Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013-2014
Ontwikkelen en toepassing van een druksensor om het suikertransport te onderzoeken in tomaat en tarwe
Lars Mattheyses Promotor: Prof. dr. ir. Kathy Steppe Tutoren: dr. ir. Veerle De Schepper & ir. Jochen Hanssens
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: milieutechnologie
De auteur en de promotor geven toestemming om dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.
The author and the supervisor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.
De promotor
De tutoren
Prof. dr. ir. Kathy Steppe
Veerle De Schepper
De auteur
Jochen Hanssens
Lars Mattheyses
Gent,
juni
2014
Voorwoord Het schrijven van een thesis is een project van lange adem. Ik had dit werk dan ook niet kunnen volbrengen zonder de hulp en steun van enkele belangrijke mensen die ik in dit gedeelte wil bedanken. In de eerste plaats wil ik mijn tutors dr. ir. Veerle De Schepper & ir. Jochen Hanssens bedanken voor hun begeleiding. Hun enthousiasme, suggesties, uitleg, feedback en continue bereikbaarheid waren cruciaal bij het volbrengen van deze masterproef. Ik wil eveneens mijn promotor Prof. dr. ir. Kathy Steppe bedanken voor de opvolging en eindevaluatie van dit werk. Prof. dr. ir. Olivier Thas en statistisch consultant Joris Meys van de vakgroep Biostat wil ik bedanken voor hun hulp bij de statistische analyse van mijn data. Verder gaat er nog speciaal dank uit naar Geert Favyts en Phillip Deman. Hun bijdrage was onontbeerlijk bij de bouw van de druksensor. Ook de andere leden van het labo plantecologie wil ik bedanken voor hun vriendelijkheid en behulpzaamheid. Nu het einde van mijn studententijd er bijna opzit, wil ik van de gelegenheid gebruik maken om een aantal mensen te bedanken. In de eerste plaats dank ik mijn ouders en mijn broer Jens, voor hun morele en financiële steun tijdens mijn studies. Verder dank ik mijn grootouders, die steeds interesse hebben getoond in mijn studies en soms de nodige bijlessen hebben voorzien, en mijn vriendin, Sara, die me het ganse traject heeft bijgestaan en deze thesis meermaals heeft nagelezen.
Samenvatting De druksensor is een veelbelovend toestel om de waterhuishouding binnen weefsels en individuele cellen te meten. De voorbije jaren heeft dit toestel voor een schat aan informatie gezorgd binnen tal van wetenschappelijke disciplines. Deze thesis heeft tot doel om zelf een druksensor te bouwen en te valideren, waarna hij zal worden gebruikt binnen enkele onderzoeksvelden van de plantenfysiologie. In de huidige consumptiemaatschappij is het cruciaal om competitief te blijven met de rest van de markt. De constante nood aan innovatie leidt ook in de tomatenteelt tot uitvoerig onderzoek naar de factoren die de productiviteit en kwaliteit van de vrucht kunnen maximaliseren. Hoewel er al veel geweten is over het ontwikkelingsproces van een tomatenvrucht, blijft dit vaak theoretisch en wordt een belangrijk deel van de resultaten bekomen door voorspellingen uit modellen. Een gedetailleerde meting van het verloop van de turgordruk binnen de vrucht ontbreekt nog in alle literatuur. In een eerste experiment werd de druksensor gebruikt om de turgordruk van tomaten te meten in functie van de leeftijd en om na te gaan of er een effect is van de EC-waarde van de voedingsoplossing op de turgordruk. Hoewel het effect van EC op turgor in deze proef niet kon worden waargenomen, werd wel een significant klokvormig patroon gevonden voor het verloop van de turgor, met een maximum rond 30 dagen na anthese. Het verloop van de turgor werd bevestigd door continue metingen van vruchtgroei met de dendrometer. Beide resultaten bevestigen de aanwezigheid van drie fases in de ontwikkeling van de vrucht: een celdelingsfase, gekenmerkt door trage groei en lage turgor; een celexpansiefase, gekenmerkt door snelle groei en hogere turgor en een rijpingsfase, gekenmerkt door trage groei, lage turgor, chemische veranderingen en sterk negatieve osmotische potentialen. In een tweede experiment werd gestreefd naar het meten van de turgordruk van floëemweefsels aan de hand van de druksensor. Het suikertransport binnen het floëem is vooralsnog een goed bewaard geheim binnen de plantenfysiologie. De weefsels zijn zeer moeilijk bereikbaar en bezitten de nodige afweermechanismen om staalafnamen en drukmetingen te verhinderen. De toepassing van floëemvoedende insecten, nl. stylectomie, werpt een heel nieuw licht op de zaak. Stylectomie is een redelijk recente techniek die zeer gedetailleerde en zuivere metingen toelaat op het floëemweefsel. In dit experiment werd gewerkt aan een methode om de floëemdruk te meten bij tarwe, door de druksensor te combineren met de stylectomietechniek. Er werd vooral aandacht geschonken aan de proefopstelling en de verschillende onderzoekshandelingen. Hoewel er nog geen kwalitatieve meting kon worden uitgevoerd op het einde van dit onderzoek, geeft deze masterproef wel enkele belangrijke tips en punten van verbetering aan, waarmee rekening kan worden gehouden voor de verdere ontwikkeling van de techniek. Vooral de bevestiging van de druksensor rond het afgebrande
stylet was nog voor verbetering vatbaar. Verder belemmerden de proefopstelling, het breken van de tip van het capillair, de lijm… , het uitvoeren van een kwalitatieve meting. Van zodra deze techniek volledig op punt zal staan, zijn de mogelijkheden voor verder onderzoek naar het floëemweefsel uitgebreid en kan nieuwe kennis in dit veld leiden tot een beter algemeen begrip van de plant.
Inhoudstafel Inleiding ................................................................................................................................................... 1 1. Literatuurstudie ................................................................................................................................... 3 1.1. Vruchtontwikkeling bij de tomaat ................................................................................................ 3 1.1.1. Tomatenteelt in België .......................................................................................................... 3 1.1.2. Vruchtontwikkeling ............................................................................................................... 3 1.2. Suikertransport via het floëem..................................................................................................... 6 1.2.1. Structuur van het floëemweefsel .......................................................................................... 6 1.2.2. Suikertransport-mechanisme ................................................................................................ 6 1.2.3. Staalname van het floëemsap ............................................................................................... 8 1.2.4. Samenstelling van het floëemsap ....................................................................................... 12 1.3. Druksensor ................................................................................................................................. 13 1.3.1. Werking van de druksensor................................................................................................. 13 1.3.2. Toepassingen van de druksensor ........................................................................................ 14 1.3.3. Nadelen van de druksensor ................................................................................................. 15 2. Materiaal en methoden..................................................................................................................... 17 2.1. Druksensor ................................................................................................................................. 17 2.1.1. Ontwikkeling van de druksensor ......................................................................................... 17 2.1.2. Validatie van de druksensor ................................................................................................ 17 2.2. Turgordruk bij kerstomaten ....................................................................................................... 20 2.2.1. Experimentele opzet ........................................................................................................... 20 2.2.2. Opmeten van de turgor ....................................................................................................... 22 2.2.3. De osmotische vruchtwaterpotentiaal bepaald met de thermokoppel psychrometer ...... 23 2.2.4. De lineair variabele differentiaaltransformator (LVDT) ...................................................... 24 2.2.5. Bereiding van de voedingsoplossing en bepaling van de EC-waarden ............................... 25 2.2.6. Statistische analyse ............................................................................................................. 26 2.3. Floëemtransport bij tarwe ......................................................................................................... 27 2.3.1. Kweken van de tarweplanten .............................................................................................. 27 2.3.2. Het kweken van de bladluizen............................................................................................. 28 2.3.3. Zapper.................................................................................................................................. 29 3. Resultaten.......................................................................................................................................... 31 3.1. Ontwikkeling van de druksensor ................................................................................................ 31 3.1.1. Bouw van de druksensor ..................................................................................................... 31
3.1.2. Valideren en kalibreren van de druksensor ........................................................................ 33 3.2. Turgordruk bij kerstomaten ....................................................................................................... 34 3.2.1. Metingen van de turgor ...................................................................................................... 34 3.2.2. Statistische analyses bij de turgormetingen ....................................................................... 35 3.2.3. Metingen van de osmotische potentiaal............................................................................. 40 3.2.4. Vruchtgroei .......................................................................................................................... 41 3.3. Floëemtransport bij tarwe ......................................................................................................... 42 3.3.1. De proefopzet ...................................................................................................................... 42 3.3.2. Het branden van de styletten.............................................................................................. 43 3.3.3. Bevestigen van de druksensor op het stylet ....................................................................... 44 4. Discussie ............................................................................................................................................ 47 4.1. Ontwikkeling van de druksensor ................................................................................................ 47 4.2. Turgordruk bij kerstomaten ....................................................................................................... 47 4.2.1. Metingen van de turgor ...................................................................................................... 47 4.2.2. Metingen van de osmotische potentiaal............................................................................. 49 4.2.3. Vruchtgroei .......................................................................................................................... 51 4.2.4. Vruchtontwikkeling ............................................................................................................. 51 4.3. Floëemtransport bij tarwe ......................................................................................................... 52 5. Toekomstig onderzoek ...................................................................................................................... 55 5.1. Druksensor ................................................................................................................................. 55 5.2. Kerstomaten ............................................................................................................................... 55 5.3. Floëemtransport bij tarwe ......................................................................................................... 56 6. Conclusies .......................................................................................................................................... 57 Bibliografie ............................................................................................................................................ 59
Inleiding Het meten van de turgordruk in cellen en weefsels van planten vormt een grote uitdaging binnen de platenfysiologie. Om zulke metingen mogelijk te maken werd een druksensor ontwikkeld. De druksensor levert een directe en continue meting van de turgordruk binnen een individuele cel, maar kan ook gebruikt worden om andere parameters van de waterhuishouding te achterhalen. Het is tevens een nauwkeurig staalnametoestel. Een van de eerste prototypes werd gebouwd en beschreven door Hüsken in 1978. In deze masterproef zal in eerste instantie een eigen druksensor worden ontwikkeld en gevalideerd. Het toestel zal vervolgens worden ingezet voor twee verschillende experimenten. Een eerste onderzoek richt zich op de turgordruk binnen kerstomaten. De turgor speelt namelijk een belangrijke rol in de ontwikkeling en groei van de vrucht. Met de druksensor zal een verloop worden opgesteld voor de turgor in functie van de vruchtleeftijd. Naast de turgor wordt gekeken naar het verloop van de osmotische en totale waterpotentiaal van de vrucht. Als laatste werd ook nog de evolutie van de vruchtdiameter opgevolgd in functie van de tijd. Door te werken met vijf verschillende EC-behandelingen werd het effect van osmotische stress op turgordruk en vruchtgroei nagegaan. Het tweede onderzoek betreft de druk binnen de zeefvaten van het floëemweefsel. Deze druk is vooralsnog een onbekend terrein binnen het vakgebied van de plantenfysiologie. Door een sterk verdedigingsmechanisme zijn de meeste planten in staat om hun suikertransport af te schermen van externe drukmetingen en staalnamen. Het gebruik van hemipteren die zich op het floëem weten te voeden, opent hier nieuwe perspectieven. Deze insecten weten met hun steeksnuit de zeefvaten te lokaliseren en de verdediging te omzeilen. Het stylet vormt dan een rechtstreeks kanaal vanuit het floëemvat. In dit onderzoek zal deze stylectomietechniek worden gecombineerd met de zelfgemaakte druksensor, om zo drukmetingen uit te voeren op het floëemweefsel van tarwe.
1
2
1. Literatuurstudie Deze literatuurstudie focust, net zoals de gehele thesis, op drie gerelateerde onderwerpen. Een eerste deel spitst zich toe op de vruchtontwikkeling bij tomaat. Gezien het belang van de suikerstroom via het floëemweefsel tijdens de vruchtontwikkeling, wordt dit floëemtransport in een tweede deel uitvoeriger besproken. Tenslotte wordt een druksensor besproken die de turgordruk in plantenweefsels kan opmeten. Deze turgordruk is onder andere een belangrijke parameter voor het floëemweefsel en het vruchtweefsel.
1.1. Vruchtontwikkeling bij de tomaat 1.1.1. Tomatenteelt in België
Tomaten (Solanum lycopersicum L.) behoren samen met de aardappel en de aubergine tot het geslacht van de nachtschadigen. Ze zijn oorspronkelijk afkomstig uit Zuid-Amerika en werden omstreeks 1750 in Europa geïntroduceerd. Hoewel de meeste mensen de tomaat als groente kennen, is het in wezen een vrucht, meer bepaald een bes. Vandaag is de tomaat uitgegroeid tot één van de populairste vruchten in België en vind je ze in alle maten en vormen. In België gebeurt de teelt van tomaten voornamelijk in serres. In 2009 vond 59% van de totale productie plaats onder glas. In ons land zijn tomaten één van de voornaamste exportproducten binnen de verse groenten (Bernaerts & Demuynck, 2009). De tomatenplant wordt in de moderne teelt klimmend gekweekt en heeft een trosvormige bloeiwijze. 1.1.2. Vruchtontwikkeling
De bloemen van de tomaat komen in trosjes en zijn zelfbestuivend. Eenmaal de bloem is bevrucht, duurt het twee tot vier dagen vooraleer het endosperm wordt gevormd. De vruchtgroei bij tomaten volgt vanaf dan een sigmoïde curve die kan opgedeeld worden in drie verschillende periodes (Ho & Hewitt, 1986) (Figuur 1). Twee dagen na anthese zal de instroom van assimilaten uit de bladeren aanzienlijk toenemen (Dennis, Archbold & Flore, 1982). De aangeworven massa is dan voornamelijk afkomstig van celdeling binnen het pericarp (vruchtwand). Hiervoor zijn vooral assimilaten en nutriënten nodig en dus niet zo zeer een hoge turgor (Davies & Cocking, 1965). De toename bedraagt slechts 10% van het finale gewicht. De eerste twee tot drie weken worden dus eerder gekenmerkt door een trage groei. In de volgende drie tot vijf weken neemt het transport van water en assimilaten van de plant naar de vrucht toe. Deze periode wordt gekenmerkt door snelle groei, met een verwacht maximum tussen 20 en 25 dagen na anthese (Ho, Sjut, & Hoad, 1983). In dit stadium wordt niet meer aan celdeling gedaan, maar worden vooral water en assimilaten aangevoerd, die zorgen voor een hoge turgor en celexpansie. In de laatste twee weken van de vruchtontwikkeling zal de tomaat niet zozeer in gewicht bijkomen, maar zullen er vooral belangrijke metabolische 3
veranderingen plaatsvinden. Het chlorofyl degradeert, wat in combinatie met de synthese van βcaroteen en lycopeen de roodverkleuring van een rijpende vrucht veroorzaakt. Eveneens wordt zetmeel tot glucose en fructose afgebroken en stijgt de productie van citroenzuur, appelzuur, glutaminezuur en andere smaakstoffen. Daarenboven beginnen oplosbare pectines te accumuleren door de degradatie van de celwand en start de afbraak van de giftige stof alkaloide α-tomatine (Gierson & Kader, 1986). Afhankelijk van de variëteit kunnen volwassen vruchten 15 (kerstomaten) tot 450 gram wegen. Vijfennegentig procent van de vrucht bestaat uit water.
Figuur 1: De drie verschillende stadia van de vruchtontwikkeling bij tomaten, uitgezet in ‘days past anthesis’ (DPA) (Mori & Lemaire-Chamley, 2009). De eerste fase wordt voornamelijk gekenmerkt door celdeling. In de tweede fase zal het gewicht exponentieel beginnen toenemen en in de derde fase zal de vrucht voornamelijk metabolische veranderingen ondergaan en van kleur beginnen veranderen.
Waterrelaties tijdens de vruchtontwikkeling Tijdens de ontwikkeling van de vrucht zal het aandeel van de wateraanvoer via het xyleemweefsel afnemen, waardoor de voornaamste waterinstroom gebeurt via het floëemweefsel. Ehret et al. (1986) toonden aan dat op een leeftijd van 25 dagen na anthese (‘Days after anthesis’, DAA), 90 % van het water naar de vrucht wordt getransporteerd via het floëem en dat de waterinstroom via het xyleem amper nog bijdraagt. Men vermoedt dat op dit tijdstip de hydraulische weerstand in de vruchtsteel drastisch toeneemt (Van Ieperen et al., 2003). Een uitgebreid verloop van de waterrelaties binnen de tomatenvrucht ontbreekt voorlopig binnen de literatuur. Eén van de belangrijkste parameters die kwaliteit en groei beïnvloeden is de aanvoer van water en nutriënten van de plant naar de vrucht (Van Ieperen et al., 2003; 2005). Droogtestress wordt in de tomatenteelt vaak gekoppeld aan de elektrische geleidbaarheid (EC) van de voedingsoplossing. Zo wijst een hoge EC-waarde op meer zouten en dus meer osmotische stress, bijgevolg zal er dus minder wateropname zijn door de plant (Ho, Grange, & Picken, 1987). De plant kan hierop reageren met een verlaging van osmotische potentiaal en bijgevolg ook de totale waterpotentiaal om zijn turgor te behouden. Shanker (2014) gaf een overzicht van de reacties op droogtestress bij verschillende gewassen, waaronder ook de tomaat. Zo zal een hoge EC-waarde de osmotische potentiaal binnen de vrucht doen dalen. Het gebrek aan water laat een stijging toe in de concentratie 4
aan zuren, suikers en mineralen, die allen een invloed hebben op de vruchtkwaliteit (Rudich & Luchinsky, 1986), daartegenover staat een verkorting van de groeiperiode en een daling van de productiviteit. Bij elke 1,5 mS/cm boven een EC-waarde van 2,0 mS/cm verminderde vruchtgroei bij tomaten tot 10% (Adams, 1986). Gemiddelde EC-waarden die in de praktijk worden opgelegd aan tomatenplanten schommelen tussen 2 en 3 mS/cm (van de Vooren, Welles, & Hayman, 1986). Sonneveld (1985) raadt zelfs een EC-waarde aan van minstens 3 mS/cm om de vruchtkwaliteit te verhogen. Soms kan in korte periodes een hoge EC-waarde tot 10 mS/cm worden gehanteerd om te voorkomen dat de vruchtwand zou barsten (van de Vooren et al., 1986). Voorlopig wordt er echter nog steeds gezocht naar de exacte fysiologische verklaring voor de interactie tussen droogtestress, vruchtkwaliteit en –kwantiteit.
