Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha Odbor rostlinolékařství, oddělení entomologie
Metody monitoringu, diagnostiky a hodnocení škodlivosti karanténních háďátek rodu Ditylenchus
Ondřej Douda, 2008
OBSAH: 1.
CÍL METODIKY ............................................................................................................... 3
2.
VLASTNÍ POPIS METODIKY......................................................................................... 3
2.1. Literární přehled .............................................................................................................. 3 2.1.1. Systematické zařazení a základní charakteristika rodu Ditylenchus........................ 3 2.1.2. Háďátko zhoubné (Ditylenchus dipsaci) - hostitelský okruh, základní biologické a morfologické vlastnosti, rozšíření, příznaky napadení........................................................... 4 2.1.3. Ditylenchus destructor - hostitelský okruh, základní biologické a morfologické vlastnosti, rozšíření, příznaky napadení ............................................................................... 11 2.2. Monitoring ..................................................................................................................... 16 2.3. Příprava nativních a trvalých preparátů ........................................................................ 17 2.4. Diagnostika háďátek pomocí světelné mikroskopie ..................................................... 19 2.5. Zakládání chovů háďátek druhů Ditylenchus dipsaci a Ditylenchus destructor, studium jejich škodlivosti a okruhů hostitelských rostlin .................................................................. 31 3. SROVNÁNÍ „NOVOSTI POSTUPŮ“ ............................................................................ 35
4.
POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY ................................................................................. 35
5.
SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY ..................................................... 36
6.
SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE ................................. 39
2
1. CÍL METODIKY Cílem této práce je vypracování metodiky pro diagnostiku háďátka zhoubného (Ditylenchus dipsaci) a háďátka Ditylenchus destructor jako hlavních karanténních škůdců z rodu Ditylenchus pomocí světelné mikroskopie. Metodika dále popisuje postupy pro hodnocení škodlivosti jednotlivých populací těchto druhů háďátek a způsoby jejich monitoringu. Metodika má rovněž za cíl sumarizovat základní údaje týkající se biologie a morfologie těchto škodlivých druhů háďátek.
2. VLASTNÍ POPIS METODIKY 2.1. Literární přehled 2.1.1. Systematické zařazení a základní charakteristika rodu Ditylenchus Systematické zařazení fytoparazitických háďátek r. Ditylenchus (Maggenti, 1991): Říše: Animalia Kmen: Nematoda Třída: Secernentea Podtřída: Tylenchia Řád: Tylenchida Podřád: Tylenchina Nadčeleď: Tylenchoidea Čeleď: Anguinidae Rod: Ditylenchus
Rod Ditylenchus zahrnuje přibližně 80 druhů háďátek, většina z nich nebyla dosud dostatečně zkoumána, některé jsou známy pouze z jednotlivých nálezů, jiné jsou rozšířeny na několika kontinentech. Většina druhů háďátek rodu Ditylenchus je považována za mykofágy, potravní nároky řady druhů však nejsou dosud známy. Za primárně fytofágní jsou pokládány 3
druhy Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus destructor, Ditylenchus africanus a Ditylenchus angustus. První dva druhy způsobují ekonomicky významné škody v mírném pásmu a jsou v České republice řazeny mezi karanténní škůdce, podrobněji o nich pojednávají následující části této práce. Z mykofágních druhů má určitý hospodářský význam Ditylenchus myceliophagus, který škodí v komerčních kulturách žampionů (Brzeski, 1998; Nagesh a Parvatha Reddy, 2000).
