005

NB

September 2006

Augustus 2005; Januari en Mei 2006

Lente - herfst 2004

Februari 2010

Periode





(Rinaldi et al., 2012)

(De Nicola et al., 2013b)



(Foan and Simon,. 2012)

(Liu et al., 2005)

(Foan and Simon, 2012)

(Foan et al., 2010)

(Otvos et al., 2004)


(Holoubek et al., 2007)

(Domeno et al., 2012)

(De Nicola et al., 2013a)

(Zechmeister et al., 2006)

(Doiegowska and Migaszewski, 2011)

(Migaszewski et al., 2009)

(Galuszka, 2007)

(Ziegenhals et al., 2008)


(Prajapati and Tripathi, 2008)

(Blasco et al., 2008)

(Rodriguez et al., 2012)

Referentie

8

9

Gemiddelde vervuiling Tropisch regenwoud Gemiddelde vervuiling Tropisch regenwoud Biologische boerderij Tropisch regenwoud Gemiddelde vervuiling Verschillende sites Gemiddelde vervuiling NB Tropisch regenwoud Rijstveld

Na industriële brand Tropisch regenwoud Verkeerstunnel Verschillende sites Geindustrialiseerde regio Stad Verschillende sites Gemiddelde vervuiling Kruispunten

Verbrandingskamer Verschillende sites Verschillende sites Verschillende sites Verschillende sites Verschillende sites

Nigeria Brazilië Nigeria Brazilië Engeland Brazilië Nigeria Palermo Nigeria Canada Spanje Brazilië China

Spanje Brazilië Frankrijk; Spanje Pyreneeën Portugal Spanje Portugal Nigeria India

Duitsland Alaska Alaska Alaska Kreta Spanje

Manihot esculenta

Miconia tormentosa

Mimosa pudica

Myrcia sp.

Nairobi carrot (Apiaceae)

Naucleopsis ternostroemiiflora

Nephrolepsis bisserata

Nerium oleander L.

Newboulda laevis

Norway spruce needles (Pinaceae)

Oat (Poaceae)

ocotea floribunda

Oryza sativa

Padron type pepper

Parkia decussata

Parmelia sulcata

Parmelia sulcata

Parmotrema hypoleucinum

Parmotrema hypoleucinum

Pcea abiës

Pennisetum purpureum

Phaeophysica hispidula Essl.

Picea abiës

Picea glauca

Picea mariana

Picea sitchensis

Pinus brutia

Pinus halepensis

Verschillende sites


Plaats

Vegetatie

Oktober 2006

Juli 2007

Mei 1997

Mei 1997

Mei 1997

Juni - Juli 2006

vrijdag 15 september 2006

April-Juli

Januari 2008

Lente 2004

Januari 2008

Lente 2004

April - Oktober 2004

September 2001

September 2006

September en Oktober 2003

September 2001


Juni 2004 - Juni 2005

April-Juli

Winter 2001

April-Juli

September 2001

NB

September 2001

April-Juli

September 2001

April-Juli

Periode

(Ratola et al., 2012)

(Ratola et al., 2011a)

(Howe et al., 2004)

(Howe et al., 2004)

(Howe et al., 2004)

(Zhu et al., 2008)

(Shukla and Upreti, 2009)


(Augusto et al., 2009)







(Tao et al., 2006)


(Sanchez-Brunete et al., 2008)

(St-Amand et al., 2009)

(Sojinu et al. 2010)

(Orecchio et al., 2005)








Referentie

Pleurozium schreberi

Pinus taeda

Pinus sylvestris L.

Pinus strobus

Pinus silvestris; Picea abies

Pinus radiata

Pinus pinea; Pinus pinaster

Pinus pinea L.

Pinus pinea

Pinus pinea

Pinus pinea

Pinus pinea

Pinus pinea

Pinus pinaster

Pinus pinaster

Pinus pinaster

Pinus pinaster

Pinus pinaster

Pinus pinaster

Pinus nigra

Pinus nigra

Pinus nigra

Pinus nigra

Pinus massoniana Lamb.

Pinus massoniana Lamb

Pinus massoniana L.

Pinus jeffreyi

Vegetatie

Polen

USA

Schotland

USA

Tsjechië

Argentinië

Portugal

Barcelona; Portugal

Portugal

Portugal

Portugal; Spanje

Spanje

Portugal

Portugal

Portugal

Portugal

Italië

Portugal; Spanje

Italië

USA

Italië

Spanje

Duitsland

China

China

China

Italië

Plaats

Bebost gebied

Verschillende sites

Verschillende sites

NB

Verschillende sites

Nabij aluminium smelterij

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

NB

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

NB

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

NB

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites


Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites


Juli 2005

Augustus 1999 - Juli 2000

NB

Augustus 2009 - Maart 2010

Augustus 1996 -2005

Februari 2010

2007

NB

April 2007

2007

NB

Oktober 2006

Januari 2008

April 2007

2007

2007

2007

NB

Augustus 1997

Augustus 2009 - Maart 2010

Augustus 1997

Oktober 2006

Juni - December 2002

Februari 2008

Periode

(Hwang and Wade, 2008)

(Gorshkov, 2008)

(Tomashuk et al., 2012)



(Ratola et al., 2011b)


(Ratola in al., 2010b)

(Ratola et al., 2011c)


(Navarro-Ortga et al., 2012)







(Piccardo et al., 2005)



(Navarro-Ortga et al., 2012)

(Lehndorff and Schwark, 2004)

2001-2002 (Liu et al., 2006) Maart- Juni - September- December (Tian et al., 2008) 2006

Juli 2008

(Galuszka et al., 2007)

(Sun et al., 2010)

(Noth et al., 2013)

Referentie

10

11

Nabij aluminium smelterij Tropisch regenwoud

Argentinië Brazilië

Brazilië Antarctica Spanje Brazilië Brazilië Italië Italië

Populus hybridus Pourouma cuspidata

Pourouma ferruginea

Prasiola crispa

Pseudoscleropodium purum

Psidium guajava

Psychotria medusula

Quercus ilex

Quercus ilex L.

Italië Italië Italië Italië NB Brazilië Antarctica Oostenrijk Brazilië

China Brazilië Brazilië Brazilië Spanje Spanje

Quercus ilex L.

Quercus ilex L.

Quercus ilex L.

Quercus ilex L.

Rhizophora mangle

Rinorea racemosa

Sanionia uncinata

Scleropodium purum

Socratea exorrhiza

Spinacia oleracea

Swartia ulei

Swartzia cuspidata

Terminalia catappa L.

Thamnobryum alopecurum Hedw. Ganulee

Thuidium tamariscinum Hedw.

Italië

Nationale parken

Alaska

Pleurozium schreberi (Brid.) Mitt.

Quercus ilex L.

Verschillende sites

Polen

Pleurozium schreberi (Brid.) Mitt.

Natuurreservaat

Natuurreservaat

Stadscentrum

Tropisch regenwoud

Tropisch regenwoud

Landbouwgebied

Tropisch regenwoud

Wienerwald

NB

Tropisch regenwoud

Industriële site

Urban street canyon

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

Verschillende sites

Tropisch regenwoud


Verschillende sites

NB

Tropisch regenwoud


Plaats

Vegetatie




(Ares et al., 2009)







Referentie

1879-1881; 1973-1975; 2006-2007

1879-1881; 1973-1975; 2006-2007

NB

September 2001

September 2001

September 2002

September 2001

September 2005


September 2001

NB

Juni 2010 en April 2004

Zomer

Mei 2005

(Foan et al., 2010)

(Foan et al., 2010)

(Pereira Netto et al., 2007)



(Tao et al., 2004)








(De Nicola et al., 2011)

Mei 2001 - Sept 2002 (Alfani et al., 2005) Mei - September 2001 en Januari (De Nicola et al., 2005) Mei 2002 Februari 2005 en 2009 (De Nicola et al., 2008)

Mei 2009

September 2001


2004; 2008; 2002


September 2001

September 2001

Februari 2010

Augustus 2007

Juli 2008

Periode

Zea mays

Xanthoria pariëtina Ylopia nitida

Wheat (Poaceae)

Valour potato (Solanaceae) Vismia cayennensis

Usnea antarctica

Tomato (Solanaceae)

Tillandsia usneoides L.

Tillandsia capillaris

Vegetatie Tibouchina pulchra

Nigeria

Brazilië

Spanje

Spanje

Brazilië

Engeland

Antarctica

Spanje

Brazilië

Duitsland

Brazilië

Plaats


Tropisch regenwoud

Stad

NB

Tropisch regenwoud


NB


Verschillende sites

Verschillende sites



April-Juli

September 2001

Lente 2004


September 2001

NB


Periode



(Sanchez-Brunette et al., 2008)




Juni - Augustus 2007 (Rodriguez et al., 2010) Juni-Augusus 2003 en December (de Souza Pereira et al., 2007) Februari 2004 September 2006 (Rey-Salgueiro et al., 2008)




Referentie

12

1.3.2. Staalvoorbereiding De verzamelde biomassa werd in elke studie (Tabel 3) behandeld voor de eigenlijke extractie uitgevoerd wordt. Deze voorbehandeling kan bestaan uit het al dan niet wassen, drogen, verkleinen en homogeniseren van de plantaardige biomassa. Na het verzamelen van de stalen moeten deze op een gepaste manier bewaard en getransporteerd worden naar het analytisch laboratorium. In 18 % van de onderzochte studies werd de biomassa bewaard in aluminiumfolie, in een andere 18 % werd de biomassa bewaard in een polyethyleen zak en in 11 % van de studies werd de biomassa bewaard in een glazen recipiënt. Een minderheid werd bewaard in een papieren zak en bij de overige studies is de bewaarmethode niet aangegeven. In 18 % van de studies werd effectief aangegeven dat de biomassa niet gewassen wordt (Alfani et al., 2005; De Nicola et al., 2013a, 2013b, 2011, 2008; Domeno et al., 2006; Foan and Simon, 2012; Foan et al., 2010; Gorshkov, 2008; Krauss et al., 2005; Ratola et al., 2010a, 2010b; Sharma and Tripathi, 2009). In een andere 18 % van de studies werd effectief aangegeven dat de stalen wel gewassen worden. Deze wasstap kan uitgevoerd worden met zowel gedistilleerd water (Ares et al., 2009; De Nicola et al., 2008; Doiegowska and Migaszewski, 2011; Galuszka, 2007; Liu et al., 2006; Migaszewski et al., 2009; SanzLandaluze et al., 2010; Tian et al., 2008; Zohair et al., 2006) als met leidingwater (Tao et al., 2006). Sun et al. (2010) en Liu et al. (2005) wasten de biomassa zowel met gedeïoniseerd water als met leidingwater. Het wassen van de naalden/bladeren laat toe de partikelgebonden fractie PAKs op het oppervlak te bepalen, daar deze PAKs afgespoeld worden van de naalden/bladeren. De overige 65% geeft niet duidelijk aan of de biomassa al dan niet gewassen wordt voor de extractie. In 37 % van de onderzochte studies werd de biomassa expliciet gedroogd. Sommige studies droogden de planten bij omgevingstemperatuur (Ares et al., 2009; De Nicola et al., 2013a; Doiegowska and Migaszewski, 2011; Galuszka, 2007; Holoubek et al., 2007; Migaszewski et al., 2009; Nadal et al., 2004; Sanz-Landaluze et al., 2010; Tomashuk et al., 2012). Blasco et al. (2006a, 2006b, 2007) droogden de mosstalen bij 35 °C gedurende 3 tot 4 dagen. Een analoge aanpak werd aangewend door Domeno et al. (2012) en Foan et al . (2010) door de stalen te drogen in een oven bij 40 en 30 °C, respectievelijk, gedurende 2 tot 3 dagen. Vriesdrogen is een andere optie, uitgevoerd door De Souza Pereira et al. (2007), Zechmeister et al. (2006), Tao et al. (2004), Foan et al. (2012), Tian et al. (2008) en Sun et al. (2010). In andere studies werd de wijze van drogen niet duidelijk gedefinieerd (Cabrerizo et al., 2012). Liu et al. (2005, 2006) wendde een andere optie aan, nl. het drogen van de stalen bij 16 °C in een donkere kamer m.b.v. een airconditioning systeem. In 11 % werd expliciet aangegeven dat er geen droogstap plaatsvond. In 45 % van de studies werd het vegetatief materiaal verkleind tot een homogeen staal bekomen werd. Deze verkleining werd voornamelijk uitgevoerd met een mortier. Slechts in 11 % van de studies werd het materiaal niet verkleind. In de andere 49 % van de studies staat niet expliciet vermeld of de biomassa al dan niet verkleind werd. Afhankelijk van de doelstelling van de studie werden de bladeren al dan niet gewassen.

13

Tabel 3: Voorbehandelingskarakteristieken gespecifieerd in de studies in de periode 2004-2014. NB = Niet Beschikbaar; x=Uitgevoerd; Bewaren

Wassen

Drogen

Verkleinen

Referentie

NB

x

NB

x

(Sanchez-Brunette et al., 2008)

NB

x

NB

x

(Tao et al., 2006)

Glazen fles

x

NB

x


Polyethyleen zak

x; Neen

Neen

x


NB; donker

x

x

NB

(Liu et al., 2006)

Polyethyleen zak; donker

x

x

x

(Liu et al., 2005)

Glazen fles

x

x

x


Glazen fles

x

x

x


Polyethyleen zak

x

x

x

(Sun et al., 2010)

Polyethyleen zak

x

x

x

(Tian et al., 2008)

NB

x

x

x

(Ares et al., 2009)

Papieren zak

x

x

x


Plastic zak

Neen

NB

NB

(Sharma et al., 2009)

<0°C

Neen

NB

NB


Aluminium container

Neen

NB

x



Neen

Neen

NB


Aluminiumfolie

Neen

Neen

NB

(Gorskhov et al., 2008)

Aluminiumfolie; donker

Neen

Neen

Neen



Neen

Neen

Neen



Neen

Neen

Neen


NB

Neen

x

NB


NB

Neen

x

x

(Foan et al., 2010)

NB

Neen

x

x

(Foan et al., 2012)

4 °C, In container; donker

NB

NB

NB

(Culotta et al., 2005)

Polyethyleen zak

NB

NB

NB


Aluminiumfolie

NB

NB

NB

(Hwang en Wade. 2008)

NB

NB

NB

NB


NB

NB

NB

NB

(Lin and Zhu. 2004)

NB; donker

NB

NB

NB

(Navarro-Ortega et al., 2012)

4 °C; donker

NB

NB

NB


Luchtdichte zak

NB

NB

NB


Glazen fles; donker

NB

NB

NB

(Pereira Netto et al., 2007)

NB; donker

NB

NB

NB


Aluminiumfolie

NB

NB

NB


Plastic zak; donker

NB

NB

NB


Plastic zak; donker

NB

NB

NB


NB

NB

NB

NB


<0°C

NB

NB

NB


Aluminiumfolie

NB

NB

NB

(Shukla et al., 2009)

Aluminiumfolie

NB

NB

NB


14

Bewaren

Wassen

Drogen

Verkleinen

Referentie

Glazen fles; donker

NB

NB

Neen


Glazen fles

NB

NB

Neen


Aluminiumfolie

NB

NB

Neen


NB

NB

NB

NB


NB

NB

NB

NB


NB

NB

NB

x

(Howe et al., 2004)

NB

NB

NB

x

(Li et al., 2010)

Aluminiumfolie; droog ijs

NB

NB

x

(Noth et al., 2013)

Glazen fles

NB

NB

x



NB

NB

x


Papieren zak

NB

NB

x


Polyethyleen zak

NB

NB

x


Glazen fles

NB

NB

x

(Zhu et al., 2008)

Papieren zak; donker

NB

Neen

Neen

(Lehndorff et al., 2004)

NB

NB

x

NB

(De Souza Pereira et al., 2007)


NB

x

NB


NB

NB

x

NB

(Zechmeister et al., 2006)

Aluminiumfolie

NB

x

x


4 °C; donker

NB

x

x


NB

NB

x

x


NB

NB

x

x


Nylon zak

NB

x

x


Polyethyleen zak

NB

x

x


4 °C

NB

x

x


NB

NB

x

x

(Tao et al., 2004)

NB; donker

NB

x

x


1.3.3. Extractie Na het voorbereiden van het plantmateriaal moeten de targetcomponenten geëxtraheerd worden m.b.v. een extractietechniek gebruikmakende van een geschikt extractiesolvent. Tabel 4 geeft een overzicht van de verschillende extractieprocedures die werden aangewend in de 70 onderzochte studies. De drie meest gebruikte methoden zijn ultrasone extractie (USE), Soxhlet extractie en verhoogde druk vloeistofextractie (PLE) in respectievelijk 42, 21 en 16 % van de studies. In 6 % van de studies wordt dynamische ultrasoon-geassisteerde solvent extractie (DSASE) aangewend. Andere gebruikte methoden zijn de Soxtec extractie en microgolf geassisteerde extractie (MAE). Deze laatste komen echter in een klein aandeel van de studies voor. In sommige studies werden chemicaliën toegevoegd aan de biomassa tijdens de extractie, vb. natriumsulfaat. Dit kan ervoor zorgen dat het water uit de biomassa gebonden wordt tijdens de extractie zelf. Kopergranulen kunnen eveneens toegevoegd worden aan de stalen om elementair zwavel te verwijderen (Liu et al., 2005; Sun et al., 2010; Tian et al., 2008).

15

1.3.3.1.

Soxhlet extractie

Deze techniek is gebaseerd op een intensieve extractie van organische componenten in een Soxhlet aparaat met een organisch solvent, dat continu over het staal wordt gerefluxt. De duurtijd van een Soxhlet extractie gaat van drie tot meer dan 48 uur waarbij 125 tot 300 mL solvent kan gebruikt worden per extractie. Verschillende solventen werden aangewend voor deze extractietechniek: acetonitrile, DCM:methanol (2:1), tolueen, DCM, hexaan, DCM:hexaan (1:1) en hexaan:aceton (1:1) (Tabel 3). De massa staal varieerde van kleiner dan 1 gram tot 30 gram. Foan et al. (2010) maakte gebruik van de Soxtec extractie methode. Dit is een geautomatiseerde Soxhlet extractie die in verhouding tot de Soxhlet extractie tijdbesparend, veiliger en minder arbeidsintensief is.

1.3.3.2.

Ultrasone extractie

De voorbehandelde biomassa wordt in een glazen recipiënt gevuld met het extractiesolvent gebracht. Dit recipiënt wordt onderworpen aan geluidsgolven om massatransfer te induceren. Het gebruik van geluidsgolven zorgt voor een betere penetratie van het solvent in het organisch materiaal waardoor de massatransfer en aldus de extractie-efficiëntie verbetert. Tal van verschillende solventen werd aangewend: DCM, DCM:hexaan (1:1), hexaan, aceton, hexaan:aceton (1:1), DCM:aceton(1:1) en ethylacetaat. De extractietijd varieerde van 15 tot 80 min. Solventvolumes van 10 tot 900 mL werden gebruikt. De massa staal varieerde van 0,2 tot 100 gram.

1.3.3.3.

Verhoogde druk vloeistofextractie

Verhoogde druk vloeistofextractie is een extractie uitgevoerd op hoge temperaturen en druk m.b.v. een organisch solvent in een gesloten cel. Onder verhoogde druk bij temperaturen hoger dan het atmosferisch kookpunt blijft het solvent in vloeibare vorm. Het solvent heeft hierdoor een hoger penetratievermogen en een lagere viscositeit waardoor de massatransfer van analyten naar het solvent toeneemt. De extractietemperaturen varieerden in de verschillende studies van 80 tot 150 °C. Tal van verschillende solventen werd aangewend: hexaan, DCM, hexaan:aceton (2:1), DCM:aceton (1:1), heptaan, DCM:hexaan (1:1) en hexaan:aceton (1:1). De massa staal varieerde van 1,5 tot 10 gram.

1.3.3.4.

Andere extractietechnieken

De dynamische ultrasoon-geassisteerde solvent extractie is een variant op de statische ultrasone extractie (Blasco et al., 2008, 2007, 2006; Domeno et al., 2012, 2006; Sanz-Landaluze et al., 2010). Het opzet bestaat erin de biomassa in een extractiecel te brengen en deze te plaatsen in een ultrasoon bad. Doorheen de cel wordt een extractiesolvent gepompt aan een constant debiet. Bij de statische extractie wordt de voorbehandelde biomassa in een glazen recipiënt gebracht samen met het extractiesolvent (Blasco et al., 2006; Hwang and Wade, 2008; Rodriguez et al., 2010; Zhu et al., 2008). Er vindt geen enkele vorm van agitatie plaats. Het gebruik van microgolven verbetert de extractiekarakteristieken van het solvent tijdens een microgolf geassisteerde extractie (Ares et al., 2009; Ratola et al., 2009). Dit leidde tot een extractietijd van 30 min en een solventgebruik tussen 30 en 90 mL. 16

Tevens kan aan de hand van een vloeistof-vloeistof extractie de hoeveelheid PAKs bepaald worden (Ziegenhals et al., 2008). Het staal werd gemengd met een waterige oplossing van KOH en verhit onder reflux gedurende een uur. Nadien werd het mengsel gekoeld en gefiltreerd over glaswol. Deze gefiltreerde oplossing werd nadien 3 maal geëxtraheerd met cyclohexaan.

1.3.3.5.

Vergelijking tussen extractietechnieken

Enkele studies hebben verschillende extractietechnieken naast elkaar uitgevoerd ter kwantificatie van dezelfde targetcomponenten. Deze worden hier aangehaald. Domeno et al. (2006) hebben een vergelijkende studie uitgevoerd tussen een DSASE, Soxhlet en een statische extractie voor extractie van de 16 US-EPA PAKs. DSASE werd uitgevoerd met hexaan als extractiesolvent. In de andere twee technieken werd DCM aangewend als extractiesolvent. Na de DSASE werd geen zuiveringsstap uitgevoerd, na de Soxhlet en statische extractie werd het ingedampt extract op een kolom met aluminiumoxide en natriumsulfaat gebracht en geëlueerd met hexaan:DCM (3:1). Recoveries van deze 16 US-EPA PAKs liggen in het interval 71 ± 5 % (acenaftyleen) tot 97 ± 5 % (benzo[a]pyreen) en 69 ± 12 % (acenafteen) tot 92 ± 5 % (benz[k]fluoranteen) en 65 ± 7 % (acenafteen) tot 89 ± 8 % (dibenz[ah]antraceen) voor DSASE, Soxhlet en statische extractie respectievelijk. Er zijn geen significante verschillen merkbaar in recovery tussen de drie methoden. De extractietijd en het solventvolume verschillen echter sterk. Zo is de duurtijd 10 min voor DSASE , 60 min voor Soxhlet extractie en 6 uur voor de statische extractie. Het solventvolume bedraagt 2 mL, 60 mL en 250 mL voor DSASE, Soxhlet en de statische extractie respectievelijk. Duidelijk is aldus dat de DSASE een kortere extractperiode kent en een lager solventvolume vraagt. Ratola et al. (2006) vergeleken de Soxhlet extractie met een USE en een PLE voor de kwantificatie van de 16 US-EPA PAKs. Een 1:1 DCM:hexaan solventmengsel werd aangewend in deze drie methoden. De extracten werden op een SPE cartridge met aluminiumoxide gebracht. Elutie met DCM:hexaan (1:1) gevolgd door puur DCM vond plaats. Recoveries liggen in het interval [65 ; 102] %, [72 ; 100] % en [70; 137] % voor Soxhlet, USE en PLE respectievelijk. De relatieve standaardafwijkingen op deze recovery bedragen maximaal 7,5, 8 en 17 %, respectievelijk. PLE kent een hoge recovery met een grotere relatieve standaardafwijking. Er werd vermoed dat tijdens PLE meer interferenties geëxtraheerd (extractie bij 150 °C) worden, wat de identificatie van de targetcomponenten nefast beïnvloedt (Ratola et al., 2006). Opvallende verschillen in extractietijd en solventvolume tussen de drie verschillende methoden worden waargenomen. Zo is de duurtijd 24 uur, 30 min en 10 min, voor Soxhlet, USE en PLE respectievelijk. Het solventvolume bedraagt 100 mL en 90 mL voor Soxhlet en USE respectievelijk. Foan et al. (2012) vergeleken de PLE met Soxtec extractie voor de kwantificatie van de 16 US-EPA PAKs. Hexaan werd aangewend als extractiesolvent in beide methoden. Het ingedampt extract, na PLE, werd op een SPE cartridge van 1 g Florisil gebracht en geëlueerd met CH:DCM (60:40) solventmengsel. Het extract afkomstig van de Soxtec extractie werd op een SPE cartridge van 1 g 17

Strata-NH2 gebracht en geëlueerd met hexaan:DCM (65:35) solventmengsel. Recovery voor LMW PAKs (77 %) en voor HMW PAKs (67 %) bij beide methoden waren vergelijkbaar. De individuele concentratie was voor elke component gelijkaardig vergeleken tussen PLE en Soxtec. Echter voor fluoreen en acenafteen is dit niet het geval. De concentratie van fluoreen is tot 2,5 keer hoger na PLE (14 ng/g dw voor Soxctec extractie) en de concentratie van acenafteen bedraagt 2,6 ng/g na Soxtec extractie en 2,0 ng/g dw na PLE. Daar deze componenten vluchtig zijn, kunnen verliezen opgetreden zijn bij de Soxtec extractie. Een andere verklaring is de interferentie van deze componenten met matrixcomponenten. Met de Soxtec extractie was het mogelijk om 2 extracties parallel uit te voeren met 200 mL n-hexaan in 3,5 uur tijd. Met de verhoogde druk vloeistofextractie daarentegen konden 3 extracties met 30 mL n-hexaan per staal uitgevoerd worden per uur. Aldus kennen beide methoden in deze studie vergelijkbare recoveries, maar kan met de verhoogde druk vloeistofextractie het solventvolume en de extractietijd gereduceerd worden. Ratola et al. (2009) vergeleek een MAE met een USE voor de kwantificatie van de 16 US-EPA PAKs. In beide methoden werd een solventmengsel van hexaan en DCM 1:1 aangewend als extractiesolvent. De zuiveringsstap betrof een elutie over een SPE cartridge van aluminiumoxide met DCM:hexaan, gevolgd door DCM. De recoveries voor beide methoden liggen in het interval [70-130] % voor alle componenten, behalve voor hoog moleculair gewichts PAKs (recovery lager dan 50 %). In beide methoden werd eenzelfde hoeveelheid solvent (90 mL) gebruikt en was eenzelfde extractietijd (30 min) nodig. Aldus zijn geen significante verschillen waargenomen tussen deze extractietechnieken. Een laatste vergelijkende studie is deze van Ziegenhals et al. (2008). Een vloeistof-vloeistof extractie, een USE en een PLE werden aangewend ter kwantificatie van 16 US-EPA PAKs in theebladeren. Deze eerste techniek maakte gebruik van een verzeping met een waterige kaliumhydroxide oplossing gevolgd door een solventextractie met cyclohexaan. Deze procedure vergt een uur tijd. In de ultrasone extractie werd gewerkt met DCM:aceton (1:1) als extractiesolvent en in de verhoogde druk vloeistofextractie bij 100 °C werd hexaan:aceton (1:1) aangewend als extractiesolvent. Van deze laatste twee methoden zijn geen extractietijden of solventhoeveelheden beschikbaar. De gemiddelde recovery voor alle 16 US-EPA PAKs ligt in het interval [75 ; 117] %. De recovery was hoogst voor de vloeistof-vloeistof extractie, gevolgd door de verhoogde druk vloeistofextractie. Exacte getalwaarden werden echter niet gespecifieerd.

