UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2009 – 2010
Stamceltherapie ter behandeling van een bacteriële ulceratieve keratitis bij een paard
Door Jan SPAAS
Promotor: Prof. dr. Ann Van Soom Medepromotor: dr. Marco Polettini
Casus in het kader van de Masterproef
INHOUDSOPGAVE Samenvatting....................................................................................................... p. 1 1. Inleiding.......................................................................................................... p. 2 2. Case Studie .................................................................................................... p. 3 2.1. Anamnese .................................................................................................. p. 3 2.2. Bijkomende onderzoeken ........................................................................... p. 4 2.3. Waarschijnlijkheidsdiagnose....................................................................... p. 4 2.4. Behandeling met stamcellen....................................................................... p. 4 4. Discussie........................................................................................................ p. 7 5. Literatuurlijst.................................................................................................. p. 10
De auteur geeft de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor. Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
Samenvatting Deze case studie behandelt het verhaal van Eros, een Italiaanse warmbloed ruin van 20 jaar oud. Hij vertoonde duidelijke ooguitvloei van het rechter oog met het deels sluiten van de oogleden. Eveneens kon men een wazige opklaring ventrocentraal tot midcentraal van de cornea waarnemen. Uit de fluoresceïnetest bleek dat de oppervlakkige lagen van de cornea aangetast waren. Na bacteriologisch en mycologisch onderzoek werd Pseudomonas aeruginosa geïsoleerd. Men kon daaruit concluderen dat het paard leed aan een bacteriële ulceratieve keratitis. Na verschillende medicamenteuze behandelingen bleek dat het probleem niet conservatief opgelost kon worden en werd het paard naar een dierenkliniek gestuurd. Hier besloten ze om Eros onder algemene anesthesie te brengen en een cauterisatie met joodtinctuur en een curettage van de ulcer uit te voeren. Na deze ingreep werden er geen verbeteringen vastgesteld en stelde de dierenarts voor om verdere chirurgische ingrepen te ondernemen. De prognose was echter gereserveerd, aangezien het paard tot hiertoe op geen enkele therapie positief reageerde. De eigenaars opteerden daarom niet voor chirurgie, maar wilden wel alternatieve therapieën proberen. Accupunctuur gaf niet de verwachte resultaten. Het gebruik van stamceltherapie gaf echter wel positieve gevolgen. Na intraveneus, intra-arterieel en lokaal inbrengen van autologe, pluripotente stamcellen werd reeds na twee weken een reductie van de ulcergrootte en het verdwijnen van de ontsteking van de cornea waargenomen. In de discussie komen andere therapieën aan bod die ook een verbetering zouden kunnen geven van de keratitis. Hieronder verstaat men etiologische, medicamenteuze en chirurgische therapieën. Deze worden uitgebreid besproken met hun voor- en nadelen, en tenslotte wordt de stamceltherapie besproken.
1. Inleiding Voor talrijke aandoeningen bestaan er nog onvoldoende of ontoereikende geneeswijzen. De oogulcer is er hier één van. Dit oppervlakkig corneadefect met weinig tot geen neiging tot heling kan onder andere veroorzaakt worden door recidiverend trauma, namelijk door een vreemd voorwerp achter het derde ooglid, door langdurig neerliggen (strohalmen in het oog) of door entropion (naar binnen gerolde ooglid met irritatie door wimpers). Ook kunnen infecties aan de basis liggen, die veroorzaakt worden door lokale infiltratie van bacteriën vanuit de huid, door systemisch aangevoerde bacteriën via een sepsis of door virussen zoals herpes. Bovendien wordt een cornea-ulcer vaak iatrogeen veroorzaakt door het meermaals aanbrengen van zalven ter hoogte van het oog. Daarenboven kan een paralyse van de nervus trigeminus eveneens bijdragen tot het ontstaan van een cornea ulcus. Minder voorkomende
oorzaken
zijn
erfelijke
aandoeningen,
zoals
een
slechte
epitheelfixatie
en
corneanecrose. Het oog is een moeilijk orgaan om medicamenteus te behandelen wegens de partiële doorbloeding en de specifieke zuurtegraad, tonus en ionensamenstelling. Daarom is het zeer moeilijk om alle structuren van het oog via systemische weg te bereiken. Bovendien neemt men bij lokale oogpreparaten en antimicrobiële middelen meerdere bijwerkingen waar zoals irritatie en resistentie. Chirurgisch ingrijpen geeft in vele gevallen niet de resultaten die men verwacht. Het vroegtijdig losscheuren van het derde ooglid na derde ooglidplastie, tot het afstoten van cornea-getransplanteerd weefsel en de moeilijkheidsgraad van de chirurgie worden als meest voorkomende struikelblokken in de literatuur over de chirurgische behandeling van corneadefecten beschreven (Denis, 2004; Wilkie en Whittaker, 1997; Wolfe, 1990). Stamceltherapie zou een waardevolle aanvulling kunnen betekenen in de aanpak van oogulcera. Met behulp van bepaalde technieken zou men uit het perifere bloed bij paarden autologe, pluripotente stamcellen kunnen verkrijgen. Deze stamcellen zijn afkomstig van het individu zelf en worden ook herkend als lichaamseigen. Bovendien kunnen ze differentiëren tot alle mogelijke cellen van het organisme (Donovan en Gearhart, 2001). Na intraveneus en lokaal inbrengen van dergelijke stamcellen, wordt een optimale regeneratie van ooglaesies bereikt. Deze casus behandelt het chronisch probleem van Eros, een ruin van 20 jaar die na drie maanden van verschillende klassieke therapieën nog altijd leed aan een bacteriële ulceratieve keratitis.
2
2. Case studie 2.1. Anamnese Op 19 december 2008 wordt een twintigjarige Italiaanse warmbloed ruin aangeboden met als klacht een zwelling ter hoogte van het onderste linkerooglid. Na twee dagen werd er eveneens uitvloei en irritatie (gesloten oogleden) waargenomen. De bedrijfsdierenarts behandelde het rechter oog lokaal met Colbiocine® (oogdruppels met chloramfenicol, tetracycline en colistine) twee keer per dag gedurende tien dagen en Voltaren Ophta® (oogdruppels met natriumdiclofenac) één keer per dag gedurende drie dagen. Op het einde van de week leek het oog verbeterd te zijn, maar na de stopzetting van de behandeling, werd de oorspronkelijke situatie wederom waargenomen. Een week later gaf de bedrijfsdierenarts opdracht om de therapie te hervatten met hetzelfde resultaat tot gevolg. Drie weken later schreef een tweede dierenarts Tobral® (oogdruppels met tobramycine) en Brunac® (oogdruppels met N-acetylcysteine) drie keer per dag gedurende één week en 10 ml Meflosyl® (IM, flunixine meglumine) gedurende drie dagen voor. Wederom verslechterde de toestand van het paard twee dagen na het stopzetten van de therapie. Drie dagen later kwam de desbetreffende dierenarts terug om een swab (steriel) te nemen van de ulcer waaruit enkel gram negatieve bacteriën (Pseudomonas aeruginosa) geïsoleerd werden. Er werd ook een afkrabsel van de ulcus genomen met de botte zijde van een bistouriemesje en hieruit konden geen schimmels gecultiveerd worden. Na curettage van de ulcer (oppervlakkige debridement met een steriele curette) schreef hij een agressievere medicamenteuze behandeling voor met Voltaren Ofta® twee keer per dag, Tobral® ’s morgens en Genticol® (oogdruppels met gentamycinesulfaat) ’s avonds en Atropina1® (oogdruppels met atropinesulfaat) twee keer de volgende dag en één keer per dag de daaropvolgende dagen gedurende twee weken. Twee weken later stelde de dierenarts vast dat Eros nog steeds geen tekenen van verbetering of herstel vertoonde en stelde voor om het paard naar de kliniek van Campagnano te brengen voor verdere onderzoeken. Na vier dagen werd het paard naar deze kliniek getransporteerd nadat hij drie dagen één keer per dag met Xantervit® (oogzalf met xantopterine, riboflavine (vit. B2), d-α-tocoferol (vit. E)) en Daktarin® (oogzalf met miconazole) behandeld werd. In de desbetreffende kliniek besloot men om het paard twee dagen zonder medicatie te laten om de oorspronkelijke toestand te kunnen evalueren. Daarna werd er een cauterisatie onder algemene anesthesie uitgevoerd door curettage van de opake delen van de ulcus gevolgd door swabben met joodtinctuur (povidone jood, 50%) om heling en vascularisatie te bevorderen. Hierna werd er gedurende één week Ocufen® (oogdruppels met natriumflurbiprofen dihydraat) en Xantervit® drie keer per dag en atropine ’s morgens toegediend. Na het stopzetten van de behandeling werd er wederom een verslechterende situatie vastgesteld waarbij zwelling, tranenvloei en irritatie nogmaals waargenomen werd. Twee weken na het stopzetten van de behandeling werd accupunctuur toegepast zonder resultaat. Een week later besloten de eigenaars om Xantervit® terug toe te dienen tot de ophtalmoloog de dag erna het oog aan nauwere inspectie onderwierp met behulp van een directe ophtalmoscoop (vergrotingscamera) en fluoresceïnetest. Het beschadigde corneaal weefsel nam de fluoresceïne op en na cobalt blauw belichting werd er een corneale epitheelerosie vastgesteld zonder beschadiging van de onderliggende en aanpalende structuren (stroma, membraan van Descemet en
3
endotheel (Van der Velden, 1991)). Er vond een debridement plaats (verwijdering van necrotisch weefsel en celdebris) en het paard werd gemediceerd met Colbiocin® vier keer per dag gedurende die dagen om de kans op iatrogene infectie met Streptococcus equi subspecies zoöepidemicus te reduceren (Carastro, 2004; Keller en Hendrix, 2005). Wegens het uitblijven van positieve resultaten werd besloten om een experimentele stamceltherapie toe te passen. Hiertoe werd bloed uit de vena jugularis gepreleveerd. Uit dit bloed werden stamcellen geïsoleerd die een week later, op 30 maart 2009 systemisch (in de vena jugularis en de oogarterie) als lokaal in het oog ingebracht werden.