2.1.2. Háďátko zhoubné (Ditylenchus dipsaci) - hostitelský okruh, základní biologické a morfologické vlastnosti, rozšíření, příznaky napadení V roce 1857 identifikoval druh Ditylenchus dipsaci Kühn ve strboulech štětky soukenické (Dipsacus sativus) a popsal jej pod názvem Anquillula dipsaci (Decker, 1969). Roku 1868 potvrdil Kühn souvislost výskytu háďátka Anquillula dipsaci s již dříve popsaným onemocněním žita, ovsu a jetele. V následujících letech bylo háďátko zhoubné opakovaně zjišťováno na dalších hostitelských rostlinách a uváděno pod dalšími názvy (např. Tylenchus havensteinii, Tylenchus hyazinthi, Tylenchus alii, Tylenchus devastatrix aj.). Háďátko zhoubné – Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936, je významným škůdcem zeleniny. Závažná poškození jsou pravidelně hlášena z porostů česneku, cibule (Aftalionová a Cohn, 1990), mrkve (Greco et al., 2002) a salátové čekanky (Urek et al., 1998). Z ostatních polních plodin je velmi často háďátkem Ditylenchus dipsaci napadána vojtěška, jetel, hrách, bob a také cukrová řepa (Whitehead, 1984; Kornobis, 1994). Důležitými hostitelskými rostlinami jsou dále okrasné cibuloviny, jako je narcis, hyacint a tulipán (Janssen, 1994). Z obilovin patří k hostitelským rostlinám žito, oves a kukuřice, pšenici a ječmen Ditylenchus dipsaci nenapadá. Na vojtěšce se Ditylenchus dipsaci někdy vyskytuje ve směsných populacích spolu s druhem Aphelenchoides ritzemabosi (háďátko kopretinové), což diagnózu může komplikovat (Wendtová et al., 1993). Hostitelský okruh háďátka Ditylenchus dipsaci je extrémně široký, odhady počtu druhů hostitelských rostlin se pohybují od 400 (Brzeski, 1998) po 500 (Wendtová et al. 1993; Esquibet et al. 1998). Viglierchio (1971) zjistil, že Ditylenchus dipsaci může kromě rostlinných hostitelů přežívat rovněž na dvou druzích hub (Verticillium theobromae a Cladosporium spp.). Z výše uvedené polyfágnosti vyplývá vysoká míra škodlivosti tohoto druhu. I z tohoto důvodu je druh Ditylenchus dipsaci řazen do seznamů karanténních organizmů Evropské unie, EPPO (Kategorie A2) i České republiky.
4
Pro druh je dále typická existence tzv. ras, lišících se vzájemně v okruhu hostitelských rostlin. Počet chromozómů v diploidní sadě u jednotlivých ras kolísá od 12 do 60 (Brzeski, 1998). Morfologicky se jednotlivé rasy většinou rozlišit nedají, z tohoto důvodu je snaha o jejich diferenciaci pomocí molekulárně biologických metod (Palmerová et al., 1991; Wendtová et al., 1993; Esquibet et al., 1998; Esquibet et al., 2003; Marek et al. 2005; Subbotin et al., 2005a, Kerkoud et al., 2007). Standardním postupem pro rozlišení ras jsou biologické testy. Výjimku tvoří polyploidní tzv. obří rasa, jež se od běžných populací liší až dvojnásobnou délkou těla a měřením tak může být od ostatních ras rozlišena. K přesnému určení je ovšem zapotřebí mnoha jedinců. Taxonomický status ras zůstává nejasný a obzvlášť postavení obří rasy je stále diskutováno. Znalost okruhu hostitelských rostlin je nezbytná pro úspěšná ochranná opatření, která spočívají hlavně v použití rezistentních odrůd a ve střídání plodin, kdy jsou na zasaženém pozemku po několik let pěstovány rostliny, na kterých se háďátko nemůže rozmnožovat. Existence morfologicky nerozlišitelných ras s rozdílnými preferencemi hostitelských rostlin a široký okruh hostitelů ovšem tuto metodu značně komplikuje (Esquibet et al., 2003). Údaje o náchylnosti či rezistenci jednotlivých rostlinných druhů vůči háďátku Ditylenchus dipsaci nalezené v literatuře jsou často rozporuplné (Greco et al., 2002). To může být způsobeno rozdíly v podmínkách pokusů, v odrůdách testovaných rostlin i genetickou variabilitou populací háďátek použitých k pokusné inokulaci. Tělo háďátka Ditylenchus dipsaci je velmi štíhlé, 1,0 – 1,6 mm dlouhé (u tzv. obří rasy 2 mm) a 40 – 60 µm široké. Po usmrcení vysokou teplotou zůstává tělo háďátka rovně natažené. Skelet hlavy je vyvinut středně. Ústní bodec (stylet) je tenký, na bázi knoflíkovitě rozšířený a dosahuje délky 9 – 13 µm. Stylet je tak v poměru k délce těla velmi krátký. Jícen má válcovitý prokorpus, který se před napojením na oválný střední bulbus (metacorpus) lehce zužuje. Isthmus je velmi úzký a obklopuje jej nervový prstenec. Kyjovitý terminální bulbus přisedá na počátek střeva většinou vodorovně, případně může někdy začátek střeva poněkud překrývat. Uspořádání pohlavního ústrojí samiček je monodelfické, vaječník přiléhá svým koncem až k terminálnímu bulbu. Vajíčka jsou uspořádána většinou v jedné řadě, někdy ve dvou řadách. Spermatéka je tvořena prodlouženým vakem z 16 buněk. Vulva je na počátku poslední pětiny délky těla. Postvulvální váček je vyvinut a dosahuje přibližně do poloviny vzdálenosti od vulvy k řitnímu otvoru (anus). Ocas je u obou pohlaví zakončen ostrou špičkou. Pářící plachetka samečků (bursa copulatrix) je leptoderní, začíná před pářící jehlicí a dosahuje do 3/4 délky ocasu. Pářící jehlice je poměrně krátká a silná. Postranní pole zabírá 1/6 – 1/8 plochy těla a jsou v něm 4 podélné linie, které se u dospělých jedinců ztrácejí. 5
Vajíčka jsou oválná, velikosti 70 – 100 µm x 30 – 40 µm. Larvy měří po opuštění vaječných obalů asi 300 µm (Decker, 1969; Geraert, 2006; Hooper, 1973a). Morfometrická data jsou u tohoto druhu velmi variabilní v závislosti na stáří háďátek a na druhu hostitele (Brzeski, 1998). Vývojová stádia (nejčastěji larvy 4. stupně) přežívají na suchých rostlinných zbytcích i 20 let (Wharton a Marshall, 2002). Dlouhá doba, po kterou háďátka přežívají na zamořených pozemcích v anabiotickém stavu (toto stádium se někdy se označuje jako dauer larva) je další komplikací pro ochranu před tímto druhem háďátka.