18

19

DCM

DCM:aceton (1:1)

DCM:aceton (1:1)

DCM:hexaan (1:1)

DCM:hexaan (1:1)

DCM:hexaan (1:99)

Heptaan

Hexaan

Hexaan:aceton (1:1)

Hexaan:aceton (2:1)

Hexaan:aceton (1:1)

PLE

PLE

PLE

PLE

PLE

PLE

PLE

PLE

PLE

PLE

PLE

Hexaan

DSASE

Hexaan:aceton (1:1)

Hexaan

DSASE

MAE

Hexaan

DSASE

Hexaan

Hexaan

DSASE

DCM:hexaan (1:1)

Hexaan; aceton

DSASE

MAE

NB

Combi

DSASE

Solvent

Techniek

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

1 x 30

1 x 90

NB

NB

NB

NB

NB

2,5; 2,5

NB

Volume solvent [mL]

1 x 10 min

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

1 x 30 min

1 x 30 min

1 x 10 min

1 x 10 min

1 x 10 min

10 min

1 x 5 min

NB

NB

Extractietijd

100

NB

100

80

120

120

140

140

120

100

NB

130

NB

NB

20

Kamertemp.

NB

Kamertemp.

0

NB

Textractie [°C]

NB; N2

1 mL; N2

Neen

1 mL; N2

< 1 mL; N2

Neen

Neen

NB; N2

NB ; N2

1 mL; N2

NB; N2

Neen

< 1 mL; N2

Neen

0,5 mL; N2

Neen

Neen

100 µL; N2

NB; argon

NB

Indampen

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

38

30

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

Tindamp [°C]

1,5 - 2,0

NB

5,0 - 8,0

1,5

9,8

10

8

NB

5

5

NB

0,6 - 0,8

2

NB

0,2

0,2

0,2

0,2

0,1

NB

Mstaal [g]

14

8

17

6

10

12

1

1

1

1

1

Extra

(Ziegenhals et al. 2008)

(Krauss et al. 2005)

(Liu et al. 2006)

(Foan et al. 2012)

(Noth et al. 2013)

(Lehndorff et al. 2004)

(St-Amand et al. 2009)

(St-Amand et al. 2008)

(Tao et al. 2004, 2006)

(Liu et al. 2005)

(Galuszka et al. 2007)

(Ares et al. 2009)

(Ratola et al. 2009)

(Domeno et al. 2012)


(Blasco et al. 2008)



(Sanz-landaluze et al. 2010)

(Holoubek et al. 2007)

Referentie

Tabel 4: Extractiekarakteristieken van 70 studies in periode 2004-2014. NB= Niet beschikbaar; DCM = dichloormethaan; PLE = Verhoogde druk vloeistof extractie (Accelerated solvent extraction); USE = Ultrasone extractie (Ultrasonic extraction); MAE = Microgolf geassisteerde extractie (Microwave assisted extraction); DSASE = Dynamische ultrasone geassisteerde solvent extractie (Dynamic sonication Assisted Solvent extraction); Combi: Büchi System B811; Na2SO4 = Natriumsulfaat; N2 = stikstofgas; Extra 1 = 0.2 mL/min; Extra 2 = 5 g Na2SO4; Extra 3 = 0.2 g Na2SO4; Extra 4 = 0.1 g Na2SO4 en Florisil; Extra 5 = Niet gespecifieerde hoeveelheid Florisil en Na2SO4; Extra 6 = 10 mg diatomeeënaarde; Extra 7 = Voor indampen, zuivering met ribbon filter; Extra 8 = Niet gespecifieerde hoeveelheid Na2SO4; Extra 9 = 0.2 g koperpoeder en 5 g Na2SO4; Extra 10 = 5 g koperpoeder en 5 g Na2SO4; Extra 11 = 10 g diatomeeënaarde; Extra 12 = 513 W; Extra 13 = 5 g Na2SO4 en niet gespecifieerde hoeveelheid kopergranulles; Extra 14 = 1,5 - 2 g salt-graft-polyethylene oxide; Extra 15 = 90 g Na2SO4; Extra 16 = 80 g NaCl en niet gespecifieerde hoeveelheid Na2SO4; Extra 17 = 0.75 g Na2SO4 en 0.75 g Florisil.

Soxhlet

Soxhlet

Soxhlet

Soxhlet

Techniek

DCM

DCM

DCM

DCM

DCM

Acetonitrile

Solvent

NB

NB

1 x 200

1 x 100

NB

1 x 250

1 x 200

Volume solvent [mL]

24 u

NB

48 u

48 u

> 48 u

16 u

NB

6u

24 u

Extractietijd

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

Textractie [°C]

10 mL; N

Neen

5 mL; N2

10 mL; N2

NB; N

2

Neen

2 mL; N2

NB; N2

1 mL; N

NB; N2

Indampen

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

Tindamp [°C]

NB

NB

20

5

5

>1 ; < 5

2

NB

0,2

2

Mstaal [g]

13

13

(Howe et al. 2004)

(Cabrerizo et al. 2012)

(Nadal et al. 2004)

(Tian et al. 2008)

(Sun et al. 2010)


(Shukla et al. 2009)

(Migaszewski et al. 2009), 2011

3

8

(Rinaldi et al. 2012)


(Augusto et al. 2009 2010)

Referentie

Soxhlet

1 x 300 24 u

10

Extra

Soxhlet DCM NB

NB

2

2

Soxhlet DCM:hexaan (1:1) 1 x 250; 1 x50

1 mL; N2

(Krommer et al. 2007)

Soxhlet DCM; Hexaan

DCM:methanol (2:1)

NB

5

Soxhlet 3u

35

Soxhlet 1 x 125

1 mL; N2

Hexaan

NB

(Zechmeister et al. 2006)

Soxhlet

NB

5

(Foan et al. 2010)

NB

35

5

(Foan et al, 2012)

Hexaan

1 mL; N2

1

17


(Zohair et al. 2006)

1,5

4

2

(De Souza Pereira et al. 2007) 30

5

(Rodriguez et al. 2010)

15

NB

0,2

16

Soxhlet

NB

30 NB

X

NB

NB

NB

NB NB

1 mL; N2

NB

10

NB

NB NB

NB

1 mL; N

1 - 2mL; N2

< 40

5

Hexaan

NB 3u

20

Kamertemp.

NB

100

Soxhlet

NB; NB

2 mL; N2

NB

12 u

0,5 mL; N2

NB

24 u

NB

1 x 100

4 x 15 min

NB

NB; N2

NB

24 u

Soxtec Hexaan

4 x 15

1 x 100

NB

NB

Neen

5 mL; N2

NB

Soxtec DCM

DCM:hexaan (1:1)

NB

4u

30

NB

1,0 - 5,0

1 x 300

Statisch

Water:aceton:PE (1:2:1)

NB

30 min

3 x 3 min

NB

2,0 - 5,0 - 10,0

Tolueen

Statisch

DCM

1 x 20

3 x 100

4-5 ml; N2

NB

Hexaan:aceton (1:1)

Statisch

DCM:aceton (1:1)

NB

< 1 mL; N2

Soxhlet

Statsich

DCM:aceton (1:1)

3 x 3 min

NB

Soxhlet

USE

3 x 100

3 x 10 min

(Lin and Zhu. 2004) (De Nicola et al. 2005a, 2005b, 2008, 2011, 2013a, 2013b) (Ratola et al. 2006, 2009, 2010a, 2010b, 2011a, 2011b, 2011c), (Navarro-Ortega et al. 2012

(Prajapati et al. 2008)

(Hwang en Wade. 2008)

(Zhu et al. 2008)

USE

DCM:aceton (1:1)

3 x 30

2

USE

DCM:hexaan (1:1)

2

USE

20

21

3 x 40

3 x 30; 3 x 30

Ethylacetaat

Hexaan

Hexaan

Hexaan:aceton (1:1)

Hexaan:aceton (1:1)

DCM:aceton (1:1)

Aceton

DCM

DCM

DCM

DCM

Cyclohexaan, KOH

USE

USE

USE

USE

USE

USE

USE

USE

USE

USE

USE Vl-Vl extractie

1 x 15

4 x 20

1 x 250

1 x 10

3 x NB

2 x 100

1x2

2 x 100

20 - 100

1x5

3 x 60

DCM:hexaan (1:1)

USE

Volume solvent [mL]

Solvent

Techniek

1 u; NB

3 x 20 min

2 x 10 min

4 x 20 min

1u

1 x 15 min

NB

NB

1 x 30 sec

2 x 30 min

1 x 20 min

15 min

3 x 10 min

Extractietijd

NB

NB

NB

NB

25

30

NB

NB

0

Kamertemp.

NB

Kamertemp.

NB

Textractie [°C]

NB; N2

Neen

200 µL; N2

10 mL; N2

10-20mL; N2

< 1 mL; N2

NB; N2

0,5 mL; N2

NB; N2

1 mL; N2

Neen

1 mL; N2

2 mL ; N2

Indampen

NB

NB

35

< 40

30

NB

NB

NB

NB

45

NB

Kamertemp.

NB

Tindamp [°C]

1,5 - 2,0

2

3

1,5

10

2

1,5 -2,0

5

0,2

10

NB

2

10

Mstaal [g]

2

9

7

8

Extra


(Orecchio et al. 2005, 2007)

(Piccardo et al. 2005)

(Pereira Netto et al. 2007)

(Sharma et al. 2009)

(Li et al. 2010)


(Otvos et al. 2004)


(Gorskhov et al. 2008)

(Rey-salgueiro et al. 2008)

(Sanchez-Brunette et al. 2008)

(Tomashuk et al. 2012)

Referentie

1.3.4. Extract zuivering Na de eigenlijke extractie kunnen de extracten gezuiverd worden om zoveel mogelijk interfererende componenten te verwijderen uit het extract. Tabel 5 geeft alle technieken weer die aangewend werden in de 70 onderzochte studies. De meest voorkomende technieken zijn kolomchromatografie (38 %), vaste fase extractie (SPE, 28 %) en Gel Permeration Chromatography (GPC, 6 %). In 17 % van de studies werd geen zuiveringstechniek aangewend.

1.3.4.1.

Kolomchromatografie / Vaste fase extractie cartridge

Een chromatografische kolom is selfmade. Een vaste fase extractie cartridge daarentegen wordt op industriële schaal geproduceerd. Om de extracten te zuiveren met een chromatografische kolom of een SPE cartridge kunnen verschillende sorbentia aangewend worden. Zo wordt meestal gebruik gemaakt worden van Florisil (MgO3Si), silica (SiO2) en aluminiumoxide (Al2O3) (Tabel 5). Florisil is een commercieel bereid magnesium-silica poeder dat polaire componenten weerhoudt. Tevens kan natriumsulfaat toegevoegd worden op de kolom om resterend water uit het extract te weerhouden en het aldus te drogen. Vooraleer het extract gezuiverd en op de kolom/SPE cartridge gebracht wordt, wordt het meestal ingedampt m.b.v. een stikstofstroom om zo de targetcomponenten op te concentreren in een kleiner solventvolume (Tabel 5). Verschillende solventen werden aangewend om de componenten te elueren op de kolom/SPE cartridge: cyclohexaan, DCM, hexaan, acetonitril, DCM:hexaan

in

verschillende

verhoudingen,

benzeen:hexaan

(9:1),

pentaan:DCM

(3:2),

DCM:petrolether (1:4) en cyclohexaan:DCM (60:40). Foan et al. (2012) onderzochten het verschil in opzuiveringsefficiëntie tussen een SPE cartridge met Florisil, aluminiumoxide en silica voor de 16 US-EPA PAKs. De extracten op elk van deze drie cartridges werden geëlueerd met 8 mL van een cyclohexaan:DCM (60:40) solventmengsel. Recovery van alle componenten op de alumina cartridge is significant lager (51 % LMW PAKs en 59 % HMW PAKs), dan deze op Florisil (71 % LMW en HMW PAKs) en silica cartridge (67 % LMW PAKs en 75 % HMW PAKs). Daar echter de relatieve standaardafwijking op de recovery van de LMW PAKs bij de silica cartridge beduidend hoger is (20 %) dan deze bij de Florisil cartridge (8 %), werd de Florisil cartridge verkozen als beste optie.

1.3.4.2.

Gel permeatie chromatografie

Deze techniek kan aangewend worden als hoofdzuiveringsstap (Noth et al., 2013; Ziegenhals et al., 2008) of als tweede fase in de zuiveringsstap zoals bij Tian et al. (2008) en Liu et al. (2006) en is gebaseerd op het scheiden van moleculen op basis van verschil in grootte. In 80 % van deze studies worden S-X3 biobeads aangewend als gelfase. Dit zijn poreuze, gecrosslinkte styreen-divinylbenzeen polymeerkralen. De kleine componenten zullen een sterkere vertraging kennen door retentie in de poriën van deze gel. De grote componenten worden niet weerhouden en elueren eerst (Bio-Rad Laboratories, 2000). Op deze manier zullen vetten eerst elueren en kan deze fractie verwijderd worden uit het extract.

22

1.3.4.3.

Andere zuiveringstechnieken

De extracten kunnen finaal over een membraan, filter of in een centrifuge gebracht worden om onoplosbare bestanddelen te verwijderen. In 4 % van de studies werd een membraan als filtermedium aangewend. In verschillende studies (De Nicola et al., 2005; Li et al., 2010; Prajapati and Tripathi, 2008) werd met een PTFE (Polytetrafluorethyleen) membraan gewerkt met een poriegrootte tussen 0,2 en 0,45 µm. Rinaldi et al. (2012) maakten gebruik van een centrifuge om de extracten te zuiveren van de epicuticulaire waslaag van het plantaardig materiaal. Na de zuiveringsstap wordt het nieuwe extract meestal opnieuw ingedampt om opconcentratie van de componenten te verkrijgen.

23

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

GPC

GPC

GPC

GPC

GPC

GPC

Glasfilter

Filter

Centrifuge Centrifuge

Techniek

Silica; Na2SO4 Silica; Aluminiumoxide Na2SO4

Florisil

Florisil; Silica; Na2SO4

Silica

NB

S-X3 biobeads

S-X3 biobeads

Nucleogel

S-X3 biobeads

S-X3 biobeads

NB

PTFE

NB NB

Sorbens

NB

NB

NB

10; 2 mm

NB

12; 4; 0,5

NB

NB

60

10

NB

10

10

NB

NB

NB NB

Hoeveelheid sorbens [g]

Propan-2-ol

PE:DCM (4:1)

NB

NB

n-Hexaan; Pentaan:DCM (3:2)

Acetonitril

DCM:Hexaan (20:80)

Cyclohexaan

CH:ethylacetaat (1:1)

Cyclohexaan:ethylacetaat (1:1)

DCM:Hexaan (1:1)

Tetrahydrofuran

DCM:Hexaan(1:1)

DCM:Hexaan(1:1)

Hexaan:aceton (1:1)

Cyclohexaan:ethylacetaat (1:1)

NB NB

Solvent

60

NB

NB

NB

NB

25; 50

30

45

NB

10

NB

80

NB

80

80

9

4,5

NB NB

Volume solvent [mL]

NB; N2

NB; N

< 1mL; N2

0,5 mL; N2

2 mL ; N2

Neen

< 1mL; N2

1 mL; N2

30 µL; N2

Neen

0,5 mL; N

NB

0,2 ml. N2

0,5 mL; N2

200 µL; N

200 µL; N2

1 mL; N2

NB

NB 2 mL; N

2

Indampen

Kt.

Kt.

NB

< 40

< 40

35

NB

38

NB

32

NB

< 40

NB

NB

NB

NB

NB

32

NB

NB NB

2

1

1

3

2

2

1

1

2

2

5

2

2

1

1

4



(Liu et al. 2005, 2006)



(Orecchio et al. 2005, 2007)

(Cabrerizo et al. 2012)

(Ares et al. 2009)

(De Souza Pereira et al. 2007)



(Tian et al. 2008)

(Noth et al. 2013)

(Liu et al. 2006)

(Liu et al. 2005)

(Ares et al. 2009)


(Lehndorff et al. 2004) (Rinaldi et al. 2012)

2

(Nadal et al. 2004)

(Tao et al. 2004, 2006)

(Augusto et al. 2009,2010)

Referentie

Kolom Silica

NB

DCM

8

NB; N2

NB

Extra

Kolom

2; 5; 5; 10

DCM

3

5 mL; N2

Tindamp [°C]

Kolom

NB Na2SO4;; Aluminiumoxide; Florisil; Silica

NB

DCM:Pentaan (20:80)

25; 40

2

Kolom

Silica

5

Hexaan; Hexaan:DCM (1:1)

2

Kolom

Silica

NB; 3

Kolom

Kolom

Aluminiumoxide ; Na2SO4

2

Kolom

Tabel 5: Opzuiveringskarakteristieken van studies in de periode 2004-2014. NB = Niet Beschikbaar; Na2SO4 = Natriumsulfaat; N2 = stikstofgas; DCM= dichloormetaan; PTFE = polytetrafluorethyleen; Extra 1= Eerste stap in een zuiveringsprocedure; Extra 2 = Tweede zuiveringsstap in de zuiveringsprocedure; Extra 3 = Derde zuiveringsstap in de zuiveringsprocedure; Extra 4 = 2 keer aan 3500 rpm bij -2 °C; Extra 5 = 0,5 mL/min; Kt : Kamertemperatuur.

(

24

25

NB 10 cm; 6 cm; 5 cm; 2 cm

10; 5; 5

NB NB

Silica, Na2SO4 Silica:Aluminiumoxide (2:1)

Silica

NB Silica; Aluminium; Florisil; Na2SO4

Silica; Aluminiumoxide; Na2SO4 Silica:Aluminiumoxide (2:1)

Florisil; Na2SO4

Aluminium; Florisil

Silica; Aluminium

Silica

Na2SO4

Silica

PTFE

PTFE

PTFE Aluminiumoxide; Na2SO4

SiO2

Aluminiumoxide

SiO2

Florisil

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

Kolom

Membraan

Membraan

Membraan

SPE

SPE

SPE

SPE

SPE

Kolom

Kolom

Kolom

kolom

1

NB

NB

NB

5; 1 cm

NB

NB

NB

4

NB

NB; 2

5;1

NB

NB

NB

NB

3,5

NB

Silica Aluminiumoxide; Na2SO4

Kolom


Sorbens

Techniek

NB

Hexaan

Hexaan:DCM (1:1) ;DCM

Hexaan

Hexaan:DCM (1:1 v/v) ; DCM

NB

NB

NB

DCM:Hexaan (1:1)

DCM:aceton (1:1)

Hexaan; Hexaan:DCM(1:1)

DCM:Pentaan(1:1)

DCM:Hexaan (1:3)

DCM:Hexaan (1:1)

DCM

DCM:Hexaan(1:1)

DCM:Hexaan (1:1)

Hexaan Hexaan; Geconcentreerd zwavelzuur

Hexaan;Hexaan:DCM(1:1)

NB

Hexaan:ethylacetaat (20:80)

NB

Solvent

NB

6

50;50

6

50;50

NB

NB

NB

10

10

20;20

NB

20

30

60

100

70

40; 20

NB

20;70 (7:3)

NB

10

NB

Volume solvent [mL]

NB

NB; N2

0,5 mL; N2

NB; N2

0,5 mL; N2

NB; N2

Neen

NB ; N2

< 1mL; N2

< 1mL; N2

0,3 mL; N2

NB; N2

500 µL; N2

2 mL; N2

NB; N2

1- 2 mL; N2

0,5 mL; N2

Neen

200 µL; N2

1 mL; N2

2 mL; N2

NB; N2

NB; N2

Indampen

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

30

NB

NB

NB

Tindamp [°C]

2

1

1

1

1

Extra

(Foan et al. 2010)


(Navarro-Ortega et al. 2012)


(De Nicola et al. 2005b) (Ratola et al. 2006, 2009, 2010a, 2010b, 2011a, 2011b, 2011c)

(Li et al. 2010)

(Prajapati et al. 2008)

(Lin en Zhu 2004)

(Lin en Zhu 2004)

(Howe et al. 2004)

(Hwang en Wade 2008)


(Tomashuk et al. 2012)

(Sun et al. 2010)

(Zhu et al. 2008)

(Tian et al. 2008)

(Tao et al. 2004, 2006)

(St-Amand et al. 2008, 2009)


(Shukla et al. 2009)

(Sanchez-Brunette et al. 2008)

(Otvos et al. 2004)

Referentie

SPE

SPE

SPE

SPE

SPE

SPE

Techniek

Silica

PCB-A

Silica

NB

C18

Florisil

Sorbens

0,5

NB

NB

NB

NB

NB

1

NB

NB

NB


Hexaan:DCM (65:35)

Hexaan:DCM (65:35)

DCM:Petrolether(1:4)

Hexaan; Hexaan:Benzeen (9:1) Hexaan; Hexaan:DCM(9:1); Hexaan:DCM(4:1)

n-Hexaan

NB

Cyclohexaan

DCM:Petrolether(1:4)

Acetonitril

Cyclohexaan:DCM(60:40)

Solvent

NB

2

2

2

NB

NB

5,5; 2

10

NB

10

NB

4,5

8

Volume solvent [mL]

Neen

NB

0,5 mL; N2

0,5 mL; N2

NB

1 mL; N

500 µL; N2

0,5 mL; N2

< 1 mL; N

1 mL; N2

Neen

1 mL; N2

1 mL; N

0,1 mL; N2

Indampen

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

NB

45°C

NB

NB

NB

NB

NB

Tindamp [°C])

2

2

(De Souza Pereira et al. 2007)

(Hwang en Wade 2008)




(Krommer et al. 2007)

(Krauss et al. 2005)

(Gorshkov et al. 2008)

(Rey-Salgueiro et al. 2008)

(Zohair et al. 2006)


(Zechmeister et al. 2006)

2

2

(Sharma et al. 2009)

(Zhu et al. 2008)

(Foan et al. 2012)

Referentie

SPE

NB

Silica Aluminiumoxide; Silica; Na2SO4

0,5 ; 0,05; 0,05

DCM

Hexaan:DCM (65:35)

NB

5 mL; N2

Extra

SPE

NB

NB; 0,05 ; 0,05

Cyclohexaan; DMF:water

NB

45

SPE

NB

Strata-NH2 Strata-NH2; Na2SO4; Florisil Strata-NH2; Na2SO4; Florisil

NB

NB

2

SPE

NB

NB

2

SPE

NB

SPE

Filtratie

SEC Vl-Vl extractie

26

1.4.