2.2. Bijkomende onderzoeken Voor de start van de stamceltherapie werden nog verschillende bijkomende onderzoeken uitgevoerd. De directe pupilreflex werd getest door het paard in een donkere ruimte een helder licht in het oog te schijnen. Deze was positief (subjectieve waarneming) en bevestigde de continuïteit van het visueel traject. Er was dus een grote kans dat het paard nog kon zien (retina en nervus opticus grotendeels intact). Ook werd het contralaterale oog onderzocht. Oogtraumata kunnen namelijk veroorzaakt worden door visuele problemen in het andere oog. Een doolhoftest werd uitgevoerd die aangaf dat de algemene visuele toestand van het paard intact was.
2.3. Waarschijnlijkheidsdiagnose Wegens het niet helen van deze oppervlakkige, geïnfecteerde epitheelerosie van de cornea en het isoleren van Pseudomonas aeruginosa kunnen we stellen dat we te maken hebben met een bacteriële ulceratieve keratitis.
2.4. Behandeling met stamcellen Bij deze patiënt werd 5 ml bloed geaspireerd uit de vena jugularis en gekoeld (7°C) opgestuurd naar het laboratorium van het departement van moleculaire biologie in Tor Vergata (Rome). Het verkrijgen van voldoende autologe, multipotente en pluripotente stamcellen in de juiste verhouding wordt met Fluorescence Activated Cell Sorting uitgevoerd (FACS). Met behulp van flowcytometrie wordt een stamcelmengsel van myeloïde, hematopoëtische en pluripotente stamcellen verkregen in bepaalde verhoudingen. De doelwitcellen worden door middel van fluoresceïne gemerkte antistoffen gemerkt en gescheiden van elkaar. Door laserbestraling wordt een elektrisch veld opgewekt en worden de cellen op basis van hun lading in verschillende recipiënten overgebracht. Na zes dagen kweken, bracht men de cellen systemisch in ter hoogte van de vena jugularis, arteria supraorbitalis en lokaal in het oog. Onderstaande foto’s vertonen het klinisch verloop vanaf het inbrengen van de stamcellen tot 14 weken later.
4
Fig. 1. Op de dag dat de stamcellen ingebracht werden, kon men duidelijke ooguitvloei met het deels sluiten van de oogleden en een wazige opklaring ventrocentraal tot midcentraal waarnemen in het rechter oog. De pijnlijkheid van het letsel was duidelijk te zien.
Fig. 2. Na 2 weken was de ooguitvloei gereduceerd tot verdwenen, de oogleden waren meer geopend en het oppervlak van de opklaring was gelegen tussen ventrocentraal en midcentraal. Het oogprobleem was aan het stabiliseren.
Fig. 3. Na drie weken kon men vaststellen dat de ooguitvloei volledig verdwenen was, de oogleden stonden volledig open en de grootte van de ulcus was nogmaals gereduceerd wat door de uitvergroting zeer goed zichtbaar is.
5
Fig. 4. Na 14 weken na de stamceltherapie was het duidelijk dat de stamcellen de ulcus hadden gereduceerd tot een minimum aan zichtbaarheid en irritatie.
Fig. 5. De algemene toestand van het paard voor de stamceltherapie was door de pijn achteruit gegaan. Fig. 6. Eros heeft niet alleen genoten van het stabiliseren van zijn chronisch oogprobleem, maar verkeert ook in een betere algemene toestand, deels door het verdwijnen van de pijn en deels door de metabole werking van de stamcellen. Zij zoeken per vena de te regenereren gebieden op en brengen het paard in een algemene beter gezondheidstoestand en “state of mind”.
6
3. Discussie Uit het voorafgaande is duidelijk dat een bacteriële ulceratieve keratitis doorgaans moeilijk te behandelen is. De behandeling kan etiologisch, medicamenteus, chirurgisch of met behulp van stamceltherapie. Ten eerste is er de etiologische behandeling die erin bestaat om de oorzaak te zoeken en te verwijderen. Vreemde voorwerpen (grashalm, stro, zaad, steentjes, enz.) wegnemen, decubitus (langdurig neerliggen) aanpakken of entropion corrigeren, behoren onder andere tot deze categorie. Ten tweede kan er medicamenteus ingegrepen worden. Voor pijnbestrijding worden NSAID’s gebruikt, maar zeker geen corticosteroïden bij epitheeldefecten wegens de kans op perforatie en het immunosuppressief effect. Het gebruik van lokale oogdruppels met indomethacine of flurbiprofen (minder interferentie met de heling) of systemisch toediening van flunixine meglumine (IV) wordt het meeste beschreven (Andrews en Willis, 2005). Antimicrobiële middelen met gram negatief spectrum vinden die geen oogirritatie veroorzaken, is een moeilijke opdracht. Aangezien de behandelingen met gentamycine, tobramycine, polymyxine B en chloramfenicol het probleem niet opgelost hebben, zou een antibiogram op zijn plaats zijn met eventueel hogere dosering en langduriger aanhouden van de therapie of veranderen van antibioticumkeuze. Er is bovendien gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa beschreven tegenover fluoroquinolones (Keller en Hendrix, 2005). Naast het gunstig effect van een antibioticumtherapie wordt met atropine bij de meeste oogproblemen een positief effect verkregen omdat het de corneale lamellen doet samenpersen en het overtollige vocht zo laat afvoeren. Het bevordert de relaxatie van de ciliaire spieren in het corpus ciliare wat de pijnlijke spasmen tegengaat. Daarenboven zal de optredende mydriase adhesies tegen de iris tegengaan. Toch moet er zelfs na enkel lokaal gebruik van atropine rekening gehouden worden met gastrointestinale discomfort of ileus. Het verschaffen van paraffine olie per os is dus aangewezen (Andrews en Willis, 2005). Indien er gevaar dreigt op perforeren van de ulcus, is pilocarpine door inwerking op de muscarinereceptor met miosis (pupilvernauwing) en het dalen van de intra-oculaire druk tot gevolg en/of een paracynthese (punctie) aangewezen om de oogdruk te verlagen (Schaer, 2007). Een subpalpebrale blijfkatheter kan aangewezen zijn voor het vergemakkelijken van de dagelijkse lokale toediening op lange termijn. Deze wordt geplaatst met behulp van een 91,44 cm katheter en een 12 gauge trocard (Schaer, 2007). Ten derde kan er chirurgisch ingegrepen worden indien bovenstaande behandelingen niet aanslaan of geen verbetering geven. Onder algemene anesthesie kan men losse randen en necrotisch weefsel wegnemen eventueel in combinatie met cauterisatie door middel van fenol of povidone. Dit werd reeds bij Eros toegepast zonder resultaat.