Koolstofrelaties tijdens de vruchtontwikkeling Tijdens de groei neemt het droge-stofgehalte in de tomatenvrucht af. Voor de bevruchting bedraagt de droge stof nog 17% van het totale gewicht, terwijl dit naar het einde toe nog slechts 5 tot 7% bedraagt (Ho & Hewitt, 1986). Het koolstofgehalte in percentage droge stof verandert weinig en blijft ongeveer 39% doorheen de ganse ontwikkeling. Tijdens de snelle groeiperiode wordt voornamelijk sucrose en fructose ingevoerd vanuit de bladeren. Sucrose en fructose zijn de belangrijkste suikerassimilaten binnen de tomatenplant en zijn verantwoordelijk voor ongeveer 65% van de oplosbare stoffen binnen rijpe vruchten (Winsor, 1966). Nochtans kent de tomaat tijdens haar ontwikkeling een daling in de concentratie van sucrose. De invoer wordt dus waarschijnlijk geregeld door de hydrolyse van sucrose in de vrucht (Walker, Ho & Baker, 1978). Naast sucrose en fructose wordt ook zetmeel ingevoerd. Hiervan worden maximumconcentraties gemeten 25 tot 30 dagen na anthese. Wanneer de vruchtgroei een maximum bereikt, start de afbraak van zetmeel in osmotisch actieve suikers, wat opnieuw een daling geeft van de osmotische potentiaal. Hoewel de meeste assimilaten afkomstig zijn uit de bladeren, kan de tomatenvrucht in een vroeg stadium ook zelf aan fotosynthese doen. Onvolgroeide vruchten hebben een groene kleur en bevatten dus veel chlorofyl. Hierdoor zijn ze in staat om aan fotosynthese te doen (Carrara et al., 2001; Laval-martin et al., 1977). Piechulla et al. (1987) konden dit bewijzen door de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de fotosynthesereacties te detecteren. Volgens Lytovchenko (2011) speelt de fotosynthese voornamelijk een rol bij de vruchtontwikkeling in de vroegste stadia. Tijdens de rijping daalt het chlorofylgehalte, waardoor de fotosynthesereactie stilvalt. Hoewel de vrucht in een vroeg stadium zelf aan CO2-fixatie kan doen, verwacht men dat deze suikerstroom ondergeschikt is aan die van het floëem en dus vooral bij de vruchtzetting een rol speelt. Door de afstand tussen de planten te vergroten zal er meer zonlicht worden opgevangen, met een hogere CO2-fixatie tot gevolg (Carrara et al., 2001). Ook het gehalte aan organische zuren neemt toe tijdens de vruchtontwikkeling (Davies & Cocking, 1965). 5
1.2. Suikertransport via het floëem Het transport van suikers is van cruciaal belang voor de groei en vruchtproductie bij planten. Ter hoogte van de bladeren wordt via stomata CO2 opgenomen die tijdens het fotosyntheseproces omgevormd wordt tot suikers. Deze suikers worden dan in het floëemweefsel getransporteerd van de ‘sources’, plaatsen waar suikers worden gefotosynthetiseerd (vb. bladeren), naar de ‘sinks’, plaatsen waar suikers worden verbruikt of opgeslagen (vb. vruchten en wortels). 1.2.1. Structuur van het floëemweefsel
Het floëemweefsel bestaat uit levende cellen. De belangrijkste structuren in het floëem zijn onder meer de zeefvaten (‘sieve elements’, SE) en hun bijbehorende zustercellen (‘Companion cells’, CC) (Figuur 2). De zustercellen bevatten de organellen die instaan voor de biochemische processen van de zeefvaten. We onderscheiden de kern (N), de vacuole (V), het endoplasmatisch reticulum (ER), de plastide (P) en de mitochondriën (M). Het cytoplasma van de zeefvaten en companioncellen is verbonden door plasmodesmata (PPU) in de celwand (CW), dewelke vrije doorgang toestaan van suikers en eiwitten. Twee zeefelementen worden van elkaar gescheiden door de zeefplaat (SP). Deze aaneenschakeling van zeefelementen vormt een zeefvat (van Bel, 2003).
Figuur 2: In vivo structuur van een zeefvat (‘sieve element’, SE), met aangrenzende zustercellen (‘companion cell’, CC). De zeefvaten staan geschrankt volgens het onderzoek van Knoblauch & van Bel (1998). De SE en CC zijn onderling verbonden door een geheel van poriën en plasmodesmata (‘plasmodesmata-pore-unit’, PPU). De SE worden van elkaar gescheiden door een zeefplaat (SP). Het SE is gemaakt voor transport, de meeste organellen (plastiden (P), mitochondria (M), endoplasmatisch reticulum (ER), nucleus (N) en vacuole (V)) vindt men terug in de CC, die verantwoordelijk zijn voor de energiehuishouding van de SE. De SE hebben zelf ook organellen (plastiden (PI), mitochondria (M) en een endoplasmatisch reticulum (ER)), maar deze vindt men terug aan de rand van de celwand, zodat het transport niet gehinderd wordt. Verder onderscheidt men callose (C), pariëtale proteïnen (PP) en proteïneclusters (CP) (van Bel, 2003).
1.2.2. Suikertransport-mechanisme
De werking van het floëem wordt vandaag nog steeds het best verklaard door de theorie van Ernst Münch (1930). Volgens zijn hypothese worden suikers via massatransport getransporteerd van plaatsen met een hoge druk naar plaatsen met een lage druk. Deze drukgradiënt wordt gecreëerd door het aan- en afvoeren van suikers in de zeefvaten (Figuur 3). Via de zustercellen (CC) worden in de ‘sources’, bijvoorbeeld de bladeren, de gevormde suikers in de zeefvaten gepompt, waardoor hun 6
concentratie stijgt. Door osmose wordt er vervolgens water in het zeefvat aangezogen, wat zorgt voor een verhoogde turgor. De ‘sinks’ zijn de plantdelen waarin de suikers de zeefvaten verlaten en waarin bijgevolg de turgordruk daalt. Naast de wortels en de vrucht, zijn ook de apex en de stam belangrijke ‘sinks’. Door het opgebouwde drukverschil tussen ‘sources’ en ‘sinks’ ontstaat een massatransport (Gould et al., 2005). In tegenstelling tot het watertransport in het xyleemweefsel, dat voornamelijk van onder naar boven stroomt, kan het floëem in beide richtingen stromen.
Figuur 3: Schematische weergave van het suikertransport van ‘sources’ naar ‘sinks’. (1) In het ‘collection’-floëem van de bladeren worden sucrose en eventueel andere suikers zoals polyolen gevormd door de Calvin cyclus in de chloroplasten van de mesofylcellen (ME). Deze suikers worden van hieruit getransporteerd via plasmodesmata (PD) naar de floëemparenchymcellen (PPA). Bij apoplastische laders worden ze daarna getransporteerd naar het apoplasma van het verzamelfloëem (CP). Sucrose, alsook eventuele alcoholsuikers, worden opgenomen in de zustercel (CC)/het zeefvat- (SE) complex door een suikersymporter, aangedreven door een ATPase protonenpomp in apoplastische soorten. In symplastische laders worden suikers getransporteerd door passieve diffusie van de mesofylcellen (MC) naar de CC/SE complex via plasmodesmata (PD). (2) In het transport-floëem (bv. in de stengel of stam) gebeurt het uitwisselen van suikers voornamelijk op apoplastische wijze. (3) In het ‘release’-floëem gebeurt het transport van de suikers voornamelijk op symplastische wijze. In het floëemvat wordt het massatransport veroorzaakt door een hydraulische druk die gelijk is aan een concentratiegradiënt tussen het xyleem en het floëem. Er is dus een sterke interactie tussen het water- en het suikertransport. Het bovenstaande schema is ook van toepassing op andere substraten aanwezig in het floëemweefsel, zoals polyols en aminozuren. XV: xyleemvaten. ST: zeefvaten. CC: zustercellen. PPC: floëemparenchymcellen. PI: stippels. ME: mesofylcellen. PD: plasmodesmata. Vertakte plasmodesmata komen voornamelijk voor in het CC/SE complex (Dinant & Lemoine, 2010).
In de sources kunnen suikers op drie manieren in de zeefvaten terecht komen. We onderscheiden ‘active apoplastic loading’, ‘active symplastic polymer trapping’ en ‘passive symplastic diffusion’ (De Schepper et al., 2013a, 2013b; Turgeon, 2010; van Bel, 1996, 2003). Via de apoplastische route worden suikers actief, m.a.w. door verbruik van energie, dus door verbruik van energie, vanuit de 7
apoplast met behulp van specifieke transportereiwitten vanuit de apoplast getransloceerd naar de symplast van de zustercellen (Torsten & van Bel, 2006). De zustercellen die dergelijke loadingstrategie hanteren worden ook wel transfercellen genoemd. De celwand van deze cellen bestaat uit meerdere inkepingen om het uitwisselingsoppervlak zo groot mogelijk te maken. Bij de symplastische route hoeven de suikers geen celmembraan te passeren. Onder invloed van een concentratiegradiënt diffunderen de suikers langs de plasmodesmata. De belangrijkste voorwaarde van deze loadingstrategie is dat het concentratieverschil voldoende hoog wordt gehouden. Bij ‘active symplastic polymer trapping’ worden de gediffundeerde suikers in de zustercel actief gemodificeerd tot de grotere oligosacchariden: raffinose en stachyose. Door de modificatie zijn de suikers te groot om terug te diffunderen door de plasmodesmata, terwijl kleinere moleculen, zoals sucrose, nog wel in staat zijn om terug te diffunderen. Typisch aan deze cellen zijn de nauwere plasmodesmata tussen mesofylcel en zustercel. Zulke cellen noemt men ook intermediaire cellen (Lalonde et al., 2003). De meest recent ontdekte loadingstrategie is die van ‘passive symplastic diffusion’ en komt voornamelijk voor bij de grotere bomen. Hierbij diffunderen suikers passief van een hoge concentratie naar een lage concentratie. Al deze technieken verhogen de suikerconcentratie in het floëemvat, met een lagere osmotische waterpotentiaal tot gevolg. 1.2.3. Staalname van het floëemsap
Het floëemweefsel bevindt zich in de bast onder een laag epidermis-, cortex- en sklerenchymcellen. De vaten zijn moeilijk te vinden en kunnen amper worden onderscheiden van het omliggende weefsel, wat staalafname bemoeilijkt. Daarbij staan de zeefvaten door de verhoogde suikerconcentratie onder een enorme hydrostatische druk, waardoor een plotseling drukverlies, bijvoorbeeld door beschadiging, nefast kan zijn voor de goede werking van het zeefvat. Aangezien de zeefelementen onderling verbonden zijn met zeefplaten, zal een plotse drukval het volledig zeefvat kunnen beschadigen. Om dergelijke zaken te vermijden, heeft de plant zelf enkele verdedigingsmechanismen ontwikkeld. Bij beschadiging zal de plant steeds proberen om het zeefvat af te sluiten, om verdere schade te voorkomen en het verlies van bouwstoffen te beperken. De belangrijkste moleculen die hiertoe bijdragen zijn het polysaccharide callose en een reeks gespecialiseerde eiwitten (Torsten & van Bel, 2006). Er zijn sterke aanwijzingen dat Ca2+ de activator is van dergelijke beschermingsproteïnen. Er is namelijk een sterke concentratiegradiënt aanwezig over het celmembraan van de zeefvaten. De celwand bezit een hoge concentratie aan Ca2+, terwijl de zeefvaten amper Ca2+ bevatten. Bij beschadiging van het celmembraan stroomt er enorm veel Ca2+ in het zeefvat. Deze bindt met de beschermingsproteïnen, waardoor hun configuratie zodanig wijzigt dat de zeefvaten en poriën verstopt geraken (Knoblauch, 2001).
8
Al deze verschillende aspecten bemoeilijken de staalafname van het floëemsap, waardoor er nood is aan geavanceerde staalafnametechnieken. Momenteel onderscheidt men drie belangrijke technieken van staalafname: stylectomie, exudatie via bastinsnijdingen bij natuurlijk bloedende planten en exudatie op basis van ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (Turgeon & Wolf, 2009).
Stylectomie Stylectomie is in alle waarschijnlijkheid de meest accurate, maar ook de meest tijdrovende methode van staalafname. Bij stylectomie wordt beroep gedaan op floëemvoedende insecten. Meestal wordt de voorkeur gegeven aan bladluizen, maar ook wantsen of cicaden kunnen worden ingezet. Ze behoren allen toe aan de familie van de hemipteren ofwel snavelinsecten (Delaplace & Ryck, 2008; Dinant et al., 2010). Bladluizen leven van de stikstof in de zeefvaten van de waardplanten, ze moeten dus in staat zijn om deze planten te herkennen en de zeefvaten te lokaliseren (Rennenberg, Schneider, & Weber, 1996). Bladluizen bezitten een lange steeksnuit of stylet, hiermee kunnen ze tussen de weefsels op zoek gaan naar de zeefvaten. Het stylet is samengesteld uit vier mondstukken (Figuur 4). Twee van de vier mondstukken vormen samen het voedings- en het speekselkanaal. De andere twee mondstukken bevatten beiden een zenuw die hen helpt bij het zoeken naar de zeefvaten (Torsten & van Bel, 2006). Zoals eerder vermeld heeft de plant een aantal verdedigingsmechanismes die bij verwonding worden geactiveerd. Om ongestoord te kunnen voeden op het floëem, moet de bladluis in staat zijn om deze verdediging te omzeilen. Hiervoor maken bladluizen in de eerste plaats twee soorten speeksel aan: schedespeeksel en voedingsspeeksel. Het schedespeeksel zorgt voor de afsluiting van het zeefvat langs de wond van het stylet, waardoor de hoge Ca2+-concentratie in de celwand behouden blijft en de Ca2+-ionen niet tot in het zeefvat kunnen dringen om verstoppingen te veroorzaken (Tjallingii, 2006). Het exacte mechanisme waarmee het voedingsspeeksel van bladluizen verstoppingen voorkomt of uitstelt, is nog niet precies gekend. Torsten en Van Bel (2006) vermoeden een chemische interactie die de werking van Ca2+ inhibeert. De steeksnuit of het stylet van de bladluis kan als kanaal gebruikt worden voor een simpele en zuivere staalname van het floëem. Hiervoor moet eerst het stylet van een voedend insect worden doorgebrand. Dit kan met behulp van radiofrequente energie (Fisher & Frame, 1984) of op basis van laserenergie (Sato et al., 1997). Dit proces vraagt zeer veel geduld en behendigheid. Een groot nadeel van deze techniek is dat de interacties tussen plant en parasiet vaak zeer specifiek zijn (Blackman & Eastop, 2006). Zo zullen niet alle soorten bladluizen op alle soorten planten kunnen voeden. Hun stylet moet namelijk lang genoeg zijn om de zeefvaten te bereiken. De diameter van het stylet moet ook kleiner zijn dan die van het zeefvat (Torsten & van Bel, 2006). Eénmaal doorgebrand kan het stylet openvallen in twee delen, waardoor het moeilijk wordt om een microcapillair over de monddelen te plaatsen (‘Materiaal en methoden’). Verder kunnen er slechts 9
zeer kleine volumes (nano- of microliters) bemonsterd worden met deze techniek. De samenstelling van het staal zal ook anders zijn door het toegevoegde speeksel van de bladluis. Een alternatieve techniek focust zich op de gevormde honingdauw van bladluizen. Honingdauw is na nectar en pollen een belangrijke secundaire bron van voedsel voor vele insecten binnen een ecosysteem. Snavelinsecten leven van suikers en aminozuren in het floëem, maar verteren niet alles van het opgenomen floëemsap. Het restproduct van onverteerde suikers en aminozuren wordt door de bladluis uitgescheiden en op het plantoppervlak achtergelaten. De samenstelling van deze honingdauw varieert van plant tot plant. Hij is verder afhankelijk van de toestand van de plant (waterpotentiaal, stress, leeftijd, klimaat, …) en van het floëemvoedende insect (Sabri et al., 2013). De samenstelling van honingdauw komt niet overeen met deze van het floëem, maar kan een goede eerste indicatie geven over de concentraties binnen het floëemsap.
Figuur 4: Schematische doorsnede van het stylet van een bladluis (Douglas, 2003).
Exudatie via bastinsnijdingen bij natuurlijk bloedend e planten Met het bloeden van planten bedoelt men het lekken van voedingsstoffen uit inkepingen of wonden. Door een krachtige voedingsstroom kan de plant de wond niet goed afsluiten en ontstaat er een gebrek aan voedingsstoffen. De vloeistof uit het lek wordt dan opgevangen in een microcapillair voor analyses op concentratie en samenstelling (Gessler et al., 2001; 2004). Het bloeden zelf is afhankelijk van de grootte van de wond, de conditie van de plant, haar soort en grootte (Turgeon & Wolf, 2009). In het algemeen is deze techniek eerder van toepassing op bomen, dan op struikachtigen. Het floëemsap kan slechts in bepaalde periodes van het groeiseizoen worden geoogst (Gessler et al., 2004). Daarnaast is bij het aanbrengen van de wond de kans op contaminatie door vermenging van de floëemsappen met xyleem- en andere celsappen bijna onvermijdelijk. Er zijn natuurlijk ook uitzonderingen waarbij het floëemsap niet noemenswaardig verschilt van de celinhoud. De 10
authenticiteit van het floëemsap kan men controleren door de samenstelling te onderzoeken. Zo weet men dat indien er hoge concentraties aan transportsuikers aanwezig zijn, dat er een hoge omzetting van suikers naar aminozuren moet zijn en weinig tot geen monosachariden aanwezig zullen zijn. In de praktijk is deze laatste factor de belangrijkste indicator van zuiver floëemsap. Een ander nadeel is dat het floëemsap slechts in bepaalde periodes kan worden geoogst.
Exudatie op basis van ethyleendiaminetetra -azijnzuur (EDTA) Zoals hierboven vermeld, vormen natuurlijk bloedende planten slechts een selecte groep. Bij de meeste soorten treedt bij verwonding het afdichtingsmechanisme op om het lekken van voedingstoffen te stoppen. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) is een veel toegepaste chelaterende organische verbinding die de verantwoordelijke metaalionen in oplossing houdt en bijgevolg inactiveert (Figuur 5). Aangezien het voornamelijk de Ca-ionen zijn die het zeefvat blokkeren bij beschadiging, kan EDTA dit voorkomen door deze Ca-ionen te inactiveren (Tetyuk et al., 2013). Er wordt eerst een snee aangebracht bij de plant, waarna EDTA wordt aangebracht op het oppervlak. Hierdoor zal het floëemsap blijven lekken en samen met het xyleemsap uit de toegebrachte verwonding blijven stromen. Om verdere schade aan de plant te voorkomen wordt slechts in concentraties tussen 10 en 20 mM gewerkt. Een volledig protocol voor de EDTA-techniek vinden we terug bij Tetyuk et al. (2013). Het is een gemakkelijke, maar vooral ook goedkope en snelle techniek om een floëemsapstaal te verkrijgen. Met deze techniek kan vrij veel extract worden gewonnen, wat haar uiterst geschikt maakt om de samenstelling te bepalen van de verschillende proteïnen, suikers, vetten, RNA, virussen en metabolieten. Een van de nadelen van deze techniek is dat het floëemsap gecontamineerd kan worden. Door de plant te verwonden zullen niet alleen de xyleem- en de floëemvaten gekwetst worden, maar zullen ook de omliggende parenchymcellen beschadigd worden, wat tot verdunning van het floëem kan leiden. De techniek kende de voorbije jaren nog enkele optimalisaties, waardoor er betere schattingen kunnen worden gemaakt over concentraties binnen het floëem en waardoor er zelfs sapstromen en turgordruk gemeten kunnen worden (Najla et al., 2010).