Scheiding & Detectie

Na zuivering en opconcentratie van het extract dienen de extracten geanalyseerd te worden m.b.v. een scheidings- en detectiemethode. Tabel 6 geeft een overzicht van alle scheidings- en detectietechnieken aangewend in literatuur in de periode 2004-2014. In 81 % van de studies werd gas chromatografie (GC) aangewend voor de scheiding van PAKs in plantextracten en slechts in 19 % van de studies werd hoge performantie vloeistof chromatografie (HPLC) aangewend.

1.4.1. Gas chromatografie Onder GC valt eveneens de snelle GC (Fast GC, (Ziegenhals et al., 2008)). Ziegenhals et al. (2008) vergeleken het concentratieniveau van 16 US-EPA PAKs, geanalyseerd met zowel snelle GC als conventionele GC. Analysetijden van 25 en 90 min werden geobserveerd voor snelle GC en conventionele GC respectievelijk. Er werd geconcludeerd dat de korte methode eveneens in staat was om dezelfde concentratieniveaus te kwantificeren als de conventionele langere analysemethode. Een snelle GC kolom heeft een interne diameter variërend tussen 0,1 en 0,18 mm, heeft een kortere kolomlengte en een dunnere filmdikte. Ziegenhals et al. (2008) maakten gebruik van een 10 m lange kolom met 0,1 mm interne diameter en 0,1 µm filmdikte. In 61 % van de studies die een GC gebruiken, werd een 5 MS kolom met 5 % fenyl-methylpolysiloxaan als stationaire fase gebruikt. In 98 % van de studies die een GC gebruiken is de detector een massaspectrometer (MS). De MS gaat van een eenvoudige quadrupool MS (Q MS, (Orecchio, 2007; Orecchio et al., 2005; Ratola et al., 2009, 2006; StAmand et al., 2009; Zohair et al., 2006) tot een hoge resolutie MS (HRMS, (Ziegenhals et al., 2008)), tandem MS/MS (Ares et al., 2009), triple quad MS (Lehndorff and Schwark, 2004) en quadrupool timeof-flight MS (Q-TOF-MS, (Domeno et al., 2012)). De acquisitie modus van de MS detector is in 71 % van de studies Selected Ion Monitoring (SIM) modus of Single ion storage (SIS) modus in een iontrap MS. Vooraf bepaalde massa/lading (m/z) verhoudingen werd geselecteerd. Zo stijgt de signaal/ ruis verhouding sterk en kan elke m/z verhouding langer gemeten worden. Meestal werd Electron Impact ionisatie (EI mode) aangewend. Enkel in de studie uitgevoerd door Domeno et al. (2012) werd Atmospheric Pressure Gas Chromatography (APGC) aangewend met N2. Dankzij de zachte ionisatie in APGC was het mogelijk om zowel nitro-PAKs als niet gesubstitueerde PAKs te identificeren en te kwantificeren in een complexe matrix. Een Vlam ionisatie detector (FID) werd enkel gebruikt door Nadal et al. (2004).

1.4.2. Hoge performantie vloeistof chromatografie In 98 % van de studies die een HPLC gebruiken werd een C18 (octadecyl) kolom aangewend. In 69 % van de studies die een HPLC gebruiken is deze gekoppeld aan de Fluorescentie detector (FLD) en in 15 % van de studies is deze gekoppeld aan een Ultraviolet detector (UV). Een combinatie van beide kan eveneens aangewend worden (Otvos et al., 2004). In deze studie werd de UV detector gebruikt voor de detectie van de laag moleculaire PAKs en de FLD voor de detectie van de hoog moleculaire PAKs. Een detector die in het zichtbare spectrum meet werd eveneens gebruikt (Augusto et al., 2010, 2009).

27

1.4.3. Detectielimieten De instrumentele detectielimiet (iLOD) werd voor de 16 US-EPA PAKs slechts in twee studies aangegeven (Ratola et al., 2011a, 2006). Dit is de kleinste hoeveelheid van een component die een signaal geeft dat significant verschillend is van de blanco. Ratola et al. (2011a) bepaalden de iLODs voor de 16 prioritaire US-EPA PAKs en deze bevonden zich in het interval 0,222 pg (acenaftyleen) tot 9,5 pg (dibenz[ah]antraceen). In de tweede studie, Ratola et al. (2006) kent deze iLOD een bereik van 0,066 µg/L voor naftaleen tot 0,113 µg/L voor fluoreen. Ratola et al. (2006) wendden een Q MS aan, Ratola et al. (2011a) specifieerden niet welke MS gebruikt werd. De methode detectielimiet (mLOD) beschrijft de laagste detecteerbare concentratie van een component na het uitvoeren van de volledige analyseprocedure. Deze procedure omvat alle stappen van de monstervoorbereiding, tot en met scheiding en detectie. Ratola et al. (2009) kwantificeerden 16 US-EPA PAKs in zowel Pinus pinaster als in Pinus pinea met GC-QMS. Alle stappen in het analyseproces waren dezelfde, behalve de extractietechniek: zo werden MAE en USE naast elkaar aangewend. Voor P. pinaster ligt de mLOD in een bereik van 0,040 ng/g dw (naftaleen) tot 0,540 ng/g dw (fluoranteen) en 0,018 ng/g dw (benz[a]antraceen) tot 0,346 ng/g dw (fluoranteen), voor MAE en USE respectievelijk. Voor P. pinea ligt deze in een bereik van 0,020 ng/g dw (chryseen) en benz[a]antraceen tot 0,340 ng/g dw (acenafteen) en van 0,028 ng/g dw (naftaleen) tot 0,256 ng/g dw (pyreen), voor MAE en USE respectievelijk. De algemeen lagere mLOD voor P. pinea is volgens Piccardo et al. (2005) te wijten aan de morfologische en fysiologische verschillen bij opname van POPs. Pinus pinaster kan over een moeilijker te analyseren matrix beschikken, waardoor meer interfererende componenten worden geanalyseerd en voor een hogere mLOD zorgen. De mLOD voor Pinus species varieerde van 0,018 tot 3,5 ng/g dw (Gorshkov, 2008; Ratola et al., 2012, 2011a, 2009, 2006) en bedroeg voor bieten (beta vulgaris) 2 ng/g dw (Nadal et al., 2004). De mLOD varieerde van 21 tot 32 ng/g dw voor korstmossen en van 7 tot 35 ng/g dw voor mossen (Domeno et al., 2012, 2006). De hogere mLOD van mossen kan te wijten zijn aan de complexe matrix van mossen waarin tal van andere organische moleculen voorkomen die de mLOD kunnen verhogen (Blasco et al., 2007).

28

Tabel 6: Scheidings- & detectiekarakteristieken. GC= Gas Chromatografie; HPLC= Hoge performantie vloeistof chromatografie; Fast-GC= Snelle GC; MS = Massa Spectrometer; HRMS = Hoge resolutie massaspectrometer; FID = Vlam ionisatie detector; MS/MS= tandem MS; Q MS = Quadrupool MS; Q-TOF-MS = Quadrupool- time of flight MS; Q MS/MS = quadrupool tandem MS; FLD = Fluorescentie detector; DAD / V-UV= Diode array detection en Zichtbaar licht- ultraviolet licht detector; NB = Niet beschikbaar; EI = Elektron impact modus; APGC = Atmosferische druk GC; SIM = selected ion monitoring; SIS = Single Ion storagemode; SCAN = scanning mode. Chromatografie

Detector

Ionisatie

Acquisitie modus

Fast-GC

HRMS

EI 45 eV

NB

TR-50 MS 10 m x 0,1 mm ID x 0,1 µm


GC

FID

NB

NB

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

VF-5MS 60 m x 0,25 mm ID x 0,25µm


GC

MS

NB

SIM

VF-5MS 60 m x 250 µm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

VF-5MS 60 m x 250 µm ID x 0,25 µm


GC

MS

EI

SIM

NB


GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

VF-5MS 60 m x 250 µm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 50 m x 0,2 mm ID x 0,3 µm


GC

MS

EI 70 eV

SCAN

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Gorshkov et al., 2008)

GC

MS

NB

NB

DB-5MS


GC

MS

NB

SIM

30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Howe et al., 2004)

GC

MS

EI 70 eV

SIM

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Hwang et al., 2008)

GC

MS

EI 70 eV

SIM

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

NB

SIM

NB


GC

MS

EI 70 eV

NB

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Liu et al., 2005)

GC

MS

NB

NB

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

NB

SIM

DB-5MS 50 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

EI 70 eV

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Liu et al., 2006) (Migaszewski et al., 2011) (Migaszewski et al., 2009) (Navarro-Ortega et al., 2012)

GC

MS

NB

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Noth et al., 2013)

GC

NB

NB

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS Ion trap MS

EI 70 eV

SIS

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Prajapati et al., 2008) (Ratola et al., 2010a, 2010b, 2011b, 2011c)

GC

MS

EI

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

EI 70 eV

SIM

ZB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

NB

NB

GC

MS

EI 70 eV

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

EI 70 eV

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

MS

EI 70 eV

SCAN

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Tao et al., 2004)

GC

MS

EI 70 eV

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Tao et al., 2006)

GC

MS

NB

SIM

GC

MS

NB

SIM

Kolom eigenschappen

NB

NB HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

Referentie

(Rodriguez et al., 2010) (Sanchez-Brunette et al., 2008) (Sharma et al., 2009)

(Tian et al., 2008) (Tomashuk et al., 2012)

29

Chromatografie

Ionisatie

Acquisitie modus

GC

Detector Ion trap MS

EI 70 eV

SIM

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

NB

SIM

GC

MS

EI 47 eV

SIM

NB Rtx-CLPesticides2 30 m x 0,25 mm ID x 0,2 µm (Zhu et al., 2008)

GC

MSMS

NB

NB

DB-XLB 60 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Ares et al., 2009)

GC

Q MS

NB

SIM

Equity-5 30m x 0,25 mm ID x 0,5 µm

(Culotta et al., 2005)

GC

Q MS

EI 70 eV

SIM

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

Q MS

NB

SIM

Equity-5 30 m x 0,25 mm ID x 0,5 µm

(Orecchio, 2007)

GC

Q MS

Ei 70 eV

SIM

DB-5MS 30m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

Q MS

EI 70 eV

SIM

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm


GC

Q MS

EI 70 eV

SIM

Zebron-5 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm (St-Amand et al., 2009)

GC

HRMS

EI 35 eV

NB

VF-17MS 60 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

Q MSMS

EI 70 eV

SIM

HP1 25 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

Q TOF-MS

APGC

NB

HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

NB

NB

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

GC

MS

EI 70 eV

SIM

DB-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm

(Domeno et al., 2012) (De Souza Pereira et al., 2007) (Pereira Netto et al., 2007)

GC

MS

NB

SIM

HPLC

FLD

NB

NB

HPLC

FLD

NB

NB

NB Hypersil Green 200 mm x 4,6 mm ID x 5 µm Hypersil Green 150 mm x 3,0 mm ID x 3 µm

(Sun et al. 2010) (Sanz-Landaluze et al., 2010) (Sanz-Landaluze et al., 2010)

HPLC

FLD

NB

NB

C18 250 mm x 4,6 mm ID x 5 µm

(Foan et al., 2012)

HPLC

FLD

NB

NB

HPLC

FLD

NB

NB

C18 250 mm x 4,6 mm ID x 5µm (Foan et al., 2010) C18 Eclipse XDB-18 150 mm x 4,6 mm ID x 5 µm (Li et al., 2010)

HPLC

FLD

NB

NB

C18 150 mm x 4,6 mm ID x 5 µm

HPLC

FLD

NB

NB

C18 250 mm x 4,6 mm ID x 5 µm

(Piccardo et al., 2005) (Rey-Salgueiro et al., 2008)

HPLC

FLD

NB

NB

C18 250 mm x 4,6 mm ID x 5 µm


HPLC

NB

NB

C18 250 mm x 2,1 mm ID x 5 µm


NB

NB

Agilent C18; Phenomenex C18


HPLC

FLD FLD; DAD/V-UV FLD; DAD/V-UV

NB

NB

Agilent C18; Phenomenex C18


HPLC

UV

NB

NB

C18 250 mm x 4,6 mm ID x NB

(Lin en Zhu 2004)

HPLC

UV

NB

NB

C18 250 mm x 4,6 mm ID x 5 µm

(Shukla et al., 2009)

HPLC

UV; FLD

NB

NB

C18 250 mm x 4,6 mm ID x 5 µm


HPLC

30

Kolom eigenschappen

Referentie (Ratola et al., 2011a) (Zechmeister et al., 2006)

(Ziegenhals et al., 2008) (Lehndorff and Schwark, 2004)

1.5.

Concentratieniveau van PAKs in plantspecies

In de meeste studies werd het concentratieniveau van de niet gesubstitueerde PAKs aanwezig in het onderzochte plantaardig materiaal bepaald. Er is tot nu toe geen enkele studie die het concentratieniveau van Oxy-PAKs in plantmateriaal bepaald heeft. Een overzicht van het concentratieniveau van de 16 US-EPA PAKs, in de vorm van boxplots, wordt gegeven in Figuur 2. Geen enkele studie heeft reeds zo’n overzicht weergegeven. De gemiddelde mediaan van LMW PAKs (2-3 ringen), MMW PAKs (4 ringen) en HMW PAKs (5-6 ringen) bedraagt 21, 28 en 4 ng/g droog gewicht, respectievelijk. Deze beduidend lagere mediaan (en lagere maximale concentratie) voor HMW PAKs is te wijten aan het feit dat de luchtconcentratie van deze componenten algemeen beduidend lager is dan voor LMW en MMW PAKs (De Nicola et al., 2013a; de Souza Pereira et al., 2007; Liu et al., 2006; St-Amand et al., 2008; Zhu et al., 2008). De grootste mediaan en de grootste waarde van het 75 percentiel wordt gevonden bij fenantreen (60 en 187 ng/g dw respectievelijk), gevolgd door fluoranteen (49 en 98 ng/g dw, respectievelijk) en pyreen (34 en 82 ng/g dw, respectievelijk). Naftaleen volgt na pyreen met een mediaan van 25 ng/g dw en 75 percentiel van 75 ng/g dw. Fenantreen representeert 30 % van de totale PAK concentratie. Fenantreen, fluoranteen (14 %) en pyreen (12 %) maken samen 56 % uit van de totale PAK concentratie. Augusto et al. (2010) vonden ook dat deze componenten abundant aanwezig waren in zowel mos als in Pinus pinea naalden. Dit is niet onverwacht daar fenantreen, fluoranteen en pyreen als voornaamste polluenten geëmitteerd worden via uitlaatgassen van op benzine en diesel rijdende voertuigen (Pereira Netto et al., 2007). Hierdoor zijn deze componenten meer abundant aanwezig in de lucht en kunnen deze aldus in grotere concentraties opgenomen worden door de aanwezige vegetatie. Figuur 3 geeft een overzicht (boxplots) weer van het concentratieniveau van de 16 US-EPA PAKs opgedeeld per ringklasse, d.i. het aantal aromatische ringen in de chemische structuur. De componenten met 3 en 4 ringen vertegenwoordigen samen 80 % van

16 US-EPA PAKs (berekend

over alle data weergegeven in Figuur 2). Dit betekent aldus dat deze componenten meest abundant aanwezig zijn in plantspecies. Deze trend werd bevestigd door verschillende studies (Augusto et al., 2010, 2009; Doiegowska and Migaszewski, 2011; Galuszka, 2007; Hwang and Wade, 2008; Lin and Zhu, 2004; Liu et al., 2005; Migaszewski et al., 2009; Orecchio, 2007; Orecchio et al., 2005; Pereira Netto et al., 2007; Ratola et al., 2012, 2011a, 2011b, 2010a, 2010b; Rodriguez et al., 2012, 2010; Sun et al., 2010; Tomashuk et al., 2012). Het concentratieniveau in het plantspecies is sterk afhankelijk van de staalnameregio. Zo werd bewezen dat planten nabij een drukke verkeersweg of nabij een industrieel gebied een hoger concentratieniveau hebben dan in een natuurlijk gebied (Augusto et al., 2010, 2009; De Nicola et al., 2008). De totale concentratie aan 16 US-EPA PAKs kan tot bijna 4 keer hoger zijn in een industriële site gelegen in een stad (454 ng/g dw) vergeleken met een site in het bos (123 ng/g dw) (Augusto et al., 2009). Blasco et al. (2007) concludeerden dat de totale concentratie aan 16 US-EPA PAKs tot bijna 5 keer hoger is in een staalnamepunt langsheen de autostrade (1654 ng/g dw) vergeleken met een afgelegen gebied (352 ng/g dw) in diezelfde regio. De Nicola et al. (2011) concludeerden dat de totale 31

concentratie aan 16 US-EPA PAKs, zonder naftaleen, en met benzo[e]pyreen en peryleen, tot 30 keer hoger is nabij een drukke verkeersweg met traag verkeer (9000 ng/g dw) vergeleken met de concentratie van de achtergrondlocatie gelegen in Vesuvius National Park (300 ng/g dw). Deze trend werd bevestigd door verschillende studies (Augusto et al., 2010, 2009; Blasco et al., 2008, 2007; De Nicola et al., 2013a, 2011, 2008; Doiegowska and Migaszewski, 2011; Holoubek et al., 2007; Howe et al., 2004; Hwang and Wade, 2008; Migaszewski et al., 2009; Nadal et al., 2004; Noth et al., 2013; Orecchio, 2007; Orecchio et al., 2005; Otvos et al., 2004; Pereira Netto et al., 2007; Piccardo et al., 2005; Ratola et al., 2012, 2011a, 2011b, 2011c, 2010a, 2010b, 2009; Rinaldi et al., 2012; Rodriguez et al., 2012, 2010; Sanchez-Brunete et al., 2008; Sharma and Tripathi, 2009; Shukla and Upreti, 2009; Sun et al., 2010; Urbat et al., 2004; Zechmeister et al., 2006). Tevens is het moment van staalname van groot belang. De meteorologische condities beïnvloeden het concentratieniveau van PAKs. Zo kunnen stalen die na een hevige regenbui verzameld worden een lagere concentratie HMW PAKs bevatten door wash-off en de impact van de druppel op het blad/de naald. Tevens is het mogelijk dat deze zwaardere PAKs, dewelke gebonden zijn op stofdeeltjes, geaccumuleerd op het blad/naald oppervlak geresuspendeerd worden door de wind. Hierdoor kan eveneens een lagere concentratie PAKs gemeten worden (De Nicola et al., 2008). Daarom is het van belang steeds de weerscondities bij te houden. Om de invloed van regen na te gaan kan een wasstap van het plantmateriaal ingevoerd worden in de voorbehandelingsfase van de analytische methode. De Nicola et al. (2008) vonden dat geen significante verschillen in concentratieniveau worden waargenomen tussen ongewassen naalden (2100 ng/g dw ) en gewassen naalden (2061 ng/g dw) bij de kwantificatie van de 16 US-EPA PAKs. De verklaring ligt in de snelle transfer van partikelgebonden PAKs op het bladoppervlak naar de waslaag in het blad. Eens in de waslaag heeft regen/water geen invloed meer op de PAKs. Alfani et al. (2005) vonden dezelfde resultaten voor Quercus ilex bladeren. Liu et al. (2005) bevestigden de aanwezigheid van partikelgebonden (HMW) PAKs na een grondige wasstap van het plantmateriaal (mos). Dit bevestigt aldus eveneens de conclusie (Alfani et al., 2005). Sun et al. (2010) concludeerden echter dat er wel een significant verschil gevonden werd tussen gewassen en ongewassen bladeren in de kwantificatie van 16 US-EPA PAKs in Pinus massoniania, uitgezonderd voor naftaleen, acenafteen, acenaftyleen, antraceen en chryseen. Voor fenantreen bedroeg de concentratie tot 900 ng/g dw in ongewassen naalden en tot 250 ng/g in gewassen naalden. Aldus maximaal bijna een factor 4 verschil werd geobserveerd in het concentratieniveau tussen ongewassen en gewassen bladeren. Tevens speelt het seizoen waarin de stalen worden genomen een rol. Zo zal tijdens de winter een hogere concentratie PAKs gemeten worden dan in de zomer. Alfani et al. (2005) rapporteerden tot 4 keer hogere totaal concentraties van 16 US-EPA PAKs in Q. ilex bladeren in januari (± 3800 ng/g dw) t.o.v. in juli (± 100 ng/g dw). Wanneer de concentratie PAKs in de omgevingslucht daalt of stijgt, wordt dit waargenomen in de gemonitorde planten (Augusto et al., 2013; Alfani et al. 2005). Deze hogere concentraties in de winter zijn o.a. het gevolg van een hogere PAK-uitstoot

door

verwarming

in

gebouwen,

door

het

stabielere

weer

en

meer

temperatuursinversies, het gebruik van houtkachels en minder pyrolyseprocessen in de winter (De Nicola et al., 2005). In de zomer kan verlies optreden van PAKs door de hoge temperaturen (verhoogde 32

vluchtigheid van de componenten) en de hogere ozonconcentratie. Tevens is de luchtconcentratie aan deze componenten in de zomer lager (Vlaamse Milieumaatschappij, 2013). Volgens Hwang and Wade (2008) kennen vluchtige PAKs een grotere seizoenafhankelijkheid dan de zwaardere niet vluchtige PAKs. Deze bevinding werd gestaafd a.d.h.v. temperatuursregressie curves. De (negatieve) hellingen bedroegen -3,85, -1,99, -0,70 en -0,16 voor PAKs met 3-, 4-, 5- en 6-ringen respectievelijk. Deze seizoenale trends worden tevens vastgesteld voor Q. ilex (De Nicola et al., 2005), voor P. pinaster en P. pinea (Ratola et al., 2010a). Tevens spelen de eigenschappen van het blad zelf een belangrijke rol. De vetinhoud van naalden kan de PAK-concentratie beïnvloeden. Zo werd een seizoenale variatie gevonden in de vetinhoud van P. sylvestris naalden (Pallardy, 2008). De Nicola et al. (2011) ondervonden dat de vetinhoud van een-, twee- en driejarige Quercus ilex bladeren echter niet significant verschilt (14, 13 en 16 mg/g dw). Er werd echter geconcludeerd dat de vetinhoud van het blad sterk varieert tussen bladeren bemonsterd op andere staalnamesites. Deze vetinhoud varieert voor tweejarige bladeren vb. van 5 tot 25 mg/g dw tussen verschillende achtergrondlocaties (De Nicola et al., 2011). Concentratieniveaus kunnen vervolgens per gram droog gewicht of per gram vet uitgedrukt worden. De ouderdom van het bemonsterde blad kan het concentratieniveau van de targetcomponenten in het blad beïnvloeden. Ratola et al. (2011a) bevestigden dit door op 18 staalnamesites zowel tweejarige als driejarige Pinus brutia naalden en op 9 staalnamesites zowel tweejarige als driejarige Pinus pinea naalden te bemonsteren en het concentratieniveau van 16 US-EPA PAKs te kwantificeren. In 13 van de 18 sites van P. brutia naalden is het concentratieniveau tot 40 % hoger in de driejarige naalden. De mediaan van de totale PAK concentratie (over de 18 sites) bedroeg voor tweejarige en driejarige naalden respectievelijk 578 en 652 ng/g droog gewicht. In 8 van de 9 sites van P. pinea is het concentratieniveau tot 2,50 keer hoger in de driejarige naalden. De mediaan van de totale PAK concentratie bedroeg voor tweejarige en driejarige bladeren respectievelijk 179 en 307 ng/g droog gewicht. De oudste bladeren bevatten aldus de hoogste concentratie aan PAKs. De Nicola et al. (2011) kwantificeerden het concentratieniveau van de 16 US-EPA PAKs (naftaleen uitgezonderd), benzo[e]pyreen en peryleen in eenjarige, tweejarige en driejarige Quercus ilex bladeren voor 19 staalnameplaatsen. De mediaan van de totale PAK concentratie lag voor eenjarige, tweejarige en driejarige bladeren in een bereik van 1102 tot 1216 ng/g droog gewicht. De Nicola et al. (2011) concludeerden dat de ouderdom van Q. ilex bladeren geen effect heeft op de accumulatie van PAKs. Piccardo et al (2005) kwantificeerden het concentratieniveau van 4 vluchtige (fenantreen, antraceen, fluoreen en pyreen) en 5 minder vluchtige (benz[a]antraceen, chryseen, benzo[b]fluoranteen, benzo[k]fluoranteen en benzo[a]pyreen) US-EPA PAKs in Pinus nigra en Pinus pinaster naalden van 6, 18 en 30 maanden oud. De waargenomen trend bij beide species voor de vluchtige PAKs is een concentratietoename in de oudste naalden (401 ng/g dw fenantreen) van 600 % vergeleken met de jongste naalden (68 ng/g dw fenantreen). De niet-vluchtige PAKs daarentegen kenden een

33

concentratieverlaging van bijna een factor 3 in de oudste naalden (1,5 ng/g dw chryseen) vergeleken met de naalden van 6 maand oud (4,3 ng/g dw chryseen). Cabrerizo et al. (2012) onderzochten het concentratieniveau van PAKs in vegetatie ( o.a. mossen en algen) op Antarctica. In deze achtergrondregio, die zo goed als geen antropogene emissiebronnen kent, werd in mossen een concentratie in het bereik [4,4 - 34] ng/g dw en in algen een concentratieniveau in een bereik van [7 - 141] ng/g dw teruggevonden. De onderzochte PAKs waren de 16 US-EPA PAKs (zonder naftaleen, fenantreen, acenafteen en acenaftyleen), benzo[e]pyreen en peryleen. LMW componenten zijn in de grootste concentratie in elk type vegetatie aanwezig. Dit betekent dat meer vluchtige PAKs lange afstanden kunnen afleggen naar meer afgelegen gebieden (Cabrerizo et al., 2012). Deze concentratieniveaus zijn lager dan deze weergegeven in Figuur 2. De oorsprong van PAKs kan achterhaald worden m.b.v. PAK concentratie ratio’s (De Nicola et al., 2011; Doiegowska and Migaszewski, 2011; Lehndorff and Schwark, 2004; Migaszewski et al., 2009). Migaszewski en Doiegowksa (2011) stellen dat de Fenantreen/Antraceen (Fen/Ant) ratio en de Fluoranteen/Pyreen (Flu/Pyr) ratio geschikt zijn om PAKs van pyrolytische of petrogene processen te achterhalen. Deze Fen/Ant ratio is temperatuursafhankelijk. Lage Fen/Ant ratio’s gaan gepaard met hoge-temperatuur processen. Zo geeft een Fen/Ant ratio hoger dan 10 een petrogene input weer, d.i. afkomstig van petroleum emissies. Een Fen/Ant ratio lager dan 10 geeft een pyrogene input weer, d.i. afkomstig van verbrandingsprocessen van hout, petroleum, diesel, benzine etc. Wanneer de Flu/Pyr ratio hoger is dan 1, geeft dit een indicatie van pyrolytische processen, vnl. steenkoolverbranding. Andere auteurs geven aan dat wanneer de Flu/Pyr ratio een waarde tussen 1,5 en 2 bedraagt, dit gepaard gaat met verkeersemissies (Lehndorff and Schwark, 2004). Een derde belangrijke ratio is deze van Fen/(Fen+Ant), dewelke een indicatie geeft van verkeersemissies (Doiegowska and Migaszewski, 2011; Migaszewski et al., 2009). Ratio’s kunnen tevens gebaseerd zijn op het aantal ringen van de PAKs. Zo geeft de ratio (3+4ringen)/(totale PAKs) hoger dan 0,9 houtverbranding weer als pollutiebron, en geeft een waarde van 0,7 steenkoolverbranding weer als pollutiebron.