Een partiële of totale conjunctivoplastie zou wel uitgevoerd
kunnen worden. Na het ondermijnen van de bulbaire conjunctiva, wordt deze gedeeltelijk of volledig vastgehecht aan de cornea. Deze techniek is omslachtiger, maar geeft betere resultaten door sterkere bloedvateningroei (Denis, 2004). Derde ooglidplastie kan ook toegepast worden. Na het scarificeren van het derde ooglid, wordt deze ofwel vastgehecht aan het ooglid van de laterale ooghoek wat nog beweging van de oogbol ten opzichte van het derde ooglid toestaat, ofwel aan de bulbaire conjunctiva wat beweging van de oogbol tegengaat. Nadelen van deze therapie zijn het vroegtijdig doorscheuren door spiertractie, het verhinderen van de absorptie van topicale medicatie, het omsluiten van
7
infectieuze organismen en necrotisch weefsel en het verhinderen van evaluatie van de cornea. Deze relatief eenvoudige techniek is enkel aangewezen indien ze toegepast wordt secundam artem (steriel en na debridement) (Wilkie en Whittaker, 1997). Ook conjunctivale grafts kunnen aangebracht worden na keratectomie. Bij deze techniek wordt necrotisch, geïnfecteerd weefsel verwijderd en ondermijnt men een onderdeel van de intacte dorsolaterale bulbaire conjunctiva dat over het defect geroteerd en vastgehecht wordt (Wolfe, 1990). Er wordt ook beschreven dat het defect met een speciale gel gelijmd kan worden of dat er zachte contactlenzen ingebracht kunnen worden die commercieel beschikbaar zijn. Met deze producten moet met een grote voorzichtigheid omgesprongen worden omdat ze het ontstaan van ulcers kunnen bewerkstelligen of de ulcer kunnen verergeren door teveel bewegingsvrijheid. In de humane geneeskunde zijn er zelfs verschillende gevallen beschreven waaruit Pseudomonas aeruginosa uit ulcers geïsoleerd werd na gebruik van contactlenzen (Delgado et al., 2008; Hsiao et al., 2004). Als laatste redmiddel kan een lamellaire keratoplastie aangewend worden waarbij men op een thermische wijze multipele puncties tot in het stroma maakt. Deze omslachtige techniek kan in combinatie met een gedeeltelijke corneatransplantatie (met de cornea van een ander individu) uitgevoerd worden, maar hierbij is er kans op histo-incompatibiliteit met afstoting van de heterologe weefsels als gevolg (Denis, 2004). Temporaire tarsorrhaphy is het tijdelijk tegen elkaar hechten van de oogleden met behulp van een horizontale matrashechting doorheen beide oogleden om heling te bevorderen en schadelijke invloeden te weren. Dit wordt meestal uitgevoerd na een van bovenstaande chirurgische ingrepen (Denis, 2004). Ten vierde is er de stamceltherapie. Stamcellen kunnen door hun vermogen tot “homing” of migreren naar de plaats van het letsel lokaal bijdragen tot regeneratie van het weefsel. Tot op heden zijn er nog geen tumorale ontaardingen beschreven door het gebruik van adulte stamcellen uit het bloed, beenmerg of vet bij paarden (Smith, 2008). Bij andere diersoorten daarentegen is dit wel al beschreven na het gebruik van embryonale en foetale stamcellen (Patrizia et al., 2006). In vergelijking met chirurgische ingrepen kan men stellen dat stamceltherapie zeer eenvoudig, diervriendelijk en niet invasief is, aangezien de handelingen enkel bestaan uit het preleveren vanuit de vena jugularis, het toedienen per vena en arteria en het lokaal inbrengen. In het geval van de resistente oogulcer kan men zich afvragen of dit paard ook genezen zou zijn zonder de stamceltherapie. Omdat een controlegroep ontbreekt kan dit niet uitgesloten worden. Wat we wel kunnen stellen is dat de patiënt na verschillende maanden met verschillende therapieën door verschillende dierenartsen geen langdurige verbetering getoond heeft. Bovendien is het al een zeldzaamheid dat zulke ulcera spontaan zouden verdwijnen. Het grootste probleem met stamceltherapie is dat de werking nog niet ten volle beschreven en uitgediept is. Men is er wel al achter dat stamcellen regenererend werken (Grovace et al., 2007; Schanbel et al., 2008). Afhankelijk van het type stamcel kunnen ze gedifferentieerd worden tot de verschillende doelweefsels (Donovan en Gearhart, 2001). Zo beschrijft men al tenogenese (Smith, 2008), myogenese (Péault et al., 2007), chondrogenese (Hegewald en Ringe, 2004; Whiley en Nydam, 2007), osteogenese (Vidal en Kilroy, 2006) en neurogenese (Moviglia en Varela, 2006; Hu en Zhu, 2007). De behandeling van oogletsels met stamcellen wordt reeds met succes toegepast (omschakeling van conjunctivaal naar corneaal fenotype na inbrengen van conjunctivale stamcellen op corneaal weefsel) in verschillende landen over heel de wereld (VSA, GB,
8
Australië, Italië,…), bij verschillende diersoorten: ratten, muizen, konijnen, paarden en mensen (Girolamo, 2009; Koizumi, 2007; Shimazaki, 2002; Ueno, 2007). De geloofwaardigheid van stamceltherapie wordt nog veel in vraag getrokken wegens het ontbreken van controlegroepen, placebo gecontroleerde patiënten en dubbel geblindeerde onderzoekers. Deze gebreken kunnen worden tegengegaan door het gebruik van proefdiermodellen waarvan de proeven in drie fazen doorlopen moeten worden. Ten eerste moet de veiligheid op een uniforme wijze getest worden. Ten tweede dient het effect van de stamcellen nauwgezet opgevolgd te worden. Indien beide positieve resultaten vertonen, kan worden overgegaan tot een grote klinische proef. Alleen op deze manier zal de potentie van stamceltherapie op een objectieve manier geïnterpreteerd kunnen worden.
9
4. Literatuurlijst 1] Andrews S. E., Willis A. M., 2005, Diseases of the cornea and sclera, Elsevier Saunders, Equine Ophtalmology St. Louis (MO), p. 157-251. 2] Carastro S. M., 2004, Equine ocular anatomy and ophthalmic examination, Veterinary Clinic of Equines, 20, 285-299. 3] Crovace A., Lacitignola L., De siena R., Rossi G., Francioso E., 2007, Cell therapy for tendon repair in horses: an experimental study, Veterinary Research Communications, 31(1), 281-283. 4] Delgado C. E., Durán O. P., Neira S. O., Veloza G. C., 2008, Pseudomonas aeruginosa keratitis associated with the use of last generation contact lens made of silicone hydrogel: case report, Review Chilena Infectology, 25(4), 295-300. 5] Denis H. M., 2004, Equine corneal surgery and transplantation, Veterinary Clinic of Northern American Equine Practice, 20(2), 361-380. 6] Donovan P. J., Gearhart J., 2001, The end of the beginning for pluripotent stem cells, Nature, 414(6859), 92-97. 7] Garcia C. R., Rivero E. M., Bartsch D. U. Ishiko S., Takamiya A., Fukui K., Hirokawa H., Freeman W., 1999, Oral fluorescein angiography with the confocal scanning laser ophtalmoscope, Ophtalmology, 106(6), 1114-1118. 8] Girolamo D., 2009, Eye stem cells provide treatment for corneal disease, Genetics and Stem Cells News, 1(1), 1-3. 9] Hegewald A. A., Ringe J., Bartel J., Kruger I., Notter M., Barneurtz D., Kaps C., Sittinger M., 2004, Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study, Tissue Cell, 36(6), 431-8. 10] Hsiao C. H., Yeh L. K., Chao A. N., Chen Y. F., Lin K. K., 2004, Pseudomonas aeruginosa corneal ulcer related to overnight orthokeratology, Chang Gung Medical Journal., 27(3), 182-7. 11] Hu J., Zhu Q. T., Liu X. L., Xu Y. B., Zhu J. K., 2007, Repair of extended peripheral nerve lesions in rhesus monkeys using acellular allogenic nerve grafts implanted with autologous mesenchymal stem cells, Experimental Neurology, 204(2), 658-66. 12] Keller R. L., Hendrix D. V. H., 2005, Bacterial isolates and antimicrobial susceptibilities in equine bacterial ulcerative keratitis, Equine Veterinary Journal, 37(3), 207-211. 13] Koizumi N., Inatomi T., Quantock A. J., Fullwood N. J., Dota A., Kinoshita S., 2007, Amniotic Membrane as a Substrate for Cultivating Limbal Corneal Epithelial Cells for Autologous Transplantation in Rabbits, Journal of Cornea and external disease, 19(1): 65-71. 14] Moviglia G. A., Varela G., Gaeta C. A., Brizuela J. A., Bastos F., Saslavsky J., 2006, Autoreactive T cells induce in vitro bone marrow mesenchymal stem cell transdifferentiation to neural stem cells, Cytotherapy, 8(3), 196-201. 15] Patrizia T., Dwain I., Gentao L., Xiangpeng Y., Zeng Z., Hiushan N., John S. Y, 2006, Brain Tumor Stem Cells: New Targets for Clinical Treatments?, Neurosurgical Focus, 20(4): E27. 16] Péault B., Rudnicki M., Torrente Y., Cossu G., Tremblay J. P., Partridge T., Gussoni E., Kunkel L. M., Huard J., 2007, Stem and progenitor cells in skeletal muscle developement, maintenance and therapy, Molecular therapy, 15(5), 867-77.