Figuur 5: Molecuulstructuur van ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (Barron, 2010).
11
1.2.4. Samenstelling van het floëemsap
Het floëemweefsel staat voornamelijk in voor het suikertransport, maar ook andere componenten zoals aminozuren en ionen (bv. K+) worden door de zeefvaten getransloceerd. Suikers, aminozuren en ionen vormen de voornaamste componenten die instaan voor de osmotische gradiënt (Patrick et al., 2001). De exacte samenstelling van het floëemsap varieert van plant tot plant, maar ook door verschillen in tijd en klimaat kunnen er variaties optreden (Gattolin et al., 2008). Turgeon en Wolf (2009) geven een gestructureerd overzicht van de verschillende stoffen die in het floëem worden getransporteerd. Koolhydraten, in het bijzonder sucrose, zijn hierbij de grootste groep. Door polymeertrapping, één van de drie ‘loading’ strategieën van de plant, kan sucrose ook worden omgevormd tot raffinose of stachyose (Turgeon & Wolf, 2009; van Bel, 1992). Naast koolhydraten onderscheidt men verder nog secundaire metabolieten, auxines, proteïnen en RNA. Secundaire metabolieten zijn metabolieten die niet direct betrokken zijn bij de groei van de plant en vaak toxische of beschermende eigenschappen hebben. Ze bevinden zich voornamelijk in de apoplast en dus niet in de symplast (floëem), hoewel er enkele uitzonderingen bestaan, zoals glucosinolaten, iridoide glycosiden, pyrrolizidine alkaloïden en cardenoliden die men wel in het floëem kan terugvinden (Turgeon & Wolf, 2009). Auxines zijn een groep van plantenhormonen die ook via het floëem worden vervoerd (Friml & Palme, 2002). Ze stimuleren voornamelijk de groei van de plant en de vrucht. Verder zijn ze verantwoordelijk voor de structuur van de wortels, het behoud van de bladeren en de houvast bij klimplanten. In het floëem bevinden zich ook honderden soorten proteïnen. Concreet zijn er nog veel vragen over het ontstaan, het transport en de functie van deze eiwitten. De samenstelling en concentratie van de eiwitten hangen af van de zone in de plant. Zustercellen en jonge zeefvaten worden geacht verantwoordelijk te zijn voor de productie van eiwitten in het floëem (Turgeon & Wolf, 2009). Over de exacte mechanismen betreffende de uitwisseling van proteïnen in en uit de zeefvaten is echter vooralsnog weinig geweten. Naast het transporteren van suiker, doet het floëemweefsel vooral dienst als boodschapper van signalen, die bijvoorbeeld gerelateerd zijn aan stress. RNA, aanwezig in het floëem, bevat specifieke transcripties voor de vorming van proteïnen die instaan voor dergelijke zaken. Ondanks de zuiverheid van het staal bij stylectomie, wordt voornamelijk gekozen voor natuurlijk bloedende planten, aangezien zo grotere volumes kunnen worden afgenomen (Doering-Saad, 2006; 2002). Er zijn momenteel een duizendtal floëem-RNA transcripties te onderscheiden, die op hun beurt sterk verschillen van het RNA aanwezig in de zustercellen. Omid et al. (2007) hebben hun analyse uitgevoerd op meloenen en zijn tot een volgende functionele onderverdeling gekomen: cellulaire reactie op hormonen en stress (40%), controle over de transcriptie en de binding van aminozuren (15%) en verdedigende responsies (10%). Slechts 2% van het floëem-RNA heeft effect op het celmetabolisme. Tot nu toe zijn er echter
12
nog steeds veel vragen over de hoeveelheid floëem-RNA en over de rol die deze speelt binnen de plant.
1.3. Druksensor Levende plantencellen staan onder een hoge turgordruk. Het cytoplasma binnen een cel heeft namelijk een hogere concentratie aan metabolieten dan de omringende apoplastische oplossing. Hierdoor zal er een osmotische instroom zijn van water, die verantwoordelijk is voor het uitzetten van de cel (Boyer, 1995). De druk die van binnenuit wordt uitgeoefend op de celwand, is de turgor. Deze turgor is onder andere verantwoordelijk voor de groei van de plantcellen (o.a. in vruchten), maar is daarnaast ook van belang voor het lange-afstandstransport van suikers in het floëemweefsel. Binnen deze weefsels kunnen drukken oplopen tot enkele MPa (Tomos, 2000). Om een organisme volledig te kunnen beschrijven, moet men de activiteiten op het niveau van de individuele cellen kunnen begrijpen. De uitvinding van de druksensor, ofwel ‘pressure probe’, heeft de voorbije jaren binnen het cellulaire onderzoek voor een revolutie gezorgd. Deze micromanometer kan naast het bepalen van de waterhuishouding van een enkele levende cel in haar weefsels, ook de turgor in een vrucht onderzoeken, zoals van Ieperen (2005) wist aan te tonen. 1.3.1. Werking van de druksensor
De druksensor bestaat uit een aangescherpt microcapillair waarmee in de celwand kan worden geprikt, een regelstaaf en een druktransducer (Gholipour et al., 2013). Een gedetailleerde weergave kan teruggevonden in de sectie ‘Resultaten’. In een eerste ontwerp van de druksensor werd slechts gewerkt met water en een luchtbel als meniscus (Hüsken, Steudle & Zimmermann, 1978). Hierdoor was men enkel in staat om turgordrukken te meten. Wanneer de vloeistof werd vervangen door olie en de druk via een druktransducer werd getransformeerd naar een elektrisch signaal, werd het mogelijk om naast de turgordruk ook de elasticiteit, de hydraulische conductiviteit en de selectiviteit voor water en metabolieten van de celwand te onderzoeken (Tomos & Leigh, 1999). Inmiddels is de druksensor geëvolueerd van een instrument om de waterstatus van een enkele cel te achterhalen, tot een toestel voor geavanceerde metingen en nauwkeurige staalname bij cellen en hogere plantenweefsels. De druksensor is volledig gevuld met olie. Wanneer met een scherp capillair in een cel wordt geprikt, zal het celsap onder invloed van de turgordruk de olie in het capillair terugduwen (Figuur 6). Er ontstaat een meniscus tussen het waterige celsap en de olie in het capillair. Door het terugduwen van de olie in het capillair zal de druk binnen de cel verlagen. Om de oorspronkelijke turgordruk te meten, moet de meniscus in het microcapillair worden teruggeduwd tot aan de celwand. Op dit moment moet de druk binnen de druksensor, weergegeven door de transducer in millivolt, gelijk zijn aan de oorspronkelijke turgordruk binnen de cel (Boyer, 1995; Tomos, 2000). Naast de turgor, is het 13
mits een kleine aanpassing ook mogelijk om de zuigspanning binnen een xyleemvat te meten (Thürmer et al., 1999). Tomos en Leigh (1999) gebruikten de druksensor onder andere voor het meten van drukveranderingen binnen het xyleem, hoewel deze resultaten nog voor discussie vatbaar zijn.
Figuur 6: Schematische weergave van de druksensor en het met olie gevuld microcapillair: (a) microcapillair steekt in de cel, (b) de druktransducer, (c) de drukregelaar, (d) de celsap- en oliemeniscus (Tomos, 2000).
1.3.2. Toepassingen van de druksensor
De druksensor kan ook als continue techniek gebruikt worden, waardoor het mogelijk is om het verloop van de turgordruk te volgen in de tijd. De turgor is namelijk sterk afhankelijk van schommelingen in de waterhuishouding (bijvoorbeeld door transpiratie). Door het opleggen van osmotische stres bij planten kan de reactie van de turgor worden gemonitord. Gemiddeld worden in goed bewaterde planten drukken waargenomen tussen de 0,5 en 1,0 MPa, maar deze kunnen verschillen naargelang het tijdstip en de omstandigheden. Boyer en Nonami (1987) bevestigden dat de gemeten turgor van de druksensor overeen kwam met deze die gevonden werden met behulp van de psychrometer. De elasticiteit van de celwand geeft de expansiemogelijkheid van de celwand weer, onder andere onder invloed van de turgor. Deze kan bepaald worden door de druksensor d.m.v. het alterneren van de meniscus tussen onder- en overdruk, waarbij telkens het signaal wordt afgelezen. Deze waarden, in combinatie met het celvolume, laten toe om de elasticiteit van de celwand te bepalen (Boyer, 1995; Hüsken et al., 1978). De grootste onzekerheid heerst er over het celvolume. Zowel Wendler en Zimmermann (1982) als Tomos en Malone (1990) beschrijven een techniek voor de bepaling van het celvolume, maar indien de onzekerheid te groot is, dan kan als alternatief een gestandaardiseerd volume voor de cellen gebruikt worden. Algemeen gezien neemt de elasticiteit van de celwand toe bij grotere cellen (Nonami & Boyer, 1990). De hydraulische conductiviteit of geleidbaarheid bepaalt de mate en snelheid waarmee water zich door een doorlaatbaar medium kan verplaatsen, in dit geval de celmembraan/celwand (Tomos & 14
Leigh, 1999). De druksensor kan hydraulische conductiviteit meten door de turgor te laten toenemen of afnemen en vervolgens de relaxatie van de cel door het uit- of instromen van water te meten. De relaxatiesnelheid geeft een indicatie van de hydraulische conductiviteit. Nonami en Boyer (1990) testten het effect van droogtestress bij sojascheuten op de hydraulische geleidbaarheid. In hun experiment zagen ze een daling van de geleidbaarheid bij toenemende droogtestress, vooral bij volwassen cellen. Niet enkel mechanische parameters zijn belangrijk voor het begrijpen van een cel, ook de chemische samenstelling is van het uiterste belang. Door de concentratie te meten van de osmotisch actieve componenten, kan de osmotische potentiaal binnen de cel worden bepaald. SiCSA (Single Cell Sampling and Analysis) is de overkoepelende naam voor alle technieken waarbij de stalen uit eencelligen geanalyseerd worden. De druksensor kan ook gebruikt worden als staalafnametoestel (Tomos & Leigh, 1999). Aan de hand van stalen, genomen met behulp van de druksensor, kan in combinatie met een massaspectrometer (Gholipour et al., 2008; 2013) of een osmometer (Nonami & Boyer, 1990) de osmotische potentiaal van cellen of weefsels bepaald worden. Koroleva en Tomos (2002) onderzochten de reactie van de osmotische potentiaal en de turgor op de accumulatie van suikers in drie soorten cellen van het blad: epidermiscellen, parenchym bundelschedecellen en mesofylcellen). Voor de accumulatie van suikers in het blad werd. De onderzoekers vonden dat door koeling van de stengel het floëemtransport stopte, waardoor de suikers accumuleerden in het blad. Zowel osmotische potentiaal als turgordruk namen toe ten opzichte van het controleblad door de afsluiting van het suikertransport in het floëemweefsel. 1.3.3. Nadelen van de druksensor
Er zijn enkele nadelen verbonden aan het gebruik van de druksensor. Zo wordt er vaak op kleine schaal gewerkt, waardoor het gebruik van een microscoop is aangewezen. Bij individuele cellen kan best gewerkt worden met exemplaren groter dan 20 µm. De aanwezige turgor moet ook voldoende hoog zijn, minstens 0,1 MPa, zodat de meniscus duidelijk voorbij het celoppervlak ligt en regelbaar is (Tomos, 2000). Het fixeren van zulke kleine cellen is niet evident. De turgor moet ongewijzigd blijven, dus lekken moeten ten allen tijde vermeden worden. Er mag via het snijvlak geen druk ontsnappen langs het capillair of de cel mag niet uitdrogen en celsap verliezen via evaporatie, wat een vertekening van de turgor zou veroorzaken. Om dergelijke zaken te voorkomen plaatst men de cel vaak in een nutriëntenvloeistof (Boyer, 1995). Daarenboven wordt de druksensor best regelmatig gecontroleerd, vooral aan de rubberen afdichtingen. Vibraties kunnen een oorzaak zijn van foute metingen. Boyer (1995) raadt dan ook aan om steeds stabiel te werken met schokabsorberende matten. Bij continue metingen moeten temperatuurschommelingen vermeden worden. Bij hogere temperaturen zal de olie uitzetten, wat tot fouten zal leiden. Een laatste probleem dat moet 15
voorkomen worden, is de verstopping van het microcapillair. Sommige cellen bevatten namelijk kleine vacuolen of hebben een zeer dik cytoplasma. Een verstopping kan men herkennen wanneer er weinig respons is van de meniscus bij het regelen van de druk met de regelstaaf. Een dergelijk probleem kan men oplossen door de druk te verhogen, zodat het biologisch materiaal er wordt uitgeduwd, of door een nieuw microcapillair te bevestigen.
16
2. Materiaal en methoden 2.1. Druksensor 2.1.1. Ontwikkeling van de druksensor
Het doel van deze masterproef is het ontwerpen en de valideren van een druksensor, een toestel waarmee de druk in cellen kan worden gemeten. Aangezien de ontwikkeling van dit toestel een belangrijke fase is in deze masterproef, werd ervoor geopteerd om de bouw en ontwikkeling ervan in de resultatensectie te beschrijven. 2.1.2. Validatie van de druksensor
De drukbom Een drukbom of drukkamer (PMS, Oregon, US), die normaal gebruikt wordt om bladwaterpotentialen op te meten (Figuur 7), werd in deze studie gebruikt om de druksensor te kalibreren en te controleren op lekken.
Figuur 7: Schematische weergave van de werking van de drukbom (Smartse, 2009).
Controle op lekken Eenmaal de druksensor compleet was samengesteld, was het van het uiterst belang dat deze geen lekken vertoonde. De drukken binnen een floëemvat zijn zeer groot. Voor een volwassen eik kan de turgordruk zelfs oplopen tot 2,3 MPa (Hammel, 1968). Een druksensor moet dus in staat zijn om deze drukken te weerstaan. Dergelijke omstandigheden kunnen worden nagebootst in een drukbom. Een ongescherpt capillair werd bevestigd in de opening voor de bladsteel, zodanig dat het uiteinde binnen de drukkamer zat. De druk binnen de kamer was regelbaar en kon worden afgelezen op de aanwezige barometer (Figuur 8).
17
Om te beginnen werd een streepje aangebracht op het capillair om het huidige niveau van de olie aan te geven. Wanneer de druk binnen de kamer langzaam werd opgevoerd, werd de olie in het capillair teruggeduwd. De samendrukbaarheid van olie is praktisch nul. Wanneer het peil van de olie stijgt, is dit dus te wijten aan lekken of aan resterende lucht in het systeem. De controle gebeurde tot 15 bar (1,5 MPa), waarna de druk binnen de kamer werd afgelaten. Achteraf werd gekeken of de olie naar zijn oorspronkelijke niveau terugkeerde. Indien er lekken aanwezig waren, zag men dat de olie langzaam maar zeker werd teruggeduwd, zelfs wanneer de druk niet verder toenam. In dit geval ging een deel van de olie verloren en keerde het oliepeil niet naar zijn originele niveau terug. Het grootste risico op lekkage werd geconstateerd bij de verbindingsstukken tussen het plexiglazen blok en de basisonderdelen. Voornamelijk aan de aanhechting van de druktransducer en de regelstaaf bleek het moeilijk om lekkage te voorkomen. Om dit op te lossen werden rubberen afdichtingsringen geplaatst en werd de druksensor vastgelijmd op het blok plexiglas (type 648, Loctite, België). Na deze handelingen was het wel mogelijk om zonder olieverlies de druk binnen de druksensor op te bouwen tot 15 bar.
Figuur 8: Foto van de proefopzet voor het valideren en kalibreren van de druksensor. De druk binnen de kamer kan stelselmatig worden opgevoerd met gas uit de gasfles en kan worden afgelezen op de barometer.
Verwijdering van luchtbellen Naast het voorkomen van lekken moest ook de aanwezigheid van luchtbellen worden vermeden. Om de aanwezige lucht tot een minimum te beperken werden volgende handelingen stelselmatig uitgevoerd vooraleer er met de druksensor gewerkt werd.
18
1. Er werd eerst gebruik gemaakt van een ongebrand en open microcapillair. Hierbij was de weerstand een stuk lager en kon het toestel gemakkelijk worden doorgespoeld zonder al te lang te hoeven wachten op een herstelling van de atmosfeerdruk. 2. Het microcapillair werd bevestigd op de micromanipulator en het uiteinde werd ondergedompeld in een beker met olie (type 8020, Loctite, België). Hierdoor zou in het geval van onderdruk geen lucht in het toestel worden gezogen. 3. De meetspuit werd gevuld en aangesloten op de BD microlance 3 en de T-klep (Shut-offvalve, Metrohm, België) werd opengezet. 4. De druksensor kon best zo worden gepositioneerd dat de micrometer naar beneden wees., Bij aanwezigheid van luchtbellen kon dan de druksensor worden gekanteld om de luchtbellen gemakkelijk langs het capillair naar boven te sturen. 5. Er werd getracht zo veel mogelijk luchtbellen te verwijderen, door het afwisselend uitblazen en opzuigen van olie met de meetspuit. Hierbij werd voornamelijk aandacht besteed aan de opening van de druksensor. Hierin kan zich het meeste lucht bevinden en is deze lucht het moeilijkst te verwijderen. Ook aan de T-klep bestond het risico op luchtbellen, omdat hier gewerkt werd met een klep, waarlangs lucht kan binnenkomen. 6. Tijdens deze procedure werd van de mogelijkheid gebruik gemaakt om de regelstaaf voldoende achteruit te draaien. Bij het gebruik van de druksensor werd voornamelijk de meniscus teruggeduwd door de druk binnen de kamer op te drijven. 7. Wanneer er zich geen luchtbellen meer verplaatsten, zowel binnen de drukkamer als binnen de meetspuit, werd het brede microcapillair uit de olie gehaald, losgedraaid en vervangen door een gescherpt microcapillair zonder de T-klep te sluiten. 8. Het microcapillair moest nu niet meer in de olie worden geplaatst, maar kon beter omhoog gezet worden om eventuele luchtbellen nog te vermijden. 9. Het gescherpt microcapillair werd opnieuw gevuld met olie m.b.v. de meetspuit. Hierna werd de T-klep gesloten en kon worden gemeten. Indien het capillair aan de punt nog niet volledig geopend was, kon er voorzichtig tegen getikt worden om de opening te vergroten.