Obr. 1: Schéma vývojového cyklu háďátka zhoubného (Ditylenchus dipsaci)
Ditylenchus dipsaci napadá hlavně osní a listové části rostlin včetně cibulí a hlíz. V menší míře mohou být infikována i semena, případně kořeny. Do rostlin pronikají háďátka nejčastěji průduchy, v rostlinných tkáních se pak vyvíjejí a rozmnožují. Např. u mrkve bylo zjištěno (Greco et al., 2002), že se napadení háďátky a stupeň poškození zvyšuje, při podzimním poklesu teplot a vyšších úhrnech srážek. Nejvíce jsou zasaženy části rostlin, které
6
jsou v blízkosti povrchu půdy, háďátka nejprve pronikají do nadzemní části rostlin (zejména do řapíků) a hlavní kořen je zasažen až později. Mladé samice začínají klást v průměru 4. den po posledním svlékání. Čerstvá vajíčka temně šedou barvu, starší jsou světlejší. Po 4 – 6 hodinách začínají být patrné známky rýhování. Vývoj larev 1. stupně trvá 5 – 5½ dne a po této době jsou larvy schopny pohybu. Vzrostlá larva 1. stupně se svléká ve vajíčku. Na larvě 2. stupně již lze pozorovat stylet. Pohyby larev 2. stupně už jsou jasně patrné. Minimální inkubační doba při teplotě 15ºC je 7 dní. Potom se larvy 2. stupně líhnou a za 2 až 2½ dne následuje 2. svlékání. Larvy 3. stádia se potřetí svlékají po 3 – 3½ dnech. Larvy 4. stupně se svlékají počtvrté za dalších 4 – 5 dní. Dospělci se objevují 9. – 11. dne od líhnutí. Při 15ºC trvá celý životní cyklus 19 – 23 dní. Pohlaví larev 2. stupně nemůže být určeno. U larev 3. a 4. vývojového stádia se dá pohlaví zjistit prozkoumáním základů pohlavních orgánů pod stereomikroskopem. Bylo zjištěno, že dospělci mohou žít na sazenicích cibule 45 – 73 dní. Za tuto dobu může samice naklást 207 až 498 vajíček. Po 30 dní klade samice každý den 8 – 10 vajíček. Dalších 10 dní se počet vajíček snižuje. Pak se kladení na 5 – 7 dní úplně zastaví. Potom začínají samice opět snášet, což pokračuje nepravidelně až do jejich smrti (Yuksel, 1960). Partenogeneze se nevyskytuje a larvy samic 4. stupně se nepáří (Webster, 1967). V rostlinách se vyvíjí několik generací háďátek za sebou, starší larvy často opouštějí rostliny a vyhledávají nové hostitele. V půdě se háďátko pohybuje ve vodním filmu mezi půdními částicemi (Wallace, 1962). Studené a vlhké podmínky možnost napadení rostlin háďátkem zhoubným (Whitehead et al., 1987) podporují. Pohyblivost háďátka zhoubného je relativně velká, asi 10 cm za 3 hodiny. Zvadlé nebo usychající rostliny háďátka většinou opouštějí a mohou v půdě přečkat 12 – 18 měsíců bez potravy. Háďátko zhoubné je značně odolné proti nízkým teplotám a přečkává bez potíží zimní období (Vlk, 1985).