10
17] Ranalli M., Sinibaldi Salimei P., Polettini M., 2008, A new method expansion and purification of blood stem cells : therapeutic applications in veterinary field, Medicine Sperimentale e Science Biochimiche, 5, 1-3. 18] Schaer B. D., 2007, Ophtalmic emergencies in horses, Veterinary Clinic of Northern American Equine Practice, 23(1), 49-65. 19] Schnabel L. V., Mohammed H. O., Jacobson M. S., Fortier L. A., 2008, Effects of PRP and acellular bone marrow on gene expression patterns and DNA content of equine suspensory ligament explant cultures, 40(3), 260-265. 20] Shimazaki J., Shimmura S., Tsubota K., 2002, Limbal Stem Cell Transplantation for the Treatment of Subepithelial Amyloidosis of the Cornea (Gelatinous Drop-like Dystrophy, ) Journal of Cornea and external disease, 21(2): 177-180. 21] Smith R. K. W., 2008, Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy, Disability and Rehabilitation,1, 1-7. 22] Ueno H., Kurokawa M. S., Kayama M., Homma R., Kumagai Y., Masuda C., Takada E., Tsubota K., Ueno S., Suzuki N., 2007, Experimental Transplantation of Corneal Epithelium-like Cells Induced by Pax6 Gene Transfection of Mouse Embryonic Stem Cells, Journal of Cornea and external disease, 26(10): 1220-1227. 23] Vidal M. A., Kilroy G. E., Johnson J. R., Lopez M. J., Moore R. M., Gimble J. M. 2006, Cell growth characteristics and differentiation frequency of adherent equine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: adypogenic and osteogenic capacity, Veterinary surgery, 35(7), 601-610. 24] Whiley J., Nydam D. V., Nixon A. J., 2007, Enhanced early chondrogenesis in articular defects following arthroscopic mesenchymal stem cells implantation in an equine model, Journal of orthopedic research, 25(7), 913-925. 25] Wilkie D. A., Whittaker C., 1997, Surgery of the cornea, Veterinary Clinic of Northern American Small Animal Practice, 27(5), 1067-1070. 26] Wolfe E. D., 1990, Conjunctival pedicle graft treatement for equine corneal ulcers, Proceedings of the 36th Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, p. 585-587.
11
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2009 – 2010
Stamceltherapie ter behandeling van een tendinitis van de midregio van de musculus interosseus medius bij een paard
Door
Jan SPAAS
Promotor: prof. dr. Ann Van Soom
Studieproject in het kader van de Masterproef
Medepromotors: DVM Frank Van Hoeck en DVM Marco Polettini
INHOUDSOPGAVE Samenvatting....................................................................................................... p. 1 1. Inleiding.......................................................................................................... p. 2 2. Casuïstiek....................................................................................................... p. 3 2.1. Anamnese .................................................................................................. p. 3 2.2. Diagnose .................................................................................................... p. 3 2.3. Stamceltherapie.......................................................................................... p. 4 2.3.1. Type van de stamcellen .................................................................. p. 4 2.3.2. Aspiratie en transport van de stamcellen ........................................ p. 6 2.3.3. Isolatie, multiplificatie en kwantificatie van de stamcellen ............... p. 6 2.3.4. Re-implantatie en werking van de stamcellen ................................. p. 7 2.4. Evolutie van het letsel................................................................................... p. 9 3. Discussie........................................................................................................ p. 11 4. Woord van dank............................................................................................. p. 14 5. Literatuurlijst.................................................................................................. p. 15
De auteur geeft de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor. Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
Samenvatting Deze casuïstiek handelt over een warmbloedmerrie die leed aan een tendinitis van het middelste derde van de musculus interosseus medius (MIM). Omdat de merrie op topsport niveau presteerde, had de eigenaar voor een kostelijke stamceltherapie geopteerd. De stamcellen werden geaspireerd uit de vena jugularis van de merrie en onder speciale condities naar een laboratorium in Italië getransporteerd. Daarna centrifugeerde men het bloedstaal om de ongekernde (rode) bloedcellen te scheiden van de overige, gekernde cellen. Vervolgens selecteerde men de stamcellen met behulp van Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Het verkregen stamcelmengsel verstuurde men hierna terug naar de patiënt. Ten slotte werden de stamcellen opnieuw geïnjecteerd in de patiënt. Deze werden zowel intraveneus als intralesionaal onder echobegeleiding ingebracht. Deze waardevolle merrie (waarvan reeds verschillende embryotransplantatieveulens geboren werden) volgde men vervolgens van nabij op. Men stelde vast dat het letsel een opmerkelijk gunstige evolutie vertoonde. De discussie handelt voornamelijk over de verschillende stamceltherapieën die mogelijk zijn bij dit soort pathologie. Mesenchymale stamcellen die afkomstig zijn van bloed, beenmerg en vet zouden allemaal gebruikt kunnen worden voor de behandeling van peesletsels, aangezien ze kunnen differentiëren tot fibroblasten die in staat zijn om tenocyten te vormen en de naburige cellen zouden kunnen aanzetten tot verhoogde matrixproductie en zo regeneratie van het letsel.
1. Inleiding Stamceltherapie ter behandeling van peesblessures is een “hot topic” zowel in de humane geneeskunde als in de diergeneeskunde. Mesenchymale stamcellen afkomstig van het beenmerg werden reeds in verschillende studies gebruikt ter behandeling van een tendinopathie (Smith, 2006; Smith, 2008; Smith et al., 2003; Violini et al., 2009). Er zijn indicaties dat voor elke 10 000 cellen in het beenmerg één stamcel aanwezig is (Kassis et al., 2006). Het beenmerg is immers een bloedvormend orgaan en er wordt continu aan hematopoëse gedaan. Daarenboven werden vet, lever, navelstrengbloed en foetale pancreas reeds beschreven als bron van mesenchymale stamcellen (Campagnoli et al., 2001; Erices et al., 2000; Hu et al., 2003; Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). Een andere manier om stamcellen te verkrijgen, is het bewerken van het perifere bloed. In het bloed is, in tegenstelling tot het beenmerg, slechts één cel op 100 000 een stamcel, wat logisch is aangezien bloed een “afgewerkt product” is (Lin et al., 2001). De stamcellen die in deze casuïstiek besproken worden, zijn uit het bloed verkregen, autoloog en voornamelijk multipotent (Kassis et al., 2006). Deze stamcellen zijn cellen afkomstig van het individu zelf (autoloog) en kunnen aan zelfvernieuwing doen en tenminste één gedifferentieerd celtype vormen door asymmetrische deling (multipotent; Donovan en Gearhart, 2001). Pluripotente stamcellen zouden ook uit het perifere bloed geïsoleerd kunnen worden (Zvaifler et al., 2000). Aangezien ze kunnen differentiëren tot alle mogelijke cellen van het organisme, vormt dit een nieuwe en waardevolle bron van stamcellen. Pluripotente stamcellen kunnen namelijk alle celtypes van de drie kiemlagen van een embryo vormen, met name endoderm, mesoderm en ectoderm (Donovan en Gearhart, 2001). Hun aanwezigheid werd enkele jaren geleden reeds in het beenmerg aangetoond (Jiang et al., 2002). De multipotente stamcellen daarentegen kunnen niet meer tot alle mogelijke celtypes differentiëren, maar slechts tot één of enkele. Ze zijn voornamelijk geprogrammeerd om gespecialiseerde weefsels te vormen waarin ze zich bevinden (Donovan en Gearhart, 2001).
2
2. Casuïstiek 2.1. Anamnese Roletta is een 13 jarige merrie die tot het stamboek van de Koninklijke Warmbloed Paarden in Nederland (KWPN) behoort. Deze merrie wordt op internationaal niveau in de showjumping ingezet. Op 19 augustus werd Roletta aan de dierenarts aangeboden met een duidelijke zwelling ter hoogte van het palmarolaterale aspect van de midregio van het pijpbeen van het rechter voorbeen.