Kalibratie van de druksensor Naast de controle op lekken en luchtbellen, moest voor het gebruik van de druksensor ook een kalibratierechte worden opgesteld. Deze werd gevonden op dezelfde wijze als in voorgaande opstelling. Opnieuw werd de druk binnen de drukkamer van de drukbom stelselmatig opgevoerd tot 1,5 MPa. Om de halve bar werd de meniscus in het capillair met de regelstaaf terug naar de oorspronkelijke positie gebracht, waarna het signaal van de voltmeter werd opgeschreven (Figuur 8).
19
2.2. Turgordruk bij kerstomaten 2.2.1. Experimentele opzet
De doelstelling van dit experiment was het opvolgen van de turgordruk in kerstomaten in functie van vruchtleeftijd en bij verschillende EC-waarden van de voedingsoplossing. Het vruchtdrukexperiment maakte deel uit van een groter onderzoek naar de invloed van EC-waarden op kwaliteit van tomatenvruchten. De proefopzet werd uitgevoerd in een ruime groeikamer (serre 208, ILVO, Merelbeke) met een regelbaar klimaat. De dagtemperatuur bedroeg 21°C, de nachttemperatuur 17°C. Er werd bijkomende assimilatiebelichting (80 µmol.m-2.s-1) voorzien van 8 uur ’s morgens tot 9 uur ’s avonds. Op die manier werd zelfs op de donkere dagen voldoende PAR (fotosynthetisch actieve straling) gegenereerd. Vijf verschillende EC-behandelingen werden opgelegd aan 45 kerstomaatplanten (Solanum lycopersicum cerasiforme). Elke behandeling kreeg negen planten toegewezen, die telkens per drie in een rotswolmat werden geplaatst. De planten werden met een automatisch irrigatiesysteem voorzien van een voedingsoplossing met verschillende EC-waarden, afhankelijk van de behandeling: (A) EC=2 mS/cm; (B) EC= 2,5 mS/cm (controlegroep); (C) EC = 3 mS/cm; (D) EC = 4 mS/cm en (E) EC = 5 mS/cm. Om 6:00 uur, 8:00 uur, 10:00 uur, 12:00 uur, 14:00 uur en 16:00 uur werd elke plant per behandeling met de juiste voedingsoplossing geïrrigeerd gedurende 2 minuten. Afhankelijk van het weer kon de duur van de irrigatie oplopen tot 5 minuten. Zo werd er op zonnige dagen meer geïrrigeerd dan op bewolkte dagen. De rotswol werd opgesteld in vijf rijen van telkens drie matten met drie planten. Om mogelijke effecten veroorzaakt door de plaats te beperken, werden de planten geschrankt opgesteld tussen de verschillende rijen, zoals getoond in Figuur 9. De uiterste planten van elke rij werden nooit in rekening genomen, omdat deze gemiddeld gezien meer zonlicht ontvingen.
20
Figuur 9: Schematisch overzicht van de proefopzet bij het vruchtdrukexperiment. Vijfenveertig planten kregen elk een van vijf verschillende behandelingen: (A) EC=2 mS/cm; (B) EC= 2,5 mS/cm (controlegroep); (C) EC = 3 mS/cm; (D) EC = 4 mS/cm en (E) EC = 5 mS/cm. De buitenste planten werden nooit in rekening genomen. De tussenliggende planten werden genummerd van één tot en met zeven. Bij A4, B6, C4, D2 en E5 (vet) werd telkens op tros twee een LVDT geplaatst om de groei te kunnen opvolgen. Hiervoor werden voornamelijk vruchten gekozen in het midden van de tros.
In totaal hoorden er dus bij elke behandeling zeven planten, waarvan voor elke plant de ontwikkeling van trossen en vruchten werd opgevolgd. Voor de nummering van de trossen werd steeds van onder naar boven geteld en voor de vruchten werd geteld van oud naar jong (Figuur 9). De bevruchting bij tomaten gebeurde door zelfbestuiving, een korte tik tegen de bloem was dus voldoende om de bevruchting tot stand te laten komen. De datum van de vruchtzetting werd eveneens nauwkeurig bijgehouden, zodat achteraf de leeftijd van de verschillende vruchten kon worden bepaald, ook wel de DAA (Days After Anthesis) genoemd. Voor de vruchtzetting zat er gemiddeld één dag tussen twee opeenvolgende vruchten. Leeftijden van vruchten waarvan de vruchtzetting niet werd genoteerd, konden aan de hand van deze veronderstelling toch worden aangevuld. In totaal werd er voor het opmeten van de vruchtdruk acht keer geoogst in de periode tussen 7 januari en 10 maart 2014, telkens ’s morgens tussen 9 en 11 uur. De geoogste trossen werden verpakt in een gesloten, gelabelde plastic zak om transpiratie te beperken.
21
Figuur 10: Schematische weergave van een kerstomaatplant met haar verschillende trossen. De nummering van de trossen gebeurde van onder naar boven. De nummering van de vruchten gebeurde van begin tot einde.
2.2.2. Opmeten van de turgor
Er werd getracht om de turgor binnen de 24 uur na het oogsten te meten, om zo de toestand van de vrucht zo weinig mogelijk te beïnvloeden. Van elke tros werden gemiddeld drie tot vier vruchten geselecteerd, gaande van kleine tot grote tomaten. De vrucht werd ontdaan van haar kroon en voorafgaand aan elke drukmeting werden volgende parameters genoteerd: de datum van de vruchtzetting en het oogsten, de meetpersoon, de kleur (groen, oranje en rood), het gewicht en de vruchtdiameters (n=3). Vervolgens werd de turgordruk opgemeten. Hiervoor werd de kerstomaat op een verstelbaar statief gefixeerd met kneedrubber (Figuur 11). Om de turgordruk niet te beïnvloeden was het belangrijk om tijdens het fixeren geen druk uit te oefenen op de vrucht. De met olie gevulde druksensor met gescherpt glazen capillair werd bevestigd op een HS-6 manuell (00-42-301-0000, Marzhauser Wetzlaz, Duitsland), een micromanipulator die werd gebruikt om apparaten zoals de druksensor of de zapper (2.3.3.) delicaat en met grote precisie te hanteren. De micromanipulator blijkt hiervoor uiterst geschikt door de drie micrometers die de druksensor op drie assen laat verschuiven. De micromanipulator met druksensor werd zodanig in stelling gebracht dat de punt van het gescherpt microcapillair enkele millimeters van het oppervlak van de kerstomaat verwijderd was. De druksensor was volledig gevuld met olie en stond onder lichte overdruk vooraleer het capillair door de celwand brak. Eenmaal het capillair in de celwand prikte, duwde het celsap, onder invloed van de turgordruk binnen de tomaat, de olie terug in het capillair. Om de meniscus te kunnen waarnemen moest steeds onder een microscoop gewerkt worden. In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van de Stemi SV 11 (Zeiss, Duitsland). Voor een goede waarneming werd meestal gewerkt op een vergroting tussen x64 en x105,6. De microscoop was tevens uitgerust met een specifiek tussenstuk voor een Nikon Coolpix 8400, waarmee het mogelijk was om foto’s te nemen op dergelijke vergrotingen. Extra belichting werd voorzien door de KL 1500 electronic (Schott, België), 22
een externe lichtbron die kon worden bijgeplaatst en gemanipuleerd rond de vrucht. Door te spelen met de intensiteit en de hoek van het licht werd steeds gezocht naar de duidelijkste observatie van de meniscus. Om vervolgens de exacte turgordruk te meten, werd het celsap met de regelstaaf terug geduwd tot aan het oppervlak van de tomaat. Het signaal, opgemeten in volt (mV), gaf de turgordruk binnen de tomaat weer. De turgor werd op deze manier in totaal drie keer bepaald, door de meniscus drie maal terug te duwen met de regelstaaf. Hierdoor kon achteraf een gemiddelde turgor worden bepaald voor de vrucht. De onderzochte vruchten werden verpakt in zilverpapier, gelabeld en samen met de rest van de vruchten in de oorspronkelijke plastic zak ingevroren. Door de tomaten te stockeren onder het vriespunt gingen de celwanden barsten. Hierdoor werd het achteraf mogelijk om de osmotische potentiaal te bepalen met de thermokoppel psychrometer (2.2.3.).
)
Figuur 11: Schematische weergave van de proefopstelling voor het meten van de turgordruk bij tomatenvruchten met de druksensor.
2.2.3. De osmotische vruchtwaterpotentiaal bepaald met de thermokoppel psychrometer
De thermokoppel psychrometer is in staat om de waterpotentiaal te meten van verschillende plantendelen. Hiervoor moet het staal binnen een afgesloten kamer onder constante temperatuur worden geplaatst, zodat een evenwicht kan ontstaan tussen het water in het staal en de atmosfeer in de kamer. De kamers zijn voorzien van een thermokoppel die toelaat om de relatieve vochtigheid binnen de kamer te berekenen. De waterpotentiaal (Ψ) kan dan worden gerelateerd aan de relatieve vochtigheid (e/e°) van de atmosfeer met de vergelijking van Spanner:
23
Figuur 12 toont de thermokoppel psychrometer (Wescor, US) die in dit onderzoek werd gebruikt. Er werd gewerkt met vier kamertjes. De kalibratie werd uitgevoerd met filtreerpapiertjes, ondergedompeld in volgende NaCl-oplossingen: 0,05 M; 1,00 M; 2,00 M; 3,00 M en 5,00 M. Vervolgens werd de osmotische potentiaal van bevroren tomatenvruchten opgemeten. Het bevriezen zorgde voor de vernietiging van de celwanden en celmembranen, waardoor het cytoplasma vrij kon evaporeren. Om de osmotische potentiaal te meten werd voor elke kamer met een scalpel een stuk weefsel afgesneden van de gekozen ingevroren vruchten. De kamertjes kregen één uur om tot evenwicht te komen, zowel bij de kalibratie als bij de meting. Gedurende twaalf seconden werd een stroom doorheen het thermokoppel gestuurd. Vervolgens werd het voltsignaal opgemeten en kon de bijhorende osmotische potentiaal berekend worden uit de wetbulb depression. Voor elke kamer afzonderlijk werd een kalibratierechte opgesteld. Aangezien de thermokoppel psychrometer sterk afhankelijk is van de temperatuur, moest deze wel steeds opnieuw worden gekalibreerd vanaf een temperatuurverschil van 2°C. Door te werken met vier kamers werd telkens een gemiddelde osmotische potentiaal bekomen met bijhorende standaarddeviatie.
Figuur 12: Foto van de thermokoppel psychrometer in het laboratorium aan de UGent. Het toestel is samengesteld uit een aantal thermokoppel kamers binnen een geïsoleerde doos van isomo (A); een ‘psychrometer switchbox’ die de spanning over de verschillende kamertjes (B) verdeelt; een ‘dewpoint microvoltmeter’ waarmee de spanning wordt opgewekt over de thermokoppel (C); en een ‘xt recorder’ waarmee het signaal wordt afgeschreven (D).
2.2.4. De lineair variabele differentiaaltransformator (LVDT)
Het was belangrijk om de groei van een vrucht te kunnen opvolgen, aangezien deze sterk gecorreleerd is met de leeftijd. Hiervoor werd gewerkt met een dendrometer (lineair variabele differentiaaltransformator, LVDT, solartron, UK), een toestel waarmee de variatie in diameter kan worden gevolgd in functie van de tijd. De LVDT werd in totaal bij vijf vruchten geplaatst waarbij 24
steeds werd gekozen voor het vijfde of zesde vruchtje van de tweede tros bij vijf verschillende planten (A5, B6, C4, D2 en E5), zoals te zien is in Figuur 9. De dendrometer wordt op een vrucht geplaatst en mat aan de hand van een veer die werd ingedrukt de groei van de plant of vrucht. De dendrometer moest goed worden vastgemaakt, maar mocht hierbij de groei niet belemmeren (Figuur 13).
Figuur 13: Voorbeeld van de bevestiging en werking van een dendrometer bij een tomatenvrucht.
2.2.5. Bereiding van de voedingsoplossing en bepaling van de EC-waarden
Nutriënten en water zijn de belangrijkste benodigdheden voor de groei van een plant. Indien de bodem arm is aan nutriënten, zoals in het rotswolsubstraat bij deze kerstomaten, dan moeten deze nutriënten op een alternatieve wijze toegediend worden, bijvoorbeeld door middel van een voedingsoplossing. Voor het tomatenexperiment werd gebruik gemaakt van twee stock-oplossingen (A en B), die samen in het juiste volume een EC-waarde gaven van 2,5 mS/cm. Deze standaardvoedingsoplossing werd in grote hoeveelheden aangemaakt en als basis aan iedere behandeling opgelegd. De hogere EC-waarden (3 mS/cm, 4 mS/cm en 5 mS/cm) werden bekomen door de zouten NaCl en CaCl2 toe te voegen aan de standaardvoedingsoplossing. Met een EC-meter (type: HI 9033, Hannah Instruments, USA) werd telkens de verhoging gemeten. De EC-waarde van 2 werd dan weer bekomen door de basisoplossing te verdunnen met regenwater. In Tabellen 1 en 2 wordt een overzicht gegeven van de benodigde macro- en micronutriënten in de oplossingen A en B. Beide oplossingen werden toegevoegd in een verhouding van 50 mL / 10 L voor de basisvoedingsoplossing. Slecht enkele snuifjes van de micronutriënten waren voldoende voor een oplossing van tientallen liters.
25
Tabel 1: Samenstelling van de twee stockoplossingen A en B, voor het bereiden van de voedingsoplossing.
Macronutriënten A-oplossing calciumnitraat ammoniumnitraat kaliumnitraat ijzerchelaat B-oplossing kaliumdiwaterstoffosfaat magnesiumsulfaat kaliumsulfaat
Concentratie (g/L)
Ca(NO3)2.4H2O NH4NO3 KNO3 Fe (EDTA 6%) KH2PO4 MgSO4.7H2O K2SO4
140.0 9.5 40.5 4.3 20.5 71.5 26.0
Tabel 2: Hoeveelheid aan micronutriënten die moet worden toegevoegd aan de voedingsoplossing.
Micronutriënten MnSO4.1H2O ZnSO4.7H2O Na2B4O7.10H2O CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O
Concentratie (mg/L) 1.7 1.45 2.85 0.19 0.12
2.2.6. Statistische analyse
Voor de analyse van de gemeten turgordruk werd gewerkt met generalized additive models (GAM), in het statistisch programma R. Een ‘GAM’-model, is een generalized linear model, waarin de verschillende variabele termen worden vervangen door functies van die variabelen, zoals in onderstaande vergelijkingen (Wood, n.d.): Generalized linear model: Generalized additive model:
(
)
De functies (vb. f1(X1)) noemen we ‘smooth splines’ en deze vertegenwoordigen elk een stuk van de best passende curve die de data kunnen beschrijven (Wood, 2003). De druk werd beschouwd als afhankelijke variabele en de behandeling en de leeftijd als onafhankelijke variabele. In totaal werden voor alle data vier GAM-modellen opgesteld, gaande van gecompliceerde tot simpele modellen. 1. Het eerste model was het meest complexe model. Er werd gewerkt met smooth splines, waardoor R naar de best passende curves zoekt voor de data. De behandeling werd hierin als effect opgenomen, waardoor het verloop van de curves voor elke behandeling onderling kon verschillen (Figuur 20).
26
2. In het tweede model werd nog steeds een effect van behandeling opgenomen, maar werd een vaste curve opgesteld op basis van alle data. Het verloop van deze curve blijft hetzelfde voor alle behandelingen, alleen de intercept kan verschillen (Figuur 21). 3. In het derde model werd nog steeds geopteerd voor een vaste curve voor alle data, maar werd het effect van de behandeling niet opgenomen. Er wordt dus van uitgegaan dat de curve zowel in het verloop als in de intercept gelijk is voor alle behandelingen (Figuur 22). 4. In het vierde model werd een rechte geschat in plaats van een curve. Het effect van behandeling wordt opnieuw opgenomen en de rechte kan dus anders liggen in richting of hoogte per behandeling (Figuur 23). Om te weten welk model de werkelijkheid het meest benadert, werd gebruik gemaakt van de Likelihood Ratio Test. Deze test vergelijkt twee modellen en hun geschatte curves met behulp van een ANOVA-test. Steeds werd een ingewikkeld model (‘null model’) vergeleken met een simpel model (‘alternative model’). Door te kijken naar de afwijking van de residuelen en naar de significantie van deze afwijking kan worden besloten welke modellen de data het beste beschrijven.