34

Concenrtatie [ng/g dw]

Acenafteen (203) Fluoreen (288) Fenantreen (300) Antraceen (292) Fluoranteen (221) Pyreen (300) Benzo[a]antraceen (333) Chryseen (327) Benzo[b]fluoranteen (292) Benzo[k]fluoranteen (282) Benzo[a]pyreen (291) Indeno[1,2,3-c,d]pyreen (221) Dibenzo[a,h]antraceen (214) Benzo[ghi]peryleen (229)

Fenantreen (300)

Antraceen (292)

Fluoranteen (221)

Pyreen (300)

Benzo[a]antraceen (333)

Chryseen (327)

Benzo[b]fluoranteen (292)

Benzo[k]fluoranteen (282)

Benzo[a]pyreen (291)

Indeno[1,2,3-c,d]pyreen (221)

Dibenzo[a,h]antraceen (214)

Benzo[ghi]peryleen (229)

0

Fluoreen (288)

100 Acenaftaleen (195)

200

Acenafteen (203)

300 Naftaleen (214)

400

Acenaftaleen (195)

500

Naftaleen (214)

Concenrtatie [ng/g dw] 5000

4000

3000

2000

1000

0

Figuur 2: Concentratieniveau 16 prioritaire US-EPA PAKs uit studies in de periode 2004 - 2014. Y-as: concentratieniveau [¦ng/g droog gewicht] ; X-as: de 16 US-EPA PAKs met aantal datapunten tussen haakjes vermeld. BOVEN: Globaal overzicht van alle data. ONDER: Zoom van figuur boven tot 500 ng/g droog gewicht. Whiskers: 10 en 90 percentiel.

35

5000

Concentratie [ng/g dw]

4000

3000

2000

1000

0

2-ring (214)

3-ring (1278)

4-ring (1181)

5-ring (1086)

6-ring (443)

2-ring (214)

3-ring (1278)

4-ring (1181)

5-ring (1086)

6-ring (443)

140

Concentratie [ng/g dw]

120 100 80 60 40 20 0 -20

Figuur 3: Concentratieniveau 16 prioritaire US-EPA PAKs uit studies in de periode 2004-2014 opgedeeld per ringklasse met aantal datapunten tussen haakjes vermeld. Y-as: concentratieniveau [ng/g droog gewicht] ; X-as: vijf verschillende ringklassen; BOVEN: Globaal overzicht van alle data. ONDER: Zoom van figuur boven tot 150 ng/g droog gewicht. Whiskers: 10 en 90 percentiel.

36

2. Doelstellingen Uit een uitgebreide literatuurstudie van in Web of Science geïndexeerde wetenschappelijke literatuur (2004–2014) over de bepaling van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAKs) in plantmateriaal bleek dat geen literatuur over kwantificatie van geoxideerde derivaten (Oxy-PAKs) in plantmateriaal beschikbaar was. Het doel van deze masterthesis is het ontwikkelen van een analytische methode voor de kwantificatie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen én geoxideerde derivaten in een plantspecies, daar nog geen enkele methode bestaat hiertoe in staat was. Dankzij de ontwikkeling van deze methode zal de eerste basis gelegd worden voor verder onderzoek in de kwantificatie van Oxy-PAKs in plantenmateriaal. Deze methode zal ontwikkeld worden m.b.v. Taxus baccata, daar dit species veelvoorkomend is en deze methode vervolgens gemakkelijk toepasbaar is in Gent. Uit literatuur blijkt dat PAKs kunnen accumuleren in de epicuticulaire waslaag op het blad. Om deze waslaag te visualiseren in Taxus baccata zal een microscopisch

bladpreparaat

gemaakt

worden.

In

de

literatuur

zijn

verschillende

extractietechnieken beschikbaar om PAKs te extraheren uit plantaardig materiaal. In de huidige mindset domineert een extractiemethode die het solventgebruik en de duurtijd reduceert tot een minimum, die deels tot volledig geautomatiseerd kan worden en aldus weinig arbeidsintensief is. Verhoogde druk vloeistof extractie komt hieraan tegemoet en zal geëvalueerd worden als extractietechniek. De extractietemperatuur dient hierbij geëvalueerd te worden alsook de mogelijkheid tot in-cell clean-up. Uit literatuur kon geconcludeerd worden dat Florisil de goede eigenschappen heeft om te dienen als in-cell clean-up sorbens. De hoeveelheid Florisil in de cel zal eveneens geëvalueerd worden. Indien deze in-cell clean-up niet volstaat ter zuivering van het extract kan een daaropvolgende zuiveringsstap uitgevoerd en geoptimaliseerd worden. GC-HRMS zal worden aangewend als scheidings- en detectietechniek om interferentie met matrixcomponenten te vermijden en identificatie van de doelcomponenten te bevorderen. Op deze manier kunnen lage detectielimieten verkregen worden. De evaluatie van de verschillende condities gegenereerd door het onderzoeken van verschillende extractietemperaturen en Florisil hoeveelheden (in-cell clean-up) zal gebaseerd zijn op zowel de individuele recoveries als de matrixeffecten voor elke component. In geen enkele studie, vermeld in Sectie 1, werden matrixeffecten meegenomen in de bepaling van een analytische methode ter kwantificatie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen. De finaal optimale methode zal toegepast worden op Taxus baccata bladeren in Gent.

37

3. Materiaal & Methoden Een overzicht van de benodigde chemicaliën en materialen wordt gegeven gevolgd door een overzicht van de geoptimaliseerde methode om zowel PAKs als Oxy-PAKs te kwantificeren in Taxus baccata bladeren. Tevens wordt de procedure om microscopische Taxus baccata bladpreparaten te maken, beschreven.

3.1.

Methodeontwikkeling voor kwantificatie van PAKs

en Oxy-PAKs in Taxus baccata bladeren 3.1.1. Chemicaliën Zestien polycyclische aromatische koolwaterstoffen die door de US-EPA als prioritair worden beschouwd (Figuur 4), werden geanalyseerd: naftaleen, acenaftyleen, acenafteen, fluoreen, fenantreen, antraceen, fluoranteen, pyreen, benzo[a]antraceen, chryseen, benzo[b]fluoranteen, benzo[k]fluoranteen,

benzo[a]pyreen,

indeno[1,2,3-cd]pyreen,

dibenzo[ah]antraceen

en

benzo[ghi]peryleen. Een mix van 16 US-EPA PAKs met een concentratie van 100 µg/mL tolueen (S4063-100-5t) werd verkregen bij Chiron AS (Trondheim, Noorwegen). Een stockoplossing van Oxy-PAKs werd bereid door Oxy-PAK kristallen (± 30 mg) te wegen met een microbalans (Sartorius, USA) en deze op te lossen in 250 mL DCM (100 µg/mL). 9H-Fluoreen-9-on (98 %), fluoreen-2-carboxaldehyde (99 %), anthraceen-9,10-dion (97 %), fenanthreen-9-carboxaldehyde (97 %) en pyreen-1-carboxaldehyde (99 %) werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (Bornem, België). Naftaleen-1,4-dion (99 %), naftaleen-1-carboxaldehyde (95 %), 10H-anthraceen-9-on (ACS-reagens) 1,8-naftaleenzuuranhydride (97 %), 7H-benzo[de]antraceen-7-on (99 %), benz[a]anthraceen-7,12-dion (99 %) en naftaceen-5,12-dion (97 %) werden aangekocht bij Acros Organics (Geel, België). Figuur 5 geeft de structuren van de targetcomponenten weer. Een oplossing van gedeuteerde PAKs (S-4124200-T, D-PAKs) en een mix van gefluoreerde PAKs (S-4103-ASS-T, F-PAKs) werd eveneens verkregen bij Chiron AS (Trondheim, Noorwegen). Deze bevatten respectievelijk naftaleen-d8, bifenyl-d10, fenantreen-d10, pyreen-d10, benz[a]antraceen-d12, benzo[a]pyreen-d10, benzo[ghi]peryleen-d12 (200 µg/mL tolueen) en 1-fluornaftaleen, 4-fluorbifenyl, 3-fluorfenantreen, 1-fluorpyreen, 3fluorchryseen en 9-fluorbenzo[k]fluoranteen (200 µg/mL tolueen).

39

Figuur 4: Overzicht van de16 PAKs die als prioritair beschouwd worden door US-EPA.

Figuur 5: Overzicht van de twaalf target geoxideerde PAKs.

40

3.1.2. Standaarden De Oxy-PAK oplossing en de oplossing van de 16 US-EPA PAKs werden gebruikt om zes kalibratiestandaarden te bereiden. Dichloormethaan ( 99.9% for residue analysis, for analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons, Acros Organics) werd aangewend als solvent voor de standaarden. Standaard 1 werd als volgt bereid: 50 µL Oxy-PAK oplossing, 50 µL 16 US-EPA PAK oplossing en 900 µL DCM. De zes kalibratiestandaarden (standaard 2 t.e.m. 7) werden bereid uit standaard 1. De concentraties waren de volgende: 1 – 0,5 – 0,1 – 0,05 – 0,01 – 0,005 µg/mL. De stockoplossing werd bewaard op -20°C, terwijl nieuwe kalibratiestandaarden werden bereid voor elke analyse. Aan alle standaarden werd 1 µL gefluoreerde PAK oplossing toegevoegd en 1 µL gedeuteerde PAK oplossing. Met deze standaarden werden kalibratiecurven opgesteld. Een uitgebreid overzicht van de instrumentele karakteristieken is gegeven in Tabel 7. Regressieanalyse (SPSS 22, IBM) op een kalibratiecurve gebaseerd op 6 punten gaf een goede lineariteit en determinatiecoëfficiënten (R²) hoger dan 0,997 (7H-benzo[de]antraceen-7-on) en 0,998 (benzo[k]fluoranteen,

dibenz[ah]antraceen)

werden

verkregen

voor PAKs

en

Oxy-PAKs,

respectievelijk. Intercepten met de Y-as waren niet significant verschillend van de oorsprong ( = 0.05). Intradag precisie voor PAKs varieerde van 1 % (naftaleen, fluoranteen) tot 6 % (chryseen). Intradag precisie voor Oxy-PAKs was lager met relatieve standaardafwijkingen (RSDs) variërend tussen 6 % (naftaleen-1-carboxaldehyde, fluoreen-2-carboxaldehyde, fenantreen-9-carboxaldehyde) en 15 % (pyreen-1-carboxaldehyde). Interdag precisie voor Oxy-PAKs is lager dan interdag precisie voor PAKs. Dertien van de 16 US-EPA PAKs vertoonden een interdag precisie lager dan 10 %. Voor 8 Oxy-PAKs werden RSDs lager dan 10 % bekomen. De stabiliteit van de retentietijden van de doelcomponenten is hoog, met RSDs variërend van 0,04 tot 0,15 % (n = 75). Instrumentele kwantificatielimieten lager dan 1 pg werden verkregen voor 12 US-EPA PAKs. De kwantificatielimiet voor naftaleen werd gedetermineerd op 0,1 pg, terwijl deze voor benzo[ghi]peryleen 0,9 pg bedroeg. De kwantificatielimiet voor fenantreen, antraceen, benzo[b]fluoranteen en benzo[k]fluoranteen is lichtjes hoger, maar blijft lager dan 5 pg. De kwantificatielimieten voor Oxy-PAKs liggen in hetzelfde bereik als deze voor PAKs. 9H-fluoreen-9-on kon gekwantificeerd worden wanneer 0,3 pg geïnjecteerd werd, terwijl fluoreen-2-carboxaldehyde pas gekwantificeerd kon worden wanneer 7 pg geïnjecteerd werd.

41

3.1.3. Analytische sequentie Figuur 6 geeft een algemeen overzicht van de monstervoorbereiding en scheiding en detectie.

3.1.3.1.

Staalname

Er werd gekozen voor Taxus baccata. Dit is een veel voorkomende plant in Gent, zowel in natuurlijke gebieden als in de stad.

3.1.3.2.

Staalvoorbereiding

Alle bladeren van Taxus baccata werden handmatig geplukt. Er werd gekozen om de bladeren niet te wassen om zo weinig mogelijk componenten te verliezen. Nadien werden ze bevroren met vloeibare stikstof (Air Liquide) en verkleind in een mortier. De gehomogeniseerde massa werd in een afgesloten recipiënt bewaard tot analyse. Blootstelling aan licht werd vermeden. Van elk staal werd het drogestof gehalte bepaald. Hiervoor werd 3 tot 5 g gehomogeniseerd materiaal (massainitieel) gedroogd in een oven bij 110 °C tot een constant gewicht (massana drogen) werd vastgesteld. Aan de hand van Vergelijking 1 werd het droge stofgehalte bepaald. droge stof gehalte [%]=

massana drogen massainitieel

x 100

[1]

Tabel 7: Intradag precisie (RSD van de hellingen van de kalibratiecurven), interdag precisie (RSD van het relatief piekoppervlak (RPO) van standaard 4), lineariteit (R²) en instrumentele detectie (iLOD) en kwantificatielimieten (iLOQ) van de doel PAKs en Oxy-PAKs. Intradag precisie (n=3) Gem. helling ± SD (RSD) PAKs Naftaleen Acenaftyleen Acenafteen Fluoreen Fenantreen Antraceen Fluoranteen Pyreen Benz[a]antraceen Chryseen Benzo[b]fluoranteen Benzo[k]fluoranteen Benzo[a]pyreen Dibenz[a,h]antraceen Indeno[1,2,3-cd]pyreen Benzo[ghi]peryleen Oxy-PAKs Naftaleen-1,4-dion Naftaleen-1-carboxaldehyde 9H-Fluoreen-9-on Fluoreen-2-carboxaldehyde 10H-Antraceen-9-on Antraceen-9,10-dion 1,8-naftaleenzuuranhydride Fenantreen-9-carboxaldehyde 7H-benzo[de]antraceen-7-on Pyreen-1-carboxaldehyde Benz[a]antraceen-7,12-dion Naftaceen-5,12-dion

42

R²

Interdag precisie (n=33) Gem. RPO ± SD (RSD)

iLOD (fg, n=18)

iLOQ (fg, n =18)

Gem. iLOD

Gem. iLOQ

5,14±0,03 (1) 2,39±0,06 (3) 1,42±0,04 (3) 1,93±0,05 (3) 4,82±0,12 (3) 4,08±0,09 (2) 4,13±0,05 (1) 4,52±0,13 (3) 5,01±0,19 (4) 5,89±0,35 (6) 5,87±0,21 (4) 7,85±0,14 (2) 5,12±0,10 (2) 3,57±0,17 (5) 4,69±0,23 (5) 4,13±0,09 (2)

0,9998 0,9996 0,9996 0,9995 0,9996 0,9998 0,9996 0,9998 0,9996 0,9994 0,9994 0,998 0,9997 0,998 0,9998 0,9999

0,48±0,03 (5) 0,19±0,03 (15) 0,11±0,02 (14) 0,14±0,01 (7) 0,41±0,02 (4) 0,33±0,02 (6) 0,33±0,01 (4) 0,38±0,02 (4) 0,41±0,03 (8) 0,44±0,04 (8) 0,44±0,03 (7) 0,55±0,05 (9) 0,42±0,02 (5) 0,25±0,03 (11) 0,34±0,03 (10) 0,34±0,03 (8)

39 106 183 75 471 669 78 68 78 73 1336 894 177 209 241 275

131 354 609 250 1570 2229 261 228 261 243 4453 2980 590 696 803 917

0,28±0,02 (8) 0,62±0,04 (6) 1,99±0,14 (7) 0,46±0,03 (6) 1,02±0,07 (7) 0,72±0,08 (10) 0,48±0,03 (7) 0,49±0,03 (6) 1,56±0,12 (8) 0,91±0,14 (15) 0,98±0,09 (10) 0,98±0,11 (11)

0,9994 0,9994 0,9996 0,998 0,998 0,9995 0,9994 0,999 0,997 0,999 0,998 0,998

0,02±0 (18) 0,05±0,01 (17) 0,21±0,01 (5) 0,04±0,01 (15) 0,09±0,02 (21) 0,07±0,01 (8) 0,04±0 (9) 0,04±0 (6) 0,09±0,01 (10) 0,08±0,01 (10) 0,04±0 (9) 0,07±0,01 (9)

243 86 83 2130 1494 101 213 173 1413 1304 395 419

811 287 276 7101 4980 337 710 576 4709 4347 1317 1398

STAALVOORBEREIDING STAALNAME Verse Taxus baccata Sectie 2.1.3.1

1. Bevriezen met vloeibaar stikstof 2. Homogeniseren m.b.v. een mortier Sectie 2.1.3.2

EXTRACTIE

ADDITIE F-PAKs 1 µL F-PAKs

PLE bij 200 °C van 3 g voorbehandelde T. baccata en 2,40 g diatomeeënaarde en 1 g Florisil in de cel met DCM Sectie 2.1.3.3

DROGEN Drogen over 10 g Na2SO4 Sectie 2.1.3.4

OPZUIVERING 1. Solventwisseling DCM:CH (1:1) 2. Elutie over SPE cartridge van 2 g Florisil met DCM:CH (1:1) Sectie 2.1.3.4

OPCONCENTRATIE Indampen met N2 bij 25 °C tot 0,5 mL Sectie 2.1.3.4

OPCONCENTRATIE 1. Indampen met N2 bij 25 °C tot de laatste drup 2. Toevoegen 1 mL DCM Sectie 2.1.3.4

INTERNE STANDAARDADDITIE

SCHEIDING & DETECTIE

1 µL D-PAKs

GC-HRMS

Sectie 2.1.4

Sectie 2.1.4

Figuur 6: Algemeen overzicht van de geoptimaliseerde analytische methode

43

3.1.3.3.

Extractie

Vóór de extractie werden de extractiecellen gezuiverd om contaminanten te verwijderen. De cellen werden hiervoor volledig gedemonteerd en 30 minuten in gedestilleerd water onderworpen aan ultrasone straling (Branson 2800 Ultrasonic Cleaner) om zouten te verwijderen. Deze reiniging werd herhaald met aceton. Nadien gingen de cellen minstens een nacht in een oven op 180 °C. Drie gram gehomogeniseerd materiaal werd m.b.v. verhoogde druk vloeistof extractie geëxtraheerd. De extracties werden uitgevoerd met een Dionex ASE 350 toestel met 22 mL extractiecellen. Dichloormethaan werd gebruikt als extractiesolvent. De belangrijkste variabele parameters zijn de extractietemperatuur [50 - 200 °C], het aantal extractiecycli [1 - 9], het spoelvolume [0 – 150 % v.h. celvolume] en de purgetijd [20 – 900 sec]. Het extractieproces zelf bestaat uit verschillende stappen. Eerst warmt de oven op tot de gewenste extractietemperatuur. Nadien wordt de cel in de oven geladen en wordt deze op dezelfde temperatuur gebracht. Een statische klep bevindt zich tussen de cel en de collectiefles. Deze is initieel gesloten. De pomp begint de cel te vullen tot de druk zo’n 10342 kPa bereikt. Het opwarmen van de cel heeft een vaste duurtijd afhankelijk van de extractietemperatuur. Dit om te verzekeren dat het staal thermisch evenwicht bereikt. De statische cyclus start. Tijdens deze statische cyclus opent de statische klep zich enkel wanneer de druk 11721 kPa bereikt. Na de statische cyclus wordt het solvent uit de cel in de opvangfles gepompt. Na de statische cyclus kan de cel eventueel opnieuw gevuld worden met solvent (spoelvolume). De hoeveelheid spoelvolume wordt uitgedrukt in functie van het volume van de cel. Zo betekent een spoelvolume van 100 % dat dezelfde hoeveelheid solvent als tijdens de extractie wordt gebruikt om de cel te spoelen. Indien twee statische cycli geselecteerd worden, wordt deze stap twee keer herhaald. Maximaal 9 cycli kunnen doorlopen worden. Na de extractie wordt resterend solvent uit de cel geperst m.b.v. N2 (Dionex corporation, 2008). Om de optimale methode te bepalen om zowel PAKs als Oxy-PAKs te kwantificeren uit Taxus baccata bladeren werd 1 statische cyclus van 5 minuten en een spoelvolume van 0 % geselecteerd. Dit betekent dat er slechts 1 celvolume gevuld werd met DCM om de cel te extraheren. Er werd gewerkt bij vier verschillende temperaturen: 50, 100, 150 en 200 °C. Aangezien het Dionex ASE 350 toestel een temperatuurbereik heeft van 50 tot 200 °C, werd zo het hele bereik overlopen. Bij een extractietemperatuur van 50 °C en 100 °C hoort een opwarmtijd van 5 min, bij 150 °C hoort een opwarmtijd van 7 min en bij 200 °C hoort een opwarmtijd van 9 min. Florisil werd toegevoegd in de cel om het extract reeds op te zuiveren tijdens de extractie. Florisil is een commercieel bereid silicamagnesium poeder (polair sorbens) en weerhoudt polaire componenten (Thermo Scientific, 2013). Er werd gewerkt met vier verschillende hoeveelheden Florisil (Sigma-Aldrich, Fluka analytical, 149 – 250 µm) in de extractiecel: 0, 1, 5 en 7,5 g. Het opvullen van de cel gebeurde steeds op eenzelfde wijze, te zien in Figuur 7. Allereerst werd een cellulosefilter (Dionex corporation, diameter 27 mm) geplaatst onderaan, daarbovenop volgde een 44

van bovenstaande hoeveelheden Florisil. Deze gelaagdheid met onderin het sorbent dient ter captatie van ongewenste matrixcomponenten en werd geprefereerd over een niet-gelaagde opbouw in de cel (Kettle, 2013). Daarbovenop volgde opnieuw een cellulosefilter en hierop kwam een mix van 3 g voorbehandeld staal en 2,40 gram diatomeeënaarde (Dionex corporation, Thermo scientific). Deze diatomeeënaarde heeft als doel het opvullen van de cel zodat zo goed als het volledige volume is ingenomen. Dit zorgt voor een reductie in solventgebruik. Tevens capteert deze diatomeeënaarde een deel van het aanwezige water in het extract en voorkomt ze het samenklitten van de bladeren. Finaal werd een extractietemperatuur van 200 °C en 1 g Florisil in de cel geselecteerd. De optimalisatie is beschreven in Sectie 4.2.