2.2. Diagnose De merrie vertoonde sterk verhoogde gevoeligheid bij palpatie van de zwelling. Er werd een lichte kreupelheid op het rechter voorbeen vastgesteld op rechte lijn. Het manken verergerde op de linker volte op zachte bodem, waar het aangetaste been zich aan de buitenzijde van de cirkel bevond. Hierna besloot men om een echografisch onderzoek uit te voeren omdat de klinische symptomen een interosseusletsel deden vermoeden. Deze werd uitgevoerd ter hoogte van de gezwollen regio. Men stelde een perifere hypoechogene zone vast (omcirkeld op onze linkerzijde van het echografisch beeld) met heterogeniciteit ter hoogte van de musculus interosseus medius (MIM) na echografie met een transversale positie van de sonde op het middelste derde van het pijpbeen. Dit leidde tot de bevestiging van het vermoeden van een tendinitis van de MIM.
Fig. 1. Echografische opname van het middelste derde van de musculus interosseus medius met een transversale positie van de sonde. Andere structuren op dit echobeeld zijn een bloedvat (BV) dat centraal te zien is en het distale check ligament (DCL) met de diepe (DB) en de oppervlakkige (OB) buigpees rechts in beeld.
3
2.3. Stamceltherapie 2.3.1. Type stamcellen De stamcellen die in deze casuïstiek aan bod komen, zijn afkomstig van het perifere bloed en kunnen behoren tot de hematopoëtische stamcellijn (multipotent), de mesenchymale cellijn of cellen met zogenaamde pluripotente stamcelreceptors. Deze laatste vindt men voornamelijk in de Inner Cell Mass (ICM) van een blastocyst en werden enkele jaren geleden ook in het beenmerg teruggevonden (Jiang et al., 2002). Hun pluripotentie werd door de Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) reeds grotendeels bevestigd door het aantonen van de pluripotentiemarkers Sox2, Oct4 en NANOG3-6 naar analogie met verschillende humane embryo- en stamcelonderzoeken (Chan et al., 2009; Chen en Khillan, 2010; Ranalli et al., 2008; Sun et al., 2009; Violini et al., 2009; tabel 1). In de literatuur werden er tot op heden veel verschillende receptoren beschreven ter identificatie van hematopoëtische, mesenchymale en pluripotente stamcellen. Enerzijds zijn er de receptoren die aanwezig moeten zijn op het celoppervlak (Tabel 1). Anderzijds zijn er bepaalde receptoren die afwezig moeten zijn om gedifferentieerde cellen uit te sluiten (Tabel 1). Verschillende onderzoeken werden op de detectie van deze receptoren gebaseerd (Jaroca et al., 2009; Kern et al., 2006; Koerner et al., 2006).
Fig. 2. Verschillende weefsels waarin stamcellen kunnen differentiëren (Mezey et al., 2000).
4
Tabel 1. Stamcellen (SC’n) worden geïdentificeerd door aan- (+) of afwezigheid (-) van bepaalde markers naar analogie met humaan onderzoek. Markers
Hematopoëtische SC’n
Mesenchymale SC’n
Pluripotente SC’n
Tenocyten
CD 4
-
-
-
-
CD 8
-
-
-
-
CD 11b
-
-
-
-
CD 13
-
-
-
+
CD 14
+
-
-
-
CD 18
-
-
-
-
CD 25
-
-
-
-
CD 29
-
+
-
-
CD 31
-
-
-
-
CD 34
+
-
-
+
CD 38
-
-
-
-
CD 41
+
-
-
-
CD 44
-
+
-
-
CD 45
+
-
-
-
CD 50
-
+
-
-
CD 61
+
-
-
-
CD 71
-
+
-
-
CD 73
-
+
-
+
CD 90
-
+
-
-
CD 105
-
+
-
-
CD 106
-
+
-
-
CD 115
-
-
-
-
CD 133
(+)
-
-
-
CD 146
-
+
-
-
CD 166
-
+
-
-
CD 271
-
+
-
-
HLA-1
-
+
-
-
SOX2
-
-
+
-
NANOG
-
-
+
-
Oct4
-
-
+
-
SSEA-4
-
-
+
-
TRA1-60
-
-
+
-
Fbx15
-
-
+
-
GDF3
-
-
+
-
hTERT
-
-
+
-
REX1
-
-
+
-
DNMT3B
-
-
+
-
c-Myc
-
-
+
-
Klf4
-
-
+
-
r5a2
-
-
+
-
Dax1
-
-
-
-
P19 lipocalcin
-
-
-
+
Decorin
-
-
-
+
Tenomodulin
-
-
-
+
Referenties
Bartling et al., 2010; Chan et al., 2009; Chen en Khillan., 2010; Heng et al., 2010; Jackson et al., 2009; Jaroca et al., 2009; Kern et al., 2006; Koerner et al., 2006; Mitjavila-Garcia et al., 2002; Riordan et al., 2009; Sokolov et al., 2008; Sun et al., 2009; Tanaka, 2010; Violini et al., 2009; Wexler et al., 2002
5
2.3.2. Aspiratie en transport van de stamcellen Met behulp van een steriele 5 ml spuit en 21 Gauche (G) naald wordt uit de vena jugularis 5 ml bloed geaspireerd. Deze hoeveelheid wordt getransporteerd bij 7°C in een bloedbuisje gecoat met onder andere heparine om te verhinderen dat het bloed gaat stollen.
2.3.3. Isolatie, multiplificatie en kwantificatie van de stamcellen In het laboratorium (van de universiteit van Tor Vergata, Rome) wordt het bloedstaal onderworpen aan densiteits gradiënt centrifugatie. Dit proces vindt plaats aan een snelheid van 1500 tot 2000 g gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Hierna bekomt men gescheiden fracties. Het plasma bevindt zich bovenaan, een buffy coat en een vastere fractie ziet men onderaan. Het plasma bestaat uit serum (90% water en 10% opgeloste stof) en fibrinogeen. De buffy coat bestaat uit de gewenste
witte
bloedcellen
en
bloedplaatjes. De vastere fractie bevat de overgebleven rode bloedcellen. Het plasma wordt
geaspireerd
en
verwijderd.
Nu
kunnen de gekernde witte bloedcellen gescheiden worden van de ongekernde (rode) bloedcellen die zich op een lager niveau bevinden. Deze gekernde cellen worden gelabeld met fluoresceïne gemerkte antistoffen die gericht zijn naar de gewenste markers (zie tabel 1). Vervolgens worden via FACS de gemerkte gekernde cellen onder druk aan een hoge snelheid in een kleine opening gezogen om ze daarna één per één via een vibrerend mechanisme in een druppel te brengen. Daarna passeren de druppels (met maximum één cel per druppel) minuscule kamertjes waar de aanof afwezigheid van fluorescentie per cel bepaald wordt. Dit wordt bekomen met behulp van 4 lasers van verschillende golflengte (354 nm, 488 nm, 544 nm, 635 nm). Deze laserstralen dienen als excitatielicht. Indien er fluoresceïne gemerkte antistoffen op het celoppervlak aanwezig zijn, zal de cel geëxciteerd worden waarna ze energie verliest onder de vorm van warmte en emissielicht. Hierdoor valt het energieniveau terug, gepaard gaande met uitzending van licht met een bepaalde golflengte. Een detector vangt het emissielicht op en genereert een elektrische lading. De positief geladen druppels (met gemerkte antistoffen die aan de stamcellen gebonden zijn) zullen naar de negatieve pool bewegen. Uiteindelijk verkrijgt men drie verzamelbuisjes
6
met positief, negatief of niet geladen druppels erin. Op die manier bekomt men een steriele sortering van specifieke zoogdiercellen gebaseerd op verschillende markers (tabel 1).
2.3.4. Re-implantatie en werking van de stamcellen Met behulp van steriele flacons wordt het vloeibare, doorschijnende stamcellenmengsel terug naar het land van herkomst getransporteerd binnen de 72u. Indien de stamcellen zich langer dan 72u in hetzelfde recipiënt bevinden, zullen er te hoge aantallen aanwezig zijn die ongewenste transformatie en celdestructie induceren door overvloedig celcontact (morfologische veranderingen en celdebris vorming). De stamcellen worden daarna uit de flacons geaspireerd met steriele naald (20 G, 70 mm) en spuit (10 ml) en worden opgewarmd tot lichaamstemperatuur. Tenslotte worden ze terug ingebracht in het desbetreffende paard via lokale en algemene toediening. Bij Roletta werd dit onder echografische begeleiding uitgevoerd drie weken na het ontstaan van de tendinitis. Figuur 4 toont aan op welke plaatsen de sonde gehouden moest worden om de musculus interosseus medius (MIM) duidelijk in beeld te krijgen. Deze bevindt zich namelijk meer dorsaal (dichter gelegen tegen het periost van de pijp) van het distale check ligament (DCL), de diepe (DB) en de oppervlakkige buigpees (OB, meest naar palmair of oppervlakkiger gelegen).