2.3. Floëemtransport bij tarwe Voor het opmeten van de floëemdruk werd opnieuw gewerkt met dezelfde microscoop, dezelfde lichtbron en dezelfde micromanipulator. Deze toestellen zullen hier dus niet meer worden aangehaald. 2.3.1. Kweken van de tarweplanten
Voor dit experiment werd gebruik gemaakt van tarwe (Triticum aestivum), zowel in pot als in aquacultuur. Beiden werden gekweekt in een groeikamer waarin het klimaat werd gecontroleerd. De temperatuur binnen bedroeg 25°C overdag en 17°C ’s nachts. Van 6 uur ‘s morgens tot 10 uur ’s avonds werd assimilatieverlichting voorzien om voldoende ‘photosynthetic active radiation’ (PAR) te genereren (120 µmol.m-2.s-1). De tarwe in pot kreeg extra stikstofbemesting en werd in de kweekkooien met de bladluizen geplaatst, zodat de bladluispopulatie kon overleven. De planten werden 3 maal per week bewaterd. De tarwe in aquacultuur dreef met behulp van piepschuim in grote bakken van ± 60 liter. Het piepschuim deed in dit geval dienst als vlot om het wortelstelsel onder water te houden. Er waren twee stockoplossing nodig, A en B, voor het bereiden van de voedingsoplossing. In dit experiment werd geopteerd voor een zelfde samenstelling als in het tomatenexperiment. De EC-waarde bedroeg ongeveer 2,5 mS/cm. Het piepschuim werd geperforeerd om er verschillende planten tegelijk in te kunnen fixeren. De zaden werden geplaatst in een medium van rotswol, dat vooraf werd geweekt in de voedingsoplossing. De stukken rotswol werden zodanig in het piepschuim geplaatst dat de zaden gemakkelijk met de nerf mee konden groeien. In totaal werden er ± 75 tarweplanten gezaaid in drie bakken met aquacultuur. Elke bak 27
werd gevuld met 30 liter voedingsoplossing. Naast het gehalte aan water en nutriënten moest ook het zuurstofgehalte hoog genoeg blijven. Hiervoor werd in iedere bak een luchtpomp geplaatst. Na elke week werd de voedingsoplossing ververst, waarbij de bakken opnieuw werden gevuld tot 30 liter. Tijdens het verversen moesten de onderzoekers steeds opletten dat de planten niet beschadigd werden. Tarwe is verder zeer vatbaar voor allerlei ziekten en plagen. Meeldauw is onder andere een veel voorkomende schimmel. Deze werd in dit onderzoek voorkomen door te werken met zwavelverdampers. Het gebruik van insecticiden werd in deze proef vermeden, aangezien deze lang in het systeem van de plant kunnen blijven zitten en er later voor de bepaling van floëemdruk met bladluizen moest gewerkt worden. Voor de finale drukmeting moesten de tarweplanten eerst afzonderlijk in een aquacultuur worden geplaatst. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een beker voorzien van een plastic zak om lekken te voorkomen. Het reservoir werd gevuld met dezelfde voedingsoplossing, waarbij werd gestreefd naar een EC-waarde van 2,5 mS/cm. De rotswol werd deze keer in een kleiner stuk piepschuim geplaatst. Het reservoir, voorzien van het piepschuim, werd met de plant langs een statief geplaatst ter ondersteuning van de stengels. Tot slot werd in het reservoir ook nog een zuurstofpomp voorzien. 2.3.2. Het kweken van de bladluizen
In België leven drie soorten bladluizen die regelmatig op tarwe voorkomen: de grote graanluis (Sitobion avenae), die aanvankelijk op de bladeren zit, maar zich kan verplaatsen naar de aren; de roos-grasluis (Metopolophium padi) die bijna uitsluitend voorkomt op de bladeren; en de vogelkersluis (Rhopalopsiphum padi) die een voorkeur kent voor de stengel. Voor dit onderzoek werd zowel gebruik gemaakt van de graanluis als van de vogelkersluis. De graanluis werd besteld bij Biobest (België), terwijl de vogelkersluis op natuurlijke wijze de gekweekte tarwe wist te besmetten. De besmette planten werden onmiddellijk in quarantaine gezet om uitbraken te voorkomen. Om onderlinge besmetting te vermijden werden de bladluizen gekweekt in een afzonderlijke groeikamer, met gelijkaardige condities als die waarin de gezonde tarwe werd gekweekt. Als extra voorzichtigheid werd gebruik gemaakt van zogenaamde kweekkooien (Vermandel, België). Kweekkooien zijn constructies (35x35x60) voorzien van een dicht gaas, waarbinnen besmette planten konden worden samen gezet met gezonde planten zonder de bladluizen te laten ontsnappen. Op deze wijze konden de bladluizen veilig gekweekt worden binnen de kooien, hoewel voorzichtigheid aangewezen was. Voornamelijk tarwe in pot werd gebruikt voor het kweken van de bladluizen, waarbij de bewatering binnen de kooien gebeurde op dezelfde tijdstippen als bij de gezonde tarwe. Voor de bladluizen op de individuele tarweplanten in aquacultuur werd gewerkt met minikweekkooitjes. Deze waren vervaardigd uit een haarspeld en ijzergaas. De bladluizen konden 28
hiermee op specifieke stengelsegmenten worden geplaatst. Hierbij was het belangrijk dat de kooi goed werd afgesloten om mogelijke uitbraken te voorkomen. Indien de kooi te zwaar was voor de stengel, kon deze ook worden opgehangen aan het statief. 2.3.3. Zapper
De zapper (Thorpe, Australië) werd gebruikt om de steeksnuit van voedende bladluizen via een gescherpte naald door te branden met korte radiogolven. Nadat de zapper bevestigd werd op een micromanipulator, werd het mogelijk om zeer gericht en lokaal te branden. De duur en de intensiteit van de stoot kon worden ingesteld door de operator. Bij dit toestel is de scherpte van de naald van groot belang. Hoe fijner de naald, hoe preciezer men kan branden. De naalden konden worden aangescherpt door ze alternerend onder te dompelen in een zoutoplossing met een spanningsdraad. De hoofdunit werd aangedreven op 13,5 volt (gelijkspanning). Met het bijgeleverde voetpedaal kon de stroom worden opgewekt. Voor het gebruik van de zapper in stylectomie moest de juiste duur en intensiteit worden ingesteld, wat een een proces van ‘trial and error’ was.
29
30
3. Resultaten 3.1. Ontwikkeling van de druksensor 3.1.1. Bouw van de druksensor
De druksensor is een toestel om onder andere de druk in cellen te kunnen meten. Voor het model van de druksensor werd gekeken naar het voorbeeld van Boyer (1995) en Hüsken (1978). De basis bestaat uit een blok plexiglas vastgemaakt op een polyesteren plank. De belangrijkste onderdelen zijn een microcapillair (intramark, Novolab, België), een druktransducer (Midas B401001, Jumo, Duitsland) en een micrometer (Spindle lock micrometer 0-25 mm, RS Components, België) met metalen regelstaaf. In het blok plexiglas werden verschillende openingen geboord met diameter 1,7 mm (Figuur 14). Dit blok vormde de drukkamer van de druksensor. Micrometer, druktransducer, meetcapillair en navulspuit werden gemonteerd op één van deze gangen, waardoor ze onderling in verbinding stonden en een continuüm vormden. Hoe kleiner de diameter van de gangen, hoe gevoeliger de druksensor is en hoe kleiner de te meten drukken worden. Het hele systeem werd opgevuld met olie (type 8020, Loctite, België). Sluitstukken die tegen hoge drukken bestand zijn, moesten lekken voorkomen (Peek fittings & tubes, Thermo Fisher, België), wat cruciaal is voor de werking van de druksensor. Tussen de navulspuit en de drukkamer werd een T-klep (Shut-off-valve, type T-02014-00, Metrohm, België) geïnstalleerd. Deze werd geopend om de druksensor bij te vullen of om lucht te verwijderen en werd gesloten wanneer er gemeten moest worden. De druktransducer werd aangedreven door een stroombron van 12 VDC en bevatte een zeer gevoelig membraan. Dit membraan zal de uitgeoefende druk omzetten in een elektrisch signaal, waarna het via een ampèremeter (Agilent, België) kan worden afgelezen in millivolt.
Figuur 14: Schematische weergave van de gangen binnen in het plexiglazen blok, die samen de drukkamer van de druksensor vormen. Op positie A werd de druktransducer gemonteerd, op positie B werd een Peek-tubing aangesloten naar het meet-microcapillair, via C werd de meetspuit gemonteerd voor het opvullen van de druksensor met olie en langs D werd de regelstaaf geplaatst om de druk te regelen via de micrometer. Alle diameters van de ingangen en openingen zijn hier weergegeven.
31
Figuren 15, 16 en 17 zijn technische tekeningen van het boven-, zij- en vooraanzicht van de volledig gemonteerde druksensor. Hierbij zijn de belangrijkste onderdelen aangeduid met hun dimensies.
Figuur 15: Technische tekening (bovenaanzicht) van de druksensor, met aanduiding van de belangrijkste afmetingen en onderdelen.
Figuur 16: Technische tekening (zijaanzicht) van de druksensor, met aanduiding van de belangrijkste afmetingen en onderdelen.
32
Figuur 17: Technische tekening (zijaanzicht) van de druksensor, met aanduiding van de belangrijkste afmetingen en onderdelen.
3.1.2. Valideren en kalibreren van de druksensor
Door het vastlijmen van de druktransducer was het uiteindelijk gelukt om de druksensor te vrijwaren van lekken. Met het opgegeven protocol voor het vermijden en verwijderen van luchtbellen (‘Materiaal en methoden’) kon de resterende lucht zo veel mogelijk worden verwijderd. De druksensor was nu klaar om te worden gekalibreerd. Resultaten van deze kalibratie worden weergegeven in Figuur 18, die het verband toont tussen de druk opgelegd via de drukbom en de spanning afgelezen van de druksensor.
Figuur 18: Signaal van de druksensor in functie van de druk opgebouwd door de drukbom.
Voor dit verband kon volgende vergelijking worden opgesteld:
33
Het signaal van de druksensor (mV) (Y) kan nu rechtstreeks worden omgezet in een druk (MPa) (X). Deze kalibratievergelijking werd vervolgens steeds toegepast bij alle metingen van de druksensor.
3.2. Turgordruk bij kerstomaten In totaal werd bij 326 vruchten, verdeeld over de vijf behandelingen, de turgordruk gemeten met behulp van de druksensor (Tabel 3). Het onderzoek had als doel de evolutie van de turgordruk tijdens het groeiproces in kaart te brengen, waarbij de belangrijkste variabele de leeftijd in DAA was. Bij de keuze van de vruchten werd dus vooral rekening gehouden met de vruchtleeftijd, om zo ook het leeftijdsverloop in kaart te brengen. Tabel 3: Het aantal vruchten waarvan de turgordruk werd bepaald binnen elke behandeling.
Behandeling A B C D E Totaal
Aantal 58 68 66 71 63 326
3.2.1. Metingen van de turgor
Zoals reeds vermeld, werd de meting van de turgordruk drie keer herhaald per vrucht. Er werden dus telkens drie signalen opgeschreven, waarvan achteraf een gemiddelde werd berekend. Figuur 19 geeft voor elke behandeling de gemiddeld gemeten turgordruk met standaardafwijking in functie van de leeftijd weer. Ook werd voor de metingen van elke behandeling een derdegraads polynoom geschat, om een eerste idee te krijgen van het verloop. Wanneer de data van de turgordruk werden bekeken over de vijf behandelingen, blijkt dat er redelijk wat verschil is tussen de metingen en hun fout. Voornamelijk de metingen op de kleinste vruchten kenden een grotere standaardafwijking. Op behandeling B en (in minder mate) behandeling D na, lijken de data op het eerste zicht een klokvormig patroon te vertonen, zoals te zien is in Figuur 19. Hierbij begon de turgor op een druk ± 0,1 MPa voor ongeveer twee weken, waarna hij in de volgende periode, op een leeftijd van 30-40 DAA, sterk toenam tot 0,3-0,4 MPa. Ongeveer 50 dagen na anthese zakte de turgor opnieuw tot een druk van ± 0,05-0,1 MPa. Dit patroon is in mindere mate aanwezig bij behandeling D, aangezien de jongste vruchten reeds turgordrukken vertoonden van ongeveer 0,3 Mpa. Bij de andere behandelingen lag dit veel lager. Behandeling B week nog verder af en vertoonde op het eerste zicht geen duidelijk patroon. Om hierover uitsluitsel te krijgen, werden statistische analyses uitgevoerd die in de volgende paragraaf worden besproken. 34
Figuur 19: De turgordruk (MPa) in functie van de vruchtleeftijd in DAA voor de vijf verschillende behandelingen: behandeling A: EC = 2 mS/cm; behandeling B: EC = 2.5 mS/cm; behandeling C: EC = 3 mS/cm; behandeling D: EC = 4 mS/cm; en behandeling E: EC = 5 mS/cm. Voor elke behandeling werd tevens een derdegraads polynoom geschat om een eerste indicatie te krijgen over het verloop van de turgor.
3.2.2. Statistische analyses bij de turgormetingen
Het eerste statistische model berekende de best passende curves door de data per behandeling. (Figuur 20). Deze curves geven de afwijking weer ten opzichte van het intercept, die voor alle behandelingen is vastgelegd op 0,148 ± 0,005 MPa. Het verloop daarentegen verschilde in functie van de behandeling. Bij behandeling A startte de turgor rond 0,048 MPa, klom gedurende 30 dagen tot een maximum van ongeveer 0,248 MPa en daalde dan voor de rest van het verloop terug tot 0,05 Mpa, ongeveer 0,1 MPa onder de intercept. De curves van behandeling C en E vertoonden een 35
gelijkaardig verloop als die van behandeling A, met dit verschil dat de turgor bij de jonge vruchtjes in behandeling E reeds startte bij het intercept (0,148 ± 0,005 MPa), lichtjes toenam tot 30 DAA en uiteindelijk daarna sterk daalde tot 1,5 MPa onder de intercept. Eenzelfde trend als A, C en E kwam bij D pas voor vanaf 20 DAA. Voor deze periode lag de turgor in tegenstelling tot de andere behandelingen veel hoger (± 0,3 MPa). Bij behandeling B was een dergelijke trend niet waar te nemen. Bij deze behandeling waren de turgorwaarden van de jonge vruchten ongeveer 1 MPa hoger dan de gemiddelde turgor. Tussen een leeftijd van 20 en 60 DAA bleef de turgor rond de intercept in plaats van naar een piek te groeien. Op een leeftijd van 60 dagen daalde de turgor opnieuw tot 1 MPa onder de intercept.
Figuur 20: De curves van het eerste ‘GAM’-model met de afwijking ten opzichte van de gemiddelde turgordruk (0,148 ± 0,005 MPa) per behandeling, in functie van de vruchtleeftijd in DAA. Het model neemt behandeling op als significant effect voor het verloop van de curve. De stippellijnen geven het 95% betrouwbaarheidsinterval weer voor het verloop.
36
Het tweede model gaat uit van één curve (vorm) voor alle behandelingen en schat deze door alle datapunten (Figuur 21A). Het effect van behandeling kan enkel worden weergegeven door een hogere of lagere intercept (Figuur 21B). De curve vertoonde opnieuw een klokvormig patroon met een maximum (± 0,250 MPa) rond 30 DAA. De turgordruk van de jonge vruchten lag rond de intercept (± 0,150 MPa) en bij de rijpe vruchten ± 0,1 MPa lager dan de intercept. Uit Figuur 21B blijkt het verschil tussen de intercepts eerder klein. Het grootste verschil werd waargenomen tussen behandeling A (0,139 ± 0,009 MPa) en behandeling C (0,162 ± 0,008 MPa).
Figuur 21: A: de best passende curve van model twee met haar residuelen, die werd opgesteld van de turgordruk in functie van de vruchtleeftijd, voor alle behandelingen. B: De verschillen in intercept per behandeling (volle lijn) met hun 95% betrouwbaarheidsinterval (stippellijn). De intercept voor (A) = 0,140 ± 0,008 MPa; (B) = 0,158 ± 0,009 MPa; (C) = 0,162 ± 0,008; (D) = 0,143 ± 0,008 en (E) = 0,150 ± 0,008 MPa. De zwarte balkjes onderaan staan voor de verdeling van de data over de verschillende behandelingen.
Model drie schat ook één curve door alle data, maar hier werd het effect van behandeling weggelaten. De curve die uit dit model werd verkregen, lijkt sprekend op model twee, wat al een eerste indicatie geeft dat deze modellen niet zo veel verschillen. De jonge vruchten startten met een turgordruk rond de intercept op 0,150 ± 0,004 MPa. De turgor nam toe tot ongeveer 30 DAA en nam daarna terug af tot waarden van ± 0,050 MPa in de laatste fase van de vruchtontwikkeling (Figuur 22). 37
Figuur 22: De best passende curve van model drie, zonder het effect van behandeling, met in stippellijn zijn 95% betrouwbaarheidsinterval.
In model vier werd gecontroleerd welke rechte door de data kon worden geschat. Het intercept kon verschillen tussen de verschillende behandelingen, maar lag gemiddeld op 0,24 ± 0,01 MPa. Uit de rechte van Figuur 23 kan dan worden afgeleid dat de jonge vruchten een turgordruk lieten noteren rond de intercept, terwijl de turgorduk van volgroeide vruchten zakte tot ongeveer 0,04 MPa op 60 DAA.
Figuur 23: A: de best passende rechte van model vier met haar residuelen, die werd opgesteld voor de turgordruk in functie van de vruchtleeftijd, voor alle behandelingen. B: de verschillen in intercept (volle lijn) per behandeling met hun 95% betrouwbaarheidsinterval (stippellijn). De zwarte balkjes onderaan staan voor de verdeling van de data over de verschillende behandelingen.
38
Om te weten welk model de werkelijkheid het best benadert, werd gebruik gemaakt van de Likelihood Ratio Test. Deze test vergelijkt twee modellen en hun geschatte curves met behulp van een ANOVA-test. Steeds werd een ingewikkeld model (‘null model’) vergeleken met een simpel model (‘alternative model’). Door te kijken naar de afwijking van de residuelen en de significantie van deze afwijking kon worden besloten welk model de data het beste beschrijft. Wanneer model één werd vergeleken met model twee in een Liklihood Ratio Test, bleek dat model één de data beter verklaart dan model twee. De afwijking van model twee (R. Dev. = 1,7182) was groter dan de afwijking van model één (R. Dev. = 1,5298) en dit verschil was significant (p < .05). Volgens de statistische analyse moest worden geopteerd voor model één en zijn er wel degelijk verschillen in curves tussen de verschillende behandelingen. Maar zoals kan worden waargenomen in Figuur 20, wijkt de curve van behandeling B, en in mindere mate D, extreem af van de andere curves. Het zijn deze curves die in alle waarschijnlijkheid de significantie van de test afdwingen. Wanneer in een zelfde analyse de metingen van behandeling B en D worden weggelaten, bleek model één de resultaten niet significant beter te beschrijven dan model twee (p = 0.1526). Aangezien de metingen van behandeling B en D kwalitatieve data blijven, werd toch geopteerd om ze in het model te houden en verder te werken met model twee om de turgordruk te voorspellen aan de hand van de leeftijd. Model twee werd vervolgens opnieuw vergeleken met model drie. Model drie schatte een curve door de data zonder rekening te houden met behandeling. De curve vertegenwoordigde dus de volledige dataset. De ANOVA die werd gebruikt om beide modellen te vergelijken, toonde aan dat model twee (R. Dev. = 1,7182) wel een betere representatie van de werkelijkheid gaf dan model drie (R. Dev. = 1,7559), maar dat dit verschil niet significant was (p > .05). De data konden dus even goed beschreven worden met model drie, waarin het effect van behandeling werd weggelaten. Hieruit kon besloten worden dat de verschillende EC-behandelingen geen effect hadden op de waargenomen turgordruk. Wanneer tot slot model vier werd vergeleken met model twee, kon worden onderzocht of het verloop van de curve in model twee eigenlijk correct is, of dat een rechte ook gewoon gebruikt mag worden om de data te verklaren. De ANOVA van model twee en model vier gaf een grotere afwijking voor model vier (R. Dev. = 2,1702) dan voor model twee en dit verschil was significant (p < .05). De curve van model twee is dus een betere benadering van de data dan de rechte opgesteld door model vier. De conclusie is dat de curves wel degelijk mogen gehanteerd worden voor de beschrijving van het verloop van de turgor.