7
Obr. 2: morfologie háďátka Ditylenchus dipsaci (dle Thorna, 1945, upraveno)
8
Obr. 3: Rozšíření háďátka zhoubného (Ditylenchus dipsaci, EPPO, 2006a; upraveno)
Háďátko Ditylenchus dipsaci je známo z většiny evropských zemí včetně Středomoří. Bylo zaznamenáno rovněž v Severní a Jižní Americe, Asii a Austrálii a na Novém Zélandu. Přes kosmopolitní výskyt způsobuje Ditylenchus dipsaci škody pouze v mírném pásmu severní i jižní polokoule (Hooper, 1973a). Příznaky napadení háďátkem zhoubným se liší podle druhu a stáří hostitelské rostliny. Obecně však platí, že se napadení projevuje zduřením infikovaných částí rostlin. Zduření je následkem rozpuštění středních lamel buněčných stěn a větší frekvence buněčného dělení. Zduření na listech bývá ohraničeno žilkami, na mladých listech tak má velmi jemnou strukturu. Dále dochází k potlačení růstu a znetvoření osních částí rostlin – jedná se především o zvlnění, zkadeření, zkřivení a zkroucení listů, lodyh a stonků (Hooper, 1973a). Některé hostitelské rostliny reagují rašením vedlejších pupenů nebo nadměrným odnožováním. Tyto symptomy jsou zřejmě vyvolány zejména trávicími šťávami háďátka (Sabová, 1993).
9
U mrkve je možné pozorovat v časné fázi vývoje rostlin a infekce částečnou ztrátu zbarvení vrchní části kořene a rozvětvení listů. Háďátka se nejprve objevují v listech a do kořenů se přemísťují později (Greco et al., 2002). Žádný z výše uvedených příznaků není pro infekci háďátkem Ditylenchus dipsaci specifický. Za příznak typický pro napadení Ditylenchus dipsaci se dají považovat pouze tmavé kruhy (Obr. 4), viditelné na řezu infikovanou cibulí. Práh škodlivosti je u háďátka Ditylenchus dipsaci velmi nízký. Podle Deckera (1969) již 10 – 20 jedinců na 1 kg půdy způsobí poškození výsadby cibule, při výskytu více než 20 jedinců dochází k úplnému zničení výsadby.
Obr. 4: příznaky infekce háďátkem Ditylenchus dipsaci na cibuli; a – podélný řez; b – příčný řez (Decker 1969; upraveno)
10
2.1.3. Ditylenchus destructor - hostitelský okruh, základní biologické a morfologické vlastnosti, rozšíření, příznaky napadení V roce 1945 byla populace háďátka r. Ditylenchus napadající v Idahu brambory popsána jako samostatný druh, jenž byl pojmenován Ditylenchus destructor (Thorne, 1945), anglicky „Potato rot nematode“, „Potato tuber eelworm“ či „Iris nematode“, pro druh byl přijat rovněž český název háďátko hlízové. Podobně jako Ditylenchus dipsaci je i Ditylenchus destructor řazen mezi karanténní druhy (ČR, EU, EPPO, NAPPO). Hostitelský okruh zahrnuje asi 70 rostlinných druhů, Ditylenchus destructor je také schopen vyvíjet se na přibližně stejném počtu druhů hub. Ditylenchus destructor způsobuje ekonomicky významné ztráty rovněž převážně v mírném pásmu.
Obr. 5: Rozšíření háďátka Ditylenchus destructor (EPPO, 2006b; upraveno)
Nejdůležitějšími hostitelskou rostlinou v podmínkách Evropy a Severní Ameriky je lilek brambor (Solanum tuberosum). Značné škody na této plodině způsobuje Ditylenchus destructor především ve východní Evropě. Při rozboru hlíz brambor postižených na Ukrajině obecnou hnilobou byl Ditylenchus destructor detekován ve 4 – 6% případů (Polozhenets, 1998). Mezi další významné hostitele patří okrasné rostliny a z nich především okrasné 11
cibuloviny. Z okrasných rostlin způsobuje nejzávažnější škody na cibulích kosatce (Iris spp.) a příležitostně rovněž na tulipánu (Tulip spp.), mečíku (Gladiolus spp.) a na hlízách jiřiny (Dahlia spp.). Někdy škodí také na cukrové řepě (Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima), mangoldu (Beta vulgaris subsp. vulgaris var. vulgaris) a mrkvi (Daucus carota ssp. sativus). Napadán je rovněž jetel luční (Trifolium pratense), jetel plazivý (Trifolium repens) a jetel zvrhlý (Trifolium hybridum). Je známo, že ničí hyfy kulturních žampionů druhu Agaricus hortensis, nicméně za většinu ekonomicky významných ztrát v pěstírnách hub je odpovědný spíše příbuzný výše uvedený druh Ditylenchus myceliophagus. Značné ztráty způsobuje Ditylenchus destructor také na batátech (povijnice batátová - Ipomoea batatas) v Číně (Plowright et al., 2002), u této plodiny je prováděno i šlechtění na rezistenci proti tomuto háďátku.