7
Er werd na drie weken (op de dag van de stamcelinjectie) nog steeds dezelfde perifere hypoechogeniciteit (omcirkelde zones aan onze linkerzijde van het onderstaand beeld) en algemene heterogeniciteit van het middelste aspect van de musculus interosseus medius (of interosseus) waargenomen. De hypoechogene zones ter hoogte van het distale check ligament, de diepe en de oppervlakkige buigpees (rechts in beeld) zijn artefacten. Wegens de loodrechte positie van de sonde op de interosseus verloopt de stralengang niet altijd optimaal om de andere pezen goed in beeld te krijgen.
Fig. 5. Transversale echografie van het middelste deel van de interosseus op het tijdstip van de stamcelinjectie. De letsels zijn nog steeds aanwezig (omcirkeld).
8
2.4. Evolutie van het letsel Vijf weken na de stamceltherapie werd er een opvullen van het letsel waargenomen. De interosseus vertoonde terug een hyperechogeniciteit over de volledige doorsnede van het middelste aspect. Toch vertoonde deze nog beperkte heterogeniciteit over het volledige oppervlak. Wederom zijn de hypoechogene zones ter hoogte van het bloedvat, het distale check ligament en de diepe buigpees artefacten wegens de schuine positie van de sonde om de interosseus goed in beeld te krijgen. De oppervlakkige buigpees is niet zichtbaar op het onderstaande beeld.
Fig. 6. Transversale opname van het middelste aspect van de musculus interosseus medius vijf weken na het inbrengen van de stamcellen.
Roletta mocht gedurende negen weken (aan de hand en onder de man) enkel stapoefeningen verrichten. Hierna heeft de dierenarts een volledige reductie van de zwelling waargenomen waardoor het griffelbeenknopje weer duidelijk te voelen was. Eveneens was de merrie niet meer mank ter hoogte van het rechter voorbeen op rechte lijn als op de linker volte op zachte bodem (met het geblesseerde been aan de buitenzijde van de cirkel).
9
Ten slotte werd er een echografie uitgevoerd (negen weken na de stamceltherapie) waarop men kon waarnemen dat de midregio van de beschadigde musculus interosseus medius terug zijn oorspronkelijke vorm had aangenomen wat zeer opmerkelijk is op zo een korte tijd na de blessure (figuur 7). Het paard was hierna met drafreprises gestart. Verder kende de revalidatie van 6 maanden een positief verloop. Nu springt de merrie terug op internationaal niveau met dezelfde elasticiteit en kracht dan voordien.
Fig. 7. Transversale opname van het middelste aspect van de interosseus negen weken na de stamcelinjectie.
Fig. 8. Roletta op een internationale wedstrijd na de stamceltherapie.
10
3. Discussie Over heel de wereld bestaat er veel discussie in de literatuur over de veiligheid en efficiëntie van stamceltherapie. Voornamelijk peesblessures worden hiermee intralesionaal behandeld. De vergelijking met beenmergstamcellen ter behandeling van een gelijkaardige aandoening, namelijk een desmitis van het proximale aspect van de musculus interosseus medius bij een zes jarige hengst, gaf minder goede resultaten. Op onderstaande dwarse en overlangse echografische opnames kan men de oppervlakkige (OB) en diepe buigpees (DB), het distale check ligament (DCL) en de musculus interosseus medius (MIM) waarnemen. De hypoechogene zones in de interosseus tonen het letsel aan (omcirkeld op onderstaande beelden).
Fig. 9. Transversale en longitudinale opname van de interosseus op de dag van de injectie met de beenmergstamcellen.
Fig. 10. Transversale en longitudinale opname van de interosseus 36 weken na het inbrengen van de beenmergstamcellen. Op dezelfde plaats waar de hypoechogene zones in beeld gebracht werden op de dag van de stamcelinjectie, stelde men na deze periode nog heterogeniciteit vast (omcirkeld).
11
Deze beelden tonen aan dat het herstel niet werd verbeterd, noch werd versneld (geen hyperechogeen peesweefsel ter hoogte van de lesie) bij de hengst na het intralesionaal injecteren van beenmergstamcellen. Dit in vergelijking met conservatieve therapieën waar men vastgesteld heeft dat het defect ook grotendeels was opgevuld met een heterogeen peesweefsel na 36 weken (Smith et al., 2003). Stamcellen uit het beenmerg verkregen, bestaan enkel uit hematopoëtische stamcellen, stromacellen (mesenchymale stamcellen (MSC’n)) en adulte multipotente progenitorcellen (Smiler en Soltan, 2006). Stamcellen verkregen uit vetweefsels, bestaan dan weer enkel uit MSC’n (Richardson et al., 2007). Bovendien
bevatten
vetcellen
TNF-α
dat
als
pro-inflammatoir
cytokine
ongewenste
ontstekingsreacties kan veroorzaken (Fitzgerald, 2004; Jones, 2004). Indien men de laatstgenoemde cellen in combinatie met een Niet Steroïdaal Anti-Inflammatoir middel (NSAID) gebruikt, zou dit minder ongewenste effecten geven. Deze manier van werken is echter tegenaangewezen omdat de afwezigheid van deze cytokines in de stamcellen uit vetweefsel tot op heden nog niet werd aangetoond en er daarom zowel een risico bestaat op neveneffecten van de vetstamcellen (door proinflammatoire cytokines) als van de NSAID’s met meer schade dan herstel tot gevolg. Niet alleen het ontstaan van maagulcera en rechter dorsale colitis, maar ook hypoproteïnemie en hypoalbuminemie werden beschreven als ongewenste effecten na het toedienen van NSAID’s (Andrews et al., 2009; Braim et al., 2008; Chapman et al., 2009; Reed et al., 2006). Stamcellen uit het perifeer bloed daarentegen inhiberen pro-inflammatoire cytokines, namelijk Interleukine-1 (Il-1) en Tumor Necrosis Factor-alfa (TNF-α; Polettini en Gambacurta, 2009). Dit zorgt ervoor dat een overmatige, schadelijke ontstekingsreactie tegengegaan wordt in het initiële stadium. Via de bloedbaan kunnen de stamcellen eveneens andere inwendige structuren van de pees bereiken en deze “slapende omgevingscellen” activeren. Bij de desbetreffende merrie werd er wel een versneld herstel gezien. We zagen reeds na vijf weken dat de musculus interosseus medius terug zijn oorspronkelijke structuur had aangenomen. In vergelijking met de hengst die met beenmergstamcellen behandeld werd, is dit enorm snel. Na 24u werden er geen hogere gehaltes van stamcellen in het bloed waargenomen dan voordien. Dit toonde aan dat de stamcellen die per vena ingebracht werden uit de bloedbaan verdwijnen. Hieruit kon men stellen dat deze ofwel naar de omgevende weefsels diffunderen ofwel in apoptose gaan (Polettini en Gambacurta, 2009). Ter hoogte van de weefsels zouden de stamcellen delen tot ze de randen van het intacte weefsel raken en er differentiëren tot de oorspronkelijke celtypes (Lucy et al., 2007; Smith, 2006). Door de daling in telomeerlengte verliezen de stamcellen hun “onsterfelijk karakter”. Een voldoende telomeerlengte is van belang om waardevol DNA tijdens de celdelingen te beschermen en ook voor de stabiliteit van de chromosomen. De expressie van het telomerase (gespecialiseerd reverse transcriptase, TERT) dat een specifieke RNA molecule als template gebruikt, namelijk TERC (om het 3’ uiteinde terug te verlengen na iedere celdeling), wordt nauwgezet geregeld. De expressie wordt gestimuleerd door c-Myc en oestrogeen en geïnhibeerd door Rb en p21. In de meeste stamcellen kon men vaststellen dat hun telomerase en RNA templates verminderen naarmate ze differentiëren door omgevende weefselinvloeden. Indien ze dit niet doen, kunnen ze tumoraal ontaarden (Calado, 2009; Ferrón et al., 2009).