39
3.2.3. Metingen van de osmotische potentiaal
Naast de turgordruk werd ook per behandeling de osmotische potentiaal van enkele vruchten met de thermokoppel psychrometer bepaald. Voor vier van de vijf behandelingen werd gekozen voor vier of vijf willekeurige vruchten, gelijk verspreid over de data. Omdat behandeling C een mooi patroon vertoonde bij de turgormetingen, werden hierbij 16 vruchten gemeten om een gedetailleerder overzicht te krijgen van de osmotische potentiaal binnen deze behandeling. Figuur 24 toont alle metingen van de osmotische potentiaal voor alle behandelingen samen op één grafiek. De trend die kan worden waargenomen is een daling van de osmotische potentiaal op 40 DAA: van ± -0,7 MPa naar ± -1,2 MPa.
Figuur 24: De osmotische potentiaal in functie van de vruchtleeftijd voor de vijf behandelingen. Van alle behandelingen werd behandeling C het meest intensief bemonsterd.
Nu de turgor en de osmotische potentiaal geweten zijn, werd een curve door beide datareeksen geschat. De totale waterpotentiaal kon worden berekend door beide potentialen op te tellen. Figuur 25 geeft het verloop weer van de drie potentialen voor behandeling C. Uit deze grafiek is duidelijk op te maken dat de totale waterpotentiaal eerst toeneemt in de eerste dagen van het groeiproces, een maximum (-0,3 MPa) bereikt ± 25 dagen na anthese en daarna een sterke daling kent die pas 60 dagen na anthese zal stabiliseren rond -1,2 MPa.
40
Potentiaal (MPa)
Vruchtleeftijd (DAA) Figuur 25: Het verloop van de turgordruk (····), de osmotische potentiaal (— —) en de totale waterpotentiaal (—) in functie van de vruchtleeftijd (DAA), voor behandeling C.
3.2.4. Vruchtgroei
De resultaten van de vruchtdendrometer worden weergegeven in Figuur 26. Voor elke behandeling afzonderlijk werd één vrucht opgevolgd doorheen het volledige groeiproces. Uit Figuur 26 is te zien dat de diameter voornamelijk toenam in de periode tussen 20 en 40 DAA, waarna het groeiproces vertraagde en de diameter niet meer toenam. Het was ook rond deze tijd dat de metingen verstoringen begonnen te vertonen en afweken van hun oorspronkelijke trend. De finale diameters bereikten min of meer dezelfde waarden (± 20 mm), enkel bij behandeling E werd een kleinere finale diameter geregistreerd (± 17 mm).
41
Figuur 26: Resultaten van de groei van de kerstomatenvruchten in functie van de leeftijd (DAA), voor de verschillende behandelingen en gemeten met de vruchtdendrometer. De metingen van de diameter werden minder accuraat naarmate de vruchten rijper werden, doordat de dendrometer de vruchten indrukte.
3.3. Floëemtransport bij tarwe 3.3.1. De proefopzet
Deze sectie zal voornamelijk dienst doen als leidraad voor de gebruikte opstelling en uitvoering van de stylectomie-techniek. Figuur 27 geeft een eerste schematische weergave van de gebruikte proefopstelling. De microscoop werd bevestigd op een mobiele, roterende paal die op zijn beurt werd gemonteerd op een massief arduinen blad. Het arduinen blad rustte op enkele rubberen matten om trillingen en schokken te beperken. De tarweplant werd vastgemaakt op een lange ijzeren regelstaaf, die met twee klemmen werd opgehangen tussen twee statieven. Door de klemmen kon de regelstaaf, en dus ook de plant, optimaal worden gepositioneerd en vastgezet onder de microscoop. Verder was er op het arduinen blad voldoende plaats voor de micromanipulator en de externe belichting. 42
Figuur 27: Proefopstelling voor de stylectomie op tarwe. De plant werd bevestigd op een roterende regelstaaf, zodanig dat de wortels nog steeds in de voedingsoplossing konden rusten. De microscoop was manipuleerbaar in alle richtingen boven de plant. Door een speciaal tussenstuk op de microscoop te plaatsen was het mogelijk om foto’s te nemen door de lens.
De tarweplant werd op de regelstaaf vastgemaakt met behulp van tape en piepschuim. Belangrijk was hierbij dat de plant niet werd beschadigd en de bladluizen niet verstoord werden tijdens het voeden. Het reservoir met de voedingsoplossing werd onder de regelstaaf geplaatst, zodanig dat het wortelstelsel voor het grootste deel in de voedingsoplossing lag. Door toevoeging van polyethyleenglycol (PEG) konden de effecten van een osmotische schok worden nagegaan. De externe lichtbron werd zo gepositioneerd dat het stengeloppervlak kon worden bijbelicht. Voor het branden van de styletten werd gebruik gemaakt van een zapper, gemonteerd op een micromanipulator. 3.3.2. Het branden van de styletten
Na de voorbereiding van de zapper ( ‘Materiaal en methoden’) werd voor het branden een geschikte bladluis uitgezocht. Een eerste vereiste was dat de bladluis zich aan het voeden was op een goed bereikbare plaats van de stengel. Met de microscoop viel het min of meer op te maken of de bladluis aan het eten was. De aanwezigheid van honingdauwdruppels op het plantoppervlak kon ook een indicatie geven van voedende bladluizen. Een tweede belangrijk punt was de grootte van de bladluis. Grotere bladluizen lieten in het algemeen gemakkelijker toe om stylectomie op uit te voeren. Het stylet was groter en er was meer ruimte voor de positionering van de zapper. Een derde belangrijk punt was de positionering van de bladluis. Het stylet moest goed zichtbaar en bereikbaar zijn voor de naald van de zapper. Hiervoor kon de bladluis best vanuit een zijaanzicht (links of rechts) worden 43
benaderd, zoals te zien is in Figuur 28B. Het was ook mogelijk om de bladluis lichtjes te manipuleren in een betere positie met een fijn voorwerp, zonder haar weg te jagen. Om het stylet door te branden moest met de microscoop worden ingezoomd (x64 – x105.6) op het monddeel van de bladluis. De naald van de zapper werd met de micromanipulator naar het monddeel van de bladluis gebracht, zodanig dat beide (het stylet en de zapper) in beeld waren onder de microscoop. De microscoop werd eerst scherpgesteld op het monddeel van de bladluis. De naald werd dan in diepte gevarieerd met de micromanipulator. Zodra de naald en het monddeel beiden scherp waarneembaar zijn, bevonden ze zich even hoog en kon er contact worden gemaakt met het monddeel, terwijl de frequentie geregeld werd (Figuur 28D). Het branden vereiste ervaring en was een tijdrovende techniek. Het kon eventueel helpen om een hoek te buigen in de naald, afhankelijk van de positie van de bladluis. Op het einde van dit onderzoek werd een slaagkans genoteerd van één op drie voor het doorbranden van de styletten (Figuur 28).
Figuur 28: Foto’s tijdens het uitoefenen van de stylectomietechniek. Op foto’s A, B en C werd de bladluis benaderd met de naald van de zapper. Foto D toont een poging tot het doorbranden van het stylet. Hierbij maakt de zapper contact met de monddelen van de bladluis. Verder is te zien hoe het stylet nog blijft hangen in de stengel wanneer er succesvol gebrand werd.
3.3.3. Bevestigen van de druksensor op het stylet
Eenmaal het stylet succesvol werd doorgebrand en er nog floëemsap exudeerde (Figuur 29A en B), moest de druksensor over het stylet worden geschoven en vastgelijmd. Dit bleek niet eenvoudig. Om niet te veel tijd te verliezen werd de druksensor vooraf in orde gebracht. De aangescherpte 44
microcapillairen waren eigenlijk te scherp om over het stylet te schuiven, dus werden ze voorzichtig afgestompt tot de juiste diameter. De druksensor werd volledig gevuld met olie en de resterende luchtbellen werden zo veel mogelijk verwijderd. Het microcapillair werd op de micromanipulator bevestigd en voorzichtig over het stylet geschoven. Hierbij kwamen een reeks van complicaties kijken. Eerst en vooral moest het stylet nog voldoende exuderen, maar ook niet te veel, aangezien dit het zicht belemmerde. Omdat de operatie moest worden uitgevoerd door een microscoop, was het dieptezicht in zeker opzicht een probleem. Verder mocht het stylet niet opensplitsen, omdat het anders onmogelijk was om het microcapillair er over te schuiven. Eens de druksensor over het stylet was geschoven (Figuur 29C), moest die nog worden vastgelijmd. Hiervoor werden verschillende soorten lijm gebruikt met bijgevoegde activator. De eerste lijm (type 319, Loctite, België) met activator (type 7649, Loctite, België) bleek niet geschikt, omdat de activator niet snel genoeg werkte. De tweede lijm (Zap-a-gap PT-02 medium Ca+, Zap, US) met activator (Zip Kicker PT-715, Zap, US) was evenmin geschikt. Hoewel de activator de lijm onmiddellijk deed opstijven, was deze te lopend waardoor hij langs het stylet in het microcapillair liep en een verstopping veroorzaakte. De derde lijm bestond uit een compositie van twee soorten (850-956 Quick Set Epoxy adhessive, RS Components, België). Deze lijm was zeer viskeus en had ongeveer 20 minuten nodig om op te stijven (Figuur 29D). Uiteindelijk was het hiermee wel gelukt om het floëemsap in het microcapillair te laten lopen en de olie terug te duwen (Figuur 29E). Jammer genoeg sloot ook deze niet genoeg af, waardoor er geen druk kon worden opgebouwd binnen de druksensor. Zelfs wanneer de derde lijm werd opgevolgd door de tweede lijm, bleek dit niet voldoende om een goede drukmeting uit te voeren.
45
Figuur 29: Foto's van de verschillende stappen bij het stylectomieproces. Foto A en B tonen een succesvol doorgebrand exuderende stylet. Foto C toont het gescherpt microcapillair dat over het stylet wordt geplaatst. Op foto D wordt het microcapillair vastgeplakt met de RS 850-956 Quick Set Epoxy adhessive lijm en op foto E is te zien hoe het exudaat van het stylet tot in het microcapillair is gelopen na één nacht rusten. Wanneer het floëem echter werd terug geduwd, bleek de lijm niet voldoende af te sluiten, waardoor er geen druk kon worden opgebouwd.
46
4. Discussie 4.1. Ontwikkeling van de druksensor De ontwikkeling van de druksensor verliep moeizaam. De samenstelling van het toestel gebeurde nauwkeurig, met oog op detail. Toch was het geen evidentie om het toestel te vrijwaren van lekken of luchtbellen. Onderdelen zoals de fingertight fitting droegen bij tot een betere afdichting, maar waren zelf ook gevoelig aan beschadiging. Ook de rubberen afdichtingsringen rond de druktransducer en regelstaaf werkten niet optimaal en lieten vaak lucht door. Voornamelijk wanneer de regelstaaf achteruit werd gedraaid, ontstonden er luchtbellen aan de aansluiting op de drukkamer en tussen de rubberen afsluitringen. Door de druktransducer vast te lijmen werden de lekken aan dit onderdeel volledig gedicht. Dit was uiteraard niet mogelijk bij de regelstaaf, aangezien deze vrij moest kunnen bewegen. De druksensor bleek een delicaat toestel te zijn dat men met de nodige voorzichtigheid moet hanteren om plotse rukken of schokken aan de afdichtingen en tussenstukken te vermijden. De gebruikte HPLC-buisjes waren bestand tegen hoge drukken, waardoor ze redelijk stroef waren. Bij de bouw van de druksensor moest rekening gehouden worden met de bedienbaarheid van het toestel. Door een kort HPLC-buisje te gebruiken werd de manipulatie van het microcapillair flink bemoeilijkt. Vaak stond de druksensor zelf ook in de weg om het experiment uit te voeren. Door het delicate karakter van het toestel moest ook hier voorzichtig mee worden omgesprongen. Belangrijke voorwaarden voor de metingen waren het verwijderen van de lucht binnen de druksensor en het voldoende aanscherpen van het capillair. Het glazen capillair was zeer fragiel; bij de minste aanraking brak de tip af en moest opnieuw worden begonnen. Het verwijderen van resterende lucht gebeurde met behulp van de meetspuit, al liet deze het af en toe ook wel eens afweten. Door de grote onderdrukken die soms werden gerealiseerd tijdens de onttrekking van de lucht, kon de spuit het begeven en diende opnieuw te worden begonnen.
4.2. Turgordruk bij kerstomaten 4.2.1. Metingen van de turgor
Wanneer de data van de turgordruk worden bekeken voor de vijf behandelingen (Figuur 19), blijkt dat er een verschil is tussen de metingen en hun fout. Voornamelijk de metingen van de kleinste vruchten kennen een grotere standaardafwijking. Dit heeft waarschijnlijk te maken met de aard van de meting. Er werden telkens drie metingen uitgevoerd op eenzelfde plaats, waarvan de eerste meting standaard veel hoger lag. Het verschil tussen de twee laatste metingen was veel kleiner. Dit kan mogelijk verklaard worden door een verlies aan celsap na de eerste meting of door verstopping 47
van het microcapillair. Verder zal bij de kleine vruchtjes het droge stofgehalte hoger zijn dan in de groeifase rond 30 DAA, wanneer de vrucht volop water aanzuigt voor de celexpansie (Ho & Hewitt, 1986). Hierdoor kan de naald gemakkelijker verstopt geraken door organisch materiaal dat na de prik in de opening vast komt te zitten. Verstoppingen kunnen een oorzaak zijn van fouten in de meting en kunnen dus best worden vermeden. Wanneer in dit onderzoek een capillair te hevig verstopt geraakte, werd dit vervangen door een nieuw capillair. Hiervoor moest elke keer de naald langs voren worden opengemaakt en moest de lucht worden onttrokken. Deze vervangingen gebeurden onregelmatig. Het kwam dus voor dat op vier vruchtjes van de zelfde tros met drie verschillende capillairen moest worden gemeten, wat dus de fout op de methode vergrootte. Op behandeling B na leken de data een klokvormig patroon te vertonen (Figuur 19). Na de controle met model één werd deze veronderstelling bevestigd (Figuur 20). Op behandeling D na, werden bij de jongere vruchten eerder lage turgordrukken gemeten tot 20 dagen na anthese, waarna de turgor steeg tot een maximum rond 30 DAA, gevolgd door een daling. Het klokvormig patroon van de turgor past bij het groeiproces van de tomatenvrucht, waarin drie verschillende fases worden onderscheiden (Ho & Hewitt, 1986). De eerste fase duurt ongeveer twee weken en wordt gekenmerkt door celdeling. Voor celdeling is geen grote turgor vereist, wat het merendeel van de lagere drukken bij de jonge vruchten kan verklaren (Davies & Cocking, 1965). De volgende fase start ongeveer twee weken na anthese en wordt voornamelijk gekenmerkt door celexpansie. Om cellen voldoende te laten uitzetten is een grote instroom van water, nutriënten en assimilaten nodig en dit verhoogt op zijn beurt de turgor binnen de cellen (Ho & Hewitt, 1986). De instroom zal voornamelijk worden verzorgd door het floëemweefsel (Liu et al., 2007). Ongeveer 40 dagen na anthese stopt de expansiefase en begint de rijpingsfase. De instroom van water en nutriënten neemt af en de celwanden beginnen te degraderen (Gierson & Kader, 1986), met als gevolg dat ook de turgordruk daalt. De hevigste groeispurten van de vrucht zijn voorbij, de tomaat zal vanaf nu voornamelijk nog chemische veranderingen ondergaan (Gierson & Kader, 1986). Behandeling D liet in tegenstelling tot A, C en E hoge turgordrukken registreren voor de jongste vruchten. Pas vanaf een leeftijd van 20 dagen na anthese wordt dezelfde trend weergegeven als in bovenstaande behandelingen. Mogelijke verklaringen voor de hoge waarden bij de jonge vruchten worden gezocht in de meetmethode. Deze was op sommige momenten namelijk niet zo accuraat, zoals in voorgaande paragraaf werd aangehaald. In combinatie met het werken op zeer kleine vruchten, vergrootte de kans op fouten. Het verloop van behandeling B lijkt in geen opzicht op voorgaande curves. Oorzaken van het verloop kunnen vermoedelijk ook gezocht worden in de accuraatheid van de meetmethode. Wanneer model één werd vergeleken met model twee bleek dat model één een significant betere benadering gaf van de resultaten. In principe zou dus model één moeten worden gebruikt voor 48
verdere studies en zijn er wel degelijk verschillen in curves tussen de verschillende behandelingen. Maar zoals kan worden waargenomen in Figuur 20, wijkt de curve van behandeling B extreem af van de andere curves. Het is deze curve die in alle waarschijnlijkheid de significantie van de test afdwingt en aangezien dit verloop te wijten is aan fouten op de meetmethode, werd toch besloten om model twee te gebruiken om de turgordruk te voorspellen aan de hand van de leeftijd. De curve in Figuur 21A is nog steeds klokvormig en beschrijft de turgordruk tijdens het groeiproces van de tomatenvrucht het best. De EC-behandeling heeft geen significant effect op het turgorverloop in functie van de leeftijd, op basis van de vergelijking tussen model twee en drie (Figuur 22A). Dit resultaat suggereert dat de plant streeft naar een zo gelijkmatig mogelijke groei van de vrucht. De treshold voor vruchtgroei is ook vrij laag, dus zodra een bepaalde turgor bereikt wordt, resulteert dit in groei, met relaxatie en turgordaling tot gevolg. Gemiddelde EC-waarden die in de praktijk worden opgelegd aan tomatenplanten schommelen tussen 2 en 3 mS/cm (van de Vooren et al., 1986). Sonneveld (1985) raadt zelfs een EC-waarde aan van minstens 3 mS/cm om de vruchtkwaliteit te verhogen. De gehanteerde EC-waarden voor kerstomaat liggen zelf nog iets hoger, aangezien deze minder gevoelig zijn voor neusrot. In dit experiment werd maximaal een EC-waarde van 5 mS/cm opgelegd. De plant lijkt ook bij deze EC-waarden, de turgor binnen de vrucht zo min mogelijk te laten afwijken van het verloop bij lagere EC. Als men weet dat in de praktijk soms EC-waarden worden opgelegd van 10 mS/cm (van de Vooren et al., 1986), dan kan worden gesteld dat de opgelegde droogtestressen niet hoog genoeg waren. Nochtans zal op een bepaald punt de turgor niet meer kunnen onderhouden worden en instorten (Rudich & Luchinsky, 1986). Dit punt werd in deze studie echter niet waargenomen, waardoor kan worden gesteld dat het effect van de opgelegde EC-behandelingen niet werd aangetoond. Het klokvormig verloop van de curves in Figuur 21A en 22 beschrijft het verloop van de turgor significant beter dan elke rechte (Figuur 23A) die door de data geschat kan worden, en dit ongeacht de toegediende EC. 4.2.2. Metingen van de osmotische potentiaal
De standaardafwijking van de osmotische potentiaal was variabel. Dit kan te wijten zijn aan de variabele temperatuur waarbij gemeten werd. De eerste kalibratie werd uitgevoerd bij een temperatuur van 24,5 °C. Halfweg de metingen daalde de temperatuur en werd het signaal van twee kamertjes onbruikbaar door vervuiling van het thermokoppel. De kamers werden vervolgens gereinigd en er werd een nieuwe kalibratie van de thermokoppel psychrometer uitgevoerd bij een temperatuur van 22,5 °C.