Figuur 7: Opvulling van de verhoogde druk vloeistofextractie cel.

3.1.3.4.

Extract zuivering

Het dichloormethaan extract werd over 10 gram natriumsulfaat (anhydrous Na2SO4, Sigma-Aldrich, ACS reagens >= 99,0%, poeder) gedroogd. Nadien werd het extract geëvaporeerd in proefbuisjes m.b.v. een stikstofstroom in de Turbovap (Caliper Life Sciences TurboVap LV Concentration Workstation) bij 25°C tot 0,5 mL overbleef in het proefbuisje. Een SPE cartridge van 2 g Florisil werd geconditioneerd met een 10 mL dichloormethaan:cyclohexaan (DCM:CH) (1:1) solventmengsel. Hierop werd 0,5 mL CH gebracht en onmiddellijk werd de 0,5 mL opgeconcentreerd extract getransfereerd van het proefbuisje naar deze SPE cartridge. Vervolgens werd 0,5 mL DCM in het proefbuisje gebracht, waar de wanden intensief mee gespoeld werden. Hieraan werd 0,5 mL CH toegevoegd en deze milliliter werd getransfereerd naar de SPE cartridge. Deze stap herhaalde zich nog 3 keer tot in totaal 5 mL over de SPE cartridge gebracht werd. Nadien werden grotere volumes van 5 mL in het proefbuisje en vervolgens op de SPE cartridge gebracht. Zo werd 30 mL solvent gebruikt om alle componenten te elueren van de SPE cartridge. Het opgezuiverd extract werd nu ingedampt met de Turbovap tot de laatste druppel. Hieraan werd 1 mL puur DCM toegevoegd samen met 1 µL D-PAKs en het extract werd geanalyseerd met de GC-HRMS. 45

3.1.4. Scheiding & Detectie Stalen werden geanalyseerd door een gaschromatograaf (GC, Thermo Finnigan) met een Restek Rxi17Sil MS kolom (30 m; 0.25 mm interne diameter (ID); 0,25 µm filmdikte; Interscience, Louvain-laNeuve, België). Een guard kolom (1 m; gedeactiveerd; 0,25 mm ID) diende ter bescherming van de analytische kolom. De Prgrammed Temperature Vaporisator (PTV) injector stond initieel op 28 °C in split modus (10 mL/min). Vervolgens werd de PTV op splitless modus gezet bij 28 °C tijdens injectiefase. Gedurende de evaporatiefase verhoogde de temperatuur met 1 °C/sec tot 50 °C en deze werd gedurende 1 minuut aangehouden. Vervolgens verhoogde de temperatuur met 14,5 °C/sec tot 320 °C bereikt werd tijdens de transferfase. Deze 320 °C werd gedurende 5 minuten behouden. Een minuut na het bereiken van deze 320 °C werd de split modus weer aangezet (10 mL/min). Tijdens de laatste fase, de cleaning phase, bleef de temperatuur op 320 °C en werd de splitflow verhoogd tot 50 mL/min. Het temperatuursprogramma van de GC kolomoven was als volgt: de initiële temperatuur bedroeg 70 °C gedurende 2,5 min, dan werd de temperatuur met 10 °C/min verhoogd tot 320 °C. Deze finale temperatuur werd behouden gedurende 15 minuten. Helium werd gebruikt als draaggas aan een constant debiet van 1 mL/min. Deze GC was gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometer (HRMS Mat95 XTrap, Thermo Finnigan) die werd ingesteld op een resolutie van 10 000. Volgens IUPAC, wordt de resolutie in massaspectrometrie gedefinieerd als zijnde het quotiënt van de m/z ratio van een bepaalde piek én het verschil met de m/z ratio van de volgende piek (IUPAC, 1997). Dit betekent dat m/z ratio’s van 100,00 en 100,01 van elkaar onderscheiden kunnen worden. De HRMS werkte in elektron impact (EI) modus bij 70 eV. De MS-transfer connectie werd opgewarmd tot 290 °C en de ionenbron staat op een temperatuur van 270 °C. Van de 70 onderzochte studies (2004–2014) wendde slechts één studie HRMS aan met een resolutie van 8000 (Ziegenhals et al., 2008). Acquisitiemodus was multiple ion detection (MID). Hierbij werd de accurate massa van de moederionen van de doelcomponenten op hun verwachte retentietijd gemonitord. De algemene vergelijking voor een sector massaspectrometer is weergeven in Vergelijking 2. m z

=

r² . B² . e 2.V

[2]

Hierin is m/z de massa over lading verhouding van de ionen, r de straal die de ionen volgen, e de massa van een elektron, B de magnetische veldsterkte en V de versnellingsspanning in de ionenbron. B werd vast gekozen en V bepaalde welk ion gemeten werd. Enkel vooraf in de methode ingevoerde massa’s werden gemeten. Hierdoor verbetert de signaal tot ruis verhouding (S/N) sterk. Om MID analyses uit te voeren is een unieke techniek beschikbaar. Dit is de lock-mass techniek (Figuur 8). Deze techniek is gebaseerd op twee referentiemassa’s rond de massa’s van de doelcomponenten. Er is een lock referentiemassa (L), deze is de massa die lager is dan deze van de doelcomponenten en er is een cali referentiemassa (C), deze is hoger dan de massa van de doelcomponenten. De lock en cali referentie-ionen zijn fragmentionen van perfluorokerosine (CnF2n+2, PFK). Dit is een organische 46

verbinding bestaande uit een koolwaterstofketen waarbij alle waterstofatomen vervangen zijn door fluoratomen. Alle onderzochte componenten worden onderverdeeld in MID vensters (Tabel 8).De lock- en cali-ionen in elk MID venster worden bepaald aan de hand van de intensiteit horende bij een bepaalde massa van deze PFK-ionen. De lock en cali massa worden dus gebruikt in de MID acquisitie vensters voor interne kalibratie. De exacte massa van acenafteen werd gewijzigd van 154,0777 naar 153,06988 daar te veel interferentie met matrixcomponenten aanwezig was. Deze MID mode wordt toegelicht voor het eerste venster Tabel 8. De doelcomponenten zijn naftaleen (T1), naftaleen-d8 (T2) en 1-fluornaftaleen (T3). Bij de start van elk tijdvenster wordt de magnetische veldsterkte B vastgezet op een massa lager dan de lock massa (m/z is 130,9915). Om de lock massapiek te bepalen wordt gescand in een klein venster rond de lock massa. Door het traag verlagen van het voltage V wordt de massapiek bij de lock massa gelokaliseerd. Pijl 1 in Figuur 8 geeft dit proces weer. Met behulp van een electrical jump wordt naar de kalibratiemassa C (m/z is 168,9883) gesprongen (pijl 2) en wordt deze gelokaliseerd (pijl 3). Deze twee referentiemassa’s zorgen dus voor de massakalibratie. Vervolgens wordt het voltage V stapsgewijs veranderd tot de massa’s van de doelcomponenten bereikt worden. Elke doelcomponent (T) kent een vooraf ingestelde meettijd (pijl 4). Tot slot is er een laatste electrical jump tot de cali massa C, weergegeven door pijl 5 (Hans-Joachim Hübschmann, 2009).

Figuur 8: MID kalibratie en acquisitie. L: lock referentiemassa; C: cali referentiemassa; T: doelcomponenten; T1 = naftaleen; T2 = naftaleen-d8; T3 = 1fluornaftaleen. X-as: massa over lading (m/z) verhouding; Y-as: Intensiteit.

Om een representatieve en reproduceerbare chromatografische piek te verkrijgen, zijn 8 tot 10 datapunten vereist per piek. Dit betekent dat de totale MID cyclustijd niet te groot mag zijn. Dit is de tijd nodig om een volledige cyclus (1 MID venster) te doorlopen en deze bedraagt 450 ms (Tabel 8). Piekintegratie werd uitgevoerd met Excalibur 1.4 software (Thermo scientific).

47

Fluoreen-2-carboxaldehyde 10H-Antraceen-9-on Antraceen-9,10-dion

3-Fluorfenantreen 9H-Fluoreen-9-on Fenantreen-d10 Fenantreen Antraceen

Acenaftyleen Naftaleen-1,4-dion Acenafteen Naftaleen-1-carboxaldehyde Fluoreen

4-Fluorbifenyl Bifenyl-d10

1-Fluornaftaleen Naftaleen Naftaleen-d8

Naam

Pyreen-d10 Pyreen-d10 Pyreen-d10 Pyreen-d10 Pyreen-d10

Fenantreen-d10 Fenantreen-d10 Fenantreen-d10

Fenantreen-d10 Fenantreen-d10 Fenantreen-d10 Fenantreen-d10

Bifenyl-d10 Bifenyl-d10 Bifenyl-d10 Bifenyl-d10 Fenantreen-d10

Bifenyl-d10 -

Naftaleen-d8 Naftaleen-d8 -

Interne standaard

20,44±0,01 20,69±0,01 21,06±0,01 21,11±0,01 21,17±0,01 21,37±0,01

19,46±0,01 19,55±0,01 19,83±0,01

16,89±0,01 17,00±0,01 17,29±0,01 17,36±0,01 17,44±0,01

13,13±0,01 13,23±0,01 13,44±0,01 14,21±0,01 14,67±0,01

11,57±0,02 11,69±0,02

8,72±0,01 8,96±0,01 8,90±0,01

tR (min), n=75

C5F7+ C5F9+ C16H10+ C16H9F+ C12H6O3+ C16D10+ C16H10+ C15H10O+

C5F7+ C5F9+ C14H10O+ C14H10O+ C14H8O2+

C3F7+ C5F7+ C14H9F+ C13H8O+ C14D10+ C14H10+ C14H10+

C3F5+ C3F7+ C12H8+ C10H6O2+ C12H10+ C11H8O+ C13H10+

C3F7+ C5F7+ C12H9F+ C12D10+

C3F5+ C3F7+ C10H7F+ C10H8+ C10D8+

Ion

192,9883 230,9851 202,0777 220,0683 198,0312 212,1405 202,0777 206,0726

192,9883 230,9851 194,0726 194,0726 208,0519

168,9883 192,9883 196,0683 180,0570 188,1405 178,0777 178,0777

130,9915 168,9883 152,0621 158,0362 153,06988 156,0570 166,0777

168,9883 192,9883 172,0683 164,1404

130.9915 168,9883 146,0526 128,0621 136,1123

[M]+

64 21 64 21 64 21 64 64

52 52 105 105 105

20 82 20 82 20 82 82

15 31 62 62 62 62 62

73 110 27 27

36 73 24 147 24

Dwell time (ms)

Tabel 8: MID vensters met bijhorende componenten, ionmassa’s, retentietijden (tR), meettijden en interne standaarden.

Component MID venster 1 (tR: 8'00" tot 10'16"); Cyclus tijd: 0,45 sec Lock-massa Kalibratie massa

MID venster 2 (tR: 10'16" tot 12'24"); Cyclus tijd: 0,45 sec Lock-massa Kalibratie massa MID venster 3 (tR: 12'24" tot 15'47"); Cyclus tijd: 0,45 sec Lock-massa Kalibratie massa

MID venster 4 (tR: 15'47" tot 18'27"); Cyclus tijd: 0,45 sec Lock-massa Kalibratie massa



Fluoranteen 1-Fluorpyreen 1,8-Naftaleenzuuranhydride Pyreen-d10 Pyreen Fenantreen-9-carboxaldehyde

48

49





Component MID venster 7 (tR: 22'37" tot 24'43"); Cyclus tijd: 0,45 sec Lock-massa Kalibratie massa

Dibenz[ah]antraceen Indeno[1,2,3-cd]pyreen Benzo[ghi]peryleen-d12 Benzo[ghi]peryleen

Benzo[a]pyreen-d12 Benzo[a]pyreen

Naftaceen-5,12-dion 9-Fluorbenzo[k]fluoranteen Benzo[b]fluoranteen Benzo[k]fluoranteen

Benzo[ghi]peryleen-d12 Benzo[ghi]peryleen-d12 Benzo[ghi]peryleen-d12

Benzo[a]pyreen-d12

Benz[a]antraceen-d12 Benzo[a]pyreen-d12 Benzo[a]pyreen-d12 Benzo[a]pyreen-d12

Benz[a]antraceen-d12 Benz[a]antraceen-d12 Benz[a]antraceen-d12

Benz[a]antraceen-d12 Benz[a]antraceen-d12 Benz[a]antraceen-d12

3-Fluorchryseen Benz[a]antraceen-d12 Benz[a]antraceen Chryseen 7H-Benzo[de]antraceen-7-on Pyreen-1-carboxaldehyde Benz[a]antraceen-7,12-dion

Interne standaard

Naam

30,82±0,02 30,85±0,02 31,97±0,02 32,09±0,02

27,73±0,01 27,79±0,01

26,38±0,01 26,45±0,01 26,83±0,01 26,89±0,01

25,05±0,01 25,11±0,01 25,60±0,01

23,85±0,01 24,10±0,01 24,17±0,01 24,38±0,01

tR (min), n=75

C6F11+ C7F13+ C22H14+ C22H12+ C22D12+ C22H12+

C5F9+ C6F11+ C20D12+ C20H12+

C5F9+ C6F11+ C18H10O2+ C20H11F+ C20H12+ C20H12+

C5F9+ C6F11+ C17H10O+ C17H10O+ C18H10O2+

C5F9+ C6F11+ C18H11F C18D12 C18H12 C18H12

Ion

280,9819 330,9787 278,1090 276,0933 288,1687 276,0933

230,9851 280,9819 264,1687 252,0933

230,9851 280,9819 258,0675 270,0839 252,0933 252,0933

230,9851 280,9819 230,0726 230,0726 258,0675

230,9851 280,9819 246,0839 240,1687 228,0934 228,0934

[M]+

65 65 65 65 21 65

65 65 26 131

39 78 78 26 78 78

38 57 115 115 115

61 61 24 24 122 122

Dwell time (ms)

3.2.

Microscopische opname Taxus baccata

De gevolgde procedure is gebaseerd op Ruzin (1999).

3.2.1. Staalname Meerjarige Taxus baccata bladeren (Figuur 9) werden handmatig verwijderd en overgebracht in een plastic buisje van 2 mL.

Figuur 9: Aanduiding geplukte Taxus baccata bladeren

3.2.2. Fixatie De eerste stap die plaatsvond is het fixeren van het vers materiaal. Dit betekent dat alle levende structuren gedood worden zodat geen autolyse optreedt en aldus de weefsels bewaard blijven. De fixator die hiervoor aangewend werd, bestaat uit 5 mL formaldehyde, 5 mL azijnzuur en 90 mL ethanol 70 % (FAA). De Taxus baccata bladeren bleven minstens 24 uur in FAA.

3.2.3. Dehydratatie Na de fixatiestap werd het plantmateriaal gedehydrateerd via acht opeenvolgende stappen. Tabel 9 geeft de samenstelling van de vereiste oplossingen in de eerste vijf stappen weer waaraan het plantmateriaal telkens 24 uur werd blootgesteld. Tertiair butanol werd verwarmd tot boven het smeltpunt van 25 °C. Stap 1 t.e.m. 5 vonden plaats bij kamertemperatuur. Na stap 5 werd de inhoud van het plastic buisje, d.i. het plantmateriaal in tertiair butanol, samen met gesmolten paraffinepellets overgebracht naar een ovenvaste afgesloten beker en in de oven op 60 °C geplaatst. Na 24 uur werd het gesmolten paraffine en resten van tertiair butanol vervangen door zuiver gesmolten paraffine. Na opnieuw 24 uur is al het tertiair butanol in het plantmateriaal vervangen door paraffine en werd het plantmateriaal uit de oven gehaald. De paraffine samen met het plantmateriaal werd getransfereerd naar een papieren cup. De paraffine in de papieren cup werd op kamertemperatuur afgekoeld (24 u). Tabel 9: Eerste vijf stappen in de dehydratatiestap van het plantmateriaal.

50

Stap

Ethanol 70% [mL]

Tertiair butanol [mL]

H2O [mL]

Duurtijd [uur]

1

80

15

5

24

2

65

35

0

24

3

45

55

0

24

4

25

75

0

24

5

0

100

0

24

3.2.4. Snijden Wanneer de paraffine volledig gestold is, kunnen blokjes die het plantmateriaal bevatten uit deze paraffine gesneden worden. Het blad moet langs alle zijden omgeven zijn door minstens 3 mm paraffine. Deze blokjes werden gesneden m.b.v. een scalpel en werden vervolgens op een houten kubus van 1,5 x 2 x 4 cm bevestigd met gesmolten paraffine. De coupes werden gemaakt m.b.v. een rotatiemicrotoom. Hierop werden de blokjes hout bevestigd en plantcoupes (10 µm dik) afgesneden. Deze dunne paraffinecoupes werden vervolgens enkele seconden in 40 % ethanol gebracht en daaropvolgend enkele minuten in warm gedestilleerd water. Dit zorgt ervoor dat de paraffinecoupes vlak worden. De coupes werden uit het water gehaald en op een microscoopglaasje gelegd. Gedurende 1 nacht werden deze op een plaat van 40 °C gedroogd (Van Cotthem and Fryns-Claessens, 1994).

3.2.5. Kleuring Een kleuring werd uitgevoerd met zowel safranine als fastgreen. Deze twee kleurstoffen samen zorgen ervoor dat de kernen en de celwanden gekleurd worden. Tabel 10 geeft een overzicht weer van de opeenvolgende stappen en bijhorende duurtijd van deze kleurstap. Vooraleer te starten met deze kleuring werden de microscoopplaatjes met de paraffinecoupes in een speciaal daarvoor ontwikkeld glazen beker gebracht waar ze met 10 plaatjes tegelijkertijd kunnen worden gekleurd. De safranineoplossing werd als volgt bereid: 4 g safranine werd opgelost in 100 mL 96 % ethanol, 100 mL gedestilleerd water, 4 g natriumacetaat en 8 mL formaldehyde. De Fastgreen oplossing werd als volgt bereid: 200 mg Fastgreen werd opgelost in 100 mL 96 % ethanol. De kleuring was de laatste stap in de hele procedure. Na deze stap zijn de preparaten klaar om een microscopische analyse te ondergaan. Tabel 10: Sequentie van opeenvolgende stappen in het kleuringsproces voor Taxus baccata bladeren. Stap

Oplossing

Duurtijd [min]

Stap

Oplossing

Duurtijd [min]

1

Xyleen

20

10

Ethanol 96% + 1-butanol (1:1)

5

2

Xyleen + ethanol 96% (1:1)

5

11

1-butanol or ethanol 70 %

5

3

Ethanol 96%

3

12

Fastgreen

5 - 15

4

Ethanol 85%

3

13

Ethanol 85 %

5

5

Ethanol 70%

3

14

Ehanol 96 %

5

6

Safranine in 50% ethanol

420

15

Ethanol 96% + xyleen (1:1)

5

7

Kraantjeswater

<1

16

Xyleen

10

8

Gedistilleerd water

<1

17

Canadabalsem

-

9

Ethanol 96% + 5 druppels NH3

<1

18

Bedek plaatje

-

51

4. Resultaten & Discussie Na een uitgebreide literatuurstudie van in Web of Science geïndexeerde wetenschappelijke literatuur (2004–2014) over de bepaling van PAKs en Oxy-PAKs in plantmateriaal werd vastgesteld dat tot nu toe geen kwantificatie van deze Oxy-PAKs werd uitgevoerd. Vanwege de schadelijke eiegenschappen van deze Oxy-PAKs (Sectie 1.1) is het van belang deze toch te onderzoeken. Daarom werd een analytische methode ontwikkeld om zowel niet gesubstitueerde PAKs als Oxy-PAKs in Taxus baccata bladeren te kwantificeren. Allereerst worden de microscopische bladpreparaten besproken. Vervolgens wordt de optimalisatie van de verhoogde druk vloeistofextractie besproken, gevolgd door de optimalistie van de zuiveringsstap m.b.v. een vaste extractie cartridge. De geoptimaliseerde methode wordt toegepast door Taxus baccata van verschillende locaties in Gent te bemonsteren. Zowel het concentratieniveau van niet-gesubstitueerde PAKs als van Oxy-PAKs in Taxus baccata bladeren wordt bepaald. Tot slot wordt de opbouw van een Taxus baccata blad besproken aan de hand van bladpreparaten.

4.1.

Microscopische opname Taxus baccata

Figuur 10 geeft de dwarsdoorsnede weer van een Taxus baccata blad, bekomen via de procedure uit Sectie 3.2. Verschillende structuren zijn hierop aangeduid. De donker gekleurde cellen in het sponsparenchym en in de epidermis weerhouden de dafranine om ongekende reden sterker dan andere cellen. Een duidelijke dubbele laag palissadeparenchym is aanwezig aan de bovenkant van het blad. De huidmondjes zijn niet duidelijk te onderscheiden in de epidermis onderaan het blad. De wazige laag die zich op de epidermis bevindt is de cuticula. Dit is een waslaag die in staat is PAKs en Oxy-PAKs te capteren en te accumuleren (Sectie 1.1). Deposities van deze componenten zijn echter niet zichtbaar op deze coupes.

Figuur 10: Microscopische opname: dwarsdoorsnede Taxus baccata blad. Vergroting 4 x.

53

4.2.

Optimalisatie: verhoogde druk vloeistofextractie

In deze studie werd Taxus baccata geselecteerd als biomonitoringspecies. Dit omdat dit een veel voorkomende plant is in Gent. Taxus baccata is reeds aangewend als biomonitoring species in het onderzoek naar stedelijke pollutie met zware metalen in Polen (Samecka-Cymerman et al., 2011). Als extractietechniek werd verhoogde druk vloeistofextractie aangewend met dichloormethaan als extractiesolvent. Deze extractietechniek zorgt voor een sterke reductie in tijd en solventgebruik. Tevens kan deze techniek grotendeels geautomatiseerd worden. Een in-cell clean-up werd geëvalueerd. Het doel van een in-cell clean-up is het weerhouden van matrixcomponenten (vb. chlorofyl) tijdens de extractie waardoor reeds na de extractie zuivere extracten verkregen worden. Op deze manier kan een minder intense zuiveringsstap uitgevoerd worden. Een gelijktijdige PLE en clean-up resulteert in een reductie in analysekosten, solventgebruik en arbeidsintensiteit (Haglund and Spinnel, 2011). Een PLE met in-cell clean-up m.b.v. silica werd uitgevoerd om humus bestanddelen en andere polaire niet-targetcomponenten te weerhouden tijdens de extractie in de kwantificatie van PAKs in bodemstalen (Ong et al., 2003). Een andere studie die PAKs kwantificeerde uit sedimentstalen voerde PLE uit met een in-cell clean-up met een mix van silica en kopergranules om zowel polaire niet-targetcomponenten als zwavel te weerhouden (Kim et al., 2003). Studies die deze techniek uitvoeren op plantmatieriaal zijn echter beperkt (Foan and Simon, 2012; Foan et al., 2010). Florisil werd in deze studies aangewend als sorbens voor in-cell clean-up. Om tot de optimale extractiemethode te komen in deze masterthesis werd de invloed van de extractietemperatuur en de hoeveelheid Florisil in de cel geëvalueerd. Vier verschillende extractietemperaturen [50 – 100 – 150 - 200 °C] en vier verschillende Florisil hoeveelheden in de cel [0 – 1 – 5 – 7,5 g] werden getest. Zestien verschillende extractiecondities werden bekomen. De zestien bijhorende extracten worden weergegeven in Figuur 11. Eerst worden de extracten kwalitatief vergeleken. Wanneer de extactie werd uitgevoerd bij 50 °C werd een troebel extract bekomen wanneer geen Florisil toegevoegd werd aan de cel. Wanneer daarentegen wel Florisil werd toegevoegd zijn de extracten helder. De extractiecellen die 5 of 7,5 g Florisil bevatten leverden kleurloze extracten op. Dit impliceert dat vanaf 5 g Florisil al het chlorofyl (en eventuele degradatieproducten) uit de bladeren weerhouden werd door het Florisil. Bij de extractie bij 100 °C werden lichtgroene troebele extracten bekomen wanneer geen of 1 g Florisil werd toegevoegd aan de cel. Een opmerkelijke verandering ten opzichte van de conditie bij 50 °C is de aanwezigheid van waterdruppels in deze extracten. De extracten bij 5 of 7,5 g Florisil daarentegen zijn helder, kleurloos en bevatten geen water. Bij de extractie bij 150 °C waren de extracten van de stalen waaraan geen of 1 g Florisil werd toegevoegd troebel en bevatten een waterlaag. De stalen waarbij 5 of 7,5 g Florisil toegevoegd werd aan de cel gaven heldere extracten, maar deze waren donker van kleur door de aanwezigheid van niet- targetcomponenten die niet gebonden waren op het in de cel aanwezige Florisil. Bij een extractietemperatuur van 200°C volstond geen enkele van de vooraf gedefinieerde Florisil hoeveelheden om een helder extract te verkrijgen.