12
In de behandeling van tendinopathieën stelde men vast dat er een toegenomen genexpressie van anabole elementen plaatsvindt na het inbrengen van mesenchymale stamcellen. Met behulp van kwantitatieve Polymerase Ketting Reactie (PCR) kon aangetoond worden dat er een verhoogde genexpressie plaatsvindt van Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP, weerstand tegen belasting; Smith et al., 1997), Collageen type 1A1 (COL1A1, functionaliteit, trekvastheid en elasticiteit van de pees bepalend), Collageen type 3A1 (COL3A1, rigiditeit van de pees bepalend) en COL1A1/COL3A1 verhouding (elasticiteit > rigiditeit, zoals een oorspronkelijke, 100% functionele pees; Schnabel et al., 2008). Daarentegen werd er geen effect op katabole cytokines, zoals Matrix Metallo Proteïnasen drie en dertien (MMP 3 en 13) waargenomen (Schnabel et al., 2008). Deze bevindingen wijzen op het regeneratieve vermogen van stamcellen. De gegevens hieromtrent zijn veelbelovend, maar nog deels tegenstrijdig. Vindt er al dan niet een restitutio ad integrum plaats? Vindt er met andere woorden een terugkeer naar de oorspronkelijke, fysiologische toestand van de weefsels plaats? In de vorige studie bestond hier geen twijfel over. Een andere studie daarentegen toonde aan dat er voornamelijk een verhoogde genexpressie van collageen type 3 (reparatie met verhoogde weerstand op trekkracht) was na inbrengen van stamcellen in de rechte patellaband van konijnen (Juncosa et el., 2006a), terwijl er door dezelfde onderzoeksgroep minder structurele veranderingen werden waargenomen bij proeven met stamcellen na inbrengen in de achillespees (Juncosa et al., 2006b). Uit de meeste studies uitgevoerd op paarden kon men wel stellen dat zowel de genexpressie van collageen type 1 als type 3 in verhoogde mate wordt waargenomen na het gebruik van stamceltherapie. Bovendien waren de meeste onderzoekers het er over eens dat er meer hyperechogeniciteit van het peesweefsel in kortere tijd (versneld herstel) kon vastgesteld worden met behulp van echografie (Richardson et al., 2007; Smith et al., 2003; Smith, 2006; Smith, 2008). Men zag bij deze patiënten slechts 18% hervallen na gebruik van stamceltherapie in vergelijking met 38% na conservatieve therapieën (Crovace et al., 2007; Lucy et al., 2007). In een studie naar de prognose van een desmopathie van de musculus interosseus medius werd er waargenomen dat 84% van de paarden terug naar het niveau van voordien konden terugkeren zonder te hervallen. Na conservatieve therapie echter stelde men vast dat er slechts 15% terugkeerde naar dezelfde toestand dan voorheen (Smith et al., 2003). Wel moet in acht genomen worden dat interosseusletsels aan een voorbeen (zoals hier het geval was) een betere prognose kennen dan aan een achterbeen (Dyson et al., 2004). Bij rupturen van de oppervlakkige buigpees vond men een terugkeer van 56% van de paarden tot het oorspronkelijk niveau na gebruik van stamcellen, in vergelijking met 18% na conservatieve therapie (Smith, 2008). Er werd niet alleen regeneratie van pezen, maar ook van aanpalende spieren, en zenuwen die voor de innervatie zorgen, beschreven na het gebruik van stamceltherapie (Hu et al., 2007; Moviglia et al., 2006; Péault et al., 2007). Bovendien werd er na de intraveneuze toediening van de stamcellen een cascadereactie op verschillende stelsels waargenomen (immuun- , zenuw- en endocrienstelsel; Morshead en Van der Kooy, 2001; Osawa et al., 1996). Dit zou een nieuwe therapeutische doorbraak in metabole aandoeningen kunnen betekenen aangezien deze cellen per vena de beschadigde inwendige structuren en organen kunnen bereiken. Om tot zulke ontwikkelingen te komen, zou het “homing effect” van de stamcellen verder bestudeerd moeten worden opdat de cellen voorgeprogrammeerd zouden kunnen worden en hun weg naar het juiste orgaan nog doeltreffender zouden vinden.
13
Het blijft de vraag of het nu de differentiatie van stamcellen tot meer gespecialiseerde celtypes is die zo een invloed heeft op de heling van talrijke aandoeningen, of het activerend effect van de stamcellen op de omgevende cellen (paracrien effect) waarvan men een verhoogde matrixproductie kon waarnemen (Smith, 2006; Smith et al., 2003).
14
4. Woord van dank Op de eerste plaats zou ik prof. Ann Van Soom willen bedanken voor haar inzet en vertrouwen in mij en de stamcellen. Zij heeft als promotor zeer stimulerend gewerkt waardoor het maken van deze casus zeer aangenaam was. Bovendien heeft haar grote interesse mij extra energie gegeven om verder het stamcellandschap in te trekken. Daarna zou ik prof. Alessandra Gambacurta en dierenartsen Frank Van Hoeck en Marco Polettini van harte willen bedanken voor de mooie echobeelden en handboeken. Bovendien zou ik Mnr. C. Kechler en Mnr G. Luise willen bedanken voor hun grote steun aan het stamcelonderzoek in Italië waardoor verschillende doorbraken in dit onderzoeksdomein mogelijk zijn geweest. Ik zou ook Mvr. D. Neyts willen bedanken voor de lessen in Wetenschappelijk Engels waardoor het lezen van artikels en het schrijven van Engelse teksten er zeker op vooruitgegaan zijn. Als laatste zou ik mijn familie en vrienden willen bedanken. Op de eerste plaats mijn mama, Hilde Berghs en mijn vriendin, Sarah Broeckx. Dankzij hun steun en liefde is iedere dag een feest, zo ook het opzoeken, lezen en verwerken van artikels, gevolgd door het schrijven van deze casuïstiek. Ook mijn stiefpapa, Mathieu Palmans verdient een pluim voor de motiverende gesprekken. Mijn papa, Michel Spaas mag zeker niet vergeten worden omdat hij voor beide casuïstieken als eigenaar van de paarden het beenmerg en perifeer bloed respectievelijk naar Groot Brittanië en Italië heeft laten verzenden. Op deze manier konden we de stamcellen vergelijken in praktijkomstandigheden en heb ik de toegang gekregen tot het laboratorium in Rome en al de processen nauwgezet kunnen volgen.
15
5. Literatuurlijst 1] Andrews F.M., Reinemeyer C.R., Longhofer S.L., 2009, Effects of top-dress formulations of suxibuzone and phenylbutazone on development of gastric ulcers in horses, Veterinary Therapies, 10(3):113-20. 2] Bartling B., Koch A., Simm A., Scheubel R., Silber R.E., Santos A.N., 2010, Insulin-like growth factor binding proteins-2 and -4 enhance migration of human CD 34-/CD133+ hematopoetic stem and progenitor cells, International Journal of Molecular Medicine, 25(1): 89-96. 3] Braim A.E., Macdonald M.H., Bruss M.L., Stanley S.D., Giri J.K., Giri S.N., 2008, Pharmacokinetics and clinical effects of pirfenidone administered intravenously in horses, American Journal of Veterinary Research, 69(7):952-960. 4] Calado R.T., 2009, Telomeres and marrow failure, American Society of Hematological Educational Programs, 1:338-43. 5] Campagnoli C., Roberts I., Kumar S., Bennett P., Bellantuono I., Fisk N.M., 2001, Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow, Blood, 98: 2396–2402. 6] Chapman A.M., 2009, Acute diarrhea in hospitalized horses, Veterinary clinic of Northern American Practitioners, 25(2): 363-380. 7] Chan E.M., Ratanasirintrawoot S., Park I., Manos P.D., Loh Y.H., Huo H., Miller J.D., Hartung O., Rho J., Ince T.A., Daley G.Q., Schlaeger T.M., 2009, Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells, Nature Biotechnology, 27: 1033-1037. 8] Chen L., Khillan J.S., 2010, A novel signalling by vitamin A/retinol promotes self renewal of Mouse embryonic stem cells by activating PI3K/Akt signaling pathway via insulin-like growthfactor-1 receptor, Stem cells, 28(1): 57-63. 9] Crovace A., Lacitignola L., De siena R., Rossi G., Francioso E., 2007, Cell therapy for tendon repair in horses: an experimental study, Veterinary Research Communications, 31(1): 281-283. 10] Donovan P.J. en Gearhart P., 2001, The end of the beginning for pluripotent stem cells, Nature, 414(6859): 92-97. 11] Dyson S., 2004, Suspensory ligament desmitis can end a horse’s carreer, Equine Veterinary Practice, 3(3): 238-255. 12] Eads N.R., 2009, tendonitis, Journal of Equine Health Topics, 1: 3-5. 13] Erices A., Conget P., Minguell J., 2000, Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. British Journal of Haematology, 109: 235–242. 14] Ferrón S.R., Marqués-Torrejón M.A., Mira H., Flores I., Taylor K., Blasco M.A., Fariñas I., 2009, Telomere shortening in neural stem cells disrupts neuronal differentiation and neuritogenesis, Journal of Neurology, 29(46): 14394-14407. 15] Fitzgerald B., 2004, Insulin resistance and inflammatory chalanges, Equine Disorders Quarterly, 13:3-4. 16] Heng J.C., Feng B., Han J., Jiang J., Kraus P., Hui J., Orlov Y.L., Yang L., Lufkin T., Lim B., Hui H., 2010, The nuclear receptor Nr5a2 can replace Oct4 in the reprogramming of murine somatic cells to pluripotent cells, stem cells, 6(2): 167-174.