49
In eerste instantie werd verondersteld dat de verschillende EC-waarden van de behandelingen tot een merkbaar verschil zouden kunnen leiden. Hogere EC-waarden vragen immers een grotere zuigkracht van de plant, wat zich vaak laat vertalen in een meer negatieve waterpotentiaal (Rudich & Luchinsky, 1986). Gezien de turgordruk tussen de behandelingen niet sterk verschilde, leidt dit bijgevolg ook tot een meer negatieve osmotische potentiaal (Ho et al., 1987). Hoewel het interessant geweest was om twee behandelingen te kunnen vergelijken met elkaar, werden er slechts vier tot vijf metingen uitgevoerd per behandeling, waardoor het moeilijk werd om ze onderling te gaan vergelijken. Enkel op behandeling C werd intensief gemeten, waardoor hiervoor wel een verloop kon worden opgesteld (Figuur 25). De gezamenlijke resultaten van alle behandelingen zijn wel voor discussie vatbaar en tonen een daling van de osmotische potentiaal naarmate de vrucht veroudert. Het buigpunt ligt ongeveer rond de leeftijd van 40 DAA, wat overeenkomt met de overgang van de expansie- naar de rijpingsfase (Gierson & Kader, 1986; Ho & Hewitt, 1986). Aangezien rond deze periode de toevoer van water naar de vrucht afneemt (Van Ieperen et al., 2003), het osmotisch inactieve zetmeel wordt omgezet naar opgeloste suikers (Ho & Hewitt, 1986) en de productie van organische zuren toeneemt (Gierson & Kader, 1986), wordt verondersteld dat hierdoor de concentratie aan osmotisch actieve componenten binnen de vrucht toeneemt en bijgevolg de osmotische potentiaal daalt. Bij de jongste vruchten (10-14 DAA) lijkt de osmotische potentiaal initieel lager dan in de expansiefase (Figuur 24 en 25). Dit kan kloppen, aangezien aan de start van de celdelingsfase de instroom van nutriënten, afkomstig van de bladeren, toeneemt (Dennis et al., 1982). Het aantal metingen op jonge vruchten was echter beperkt in dit onderzoek. Extra metingen op jonge vruchten zouden hier uitsluitsel over kunnen geven. De expansiefase wordt gekenmerkt door een snelle instroom van water, assimilaten en nutriënten. Verdunning in combinatie met de opstapeling van zetmeel (Walker et al., 1978) kunnen leiden tot een lagere concentratie aan osmotisch actieve componenten. De osmotische potentiaal blijft gedurende de expansiefase vrij constant. De turgordruk in de cellen neemt toe tot een punt waarop ze wordt beperkt door haar eigen celexpansie. De belangrijkste instroom van water en suikers gebeurt via het floëem, vermoedelijk onder invloed van positieve drukgradiënten, die als het ware water vanuit het floëem in de vrucht duwen (Liu et al., 2007). Op deze wijze kan de turgor toch toenemen, terwijl de osmotische potentiaal gelijk blijft. Wanneer een bepaalde grenswaarde van de turgor bereikt wordt, resulteert dit in irreversibele groei, waardoor er opnieuw turgorafname is. De totale waterpotentiaal is voornamelijk verantwoordelijk voor het instromen van water via het xyleem. De maximale turgor in de vrucht wordt bereikt na 30 dagen. Voorbij dit punt daalde zowel de turgordruk als de osmotische potentiaal door een afname van de watertoevoer en de afbraak van het zetmeel in sucrose, glucose 50
en fructose (Ho et al., 1983). De verlaagde turgor verklaart waarom de dendrometer niet langer werd ingedrukt, maar de dendrometer de vrucht indrukte. De vrucht bereidde zich namelijk voor op de rijpingsfase (Gierson & Kader, 1986; Ho & Hewitt, 1986). Door deze daling ging ook de totale waterpotentiaal verder dalen. 4.2.3. Vruchtgroei
In Figuur 26 kende de vruchtgroei initieel een sterke toename van de diameter voor alle behandelingen. Hieruit kan worden geconcludeerd dat deze vruchten zich reeds in de expansiefase van het groeiproces bevonden. Volgens Ho & Hewitt (1986) duurt de eerste celdelingsfase ongeveer twee weken, wat overeenkomt met onze metingen die een snelle expansie vertonen vanaf ongeveer 14 DAA. De snelste diametertoenames werden geregistreerd tussen 20 en 25 dagen na anthese, wat overeenkomt met de bevindingen van Ho et al. (1983). De groeisnelheid neemt af naarmate de vrucht ouder wordt, wat samenvalt met de gemeten afname van de turgor, die de daling van de groeisnelheid verklaart. Dertig tot veertig dagen na anthese begonnen de resultaten van de dendrometer verstoord te geraken door deze daling van de turgor. De afname zorgde ervoor dat de dendrometer de vrucht gemakkelijker kon indrukken waardoor het moeilijk werd om eventuele vruchtgroei nog te registreren. Jammer genoeg kon er voor vruchten jonger dan 14 DAA geen diameter worden bepaald, omdat deze nog te klein waren en het onmogelijk was om de dendrometer op deze kleine vruchten te installeren. Er kan echter verondersteld worden dat dit proces zou leiden tot een sigmoïde groeicurve in Figuur 26, met een lagere groeisnelheid in de celdelingsfase, zoals voorspeld door Ho & Hewitt (1986). Het voornaamste verschil dat kan worden waargenomen tussen de vruchtdiameters op het einde van de groeifase, is dat deze van behandeling E twee millimeter kleiner zijn dan bij de andere behandelingen. Extra metingen uit het overkoepelend vruchtkwaliteitexperiment, die in deze thesis niet worden meegegeven, tonen dat dit geen toeval is. Aangezien EC-waarden een sterke invloed kennen op de lengte van het groeiproces en dus de grootte van de vrucht (Rudich & Luchinsky, 1986), is dit geen echte verrassing. 4.2.4. Vruchtontwikkeling
Algemeen kan worden gesteld dat het vruchtdrukexperiment een waardevolle bevestiging geeft van de literatuur. Meteen na de anthese begint de celdelingsfase. Na twee dagen zal de assimilatenaanvoer vanuit de bladeren toenemen. Door een gebrek aan metingen van de osmotische potentiaal bij de jongste vruchten konden hier echter geen conclusies worden uit getrokken. Aangezien volgens Ho & Hewitt (1986) in deze fase de nadruk ligt op celdeling, is een zeer hoge turgor niet echt nodig. Er werden pas resultaten van de vruchtgroei genoteerd ten vroegste vanaf 12 dagen na anthese, waardoor ook de groeisnelheid in deze fase niet uitvoerig kan besproken worden.
51
Na de celdeling begint de fase van celexpansie. De expansie gebeurt onder verhoogde turgor en wordt gekenmerkt door snelle groei. De turgor in Figuur 21A beaamt dit en nam toe naar een maximum binnen de expansiefase. Het maximum lag rond 30 DAA, wat enigszins later is dan de 20 tot 25 DAA die Ho et al. (1983) voorspellen. De vruchtdiameter nam wel het snelste toe tussen de 20 en 25 dagen na anthese. Aangezien de turgordruk parallel zou moeten lopen met de groei, werd verwacht dat deze rond dezelfde periodes zou pieken. Wanneer rekening wordt gehouden met het feit dat Figuur 21A werd opgesteld voor alle turgormetingen, inclusief behandeling B die ver van de andere resultaten afweek, lijkt deze Figuur de relatie tussen turgordruk en vruchtgroei te bevestigen. De osmotische potentiaal bleef gedurende de expansiefase ongeveer constant. De totale waterpotentiaal nam echter in beperkte mate toe door de stijging van de turgor (Figuur 25). De verhoogde turgor wordt veroorzaakt door de instroom van water, assimilaten en nutriënten uit het xyleem en floëem. De instroom via het xyleem, die wordt gestuurd door de totale waterpotentiaal, is echter veel lager dan deze van floëem, die zowel door osmotische potentialen als door positieve drukgradiënten wordt gedreven (Liu et al., 2007). De toename van de turgordruk gaat gepaard met een snellere groei, die opnieuw voor een relaxatie van de cel zorgt. Hierdoor zal de turgor nooit echt hoog worden. In de rijpingsfase zal de instroom via de transportweefsels afnemen door een verhoogde weerstand in de vruchtsteel (Van Ieperen et al., 2003). De verminderde instroom in combinatie met de degradatie van de celwanden binnen de vrucht heeft tot gevolg dat de turgor opnieuw daalt. Ook op de resultaten van de dendrometer is dit duidelijk zichtbaar aan het afvlakken van de curve vanaf een leeftijd van 35 tot 40 dagen. De turgor daalde, waardoor de dendrometer in staat was om de vrucht in te duwen met haar veer en een vertekend beeld te geven van het verloop van de vruchtgroei. Tegelijk kan verondersteld worden dat de verlaagde turgor voor een verminderde groei zorgt, aangezien voldoende turgor nodig is om irreversibele groei te veroorzaken. De vrucht zit dan volop in de rijpingsfase en ondergaat voornamelijk nog metabolische veranderingen. Door de afbraak van zetmeel en de productie van organische zuren zal de osmotische potentiaal en bijgevolg ook de totale waterpotentiaal sterk dalen (Gierson & Kader, 1986).
4.3. Floëemtransport bij tarwe De stylectomietechniek dient nog verder geoptimaliseerd te worden. Hoewel het branden van de bladluizen na het opbouwen van ervaring relatief vlot verliep, zijn er ongetwijfeld nog punten van verbetering. Door de kleine schaal en nauwkeurigheid van de uitvoering, waren trillingen en schokken bijvoorbeeld niet gewenst. Dit was jammer genoeg in deze proefopstelling meermaals het geval. In dit onderzoek werd de proefopzet op een metalen bureau uitgevoerd. De bureau bleek achteraf te onstabiel om schokvrij te kunnen werken. Hoewel het arduinen blad en de rubberen 52
schokdempers het merendeel van de trillingen opvingen, gold dit enkel voor de toestellen die op het blad rustten (de microscoop en de micromanipulator). De statieven met de regelstaaf stonden op het bureaublad en aangezien hierop de tarweplanten worden bevestigd, waren de kleinste trillingen al verantwoordelijk voor het mislukken van het merendeel van de brandingen. Niet alleen het branden, ook het lijmen van het microcapillair vereiste een stabielere proefopstelling zonder trillingen. Een tweede moeilijkheid van de stylectomietechniek was het dieptezicht. Zowel bij het branden als bij het plaatsen van het microcapillair werden er moeilijkheden genoteerd. Door de schaal waarop het stylet moest worden doorgebrand, was het afstellen van de juiste scherpte geen sinecure. Een succesvolle branding gebeurde soms in meerdere stappen. Het plaatsen van het capillair van de druksensor vormde wellicht de grootste uitdaging. Enerzijds was het onder dergelijke vergrotingen moeilijk om goed in te schatten wanneer het stylet nu juist in het capillair zat. Anderzijds kon de aanraking van het capillair de splitsing van het stylet veroorzaken. Het bestaat namelijk uit vier monddelen die kunnen openvallen in twee afzonderlijke stukken (Figuur 4). In dit geval werd het onmogelijk om het microcapillair over het stylet te plaatsen. Het was ook geen evidentie om de juiste hoek te vinden om het stylet te benaderen, aangezien dit stylet vaak gebogen was. Het stylet zelf moest ook nog exuderen, wat het proces alleen maar bemoeilijkte. Druppels floëem bleven namelijk aan het capillair plakken en belemmerden het zicht, of zorgden door hun gewicht voor het omvallen van het stylet. Belangrijk voor de slaagkansen van de techniek was de scherpte van het capillair. Een pas gebrand capillair was te smal om over het stylet te schuiven. Er werd dus geopteerd om de punt van het capillair te breken en zo de opening te vergroten. Voor dit onderzoek werd gebruik gemaakt van een effen metalen oppervlak waarmee voorzichtig onder een microscoop tegen het microcapillair werd getikt. Het breukvlak was echter nooit volledig recht en dus kan er voor volgend onderzoek beter beroep worden gedaan op een glas- of diamant vijl om de tip van het microcapillair zorgvuldig af te slijpen. Dit komt niet alleen de techniek ten goede, maar ook het zicht op het stylet, omdat breukvlakken een vertekend beeld geven. Eenmaal het microcapillair op zijn plaats zat, moest het nog worden vastgelijmd. In het onderzoek van Fisher et al. (1984) werd een methode beschreven waarin in twee stappen wordt gewerkt. In een eerste stap werd het exudaat aan de tip van het stylet opgevangen met een capillair, waarna de basis rond de stengel een eerste lijm laag kreeg. Dit zou niet alleen een lekvrije basis voorzien voor de druksensor, maar zou ook voorkomen dat het stylet openvalt. In een tweede stap werd de druksensor over het stylet geplaatst met aanbrenging van een tweede laag lijm en activator. De eerste problemen doken op bij de gebruikte lijm. Verschillende soorten werden ongeschikt bevonden 53
doordat ze te vloeibaar waren, of gecombineerd werden met een slechte activator. De enige keer dat het wel gelukt was om het microcapillair succesvol vast te lijmen, kon er onvoldoende druk worden opgebouwd. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het feit dat het microcapillair na het te breken, te groot werd. Hierdoor werd in plaats van druk te zetten op het stylet en het floëemsap terug te duwen, druk gezet op het oppervlak van de stengel, waardoor de druk onhoudbaar werd en de lijm los kwam van de stengel.
54
5. Toekomstig onderzoek 5.1. Druksensor Hoewel de eerste poging voor het ontwikkelen van de druksensor succesvol was, zijn er toch een aantal verbeteringspunten die voor toekomstig onderzoek kunnen worden geïmplementeerd. Het volledige toestel is zeer delicaat, wat niet bevorderlijk was om lekkage te voorkomen. Een robuuster ontwerp waarin nog meer rekening wordt gehouden met afdichting van de onderdelen, zou het toestel accurater en gebruiksvriendelijker maken. Vooral het stuk van de T-klep en de navulspuit was zeer lekgevoelig en vraagt voor alternatieven. Een langer en soepeler HPLC-buisje behoort ook tot de verbeteringen en zal voornamelijk het gebruik vergemakkelijken. Er moet verder worden gezocht naar een efficiëntere methode voor de verwijdering van luchtbellen. Vooral de T-klep was verantwoordelijk voor het terugkeren van lucht. Het protocol omschreven in deze masterproef ( ‘Materiaal en methoden’) was tijdrovend en onhandig. Een druksensor die beter is afgedicht, zou dit al een stuk vergemakkelijken.
5.2. Kerstomaten Binnen dit experiment waren zeker nog punten voor verbetering. Bij de osmotische potentiaal moesten meer behandelingen intensief worden gemeten, aangezien de vier tot vijf punten te weinig informatie gaven om onderling vergelijkende conclusies te trekken. Er werd gekozen om te werken met behandeling C, maar ook behandeling A en E hadden beter een intensievere meting van de osmotische potentiaal ondergaan, aangezien hier de twee uiterste condities werden opgelegd. Ook voor de vruchtgroei hadden meerdere metingen moeten worden uitgevoerd om uit te maken of de laagste vruchtdiameter bij behandeling E toeval was of werkelijk het effect van de hoge ECbehandeling beschreef. Het gehele experiment was oorspronkelijk bedoeld om het effect van EC-waarden op de kwaliteit van tomatenvruchten te testen. Aangezien alle behandelingen ook in de praktijk voorkomen, werd een goede productie verwacht. Voor de turgor zou het echter interessanter zijn als de verschillende ECwaarden verder uit elkaar zouden liggen, bijvoorbeeld 2,5; 5; 7,5 en 10 mS/cm. Op deze wijze zou de productie aanzienlijk minder zijn, maar zouden misschien wel de nodige verschillen kunnen worden opgemaakt tussen behandelingen. De druksensor leent zich perfect voor continue opvolging van de turgordruk, om zo de evolutie tijdens de dag of het effect van weersomstandigheden te kunnen meten. De vrucht moet niet geoogst worden, maar kan intact aan de plant blijven doorgroeien, terwijl de turgordruk wordt 55
gemeten. Wanneer het totale verloop in kaart wordt gebracht onder normale omstandigheden, kan verder
worden
geëxperimenteerd
met
parameters
zoals
toenemende
droogtestress,
droogteschokken, temperatuur, belichting, e.d.