54

Figuur 11: Overzicht van de zestien dichloormethaan extracten verkregen na extractie met een Dionex ASE 350 toestel bij de zestien verschillende condities (50 °C – 100 °C – 150 °C – 200 °C en 0 – 1 - 5 – 7,5 g Florisil in de cel). Een statische cyclus met een statische cyclus tijd van 5 min en 0 % spoelvolume werd geselecteerd. A: Het extract werd gefiltreerd over een SPE cartridge van 1 g Florisil. B: Het extract ondergaat filtratie over 2 g Florisil.

Belangrijke factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij methodeontwikkeling is het verkrijgen van een hoge recovery (REC) en het reduceren van matrixeffecten (ME) voor elke component. De recovery van een component is het percentage van die component dat teruggevonden wordt na de hele analyseprocedure t.o.v. de initieel aanwezige hoeveelheid component op de bladeren. Matrixeffecten worden omschreven als een afzwakking of versterking van de detectorrespons van een component in matrixoplossing ten opzichte van in zuiver solvent. Onzuiverheden in het staal kunnen concurreren met de targetcomponenten om te binden op de actieve plaatsen in de GC injector en kolom. Hierdoor binden targetcomponenten niet op deze actieve plaatsen en treedt er minder sorptie en degradatie van de doelcomponenten op wat voor een verhoogd signaal kan zorgen (Li et al., 2012). Anderzijds kan er interactie optreden van de targetcomponent met de matrix waardoor meer afbraak van de targetcomponent optreedt. Tevens kunnen de interferenten het ionisatieproces van de doelcomponenten versterken of verzwakken. Hierdoor kan een hogere of lagere respons van de targetcomponenten verkregen worden. Concreet zijn matrixeffecten dus de respons van een staal in een vuile matrix ten opzichte van de respons in een proper solvent. Om deze te kwantificeren werd een postextractie additie uitgevoerd (Taylor, 2005). Na een uitgebreide literatuurstudie van in Web of Science geïndexeerde wetenschappelijke literatuur (2004 – 2014) over de bepaling van deze componenten in plantmateriaal werd vastgesteld dat tot nu toe geen dergelijke kwantificatie van matrixeffecten werd uitgevoerd. De concentratieniveaus die in deze literatuur bepaald werden, zijn hiervoor niet gecorrigeerd. Om zowel recovery als matrixeffecten te bepalen werden per conditie (extractietemperatuur en Florisil hoeveelheid) drie dezelfde stalen (n=3) onderworpen aan extractie. Een schematische 55

weergave is te zien in Figuur 12. De troebele extracten (Figuur 11 A en B) konden echter niet direct worden geanalyseerd (te veel niet-targetmacromoleculen aanwezig), dus werd een extra zuiveringsstap uitgevoerd. Het extract (Figuur 11 A) werd hierbij gefiltreerd over een SPE cartridge met 1 g Florisil. Het extract bij 200 °C en 0 g Florisil onderging deze extra zuiveringstap twee keer (Figuur 11 B). Alle extracten werden ingedampt met een stikstofstroom in een Turbovap tot een volume van 1 mL. Hieraan werd 1 µL D-PAK oplossing toegevoegd en de extracten werden geanalyseerd met GC-HRMS. Deze drie stalen werden op een verschillende wijze gespiked met 20 µL Standaard 1 (100 ng voor elke US-EPA PAKs en tussen 99,6 en 130 ng per Oxy-PAKs) en 1 µL F-PAK oplossing (tussen 0,1 en 0,201 ng per F-PAK). De gebruikte Standaard 1 oplossing bevat geen D-PAKs. Zo werd het eerste van deze drie stalen vóór de extractie gespiked met beide oplossingen (prespike), het tweede staal werd niet gespiked (nospike) en het derde staal werd na (postspike) de eventuele zuiveringsstap gespiked met beide oplossingen. D-PAK oplossing (1 µL of tussen 0,196 en 0,199 ng per D-PAK) werd na de hele procedure, vóór analyse met GC-HRMS, toegediend aan elk van de drie stalen. Deze procedure werd voor elke combinatie van onderzochte extractietemperatuur en hoeveelheid Florisil in de cel uitgevoerd (n=16). Recovery wordt bepaald a.d.h.v. Vergelijking 3; matrixeffecten worden bepaald a.d.h.v. Vergelijking 4. Beiden worden bepaald op basis van het relatief piekoppervlak (RPO) van de component. Het RPO werd gedefinieerd als de verhouding van de respons (piekoppervlak) van de component t.o.v. de respons van de overeenkomstige interne standaard. Bijhorende interne standaard per component werd weergegeven in Tabel 8. In Verglijkingen 3 en 4 geven massapost spike, massapre spike en massano spike, respectievelijk de massa (droge stof) weer van het overeenkomstige geëxtraheerde staal. RPOno spike

REC [%] =

ME [%]=

RPOpre spike -massa

×massapre spike

RPOpost spike -massa

×massapost spike

no spike RPOno spike

no spike

RPOno spike RPOpost spike ×massapost spike massano spike

RPOstandaard4

×100

×100

[3]

[4]

Optimaal zijn een REC en ME van 100 %. Indien de REC lager is dan 100 % betekent dit dat er minder van deze component teruggevonden werd in het staal dan er effectief aanwezig was op de plant. Indien de waarde van de ME lager is dan 100 %, betekent dit dat de respons van GC-HRMS procentueel verzwakt werd met de afwijking van die waarde tot de 100 % grens en vice versa. REC en ME worden in Figuur 13 t.e.m. Figuur 16 weergegeven voor alle componenten in de vorm van boxplots per extractietemperatuur en hoeveelheid Florisil in de cel. Acenafteen, 1,8-naftaleenzuuranhydride en 10H-antraceen-9-on konden niet gekwantificeerd worden. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat geen opconcentratiestap plaats heeft gevonden. De boxplots maken duidelijk dat er grote verschillen zijn tussen de diverse condities, in de ligging van de mediaan en in de spreiding van de resultaten. Dit laatste betekent dat REC en ME sterk verschillen tussen de doelcomponenten. De blauw gekleurde banden in Figuur 13 t.e.m Figuur 16 geven een REC en ME weer tussen 0 en 75% en een REC en ME 56

boven 125 %. Slechts twee condities hebben een REC tussen 75% en 125 %, nl. 1) 150 °C en 5 g Florisil in de cel en 2) 200 °C en 1 g Florisil in de cel. 80 % van alle PAKs en 60 % van alle Oxy-PAKs liggen in dit interval bij 150 °C en 5 g Florisil. 87 % van de 15 PAKs en 60 % van alle Oxy-PAKs liggen in dit interval bij 200 °C en 1 g Florisil. Bij een lage extractietemperatuur (50 °C) worden lage RECs waargenomen. Bij 100 °C wordt een duidelijke trend waargenomen. Stalen bij 0 en 1 g Florisil in de cel hebben allebei een SPE clean-up stap ondergaan; stalen bij 5 en 7,5 g Florisil in de cel niet. Bij een verhoging van het Florisil gehalte in de cel (1 g t.o.v. 0 g en 7,5 g t.o.v. 5 g) worden lagere RECs geobserveerd. Bij 200 °C hebben alle extracten een clean-up stap ondergaan en daalt de REC eveneens met toenemend gehalte Florisil in de cel. Wanneer de hoeveelheid Florisil in de cel toeneemt kan dit gezien worden als een langere kolom van sorbent, waardoor meer component gebonden werd op de functionele groepen op het oppervlak van het Florisil (Rozita Osman, 2012). Bij 150 °C wordt deze trend niet duidelijk waargenomen. Dit kan te wijten zijn aan de hoge ME voor deze conditie. De twee mogelijk optimale condities moeten eveneens geëvalueerd worden voor matrixeffecten. Uit Figuur 15 en Figuur 16 volgt dat 80 % van alle PAKs en slechts 16 % van alle Oxy-PAKs liggen in het interval [75 – 125 %] bij 150 °C en 5 g Florisil. 54 % van alle PAKs en 58 % van alle Oxy-PAKs liggen in dit interval bij 200 °C en 1 g Florisil. Op basis van deze bevindingen en het feit dat de ligging van de mediaan voor deze conditie optimaal is, kan besloten worden dat een extractietemperatuur van 200 °C en 1 g Florisil in de cel de meest optimale resultaten geeft voor verder onderzoek.

57

Figuur 12: Algemeen overzicht van het vullen van de ASE extractie cel tot het analyseren m.b.v. een GC-HRMS. Drie manieren van spiken worden weergegeven. Bovenaan: Het monster werd gespiked voor de analyseprocedure (pre spike). Midden: Het monster werd niet gespiked (no spike). Onderaan: Het monster werd na de procedure gespiked (post spike). RPO = Relatief Piek Oppervlak.

58

Figuur 13: Recovery [%] voor US-EPA PAKs. A: 50 °C; B: 100 °C; C: 150 °C; D: 200 °C.

59

Figuur 14: Recovery [%] voor Oxy-PAKs. A: 50 °C; B: 100 °C; C: 150 °C; D: 200 °C.

60

Figuur 15: Matrixeffecten [%] voor US-EPA PAKs. A: 50 °C; B: 100 °C; C: 150 °C; D: 200 °C

61

Figuur 16: Matrixeffecten [%] voor Oxy-PAKs. A: 50 °C; B: 100 °C; C: 150 °C; D: 200 °C.

62

4.3.

Optimalisatie: extract zuivering

Na de verhoogde druk vloeistofextractie kan het opgeconcentreerde extract niet onmiddellijk geanalyseerd worden daar dit te veel interfererende moleculen bevat die de GC liner en guard kolom vervuilen. Deze vervuiling zorgt voor interferenties en chromatografische piekverbreding. Om deze reden is verdere zuivering van het extract noodzakelijk. Gedurende de experimentele periode was het nodig om op geregelde tijdstippen de GC liner en guard kolom te vervangen. Na de verhoogde druk vloeistofextractie bij 200 °C en 1 g Florisil in de cel is er water aanwezig in het extract dat geëlimineerd moet worden voor de opconcentratiestap (indampen m.b.v. een stikstofstroom met N2) en voor de opzuiveringstap m.b.v. een vaste fase extractie cartridge met 2 g Florisil. Daarom werd dit extract gefiltreerd over 10 gram natriumsulfaat (anhydrous Na2SO4, SigmaAldrich). Bij het aanwenden van SPE opzuivering is het van cruciaal belang het benodigde elutievolume te bepalen. Daarom werd een een SPE cartridge van 2 g Florisil geconditoneerd met 10 mL DCM. Nadien werd een gekende hoeveelheid PAKs en Oxy-PAKs in 0,5 mL DCM op deze cartridge geladen. Daarna werd een elutie toegepast met DCM en werd elke milliliter opgevangen in een GCflesje waaraan 1 µL D-PAK oplossing werd toegevoegd. Vervolgens werden alle GC-flesjes geanalyseerd met GC-HRMS. Dit laat toe een cumulatief elutieprofiel op te stellen voor elke component, een voorbeeld is gegeven in Figuur 17. Dit laat eveneens toe om het benodigde elutievolume te bepalen. Figuur 17 toont dat ± 7,5 mL DCM per gram Florisil volstaat om pyreen

% Relatief Piekoppervlak

volledig te elueren. 120 100 80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

mL DCM / 2 g Florisil Figuur 17: Cumulatief elutieprofiel van Pyreen bij elutie met DCM. X-as: Aantal mL DCM vereist per 2 gram Florisil; Y-as: Percentage van het RPO.

Tabel 11 geeft weer hoeveel mL DCM nodig is voor 90 en 100 % elutie van de targetcomponenten te verkrijgen op 2 g Florisil. Voor PAKs ligt deze 90 % elutie waarde in een bereik van 4,5 mL (acenafteen, acenaftyleen, fluoreen, fenantreen, antraceen, fluoranteen, pyreen, benzo[a]antraceen en chryseen) tot 6,5 mL (naftaleen). Voor Oxy-PAKs ligt deze 90 % elutie waarde in een bereik van 6 mL (naftaleen1-carboxaldehyde) tot 19,5 mL (naftaleen-1,4-dion). Het minimaal solventvolume vereist voor 90 of 100 % elutie van Oxy-PAKs is groter dan het minimaal volume vereist tot 90 of 100 % elutie van PAKs. Dit is te wijten aan de grotere polariteit van Oxy-PAKs, waardoor meer retentie werd geobserveerd. 63

1,8-naftaleenzuuranhydride en naftaceen-5,12-dion konden niet gekwantificeerd worden. Daar geen opconcentratiestap plaatsvond, kunnen deze componenten onder de detectielimiet aanwezig zijn. Tabel 11 geeft tevens de recovery weer van elke targetcomponent na elutie op een SPE cartridge van 2 g Florisil. Deze wordt bepaald a.d.h.v. Vergelijking 5. De recovery ligt in een bereik van 93 % (acenaftyleen) tot 110 % (fluoranteen) voor PAKs en van 42 % (naftaleen-1,4-dion) tot 103 % (pyreen1-carboxaldehyde) voor Oxy-PAKs. De massa PAKs en Oxy-PAKs geladen op de cartridge is 200 ng voor elke US-EPA PAK en tussen 199 en 260 ng per Oxy-PAK. 𝑅𝐸𝐶 (%) =

∑𝑅𝑃𝑂𝑠𝑡𝑎𝑙𝑒𝑛 𝐺𝐸𝑀 𝑅𝑃𝑂𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑎𝑟𝑑 4

∗ 100 %

[5]

Vervolgens werd deze procedure herhaald met een Taxus baccata extract. De ASE extractiecel werd gevuld op de wijze aangegeven in Figuur 7. Na de verhoogde druk vloeistofextractie, bij 200 °C en 1 g Florisil in de cel, werd het extract ingedampt tot 0,5 mL m.b.v. N2 in een Turbovap. Deze halve milliliter extract werd op een cartridge van 2 g Florisil gebracht. Zuiver DCM werd vervolgens mL per mL op de cartridge gebracht. Uit Tabel 11 blijkt dat 25,5 mL DCM vereist is tot volledige elutie van de laatste component (naftaleen). Echter na toevoegen van 3 mL DCM werd doorbraak van een zwarte band van interfererende componenten (waarschijnlijk macromoleculen) waargenomen. Wegens deze doorbraak werd geopteerd voor een minder polair elutiesolvent, nl een (1:1) oplossing van DCM en cyclohexaan. Vervolgens werd eenzelfde elutie-experiment uitgevoerd met DCM:CH (1:1). De SPE cartridge van 2 g Florisil werd geconditioneerd met 10 mL DCM:CH (1:1). Vervolgens werd een gekende hoeveelheid PAKs en Oxy-PAKs (200 ng voor elke US-EPA PAK en tussen 199 en 260 ng per Oxy-PAK) in 0,5 mL DCM geladen op deze cartridge en elutie werd uitgevoerd met DCM:CH (1:1). Tabel 11 geeft weer hoeveel mL DCM:CH (1:1) nodig is om 90 en 100 % elutie van de targetcomponenten te verkrijgen op 2 g Florisil. Voor PAKs ligt deze 90 % elutie waarde in een bereik van 4,5 mL (naftaleen, acenafteen, acenaftyleen, fluoreen, fenantreen, antraceen, fluoranteen, pyreen, benzo[a]antraceen, pyreen, chryeen, benzo[b]fluoranteen, benzo[k]fluoranteen en benzo[a]pyreen) tot 6 mL (dibenzo[a]antraceen, indeno[1,2,3-cd]pyreen en benzo[ghi]peryleen). Voor Oxy-PAKs ligt deze 90 % elutie waarde in een bereik van 7,5 mL (naftaleen-1-carboxaldehyde) tot 33 mL (7Hbenzo[de]antraceen-7-on). Eveneens in dit experiment is het minimaal solventvolume vereist tot 90 of 100 % elutie van Oxy-PAKs groter dan het minimaal volume vereist tot 90 of 100 % elutie van PAKs. Het volume vereist voor een volledige elutie is 34,5 mL. Volgende componenten konden niet gekwantificeerd worden: naftaleen-1,4-dion, naftaceen-5,12-dion en 1,8-naftaleenzuuranhydride. De recovery (Vergelijking 5) ligt in een bereik van 84 % (fluoreen) tot 131 % (fenantreen) voor PAKs en van 21 % (10H-antraceen-9-on) tot 120 % (naftaleen-1-carboxaldehyde) voor Oxy-PAKs. De recovery van de targetcomponenten is beter (100 % is optimaal) wanneer DCM aangewend wordt als elutiesolvent, maar wegens doorbraak van interfererende componenten kan DCM niet aangewend worden als elutiesolvent.

64

Hierna werd een elutie-experiment uitgevoerd met een extract. Na de verhoogde druk vloeistofextractie, bij 200 °C en met 1 g Florisil in de extractiecel, werd het dichloormethaan extract gedroogd over 10 g natriumsulfaat en vervolgens ingedampt tot 0,5 mL. Hieraan wordt 40 µL Standaard 1 en 1 µL F-PAK oplossing toegevoegd. Een SPE cartridge van 2 g Florisil werd geconditioneerd met 10 mL DCM:CH (1:1). Wanneer 0,5 mL CH toegevoegd werd aan het opgeconcentreerde extract (0,5 mL) in het proefbuisje om een (1:1) DCM:CH oplossing te verkrijgen, werd een neerslag waargenomen op de wanden van het proefbuisje. Om te voorkomen dat targetcomponenten neerslaan, werd het CH direct op de geconditioneerde SPE cartridge gebracht en werd vervolgens het DCM extract naar de SPE cartridge getransfereerd. Vervolgens werd het proefbuisje gespoeld met 1 mL DCM:CH (1:1). Deze milliliter werd vervolgens op de SPE cartridge gebracht. Tabel 11 geeft weer hoeveel mL DCM:CH (1:1) nodig is om 90 en 100 % elutie van de targetcomponenten te verkrijgen op 2 g Florisil. Voor PAKs ligt deze 90 % elutie waarde in een bereik van 5,5 mL (acenafteen, acenaftyleen, fluoreen, fenantreen, antraceen, fluoranteen, pyreen, benzo[a]antraceen, pyreen, chryeen, benzo[b]fluoranteen, benzo[k]fluoranteen en benzo[a]pyreen) tot 6 mL (dibenzo[a]antraceen, indeno[1,2,3-cd]pyreen en benzo[ghi]peryleen). Voor Oxy-PAKs ligt deze 90 % elutie waarde in een bereik van 6,5 mL (naftaleen-1-carboxaldehyde) tot 43 mL (1,8 naftaleenzuuranhydride). Het minimaal solventvolume vereist tot 90 of 100 % elutie van Oxy-PAKs is groter dan het minimaal volume vereist tot 90 of 100 % elutie van PAKs. Dit is opnieuw te wijten aan de grotere polariteit van Oxy-PAKs, waardoor meer retentie op het Florisil geobserveerd wordt en aldus een groter volume solvent vereist is om deze te elueren. Dat naftaleen-1,4-dion, fluoreen-2carboxaldehyde, naftaceen-5,12-dion en 1,8-naftaleenzuuranhydride wel teruggevonden werden, maakt de invloed van de plantmatrix duidelijk. Interfererende componenten kunnen functionele groepen op het Florisil afschermen en aldus een verlaging in retentie van de doelcomponenten veroorzaken. Wanneer het maximaal solventvolume vereist voor 100 % elutie van alle targetcomponenten bekeken wordt, vereisen 15 van de 16 PAKs (uitgezonderd fenantreen) en 10 van de 12 Oxy-PAks

(uitgezonderd

10H-antraceen-9-on

en

1,8-naftaleenzuuranhydride) een

solventvolume kleiner dan 30 mL per 2 g Florisil. Fenantreen vraagt 38 mL tot volledige elutie, maar slechts 9 mL per 2 g Florisil tot 98 % elutie. 10H-Antraceen-9-on vraagt 48 mL tot volledige elutie, maar slechts 24 mL tot 98 % elutie. Dit betekent dat de extra milliliters solvent volgend op 9 mL (fenantreen) en op 24 mL (10H-antraceen-9-on) slechts weinig resterende component bevatten. Alle gefluoreerde PAKs worden volledig geëlueerd met 26 mL DCM:CH (1:1). Er wordt aldus besloten om met 30 mL DCM:CH (1:1) de doelcomponenten te elueren op een SPE cartridge van 2 g Florisil. Hierbij vindt geen doorbraak van interfererende componenten plaats. Dit extract (30 mL) wordt vervolgens ingedampt m.b.v. een stikstofstroom tot de laatste druppel. Deze druppel wordt opgelost in 1 mL DCM en wordt vervolgens geanalyseerd met GC-HRMS. Minder piekverbreding wordt geobserveerd en een betrouwbaardere identificatie van de targetcomponenten is mogelijk. 65

Aantal mL tot 90 % elutie 24 7,5 7,5 7,5 6 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 9 9 16,5 10,5 12 13,5

Aantal mL tot 100 % elutie

42 87 99 91 75 98 NQ 101 92 103 79 NQ

98 94 99 96 102 109 110 103 98 99 96 99 107 99 97 101

REC [%]

NQ 7,5 12 16,5 12 24 NQ 10,5 33 30 16,5 NQ

4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 6 6 6


NQ 10,5 18 19,5 12 34,5 NQ 15 34,5 34,5 24 NQ

4,5 4,5 4,5 4,5 12 4,5 6 6 6 6 9 9 9 9 10,5 13,5


NQ 120 91 88 21 100 NQ 97 66 88 80 NQ

97 102 87 84 131 118 109 99 101 100 111 102 106 107 102 99

REC [%]

11 6,5 7 7,5 9 7,5 43 7 9 7,5 7 9

6 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 6 6 6


14 27 30 12 48 29 47 11 18 11 11 15

30 8 8 9 38 9 9 11 9 9 11 11 11 14 11 11


DCM:CH (1:1) extract

6,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 6 6 6 6 6 6 21 9 21 12 19,5 27 NQ 9 25,5 22,5 13,5 NQ

DCM:CH (1:1) solvent

19,5 6 7,5 9 12 13,5 NQ 7,5 16,5 13,5 9 NQ

DCM solvent

Tabel 11: Voor elk elutie-experiment wordt het solventvolume weergegeven vereist voor 90 en 100 % elutie van elke targetcomponent op een SPE cartridge van 2 gram Florisil [mL/2g Florisil]. Voor elutie-experimenten met puur solvent wordt tevens de recovery [%] weergegeven van elke targetcomponent. NQ: Niet gekwantificeerd.

PAKs Naftaleen Acenaftyleen Acenafteen Fluoreen Fenantreen Antraceen Fluoranteen Pyreen Benz[a]antraceen Chryseen Benzo[b]fluoranteen Benzo[k]fluoranteen Benzo[a]pyreen Dibenz[ah]antraceen Indeno[1,2,3-cd]pyreen Benzo[ghi]peryleen Oxy-PAKs Naftaleen-1,4-dion Naftaleen-1-carboxaldehyde 9H-Fluoreen-9-on Fluoreen-2-carboxaldehyde 10H-Antraceen-9-on Antraceen-9,10-dion 1,8-naftaleenzuuranhydride Fenantreen-9-carboxaldehyde 7H-benzo[de]antraceen-7-on Pyrene-1-carboxaldehyde Benz[a]antraceen-7,12-dion Naftaceen-5,12-dion

66

4.4.