16
17] Hu J., Zhu Q.T., Liu X.L., Xu Y.B., Zhu J.K., 2007, Repair of extended peripheral nerve lesions in rhesus monkeys using acellular allogenic nerve grafts implanted with autologous mesenchymal stem cells, Experimental Neurology, 204(2): 658-66. 18] Hu Y., Liao L., Wang Q., Ma L., Ma G., Jiang X., 2003, Isolation and identification of mesenchymal stem cells from human fetal pancreas, Journal of Laboratory Clinical Medicine, 141: 342–349. 19] Jackson W.M., Aragon A.B., Djouad F., Song Y., Koehler S.M., Nesti L.I., Tuan R.S., 2009, Mesenchymal progenitor cells derived from traumatized human muscle, Journal for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 3(2): 129-138. 20] Jaroca D., Lukasiewics E., Majka M., 2008, Advantage of mesenchymal stem cells (MSC) expansion directly from purified bone marrow CD105+ and CD271+ cells, Folia Histochemica Cytobiologica, 46(3): 307-314. 21] Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L., Schwartz R.E., Keene C.D., Ortiz-Gonzalez X.R., 2002, Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow, Nature Medicine, 418: 41–49. 22] Julius M.H., Masuda T., Herzenberg L.A., 2006, Demonstrating that antigen-binding cells are precursors of anti-body-producing cells after purification with a fluorescence-activated cell sorter, Proceedings of National Academic Science, USA, 69: 1934-1938. 23] Juncosa-Melvin N., Shearn J.T., Boivin G.P., Gooch C., Galloway M.T., West J.R., Nirmalanandhan V.S., Bradica G., Butler D.L., 2006a, Effects of mechanical stimulation on the biochemics and histology of stem cell-collagen sponge constructs for rabbit patellar tendon repair, Tissue Engineering, 12(8): 2291-300. 24] Juncosa-Melvin N., Boivin G.P., Gooch C., Galloway M.T., West J.R., Butler D.L., 2006b, Effects of cell-to-collagen ratio in stem cell-seeded constructs for the Achilles tendon repair, Tissue Engineering, 12(4): 681-689. 25] Jones W.E., 2004, Questions about cushing’s syndrome, Journal of Equine Veterinary Science, 24(4): 144-145. 26] Kassis I., Rivkin R., Levdansky L., Samuel S., Marx G., Gorodetsky R., 2006, Isolation of mesenchymal stem cells from G-CSF-mobilized human peripheral blood using fibrin microbeads, Bone Marrow Transplantation, 37: 967–976. 27] Kern S., Eichler H., Stoeve J., Klüter H., Bieback K., 2006, Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue, Stem Cells, 24: 1294-1301. 28] Koerner J., Nesic D., Romero J.D., Brehm W., Mainil-Varlet P., Grogan S.P., 2006, Equine Peripheral Blood-Derived Progenitors in Comparison to Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, 24: 1613-1619. 29] Lin S.J., Yang M.H., Chao H.C., Kuo M.L., Huang J.L., 2000, Effect of interleukin-15 and Flt3ligand on natural killer cell expansion and activation: umbilical cord vs. adult peripheral blood mononuclear cells, Pediatrical Allergy Immunolical, 11: 168–174. 30] Mezey E., Chandross K.J., Harta G., Maki R.A., McKercher S.R., 2000, Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow, Journal of Science, 290: 1779– 1782.
17
31] Mitjavila-Garcia M.T., Gailleret M., Godin I., Nogueira M.M., Cohen-Lalal K., Schiavon V., Lecluse Y., Le Pesteur F., Lagrue A.H., Vainchenker W., 2002, Expression of CD41 on hematopoetic progenitors derived from embryonic hematopoetic cells, Development, 129(8): 2003-2013. 32] Morshead C.M., Van der kooy K.D., 2001, A new spin on neural stem cells, Current Opinion Neurobiology, 11: 59-65. 33] Moviglia G.A., Varela G., Gaeta C.A., Brizuela J.A., Bastos F., Saslavsky J., 2006, Autoreactive T cells induce in vitro bone marrow mesenchymal stem cell transdifferentiation to neural stem cells, Cytotherapy, 8(3): 196-201. 34] Osawa M., Hanada K., Hamada H., Nakauchi H., 1996, Long term lymfohematopoetic reconstitution by a single CD34 low/negative hematopoetic stem cell, Science, 273: 242-245. 35] Péault B., Rudnicki M., Torrente Y., Cossu G., Tremblay J.P., Partridge T., Gussoni E., Kunkel L.M., Huard J., 2007, Stem and progenitor cells in skeletal muscle developement, maintenance and therapy, Molecular therapy, 15(5): 867-877. 36] Polettini M., Gambacurta A., 2009, Peripheral blood stem cells heal, improve metabolism and the quality of life, Altea, p 17, 58, 61, 183-196. 37] Ranalli M., Polettini M., Sinibaldi Salimei P., Gambacurta A., 2008, A new method expansion and purification of blood stem cells: therapeutic applications in the veterinary field, Medicina Sperimentale e Science Biochimiche, 3: 15-38. 38] Reed S.K., Messer N.T., Tessman R.K., Keegan K.G., 2006, Effects of phenylbutazone alone or in combination with flunixin meglumine on blood protein concentrations in horses, American Journal of Veterinary Research, 67(3):398-402. 39] Richardson L.E., Dudhia J., Clegg P.D., Smith R., 2007, Stem cells in veterinary medicineattempts at regenerating equine tendon after injury, Trends Biotechnology, 25(9), 409-416. 40] Riordan N.H., Ichim T.E., Min W., Wang H., Solano F., Lara F., Alfaro M., Rodriguez J.P., Harman R.J., Patel A.N., Murphy M.P., Lee R.R., Minev B., 2009, Non-expanded adipose stromal vascular fraction cell therapy for multiple sclerosis, Journal of Translational Medicine, 7: 29-38. 41] Schnabel L.V., Mohammed H.O., Jacobson M.S., Fortier L.A., 2008, Effects of PRP and acellular bone marrow on gene expression patterns and DNA content of equine suspensory ligament explant cultures, 40(3): 260-265. 42] Smiler D., Soltan M., 2006, Bone Marrow Aspiration: Technique, Grafts and Reports, Implant Densitry, 15(3): 229-235. 43] Smith R.K., 2006, Stem cell technology in equine tendon and ligament injuries, Veterinary Research, 28(4): 140-158. 44] Smith R.K., Korda M., Blunn G.W., Goodship A.E., 2003, Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the SDFT as a potential novel treatment, Equine Veterinary Journal, 35(1): 99-102. 45] Smith R.K.W., 2008, Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy, Disability and Rehabilitation, 1: 1-7.
18
46] Smith R.K.W., Zunino L., Webbon P.M., Heinegard D., 1997, The distribution of Cartilage Oligomeric Protein (COMP) in tendon and its variation with tendon site, age end load, Matrix Biology, 16(5): 255-271. 47] Sokolov V.O., Krasnikova T.L., Prokofi E.L.V., Kukhtina N.B., Arefi E.T.I., 2009, Expression of Markers of Regulatory CD4+CD25+foxp3+ Cells in Artherosclerotic Plaques of Human Coronary Arteries, Immunology and Microbiology, 146(6): 726-730. 48] Sun C., Nakatake Y., Akagi T., Ura H., Matsuda A., Koide H., Ko M.S., Niwa H., Yokota T., 2009, Dax1 binds to Oct3/4 and inhibits its transcriptional activity in embryonic stem cells, Molecular Cellular Biology, 29(16): 4574-4583. 49] Tanaka S., 2010, Targeting CD44 in mast cell regulation, Expert Opinion on therapeutic Targets, 14(1): 31-43. 50] Violini S., Ramelli P., Pisani L.F., Gorni C., Mariani P., 2009, Horse bone marrow mesenchymal stem cells express embryo stem cell markers and show the ability for tenogenic differentiation by in vitro exposure to BMP-12, BMC Cell Biology, 10: 29-39. 51] Wexler S.A., Donaldson C., Denning-Kendall P., Roce C., Bradley B., Hows J.M., 2002, Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal ‘stem’ cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not, British Journal of Haemotology, 121: 368-374. 52] Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., 2001, Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering, 7: 211–228. 53] Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., 2002 Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular and Cellular Biology, 13: 4279–4295. 54] Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Edwards C.J., Moss J., Burger J.A., 2000, Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Research, 2: 477–488.
19