5.3. Floëemtransport bij tarwe Het laatste experiment bevond zich op onbekend terrein en kon jammer genoeg niet vervolledigd worden. Hoewel de uitvoering bijna gelukt was, kon er geen kwalitatieve meting worden uitgevoerd. Dit is uiteraard een vereiste voor verder onderzoek naar floëemdrukken. De meeste factoren die aan de oorzaak lagen van het falen werden al aangehaald in de discussie. De proefopzet liet te veel schokken en trillingen door, het stylet werkte niet mee door open te vallen of om te buigen, het microcapillair kon niet goed worden afgesneden en de lijm was ofwel te vloeibaar of niet sterk genoeg. De proefopzet moet worden uitgevoerd op een stabiele ondergrond, waarbij de operator de opstelling zo weinig mogelijk aanraakt. Door te werken met een tweede micromanipulator, kan een gebogen stylet beter worden gepositioneerd of kan een opengevallen stylet terug worden samen geduwd. Door dan gebruik te maken van de tweede micromanipulator kan eerst een glazen opvangcapillair worden geplaatst over het stylet, waarna een eerste laag lijm wordt aangebracht op het oppervlak rond het stylet. Dit zal er enerzijds voor zorgen dat het stylet niet meer zal openvallen, maar ook dat de druksensor daarna niet zo ver over het stylet kan worden geschoven, waardoor de druk meer op de opening van het stylet zal inwerken. Anderzijds moet de lijm voor een stabiele lekvrije ondergrond zorgen om de druk op op te voeren. Een tweede laag lijm sluit dan alles af, waardoor het floëemsap enkel nog in de druksensor kan stromen en waardoor de floëemdruk kan opgebouwd worden (Fisher & Frame, 1984). Belangrijk hierbij is dat het stylet een goede opening heeft. Deze kan idealiter worden bekomen met een diamantvijl. Eenmaal de druksensor correct kan worden bevestigd en een goede kwalitatieve meting kan worden bekomen, kan de originele doelstelling van dit onderzoek worden uitgevoerd. In de eerste plaats kan de druk binnen het floëemweefsel van tarwe worden gemeten. Er kan worden gekeken naar het effect van EC-waarden in de voedingsoplossing en droogteschokken met behulp van polyethyleenglycol (PEG). Een ander interessante onderzoekspiste betreft het zoeken naar verschillen in floëemdruk tussen de aren (‘sinks’), de stengel en de bladeren (‘sources’). Eenmaal de techniek is geoptimaliseerd, zou kunnen gemeten worden op bomen waarop hemipteren voeden, aangezien nog weinig geweten is rond het suikertransport bij zulke bomen. 56
6. Conclusies De bouw van de druksensor kan succesvol genoemd worden. Na enkele aanpassingen waren er geen lekken te bespeuren en kon een goede, kwalitatieve drukmeting worden uitgevoerd. Voor de bepaling van de turgordruk bij kerstomaten werd een significant klokvormig patroon gevonden. De maximale turgordrukken werden opgemeten rond 30 dagen na anthese, wat overeenkomt met de expansiefase. De osmotische potentiaal binnen de vrucht bleef gedurende de expansiefase vrij constant. Bij de start van de rijpingsfase begon deze echter sterker negatief te worden, door de vele chemische veranderingen die plaatsvonden binnen de vrucht. De verdere correlatie tussen vruchtgroei, turgordruk en osmotische potentiaal kon worden verklaard aan de hand van de literatuur. De drie fases (celdeling, celexpansie en vruchtrijping) van de vruchtontwikkeling werden allen teruggevonden binnen de resultaten. Het effect van EC-behandeling kon niet worden vastgesteld in de metingen van turgordruk en osmotische potentiaal. Voor de turgordruk werden geen significante verschillen opgemeten tussen de behandelingen. Om een eventueel effect te kunnen waarnemen, zou wellicht een grotere osmotische stress moeten worden opgelegd. Om het effect op de osmotische potentiaal en de vruchtgroei na te gaan werden te weinig metingen uitgevoerd om eenduidige conclusies te trekken. De uitvoering van de stylectomietechniek kende echter meer problemen. Voor het gebruik van de zapper en het doorbranden van de styletten werd wel de nodige ervaring verworven. Op het einde van het onderzoek werd een slaagpercentage gehaald van 1/3. De bevestiging van de druksensor was nog voor verbetering vatbaar. Onder andere m.b.t. de proefopstelling, het breken van de tip van het capillair en de lijm zijn er nog verbeteringen noodzakelijk om kwalitatieve metingen te kunnen uitvoeren.
57
58
Bibliografie Adams, P. (1986). Mineral nutrition. In The tomato crop (pp. 281–334). Bernaerts, E. & Demuynck, E. (2009). Tuinbouw in België (p. 21). Retrieved from http://lv.vlaanderen.be/nlapps/data/docattachments/LARA_Sectoren_H5_Tuinbouw.pdf Blackman, Roger L. & Eastop, V. F. (2006). No Aphids on the world’s herbaceous plants and shrubs. (J. W. & Sons, Ed.) (December 2., p. 1460). Boyer, J. S. (1995). Pressure Probe. In Measuring the water status of plants and soils (pp. 103–142). Academis Press, INC. Retrieved from http://udspace.udel.edu/bitstream/handle/19716/2828/Chapter+4.+Pressure+Probe.pdf?sequ ence=5 Carrara, S., Pardossi, A., Soldatini, G. F., Tognoni, F. & Guidi, L. (2001). Photosynthetic activity of ripening tomato fruits. Davies, J. W. & Cocking, E. C. (1965). Changes in carbohydrates, proteins and nucleic acids during cellular development in tomato fruit locule tissue. Planta, 67(3), 242–253. doi:10.1007/BF00385654 De Schepper, V., Buehler, J., Thorpe, M., Roeb, G., Huber, G., van Dusschoten, D., … Steppe, K. (2013a). C-11-PET imaging reveals transport dynamics and sectorial plasticity of oak phloem after girdling. FRONTIERS IN PLANT SCIENCE, 4. doi:10.3389/fpls.2013.00200 De Schepper, V., De Swaef, T., Bauweraerts, I. & Steppe, K. (2013b). Phloem transport: a review of mechanisms and controls. JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, 64(16), 4839–4850. doi:10.1093/jxb/ert302 Delaplace, K. & Ryck, T. De. (2008). Bladluizen in ecofysiologisch onderzoek : een vloek of een zegen ? Dennis, F. G. J., Archbold, D. D. & Flore, J. A. (1982). Accumulation of 14C -labelled material from foliar-applied 14C sucrose by tomato ovaries during fruit set and initial development. Journal of the American Society for Horticultural Science. Dinant, S., Bonnemain, J.-L., Girousse, C. & Kehr, J. (2010). Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding. Comptes Rendus Biologies, 333(6-7), 504–15. doi:10.1016/j.crvi.2010.03.008 Dinant, S. & Lemoine, R. (2010). The phloem pathway: new issues and old debates. Comptes Rendus Biologies, 333(4), 307–19. doi:10.1016/j.crvi.2010.01.006 Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S. & Pritchard, J. (2002). Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements. Journal of Experimental Botany, 53(369), 631–7. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11886882 Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Couldridge, C. E., Bale, J. S. & Pritchard, J. (2006). A phloemenriched cDNA library from Ricinus: insights into phloem function. Journal of Experimental Botany, 57(12), 3183–93. doi:10.1093/jxb/erl082 59
Ehret, D. L. & Ho, L. I. M. C. (1986). Effects of Osmotic Potential in Nutrient Solution on Diurnal Growth of Tomato Fruit. Journal of Experimental Botany, 37(9), 1294–1302. doi:10.1093/jxb/37.9.1294 Fisher, D. & Frame, J. (1984). A guide to the use of the exuding-stylet technique in phloem physiology. Planta, 161(5), 385–393. doi:10.1007/BF00394567 Friml, J. & Palme, K. (2002). Polar auxin transport--old questions and new concepts? Plant Molecular Biology, 49(3-4), 273–84. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12036254 Gattolin, S., Newbury, H. J., Bale, J. S., Tseng, H.-M., Barrett, D. & Pritchard, J. (2008). A diurnal component to the variation in sieve tube amino acid content in wheat. Plant Physiology, 147(2), 912–21. doi:10.1104/pp.108.116079 Geßler, A., Rennenberg, H. & Keitel, C. (2004). Stable isotope composition of organic compounds transported in the phloem of European beech--evaluation of different methods of phloem sap collection and assessment of gradients in carbon isotope composition during leaf-to-stem transport. Plant Biology (Stuttgart, Germany), 6(6), 721–729. doi:10.1055/s-2004-830350 Geßler, A., Schrempp, S., Matzarakis, A., Mayer, H., Rennenberg, H. & Adams, M. A. (2001). Radiation modifies the effect of water availability on the carbon isotope composition of beech (Fagus sylvatica). New Phytologist, 150(3), 653–664. doi:10.1046/j.1469-8137.2001.00136.x Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Hiraoka, K. & Nonami, H. (2013a). Living cell manipulation, manageable sampling, and shotgun picoliter electrospray mass spectrometry for profiling metabolites. Analytical Biochemistry, 433(1), 70–8. doi:10.1016/j.ab.2012.10.001 Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Hiraoka, K. & Nonami, H. (2013b). Living cell manipulation, manageable sampling, and shotgun picoliter electrospray mass spectrometry for profiling metabolites. Analytical Biochemistry, 433(1), 70–8. doi:10.1016/j.ab.2012.10.001 Gholipour, Y., Nonami, H. & Erra-Balsells, R. (2008). Application of pressure probe and UV-MALDI-TOF MS for direct analysis of plant underivatized carbohydrates in subpicoliter single-cell cytoplasm extract. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 19(12), 1841–8. doi:10.1016/j.jasms.2008.08.006 Gierson, D. & Kader, A. A. (1986). Fruit ripening and quality. In J. G. Atherton & J. Rudich (Eds.), The tomato crop (pp. 241–280). Cambridge: University Press, Cambridge. Gould, N., Thorpe, M. R., Koroleva, O., Minchin, P. E. H., Innes, C. J., Lane, C., … Forschungszentrum, J. (2005). Phloem hydrostatic pressure relates to solute loading rate : a direct test of the M unch ¨. Functional Plant Biology, 1019–1026. Hammel, H. T. (1968). Measurement of turgor pressure and its gradient in the Phloem of oak. Plant Physiology, 43(7), 1042–8. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1086970&tool=pmcentrez&render type=abstract Ho, L. C., Grange, R. I. & Picken, A. J. (1987). An analysis of the accumulation of water and dry matter in tomato fruit. Plant, Cell and Environment, 10(2), 157–162.
60
Ho, L. C. & Hewitt, J. D. (1986). Fruit development. In J. G. Atherton & J. Rudich (Eds.), The tomato crop (pp. 201–239). University Press, Cambridge. Ho, L. C., Sjut, V. & Hoad, G. V. (1983). The effect of assimilate supply in fruit growth and hormone level in tomato plants. Ann. Bot., (1), 155–171. Hüsken, D., Steudle, E. & Zimmermann, U. (1978). Pressure probe technique for measuring water relations of cells in higher plants. Plant Physiology, 61(2), 158–63. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1091824&tool=pmcentrez&render type=abstract Knoblauch, M., Peters, W. S., Ehlers, K. & van Bel, a J. (2001). Reversible calcium-regulated stopcocks in legume sieve tubes. The Plant Cell, 13(5), 1221–30. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=135563&tool=pmcentrez&rendert ype=abstract Koroleva, O. a, Tomos, a D., Farrar, J. & Pollock, C. J. (2002). Changes in osmotic and turgor pressure in response to sugar accumulation in barley source leaves. Planta, 215(2), 210–219. doi:10.1007/s00425-002-0744-2 Lalonde, S., Tegeder, M., Throne-Holst, M., Frommer, W. B. & Patrick, J. W. (2003). Phloem loading and unloading of sugars and amino acids. Plant, Cell and Environment, 26(1), 37–56. doi:10.1046/j.1365-3040.2003.00847.x Laval-martin, Danielle, Cytophysiologie, L. De, Photosynthese & Diamond, J. (1977). Light versus Dark Carbon Metabolism in Cherry Tomato Fruits, 872–876. Liu, H.-F., Génard, M., Guichard, S. & Bertin, N. (2007). Model-assisted analysis of tomato fruit growth in relation to carbon and water fluxes. Journal of Experimental Botany, 58(13), 3567–80. doi:10.1093/jxb/erm202 Lytovchenko, A., Eickmeier, I., Pons, C., Osorio, S., Szecowka, M., Lehmberg, K., … Fernie, A. R. (2011). Tomato fruit photosynthesis is seemingly unimportant in primary metabolism and ripening but plays a considerable role in seed development. Plant Physiology, 157(4), 1650–63. doi:10.1104/pp.111.186874 Malone, M. & Tomos, A. D. (1990). A simple pressure-probe method for the determination of volume in higher-plant cells. Planta, 182(2), 199–203. Mori, K. & Lemaire-Chamley, M. (2009). Study on regulatory mechanisms of y-amino butyric acid (GABA) metabolism and accumulation in tomato fruit. TIL. Münch, E. (1930). Die Stoffbewegungen in der Pflanze. Najla, S., Vercambre, G. & Génard, M. (2010). Improvement of the enhanced phloem exudation technique to estimate phloem concentration and turgor pressure in tomato. Plant Science, 179(4), 316–324. doi:10.1016/j.plantsci.2010.06.003 Nonami, H. & Boyer, J. S. (1990). Wall Extensibility and Cell Hydraulic Conductivity Decrease in Enlarging Stem Tissues at Low Water Potentials1. Plant Physiology, 1610–1619.
61
Nonami, H., Boyer, J. S. & Steudle, E. (1987). Pressure probe and isopiestic psychrometer measure similar turgor. Plant Physiology, 83(3), 592–5. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1056410&tool=pmcentrez&render type=abstract Omid, A., Keilin, T., Glass, A., Leshkowitz, D. & Wolf, S. (2007). Characterization of phloem-sap transcription profile in melon plants. Journal of Experimental Botany, 58(13), 3645–56. doi:10.1093/jxb/erm214 Patrick, J. W., Zhang, W. H., Tyerman, S. D., Offler, C. E. & Walker, N. A. (2001). Role of membrane transport in phloem translocation of assimilates and water. AUSTRALIAN JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, 28(7), 695–707. doi:10.1071/PP01023 Piechulla, B., Glick, R. E., Bahl, H., Melis, A. & Gruissem, W. (1987). Changes in Photosynthetic Capacity and Photosynthetic Protein Pattern during Tomato Fruit Ripening. Plant Physiology, 84(3), 911–7. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1056694&tool=pmcentrez&render type=abstract Rennenberg, H., Schneider, S. & Weber, P. (1996). Analysis of uptake and allocation of nitrogen and sulphur compounds by trees in the field, 47(303), 1491–1498. Rudich, J., & Luchinsky, U. (1986). Water economy. In The tomato crop (pp. 335–367). Sabri, A., Vandermoten, S., Leroy, P. D., Haubruge, E., Hance, T., Thonart, P., … Francis, F. (2013). Proteomic investigation of aphid honeydew reveals an unexpected diversity of proteins. PloS One, 8(9), e74656. doi:10.1371/journal.pone.0074656 Sato, M., Mitsuhashi, W., Watanabe, K. & Kawakita, H. (1997). A new system for the detection of phytopathogenic phytoplasmas using PCR (polymerase chain reaction) and laser stylectomy. JARQ-JAPAN AGRICULTURAL RESEARCH QUARTERLY, 31(4), 281–285. Shanker, A. K., Maheswari, M., Yadav, S. K., Desai, S., Bhanu, D., Attal, N. B. & Venkateswarlu, B. (2014). Drought stress responses in crops. Functional & Integrative Genomics, 14(1), 11–22. doi:10.1007/s10142-013-0356-x Smartse. (2009). Pressure Bomb image. Wikipedia. Retrieved from http://en.wikipedia.org/wiki/File:Pressurebomb.svg Sonneveld, C. (1985). Adaptation of fertilisation. Tuinderij, 64, 16–19. Tetyuk, O., Benning, U. F. & Hoffmann-Benning, S. (2013). Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method. Journal of Visualized Experiments : JoVE, (80), e51111. Retrieved from http://europepmc.org/abstract/MED/24192764 Thürmer, F., Zhu, J. J., Gierlinger, N., Schneider, H., Benkert, R., Geßner, P., … Zimmermann, U. (1999). Diurnal changes in xylem pressure and mesophyll cell turgor pressure of the lianaTetrastigma voinierianum: The role of cell turgor in long-distance water transport. Protoplasma, 206(1-3), 152–162.
62
Tjallingii, W. F. (2006). Salivary secretions by aphids interacting with proteins of phloem wound responses. Journal of Experimental Botany, 57(4), 739–45. doi:10.1093/jxb/erj088 Tomos, A. D. & Leigh, R. A. (1999). THE PRESSURE PROBE : A Versatile Tool in Plant Cell Physiology. Tomos, D. (2000). The Plant Cell Pressure Probe. Biotechnology Letters, 22, 437–442. Torsten, W. & van Bel, a. J. E. (2006). Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany, 57(4), 729–737. doi:10.1093/jxb/erj089 Turgeon, R. (2010). The role of phloem loading reconsidered. Plant Physiology, 152(4), 1817–23. doi:10.1104/pp.110.153023 Turgeon, R. & Wolf, S. (2009). Phloem transport: cellular pathways and molecular trafficking. Annual Review of Plant Biology, 60, 207–21. doi:10.1146/annurev.arplant.043008.092045 Van Bel, a. J. E. (1992). PATHWAYS AND MECHANISMS OF PHLOEM LOADING. In A. Pollock, CJ and Farrar, JF and Gordon (Ed.), CARBON PARTITIONING : WITHIN AND BETWEEN ORGANISMS (pp. 53–70). OXFORD: BIOS SCIENTIFIC PUBLISHERS LTD. Van Bel, a. J. E. (1996). Interaction between sieve element and companion cell and the consequences for photoassimilate distribution. Two structural hardware frames with associated physiological software packages in dicotyledons? Journal of Experimental Botany, 47 Spec No(August), 1129– 40. doi:10.1093/jxb/47.Special_Issue.1129 Van Bel, a. J. E. (2003). The phloem, a miracle of ingenuity. Plant, Cell and Environment, 26(1), 125– 149. doi:10.1046/j.1365-3040.2003.00963.x Van de Vooren, J., Welles, G. W. H. & Hayman, G. (1986). Glasshouse crop production. In The tomato crop (pp. 581–623). Van Ieperen, W., Van Meeteren, U., Oosterkamp, J. & Trouwborst, G. (2005). Macro- and microscopic aspects of fruit water relations influencing growth and quality in tomato. Acta Horticulturae, 501–506. Retrieved from http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=17459392 Van Ieperen, W., Volkov, V. S. & Van Meeteren, U. (2003). Distribution of xylem hydraulic resistance in fruiting truss of tomato influenced by water stress. Journal of Experimental Botany, 54(381), 317–324. doi:10.1093/jxb/erg010 Walker, A. J., Ho, L. C. & Baker, D. A. (1978). Carbon translocation in the tomato: pathway to carbon metabolism in the fruit. Ann. Bot., (42), 901–909. Wendler, S. & Zimmermann, U. (1982). A new method for the determination of hydraulic conductivity and cell volume of plant cells by pressure clamp. Plant Physiology, 69(5), 998– 1003. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=426346&tool=pmcentrez&rendert ype=abstract Winsor, G. W. (1966). Some factors affecting the composition, flavour and firmness of tomatoes. Sci. Hort., 18(27).
63
Wood, S. N. (n.d.). Generalized Additive Models: an introduction with R. Wood, S. N. (2003). Thin plate regression splines. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology), 65(1), 95–114. doi:10.1111/1467-9868.00374 Zimmermann, U. & Steudle, E. (1978). Physical aspects of water relations of plant cells. Adv. Bot. Res., 6, 45–117.
64