Geoptimaliseerde methode: Recovery en

Matrixeffecten Om het concentratieniveau van elke doelcomponent voor de optimale methode (een extractietemperatuur van 200 °C en 1 g Florisil in de cel) te bepalen moeten recovery en matrixeffecten voor elke doelcomponent gekend zijn. Deze zijn bepaald a.d.h.v. Vergelijking 3 en Vergelijking 4 op basis van het experiment in Sectie 4.2. Tabel 12 geeft deze weer voor elke doelcomponent. Recoveries voor PAKs liggen in een bereik van 31 % (acenaftyleen) tot 95 % (naftaleen). Recoveries voor Oxy-PAKs liggen in een bereik van 6 % (1,8-naftaleenzuuranhydride) tot 88 % (antraceen-9,10-dion). De lage REC voor 1,8-naftaleenzuuranhydride is te wijten aan de sterke retentie op Florisil. De gemiddelde REC van PAKs ligt 16 % hoger dan deze van Oxy-PAKs. Slechts drie studies geven een recovery per component weer (Blasco et al., 2007; Rey-Salgueiro et al., 2008; SanzLandaluze et al., 2010). Het verschil in REC tussen deze verkregen in deze masterthesis en deze uit de genoemde literatuur kan te wijten zijn aan de verschillende extractie- en zuiveringstechnieken. Het US-EPA aanvaardt recoveries tussen 70 en 130 % (Ratola et al., 2006). 13 van de 16 onderzochte USEPA PAKs in deze masterthesis liggen in dit interval, met uitzondering van acenaftyleen, acenafteen en fluoreen. De recovery voor net deze drie componenten werd in de vermelde drie studies niet weergegeven. REC voor F-PAKs ligt tussen 33 % (1-fluornaftaleen) en 93 % (3-fluorfenantreen). Tabel 12: Recovery [%] en Matrixeffecten [%] voor elke doelcomponent ± standaard deviatie (SD). NQ : Niet gekwantificeerd. Component PAKs Naftaleen Acenaftyleen Acenafteen Fluoreen Fenantreen Antraceen Fluoranteen Pyreen Benz[a]antraceen Chryseen Benzo[b]fluoranteen Benzo[k]fluoranteen Benzo[a]pyreen Dibenz[ah]antraceen Indeno[1,2,3-cd]pyreen Benzo[ghi]peryleen F-PAKs 1-Fluornaftaleen

REC [%] ± SD ME [%] ± SD Component 95±78 31±19 37±22 61±7 82±18 85±21 71±20 77±15 74±12 73±18 79±17 84±22 73±5 73±15 72±18 73±20

210±123 214±164 192±130 89±11 103±18 103±21 126±37 108±16 124±12 111±19 108±13 97±12 75±5 117±19 114±21 100±17

33±7

135±14

4-Fluorbifenyl 3-Fluorfenantreen 1-Fluorpyreen 3-Fluorchryseen 9-Fluorbenzo[k]fluoranteen Oxy-PAKs Naftaleen-1,4-dion Naftaleen-1-carboxaldehyde 9H-Fluoreen-9-on Fluoreen-2-carboxaldehyde 10H-Antraceen-9-on Antraceen-9,10-dion 1,8-naftaleenzuuranhydride Fenantreen-9-carboxaldehyde 7H-benzo[de]antraceen-7-on Pyrene-1-carboxaldehyde Benz[a]antraceen-7,12-dion Naftaceen-5,12-dion

REC [%]± SD ME [%]± SD 39±20 101±40 68±6 64±9 71±16

207±108 19±138 140±3 129±7 145±16

NQ 35±26 79±23 86±17 28+14 88±4 6±5 74±14 61±32 68±14 59±17 74±15

NQ 248±210 124±15 166±19 78±10 120±5 134±27 145±12 146±61 146±21 136±37 161±21

Matrixeffecten van PAKs liggen in een bereik van 75 % (benzo[a]pyreen) tot 214 % (acenaftyleen). Matrixeffecten van Oxy-PAKs liggen in een bereik van 78 % (10H-antraceen-9-on) tot 248 % (naftaleen1,4-dion). De gemiddelde ME van Oxy-PAKs liggen 15 % hoger dan deze van PAKs. Na een uitgebreide literatuurstudie van in Web of Science geïndexeerde wetenschappelijke literatuur (2004 – 2014) over 67

de bepaling van PAKs en Oxy-PAKs in plantmateriaal werd vastgesteld dat tot nu toe geen bepaling van matrixeffecten werd uitgevoerd. ME voor F-PAKs liggen in een bereik van 108 % (3fluorfenatreen) tot 207 % (4-fluorbifenyl).

4.5.

Toepassing: concentratieniveau van PAKs en Oxy-

PAKs in Taxus baccata bladeren uit Gent De ontwikkelde geoptimaliseerde methode om niet-gesubstitueerde en geoxideerde PAKs te kwantificeren in Taxus baccata bladeren werd toegepast in Gent op 29 april 2015. Figuur 18 geeft de staalnameplaatsen weer. Punt 1 (ADB) is gelegen in de Blaarmeersen, Aan den Bocht. Punt 2 (CIT) is gelegen in het Citadelpark. Punt 3 (TEN) is gelegen op zo’n 100 m van de drukke Charles De Kerchovelaan, in een afgelegen tuin van een rijhuis dwars op deze drukke verkeersweg. Punt 4 (KOR) is gelegen midden in het centrum van het stad, nl. in de Kortekruisstraat. Punt 5 (ZUI) is gelegen evenwijdig met de Zuidparklaan. Hierlangs is druk verkeer van bussen, auto’s en vrachtwagens. Punt 6 (LUC) is gelegen in de luchthavenstraat evenwijdig met de E 40. Er waren geen afschermende panelen tussen de autostrade en de bemonsterde Taxus baccata plant. Op het moment van staalname was er reeds twee dagen geen regen meer gevallen, de wind kwam uit het ZZW met een snelheid van 21 km/u. De omgevingstemperatuur was 12 °C en de relatieve vochtigheid bedroeg 50 % (“www.kmi.be,” 2015, “www.meteo-info.be,” 2015).

Figuur 18: Locaties staalname voor toepassing van de optimale methode. Punt 1: Aan de bocht 10, 9000 Gent; Punt2: Citadelpark 9000 Gent; Punt 3: Tentoonstellingslaan 137, 9000 Gent; Punt 4: Korte kruisstraat 1, 9000 Gent; Punt 5: Zuidparklaan 9000 Gent; Punt 6: Luchthavenlaan 2, 9000 Gent.

De massa F-PAK na de volledige analyseprocedure werd berekend door de teruggevonden hoeveelheid te corrigeren met REC en ME (Sectie 4.4). Deze massa had een gemiddelde afwijking van 10 % t.o.v. de initieel toegediende hoeveelheid F-PAKs, waaruit kan besloten worden dat de geoptimaliseerde methode werkt voor de eigenlijke stalen. 3-Fluorfenantreen werd buiten beschouwing gelaten wegens interferentie van niet-doelcomponenten op dezelfde retentietijd. Het concentratieniveau van elke PAK en Oxy-PAK werd bepaald a.d.h.v Vergelijking 6. 68

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑒

𝑛𝑔 [ 𝑑𝑤] 𝑔

=

𝑅𝑃𝑂𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡 𝑅𝑆𝑅𝐹𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑎𝑟𝑑 4

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎𝐼𝑆 103

𝑅𝐸𝐶 𝑀𝐸 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡

[6]

De individuele concentraties voor elke component per locatie worden in Tabel 13 weergegeven (Kolom A). De

(16 US-EPA PAKs + 12 Oxy-PAKs) bedraagt 577 ng/g dw voor ADB, 976 ng/g dw voor

CIT, 393 ng/g dw voor TEN, 425 ng/g dw voor KOR, 303 ng/g dw voor ZUI en 251 ng/g dw voor LUC. De maximale totale concentratie wordt aldus gevonden in punt 2, het Citadelpark. Deze concentratie is zo’n 4 keer hoger dan de concentratie in LUC, waar de laagste concentraties gemeten werden. De bijdrage van PAKs en Oxy-PAKs in

(16 US-EPA PAKs + 12 Oxy-PAKS) is voor ADB respectievelijk 30

en 70 %, voor CIT respectievelijk 31 en 69 %, voor TEN respectievelijk 63 en 37 %, voor KOR respectievelijk 64 en 36 %, voor ZUI respectievelijk 48 en 52 % en voor LUC respectievelijk 58 en 42 %. Hieruit blijkt dat geoxideerde PAKs een grote bijdrage kennen, waardoor het van belang is deze componenten te meten en op te volgen in luchtpollutiecampagnes. Het concentratieniveau van PAKs in deze masterthesis ligt in dezelfde grootteorde als deze teruggevonden in de 70 studies uit de periode 2004 – 2014 (Figuur 2). Acenafteen, naftaleen-1,4-dion, fluoreen-2-carboxaldehyde, fenantreen-9-carboxaldehyde en pyreen-1-carboxaldehyde konden niet worden gekwantificeerd. Deze worden weergegeven als ‘NQ’ in Tabel 13. Tabel 13 geeft de relatieve bijdrage weer van elke component tot 16 US-EPA PAKs of tot 12 Oxy-PAKs (kolom B). Naftaleen heeft in elk staalnamepunt de grootste bijdrage (17 - 34 %). Naftaleen wordt gevolgd door fluoranteen (11 – 17 %), fenantreen (13 – 15 %), chryseen (7 – 14 %), en pyreen (8 – 11 %). Dit is in overeenstemming met de bevindingen van Li et al. (2010) (55 % naftaleen, ± 8 % fluoranteen en fenantreen). De algemene trend in literatuur waargenomen uit Figuur 2 is als volgt: fenantreen (30 %) > fluoranteen (14 %) > pyreen (12 %) > naftaleen (8 %) en chryseen (8 %) (Sectie 1.5). 1,8-naftaleenzuuranhydride heeft in elk staalnamepunt de grootste bijdrage tot

12 Oxy-PAKS

(39 - 84 %). Deze component wordt gevolgd door 10H-antraceen-9-on (3 – 19 %), antraceen-9,10-dion (3 – 14 %), 9H-fluoreen-9-on (2 - 13 %) en naftaleen-1-carboxaldehyde (0 – 12 %). Daar echter nog geen literatuur voorhanden is over de kwantificatie van Oxy-PAKs in vegetatie, kunnen deze bevindingen niet vergeleken worden met andere data. Enkele studies naar kwantificatie van Oxy-PAKs in bodemstalen zijn daarentegen wel uitgevoerd. 9H-Fluoreen-9-on, antraceen-9,10-dion, 7Hbenzo[de]antraceen-7-on, benz[a]antraceen-7,12-dion en naftaceen-7,12-dion werden onderzocht door Lundstedt et al. (2014). Deze laatst genoemde component kende de grootste maximale concentratie en grootste mediaan, vergeleken met de andere onderzochte componenten (Lundstedt et al., 2014). In de Taxus baccata stalen is naftaceen-7,12-dion echter de component met de laagste concentratie, vergeleken met alle geanalyseerde Oxy-PAKs. 9H-Fluoreen-9-on, antraceen-9,10-dion, 7H-benzo[de]antraceen-7-on, benz[a]antraceen-7,12-dion en naftaceen-7,12-dion werden eveneens gekwantificeerd in bodemstalen van zes verschillende sites door Lundstedt et al. (2007). In drie van deze sites werd naftaceen-7,12-dion gevonden in de hoogste concentratie, 9H-fluoreen-9-on had in twee sites de hoogste concentratie, en in de laatste site kende antraceen-9,10-dion de hoogste concentratie. De 16 US-EPA PAKs werden eveneens onderzocht. Hiervan kende fluoranteen de hoogste concentratie in vijf van de zes sites (Lundstedt et al., 2007). 69

Tabel 13 geeft het percentage dat elke ringklasse uitmaakt van

16 US-EPA PAKs weer per

staalnamesite. De componenten bestaande uit 3 en 4 ringen omvatten samen in elke staalnamesite meer dan de helft van de totale concentratie 16 US-EPA PAKs (van 50 % voor ADB tot 64 % voor KOR). In CIT, TEN, KOR, en ZUI domineert de klasse met 4 aromatische ringen. Dit is te wijten aan de grote individuele relatieve bijdrage van fenantreen, fluoranteen, pyreen en chryseen in deze klasse. Dit vanwege het feit dat deze als primaire polluenten geëmitteerd worden via uitlaatgassen van op diesel en benzine rijdende voertuigen. Dominantie van de klasse met 3 en 4 aromatische ringen is reeds bevestigd vanuit de literatuur (Sectie 1.5). Naftaleen (enige component in de klasse met 2 ringen) was meest abundant aanwezig in site LUC (34 % van

16 US-EPA PAKs) en ADB (33 % van

16 US-EPA

PAKs). In alle andere sites is deze component eveneens in grote concentraties aanwezig (Tabel 13). Eenzelfde trend werd bevestigd door Krauss et al. (2005). De relatieve bijdrage van naftaleen was 94 % tot de

21 PAKs in bladeren (Krauss et al., 2005).

De invloed van verschillende PAK-bronnen kan achterhaald worden m.b.v. diagnostische ratio’s (Sectie 1.5). Tabel 13 geeft twee veel gebruikte ratio’s weer. De Flu/Pyr ratio varieert tussen 1,4 en 2. Volgens Lehndorff en Schwark (2004) komt een Flu/Pyr ratio tussen 1,5 en 2 overeen met verkeersemissies. Lagere ratio’s duiden op diesel emissies, terwijl hogere ratio’s duiden op benzine emissies. De fenantreen antraceen (Fen/Ant) ratio varieert van 4,5 tot 9. Volgens Migaszewski et al. (2011) betekent dit dat de componenten van pyrogene oorsprong zijn, d.i. afkomstig van verbrandingsprocessen van petroleum, diesel, benzine en hout. Methode detectie- en kwantificatielimieten, respectievelijk mLOD en mLOQ, per doelcomponent werden bepaald a.d.h.v. Vergelijkingen 7 en 8. Tabel 14 geeft de minmale en maximale mLOD en mLOQ (ng/g dw) weer voor elke component over alle staalnamelocaties. De mLOD varieert van 0,03 tot 1,82 ng/g dw voor US-EPA PAKs. Dit is net iets lager dan deze vermelde in Sectie 1.4.3. De mLOD varieert van 0,03 tot 6,98 ng/g dw voor Oxy-PAKs. Er zijn geen (vergelijkbare) resultaten beschikbaar in literatuur. 𝑛𝑔

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑒∗3 𝑆/𝑁

[7]

𝑛𝑔

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑒∗10 𝑆/𝑁

[8]

𝑚𝐿𝑂𝐷 [𝑔 𝑑𝑤] = 𝑚𝐿𝑂𝑄 [𝑔 𝑑𝑤] =

70

Tabel 13: Kolom A: De concentratie per component [ng/g dw] voor elke staalnamelocatie; Kolom B: Relatieve bijdrage [%] van elke component tot 16 US-EPA PAKs of 12 Oxy-PAKs. NQ = Niet gekwantificeerd; NB = Niet Beschikbaar. Kolom C: relatieve bijdrage [%] van elke ringklassen tot 16 US-EPA PAKs wordt weergeven. Fluoranteen/pyreen (Flu/Pyr) en fenantreen/antraceen (Fen/Ant) ratio’s voor elke staalnamelocatie zijn beschikbaar in Kolom D. ADB PAKs Naftaleen Acenaftyleen Acenafteen Fluoreen Fenantreen Antraceen Fluoranteen Pyreen Benz[a]antraceen Chryseen Benzo[b]fluoranteen Benzo[k]fluoranteen Benzo[a]pyreen Dibenz[ah]antraceen Indeno[1,2,3-cd]pyreen Benzo[ghi]peryleen PAKs Oxy-PAKs

TEN

KOR

ZUI

LUC

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

56 4 NQ 4 20 4 18 13 4 17 10 3 4 3 5 5

33 2 NB 3 12 3 11 8 2 10 6 2 2 2 3 3

49 4 NQ 10 37 5 39 27 11 42 30 10 14 2 8 11

17 1 NB 3 13 2 13 9 4 14 10 3 5 1 3 4

43 3 NQ 7 38 4 43 26 8 26 15 6 10 2 6 9

18 1 NB 3 15 2 17 11 3 10 6 2 4 1 2 4

48 3 NQ 12 42 7 42 26 12 31 18 7 14 2 6 7

17 1 NB 4 15 2 15 9 4 11 6 2 5 1 2 3

41 3 NQ 7 22 4 24 12 3 10 6 3 4 1 2 4

28 2 NB 5 15 3 16 8 2 7 4 2 3 0 1 2

49 4 NQ 7 23 3 18 12 3 10 5 3 3 0 2 4

34 3 NB 5 15 2 12 8 2 7 4 2 2 0 1 3

170

298

247

276

145

146

ADB

CIT

TEN

KOR

ZUI

LUC

A

Naftaleen-1,4-dion Naftaleen-1-carboxaldehyde 9H-Fluoreen-9-on Fluoreen-2-carboxaldehyde 10H-Antraceen-9-on Antraceen-9,10-dion 1,8-naftaleenzuuranhydride Fenantreen-9-carboxaldehyde 7H-benzo[de]antraceen-7-on Pyrene-1-carboxaldehyde Benz[a]antraceen-7,12-dion Naftaceen-5,12-dion Oxy-PAKs

CIT

B

NQ 14 13 NQ 51 17 292 NQ 7 NQ 9 3 407

NB 4 3 NB 13 4 72 NB 2 NB 2 1

A 13 3 14 NQ 21 19 571 NQ 19 NQ 14 2 678

B

A

B

A

B

A

B

A

B

NB 0 2 NB 3 3 84 NB 3 NB 2 0

13 0 14 NQ 11 18 73 NQ 8 NQ 7 1

NB 0 9 NB 8 13 50 NB 5 NB 5 1

13 10 12 NQ 12 13 77 NQ 6 NQ 6 2

NB 7 8 NB 8 9 50 NB 4 NB 4 1

13 8 12 NQ 15 12 89 NQ 4 NQ 3 1

NB 5 7 NB 10 8 56 NB 3 NB 2 1

13 11 12 NQ 17 9 35 NQ 3 NQ 2 1

NB 11 12 NB 17 8 34 NB 3 NB 2 1

146

153

158

105

ADB

CIT

TEN

KOR

ZUI

LUC

C

C

C

C

C

C

33 19 31 12 5 50 ADB

17 19 40 19 6 59 CIT

18 21 41 14 6 63 TEN

17 23 40 14 5 64 KOR

28 25 34 9 4 59 ZUI

34 25 29 8 4 55 LUC

Ratio's

D

D

D

D

D

D

Flu/Pyr Fen/Ant

1,4 4,5

1,5 7,0

1,6 9,1

1,6 6,3

2,0 5,0

1,5 7,0

Aantal ringen PAKs 2 3 4 5 6 3+4

71

Tabel 14: Minimale en maximale mLOD [ng/g dw] en mLOQ [ng/g dw] voor elke doelcomponent over alle staalnamelocaties (n=6). NQ: Niet gekwantificeerd. Component

mLOD

mLOQ

Component

mLOD

mLOQ

PAKs

Min

Max

Min

Max

Oxy-PAKs

Min

Max

Min

Max

Naftaleen Acenaftyleen Acenafteen Fluoreen Fenantreen Antraceen Fluoranteen Pyreen Benz[a]antraceen Chryseen Benzo[b]fluoranteen Benzo[k]fluoranteen Benzo[a]pyreen Dibenz[ah]antraceen Indeno[1,2,3-cd]pyreen Benzo[ghi]peryleen

0,24 0,04 NQ 0,11 0,17 0,03 0,17 0,15 0,06 0,14 0,13 0,09 0,06 0,06 0,06 0,08

0,65 0,27 NQ 0,58 1,82 1,74 0,73 0,60 0,23 0,40 0,91 0,23 0,29 0,17 0,16 0,20

0,79 0,14 NQ 0,37 0,57 0,11 0,57 0,49 0,20 0,45 0,42 0,29 0,19 0,21 0,20 0,26

2,18 0,91 NQ 1,94 6,05 5,82 2,44 2,01 0,76 1,34 3,02 0,78 0,98 0,57 0,52 0,66

Naftaleen-1,4-dion Naftaleen-1-carboxaldehyde 9H-Fluoreen-9-on Fluoreen-2-carboxaldehyde 10H-Antraceen-9-on Antraceen-9,10-dion 1,8-naftaleenzuuranhydride Fenantreen-9-carboxaldehyde 7H-benzo[de]antraceen-7-on Pyrene-1-carboxaldehyde Benz[a]antraceen-7,12-dion Naftaceen-5,12-dion

NQ 0,02 0,03 NQ 0,46 0,03 1,69 NQ 0,16 NQ 0,05 0,05

NQ 0,27 0,09 NQ 6,98 0,19 5,59 NQ 1,48 NQ 0,33 0,84

NQ 0,07 0,08 NQ 1,53 0,09 5,64 NQ 0,53 NQ 0,17 0,17

NQ 0,92 0,29 NQ 23,28 0,65 18,64 NQ 4,95 NQ 1,10 2,81

72

5. Conclusie Uit een uitgebreide literatuurstudie van in Web of Science geïndexeerde wetenschappelijke literatuur (2004 – 2014) over de bepaling van polycylische aromatische koolwaterstoffen (PAKs) in plantenmateriaal bleek dat geen literatuur over geoxideerde derivaten (Oxy-PAKs) in plantenmateriaal beschikbaar was. Het ontwikkelen van één analytische methode om beide componentgroepen te kwantificeren uit Taxus baccata bladeren was succesvol. Verhoogde druk vloeistofextractie

met

dichloormethaan

als

extractiesolvent

werd

geëvalueerd

naar

extractietemperatuur en de mogelijkheid tot in-cell clean-up met Florisil. Deze evaluatie was gebaseerd op recovery en matrixeffecten van elke doelcomponent bij elke onderzochte (verhoogde druk vloeistofextractie) conditie. Een extractietemperatuur van 200 °C gecombineerd met 1 gram Florisil in de extractiecel leverde de beste recoveries en matrixeffecten op voor de 16 US-EPA PAKs en de 12 Oxy-PAKs. Vervolgens werd een vaste fase extractie opzuivering over 2 g Florisil aangewend. Elutie-experimenten met dichloormethaan ter bepaling van het vereiste elutievolume om 100 % elutie te verkrijgen van elke doelcomponent op een vaste fase extractie cartridge van 2 g Florisil werden uitgevoerd. Doorbraak van interfererende matrixcomponenten trad reeds op vooraleer 100 % elutie van de doelcomponenten bereikt werd. Daarom werd dichloormethaan:cyclohexaan in een (1:1) verhouding geëvalueerd als elutiesolvent. Reeds 30 mL volstond om 100 % elutie van de doelcomponenten te verkrijgen zonder dat doorbraak optrad. Matrixeffecten en recoveries voor deze geoptimaliseerde methode werden bepaald voor elke doelcomponent. Recoveries lagen voor 13 van de 16 onderzochte US-EPA PAKs binnen het interval: 70 – 130 %. Recoveries van Oxy-PAKs konden niet vergeleken worden met literatuur daar deze niet beschikbaar waren. Het belang van matrixeffecten voor de bepaling van het concentratieniveau van PAKs en Oxy-PAKs in Taxus baccata kan niet genegeerd worden. Uit de toepassing van de ontwikkelde methode bleek duidelijk dat het verkeer de grootste bijdrage heeft in de emissie van PAKs. Tevens bleek dat het concentratieniveau van Oxy-PAKs het concentratieniveau van PAKs benadert. Hierdoor is het van belang deze geoxideerde derivaten op te nemen in polluentmetingen in lucht in Vlaanderen. Taxus baccata wordt ook teruggevonden in N-Amerika, Groot-Brittanië, N-Afrika, de Caucasus, Iran, het Himalayagebergte en Europa. Aan de hand van deze spatiale verdeling kan Taxus baccata dienen als geschikt biomonitoringspecies, wereldwijd. Een belangrijke factor die verder onderzoek vereist is de accumulatieperiode van deze componenten in vegetatie. Seizoenale trends van PAKs in het biomonitoringspecies werden in verschillende studies waargenomen wat erop wijst dat de accumulatie in een biomonitoringspecies eenzelfde trend volgt als de luchtconcentratie van PAKs. Hoe snel het concentratieniveau verandert in het species is echter 73

niet geweten en vereist verder onderzoek. Aansluitend hierbij vereist kennis over de invloed van de ouderdom van het onderzochte blad/naald verder onderzoek. Hierbij kan eveneens nagegaan worden of de vetinhoud van het blad/naald een belangrijke rol vervult in de accumulatie van deze lipofiele componenten. Het effect van meteorologische condities zoals wind en regen kan eveneens verder onderzocht worden. Onenigheid in de literatuur over het effect van regen en wind zorgt ervoor dat geen eenduidige conclusie kan gemaakt worden over deze effecten op het concentratieniveau van PAKs in een plantspecies.

74

6. Referenties Alfani, A., De Nicola, F., Maisto, G., Prati Vittoria, M., 2005. Long-term PAH accumulation after bud break in Quercus ilex L. leaves in a polluted environment. Atmos. Environ. 39, 307–314. Ares, A., Aboal, J.R., Fernandez, J.A., Real, C., Carballeira, A., 2009. Use of the terrestrial moss Pseudoscleropodium purum to detect sources of small scale contamination by PAHs. Atmos. Environ. 43, 5501–5509. Augusto, S., Maguas, C., Branquinho, C., 2013. Guidelines for biomonitoring persistent organic pollutants (POPs), using lichens and aquatic mosses - A review. Environ. Pollut. 180, 330–338. Augusto, S., Maguas, C., Matos, J., Joao Pereira, M., Soares, A., Branquinho, C., 2009. Spatial Modeling of PAHs in Lichens for Fingerprinting of Multisource Atmospheric Pollution. Evironmental Sci. Technol. 43, 7762–7769. Augusto, S., Maguas, C., Matos, J., Pereira, M.J., Branquinho, C., 2010. Lichens as an integrating tool for monitoring PAH atmospheric deposition: A comparison with soil, air and pine needles. Environ. Pollut. 158, 483–489. Bio-Rad Laboratories, 2000. Bio-Beads ® S-X Beads Gel Permeation Chromatography Instruction Manual. Blasco, M., Domeno, C., Bentayeb, K., Nerin, C., 2007. Solid-phase extraction clean-up procedure for the analysis of PAHs in lichens. Int. J. Environ. Anal. Chem. 87, 833–846. Blasco, M., Domeno, C., Nerin, C., 2006. Use of lichens as pollution biomonitors in remote areas: Comparison of PAHs extracted from lichens and atmospheric particles sampled in and around the Somport tunnel (Pyrenees). Environ. Sci. Technol. 40, 6384–6391. Blasco, M., Domeno, C., Nerin, C., 2008. Lichens biomonitoring as feasible methodology to assess air pollution in natural ecosystems: Combined study of quantitative PAHs analyses and lichen biodiversity in the Pyrenees Mountains. Anal. Bioanal. Chem. 391, 759–771. Boitsov, S., Jensen, H.K.B., Klungsoyr, J., 2009. Natural background and anthropogenic inputs of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in sediments of South-Western Barents Sea. Mar. Environ. Res. 68, 236–245. Byeong-Kyu, L., 2010. Sources, Distribution and Toxicity of Polyaromatic Hydrocarbons (PAHs) in Particulate Matter., Air Pollution. Cabrerizo, A., Dachs, J., Barcelo, D., Jonest, K.C., 2012. Influence of Organic Matter Content and Human Activities on the Occurrence of Organic Pollutants in Antarctic Soils, Lichens, Grass, and Mosses. Environ. Sci. Technol. 46, 1396–1405. De Nicola, F., Claudia, L., Maria Vittoria, P., Maisto, G., Alfani, A., 2011. Biomonitoring of PAHs by using Quercus ilex leaves: Source diagnostic and toxicity assessment. Atmos. Environ. 45, 1428– 1433. 75

De Nicola, F., Maisto, G., Prati, M. V, Alfani, A., 2005. Temporal variations in PAH concentrations in Quercus ilex L. (holm oak) leaves in an urban area. Chemosphere 61, 432–440. De Nicola, F., Maisto, G., Prati, M. V, Alfani, A., 2008. Leaf accumulation of trace elements and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in Quercus ilex L. Environ. Pollut. 153, 376–383. De Nicola, F., Murena, F., Antonietta Costagliola, M., Alfani, A., Baldantoni, D., Vittoria Prati, M., Sessa, L., Spagnuolo, V., Giordano, S., 2013a. A multi-approach monitoring of particulate matter, metals and PAHs in an urban street canyon. Environ. Sci. Pollut. Res. 20, 4969–4979. De Nicola, F., Spagnuolo, V., Baldantoni, V., Sessa, L., Alfani, A., Bargagli, R., Monaci, F., Terracciano, S., Giordano, S., 2013b. Improved biomonitoring of airborne contaminants by combined use of holm oak leaves and epiphytic moss. Chemosphere 92, 1224–1230. De Souza Pereira, M., Heitmann, D., Reifenhauser, W., Meire, R.O., Santos, L.S., Torres, J.P.M., Malm, O., Koerner, W., 2007. Persistent organic pollutants in atimospheric deposition and biomonitoring with Tillandsia usneoides (L.) in an industrialized area in Rio de Janeiro state, southeast Brazil - Part II: PCB and PAH. Chemosphere 67, 1736–1745. Dionex corporation, 2008. ASE 350 Accelerated Solvent Extractor Operator’s Manual. Doiegowska, S., Migaszewski, Z.M., 2011. PAH concentrations in the moss species Hylocomium splendens (Hedw.) BSG and Pleurozium schreberi (Brid.) Mitt. from the Kielce area (southcentral Poland). Ecotoxicol. Environ. Saf. 74, 1636–1644. Domeno, C., Blasco, M., Sanchez, C., Nerin, C., 2006. A fast extraction technique for extracting polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) from lichens samples used as biomonitors of air pollution: Dynamic sonication versus other methods. Anal. Chim. Acta 569, 103–112. Domeno, C., Canellas, E., Alfaro, P., Rodriguez-Lafuente, A., Nerin, C., 2012. Atmospheric pressure gas chromatography with quadrupole time of flight mass spectrometry for simultaneous detection and quantification of polycyclic aromatic hydrocarbons and nitro-polycyclic aromatic hydrocarbons in mosses. J. Chromatogr. A 1252, 146–154. Foan, L., Sablayrolles, C., Elustondo, D., Lasheras, E., Gonzalez, L., Ederra, A., Simon, V., Santamaria, J.M., 2010. Reconstructing historical trends of polycyclic aromatic hydrocarbon deposition in a remote area of Spain using herbarium moss material. Atmos. Environ. 44, 3207–3214. Foan, L., Simon, V., 2012. Optimization of pressurized liquid extraction using a multivariate chemometric approach and comparison of solid-phase extraction cleanup steps for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in mosses. J. Chromatogr. A 1256, 22–31. Galuszka, A., 2007. Distribution patterns of PAHs and trace elements in mosses Hylocomium splendens (Hedw.) BSG and Pleurozium schreberi (Brid.) Mitt. from different forest communities: A case study, south-central Poland. Chemosphere 67, 1415–1422. Goldfard, J.L., Suuberg, E.M., 2008. Vapor Pressures and Thermodynamics of Oxygen-Containing Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Measured Using Knudsen Effusion. Env. Toxicol Chem 27, 1244–1249. Gorshkov, A.G., 2008. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in the needles of a Scotch pine (Pinus sylvestris L.), a biomonitor of atmospheric pollution. J. Anal. Chem. 63, 805–811.

76

Haglund, P., Spinnel, E., 2011. A Modular Approach to Pressurized Liquid Extraction with In-cell Cleanup. Appl. Noteb. 66–72. Hans-Joachim Hübschmann, 2009. Handbook of GC/MS: Fundamentals & Applications. WILEY-VCH Verlag GmbH&Co, KGaA, Weinheim. Harmens, H., Foan, L., Simon, V., Mills, G., 2013. Terrestrial mosses as biomonitors of atmospheric POPs pollution: A review. Environ. Pollut. 173, 245–254. Holoubek, I., Klanova, J., Jarkovsky, J., Kohoutek, J., 2007. Trends in background levels of persistent organic pollutants at Kosetice observatory, Czech Republic. Part I. Ambient air and wet deposition 1996-2005. J. Environ. Monit. 9, 557–563. Howe, T.S., Billings, S., Stolzberg, R.J., 2004. Sources of polycyclic aromatic hydrocarbons and hexachlorobenzene in spruce needles of eastern Alaska. Environ. Sci. Technol. 38, 3294–3298. Hwang, H.-M., Wade, T.L., 2008. Aerial distribution, temperature-dependent seasonal variation, and sources of polycyclic aromatic hydrocarbons in pine needles from the Houston metropolitan area, Texas, USA. J. Environ. Sci. Heal. Part a-Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng. 43, 1243– 1251. IUPAC, 1997. Compendium of Chemical Terminology. Jariyasopit, N., Zimmermann, K., Schrlau, J., Arey, J., Atkinson, R., Yu, T.-W., Dashwood, R.H., Tao, S., Staci, L., Massey, S., 2014. Heterogeneous Reactions of Particulate Matter-Bound PAHs and NPAHs with NO3/N2O5, OH Radicals, and O3 under Simulated Long- Range Atmospheric Transport Conditions: Reactivity and Mutagenicity. Evironmental Sci. Technol. 48, 10155−10164. Kettle, A., 2013. Use of Accerlated Solvent Extraction with In-Cell Cleanup to Eliminate Sample Cleanup During Sample Preparation. Thermo Fish. Sci. 1–7. Kim, J.., Moon, J.., Li, Q.., Cho, J.., 2003. One-step pressurized liquid extraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons. Anal. Chim. Acta 498, 55–60. Krauss, M., Wilcke, W., Martius, C., Bandeira, A.G., Garcia, M.V.B., Amelung, W., 2005. Atmospheric versus biological sources of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in a tropical rain forest environment. Environ. Pollut. 135, 143–154. Krommer, V., Zechmeister, H.G., Roder, I., Scharf, S., Hanus-Illnar, A., 2007. Monitoring atmospheric pollutants in the biosphere reserve Wienerwald by a combined approach of biomonitoring methods and technical measurements. Chemosphere 67, 1956–1966. Lehndorff, E., Schwark, L., 2004. Biomonitoring of air quality in the Cologne Conurbation using pine needles as a passive sampler - Part II: polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). Atmos. Environ. 38, 3793–3808. Lehndorff, E., Schwark, L., 2009. Biomonitoring airborne parent and alkylated three-ring PAHs in the Greater Cologne Conurbation II: Regional distribution patterns. Environ. Pollut. 157, 1706–1713. Li, J., Shang, X., Zhao, Z., Tanguay, R.L., Dong, Q., Huang, C., 2010. Polycyclic aromatic hydrocarbons in water, sediment, soil, and plants of the Aojiang River waterway in Wenzhou, China. J. Hazard. Mater. 173, 75–81. 77

Li, Y., Chen, X., Fan, C., Pang, G., 2012. Compensation for matrix effects in the gas chromatography– mass spectrometry analysis of 186 pesticides in tea matrices using analyte protectants. J. Chromatogr. A 1266, 131–142. Lin, D.H., Zhu, L.Z., 2004. Polycyclic aromatic hydrocarbons: Pollution and source analysis of a black tea. J. Agric. Food Chem. 52, 8268–8271. Liu, G., Zhang, G., Li, J., Li, X., Peng, X., Qi, S., 2006. Spatial distribution and seasonal variations of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using semi-permeable membrane devices (SPMD) and pine needles in the Pearl River Delta, South China. Atmos. Environ. 40, 3134–3143. Liu, X., Zhang, G., Jones, K.C., Li, X.D., Peng, X.Z., Qi, S.H., 2005. Compositional fractionation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in mosses (Hypnum plumaeformae WILS.) from the northern slope of Nanling Mountains, South China. Atmos. Environ. 39, 5490–5499. LRTAP, 1998. Protocol to the 1979 convention on Long Range Transboundary Air Pollution on Persistent Organic Pollutants. Lundstedt, S., Bandowe, B.A.M., Wilcke, W., Boll, E., Christensen, J.H., Villa, J., Grifoll, M., Faure, P., Biache, C., Lorgeoux, C., Larsson, M., frech Irgum, K., Ivarsson, P., Ricci, M., 2014. First intercomparison study on the analysis of oxygenated polycyclic aromatic hydrocarbons (oxyPAHs) and nitrogen heterocyclic polycyclic aromatic compounds (N-PACs) in contaminated soil. Trends Anal. Chem. 57, 83–92. Lundstedt, S., White, P.A., Lemieux, C.L., Lynes, K.D., Lambert, I.B., Oberg, L., Haglund, P., Tysklind, M., 2007. Sources, Fate, and Toxic Hazards of Oxygenated Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) at PAH-contaminated Sites. A J. Hum. Environ. 36, 475–485. Lundtsted, S., White, P.A., Lemieux, C.L., Lynes, K.D., Lambert, I.B., Oberg, L., Haglund, P., Tysklind, M., 2007. Sources, Fate, and Toxic Hazards of Oxygenated Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) at PAH-contaminated Sites. J. Hum. Environ. 36(6), 475–485. Migaszewski, Z.M., Galuszka, A., Crock, J.G., Lamothe, P.J., Dolegowska, S., 2009. Interspecies and interregional comparisons of the chemistry of PAHs and trace elements in mosses Hylocomium splendens (Hedw.) BSG and Pleurozium schreberi (Brid.) Mitt. from Poland and Alaska. Atmos. Environ. 43, 1464–1473. Nadal, M., Schuhmacher, M., Domingo, J.L., 2004. Levels of PAHs in soil and vegetation samples from Tarragona County, Spain. Environ. Pollut. 132, 1–11. National Center for Biotechnology Information, 2015. www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov [WWW Document]. Noth, E.M., Hammond, S.K., Biging, G.S., Tager, I.B., 2013. Mapping and modeling airborne urban phenanthrene distribution using vegetation biomonitoring. Atmos. Environ. 77, 518–524. Nylander, W., 1866. Les lichens du Jardin du Luxembourg. Bull. la Société Bot. Fr. 13, 364–372. Ong, R., Lundstedt, S., Haglund, P., Marriott, P., 2003. Pressurised liquid extraction-comprehensive two-dimensional gas chromatography for fast-screening of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. J. Chromatogr. A 1019, 221–232.

78

Orecchio, S., 2007. PAHs associated with the leaves of Quercus ilex L.: Extraction, GC-MS analysis, distribution and sources Assessment of air quality in the Palermo (Italy) area. Atmos. Environ. 41, 8669–8680. Orecchio, S., Culotta, L., Gianguzza, A., 2005. Leaves of Nerium oleander L. as bioaccumulators of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) in the air of Palermo (Italy): Extraction and GC-MS analysis, distribution and sources. Polycycl. Aromat. Compd. 25, 327–344. Orecchio, S., Gianguzza, A., Culotta, L., 2008. Absorption of polycyclic aromatic hydrocarbons by Pinus bark: Analytical method and use for environmental pollution monitoring in the Palermo area (Sicily, Italy). Environ. Res. 107, 371–379. Otvos, E., Kozak, I.O., Fekete, J., Sharma, V.K., Tuba, Z., 2004. Atmospheric deposition of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in mosses (Hypnum cupressiforme) in Hungary. Sci. Total Environ. 330, 89–99. Pallardy, S.G., 2008. Physiology of woody plants, 3rd ed. Elsevier Inc. Palm, L.M.N., Carboo, D., O.Yeboah, P., Quasie, W.J., Gorleku, A.M., Darko, A., 2011. Characterization of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) Present in Smoked Fish from Ghana. Adv. J. Food Sci. Technol. 3, 332–338. Pereira Netto, A.D., Barreto, R.P., Moreira, J.C., Arbilla, G., 2007. Spatial distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in Terminalia catappa L. (Combretaceae) bark from a selected heavy road traffic area of Rio de Janeiro City, Brazil. J. Hazard. Mater. 142, 389–396. Piccardo, M.T., Pala, M., Bonaccurso, B., Stella, A., Redaelli, A., Paola, G., Valerio, F., 2005. Pinus nigra and Pinus pinaster needles as passive samplers of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Pollut. 133, 293–301. Prajapati, S.K., Tripathi, B.D., 2008. Biomonitoring seasonal variation of urban air polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using Ficus benghalensis leaves. Environ. Pollut. 151, 543–548. Ratola, N., Alves, A., Psillakis, E., 2011a. Biomonitoring of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Contamination in the Island of Crete Using Pine Needles. Water Air Soil Pollut. 215, 189–203. Ratola, N., Amigo, J.M., Alves, A., 2010a. Comprehensive assessment of pine needles as bioindicators of PAHs using multivariate analysis. The importance of temporal trends. Chemosphere 81, 1517–1525. Ratola, N., Amigo, J.M., Alves, A., 2010b. Levels and Sources of PAHs in Selected Sites from Portugal: Biomonitoring with Pinus pinea and Pinus pinaster Needles. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 58, 631–647. Ratola, N., Amigo, J.M., Alves, A., 2011b. Study of geographical trends of polycyclic aromatic hydrocarbons using pine needles. Atmos. Environ. 45, 5988–5996. Ratola, N., Amigo, J.M., Oliveira, M.S.N., Araujo, R., Silva, J.A., Alves, A., 2011c. Differences between Pinus pinea and Pinus pinaster as bioindicators of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Exp. Bot. 72, 339–347.

79

Ratola, N., Lacorte, S., Alves, A., Barcelo, D., 2006. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in pine needles by gas chromatography-mass spectrometry - Comparison of different extraction and clean-up procedures. J. Chromatogr. A 1114, 198–204. Ratola, N., Lacorte, S., Barcelo, D., Alves, A., 2009. Microwave-assisted extraction and ultrasonic extraction to determine polycyclic aromatic hydrocarbons in needles and bark of Pinus pinaster Ait. and Pinus pinea L. by GC-MS. Talanta 77, 1120–1128. Ratola, N., Navarro-Ortega, A., Hildebrandt, A., Alves, A., Lacorte, S., Damia, B., 2012. Environmental distribution of PAHs in pine needles, soils, and sediments. Environ. Sci. Pollut. Res. 19, 677–688. Rey-Salgueiro, L., Martinez-Carballo, E., Garcia-Falcon, M.S., Simal-Gandara, J., 2008. Effects of a chemical company fire on the occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons in plant foods. Food Chem. 108, 347–353. Rinaldi, M.C.S., Domingos, M., Dias, A.P.L., Esposito, J.B.N., Pagliuso, J.D., 2012. Leaves of Lolium multiflorum “Lema” and tropical tree species as biomonitors of polycyclic aromatic hydrocarbons. Ecotoxicoly Environ. Saf. 79, 139–147. Rodriguez, J.H., Pignata, M.L., Fangmeier, A., Klumpp, A., 2010. Accumulation of polycyclic aromatic hydrocarbons and trace elements in the bioindicator plants Tillandsia capillaris and Lolium multiflorum exposed at PM10 monitoring stations in Stuttgart (Germany). Chemosphere 80, 208–215. Rodriguez, J.H., Wannaz, E.., Salazar, M.J., Pignata, M.L., Fangmeier, A., Franzaring, J., 2012. Accumulation of polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the tree foliage of Eucalyptus rostrata, Pinus radiata and Populus hybridus in the vicinity of a large aluminium smelter in Argentina. Atmos. Environ. 55, 35–42. Rozita Osman, N.S., 2012. Selective Extraction of Organic Contaminants from Soil Using Pressurised Liquid Extraction. J. Chem. 2013, 8. Ruzin, S.E., 1999. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University press. Samecka-Cymerman, A., Kolon, K., Kempers, A.J., 2011. Taxus baccata as a Bioindicator of Urban Environmental Pollution. Polish J. Environ. Stud. 20, 1021–1027. Sanchez-Brunete, C., Miguel, E., del Mar Delgado, M., Tadeo, J.L., 2008. LEVELS OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS IN PLANTS AND SOIL FROM SPANISH CEREAL FIELDS. Fresenius Environ. Bull. 17, 1601–1606. Sanz-Landaluze, J., Bocanegra-Salazar, M., Ortiz-Perez, D., Camara, C., 2010. Miniaturisated method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in leaf samples. J. Chromatogr. A 1217, 3567–3574. Sharma, P.A., Tripathi, B.D., 2009. Assessment of atmospheric PAHS profile through Calotropis gigantea R.Br. leaves in the vicinity of an Indian coal-fired power plant. Environ. Monit. Assess. 149, 477–482. Shukla, V., Upreti, D.K., 2009. Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) accumulation in lichen, Phaeophyscia hispidula of DehraDun City, Garhwal Himalayas. Environ. Monit. Assess. 149, 1–7.

80

Sienra, M.D., Rosazza, N.G., Prendez, M., 2005. Polycyclic aromatic hydrocarbons and their molecular diagnostic ratios in urban atmospheric respirable particulate matter. Atmos. Res. 75, 267–281. Sojinu, O.S., Sonibare, O.O., Ekundayo, O., Zeng, E.Y., 2010. Biomonitoring potentials of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by higher plants from an oil exploration site, Nigeria. J. Hazard. Mater. 184, 759–764. Srogi, K., 2007. Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: a review. Environ. Chem. Lett. 5, 169–195. St-Amand, A.D., Mayer, P.M., Blais, J.M., 2008. Seasonal trends in vegetation and atmospheric concentrations of PAHs and PBDEs near a sanitary landfill. Atmos. Environ. 42, 2948–2958. St-Amand, A.D., Mayer, P.M., Blais, J.M., 2009. Modeling PAH uptake by vegetation from the air using field measurements. Atmos. Environ. 43, 4283–4288. Sun, F., Wen, D., Kuang, Y., Li, J., Li, J., Zuo, W., 2010. Concentrations of heavy metals and polycyclic aromatic hydrocarbons in needles of Masson pine (Pinus massoniana L.) growing nearby different industrial sources. J. Environ. Sci. 22, 1006–1013. Tao, S., Cui, Y.H., Xu, F., Li, B.G., Cao, J., Liu, W., Schmitt, G., Wang, X.J., Shen, W., Qing, B.P., Sun, R., 2004. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in agricultural soil and vegetables from Tianjin. Sci. Total Environ. 320, 11–24. Tao, S., Jiao, X.C., Chen, S.., Liu, W.X., Coveney Jr, R.M., Zhu, L.Z., Luo, M.Y., 2006. Accumulation and distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in rice (Oryza sativa). Environ. Pollut. 140, 406–415. Taylor, P.J., 2005. Matrix effects: The Achilles heel of quantitative high-performance liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Clin. Biochem. 38, 328–334. Thermo Scientific, 2013. Accelerated Solvent Extraction Techniques for In-Line Selective Removal of Interferences. Tian, X., Liu, J., Zhou, G., Peng, P., Wang, X., Wang, C., 2008. Estimation of the annual scavenged amount of polycyclic aromatic hydrocarbons by forests in the Pearl River Delta of Southern China. Environ. Pollut. 156, 306–315. Tomashuk, T.A., Truong, T.M., Mantha, M., McGowin, A.E., 2012. Atmospheric polycyclic aromatic hydrocarbon profiles and sources in pine needles and particulate matter in Dayton, Ohio, USA. Atmos. Environ. 51, 196–202. Unie, E., 2004. DIRECTIVE 2004/107/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 15 December 2004 relating to arsenic, cadmium, mercury, nickel and polycyclic aromatic hydrocarbons in ambient air. Urbat, M., Lehndorff, E., Schwark, L., 2004. Biomonitoring of air quality in the Cologne conurbation using pine needles as a passive sampler - Part I: magnetic properties. Atmos. Environ. 38, 3781– 3792. Van Cotthem, W., Fryns-Claessens, E., 1994. Plantenanatomie in praktijk. Van In - Lier.

81

Vlaamse Milieumaatschappij, 2013. Luchtkwaliteit in Vlaanderen Polycyclische aromatische koolwaterstoffen – jaarrapport 2013. Wang, X.L., Tao, S., Dawson, R.W., Xu, F.L., 2002. Characterizing and comparing risks of polycyclic aromatic hydrocarbons in a Tianjin wastewater-irrigated area. Environ. Res. 90, 201–206. Wei, C., Han, Y., Bandowe, B.A.M., Junji, C., Huang, R.-J., Haiyan, N., Tian, J., Wilcke, W., 2015. Occurrence, gas/particle partitioning and carcinogenic risk of polycyclic aromatic hydrocarbons and their oxygen and nitrogen containing derivatives in Xi’an, central China. Sci. Total Environ. 505, 814–822. www.kmi.be [WWW Document], 2015. www.meteo-info.be [WWW Document], 2015. Zechmeister, H.G., Dullinger, S., Hohenwallner, D., Riss, A., Hanus-Illnar, A., Scharf, S., 2006. Pilot study on road traffic emissions (PAHs, heavy metals) measured by using mosses in a tunnel experiment in Vienna, Austria. Environ. Sci. Pollut. Res. 13, 398–405. Zhu, X., Pfister, G., Henkelmann, B., Kotalik, J., Bernhoeft, S., Fiedler, S., Schramm, K.-W., 2008. Simultaneous monitoring of profiles of polycyclic aromatic hydrocarbons in contaminated air with semipermeable membrane devices and spruce needles. Environ. Pollut. 156, 461–466. Ziegenhals, K., Jira, W., Speer, K., 2008. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in various types of tea. Eur. Food Res. Technol. 228, 83–91. Zohair, A., Salim, A.B., Soyibo, A.A., Beek, A.J., 2006. Residues of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs) and organochlorine pesticides in organically-farmed vegetables. Chemosphere 63, 541–553.

82

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen. Academiejaar

Recommend Documents