12
Obr. 6: morfologie háďátka Ditylenchus destruktor (dle Thorna, 1945, upraveno)
13
Tělo háďátka Ditylenchus destructor je štíhlé, celková délka těla se podle Brzeskiho (1998) pohybuje od 0,69 po 1,89 mm. Tělo samice je po zabití zvýšenou teplotou lehce prohnuté na ventrální straně a vyznačujíce se slabými příčnými kutikulárními rýhami vzdálenými od sebe asi 1 µm; boční pole má po většinu délky těla 6 podélných rýh, tento počet se postupně k oběma koncům těla snižuje na 2. Oblast pysků je nízká a plochá, lehce vystupuje z těla, většinou se zdá být bez rýh. Soustava pysků vyvinuta slabě, stylet je dlouhý 10 – 14 µm a má zřetelné bazální knoflíky. Cefalické papily a amfidy jsou viditelné pouze při čelním pohledu, jejich uspořádání je podobné jako u Ditylenchus dipsaci. Krční papily (deiridy) jsou obvykle viditelné blízko základny krku. Střední bulbus je vřetenovitý, isthmus velmi úzký a obklopený nervovým prstencem, z místa zúžení se jícen rozpíná do kyjovitého žlaznatého bulbu, který obvykle překrývá střevo asi v polovině délky těla na dorzální straně. Vulva je jasně patrná, vaječník je dopředu prodloužený, někdy dosahuje až do oblasti jícnu, oocyty jsou v horní části uspořádány ve dvou řadách, ale blíže k děloze už v řadě jedné. Postvulvální váček dosahuje přibližně do tří čtvrtin vzdálenosti k řitnímu otvoru. Zadní větev dělohy je rudimentární, nebylo pozorováno, že by fungovala jako spermatéka. Spermatozoidy obvykle stoupají v děloze nahoru. Ocas je kuželovitý s lehkým prohnutím na ventrální straně, dlouhý 3 – 5 násobek šířky těla u řitního otvoru, konec ocasu je mírně zakulacený. Fasmidy nejsou pozorovatelné (Hooper, 1973b; Anonym 1). Odpadní látky se shromažďují v tenkostěnném kanálku a pohybují se směrem k exkrečnímu póru. Terminální kanálek má tlusté stěny, odpadní látky se v něm koncentrují do vejčitých globulí, které způsobují rozšiřování kanálku a posléze vyloučení exkrečním pórem do vnějšího prostředí (Evans a Fischer, 1970). Exkreční pór je umístěn u nebo těsně před spojením jícnu se střevem; hemizonid se nachází těsně před exkrečním pórem. (Hooper, 1973b). U samce je přední část těla podobná samici. Tělo je po usmrcení zvýšenou teplotou rovné nebo lehce zkroucené na ventrální straně. Ocas je také podobný jako u samice, někdy poněkud užší, konec ocasu je poněkud zakulacený; pářící plachetka dosahuje od předního konce pářící jehlice přibližně do tří čtvrtin délky ocasu. Pářící jehlice jsou ventrálně zahnuté a protažené dopředu; gubernákulum je krátké a jednoduché (Hooper, 1973b; Anonym 1). Základní morfologické vlastnosti háďátka Ditylenchus destructor jsou poměrně podobné výše popisovanému druhu Ditylenchus dipsaci, nicméně existuje i několik poměrně významných rozdílů. V první řadě to je poněkud menší celková průměrná délka těla dospělců. Za důležité diagnostické znaky, pomocí nichž je možné odlišit tento druh od háďátka Ditylenchus dipsaci se dále považují šikmé překrytí počáteční části střeva laloky jícnových 14
žláz (tvar terminálního bulbu), odlišná struktura a délka vaječníku obsahujícího oocyty uspořádané v horní části ve 2 řadách, menší velikost vajíček téměř nepřesahující šířku těla samičky, delší postvulvální váček a 6 podélných rýh v postranním poli (Vlk, 1985).
Obr. 7: rozdíly v morfologii háďátek Ditylenchus dipsaci a Ditylenchus destructor; a – e: Ditylenchus dipsaci; f – i: Ditylenchus destructor; a, b – tvar laloků jícnových žláz; b, g – velikost vajíček; c, h – délka postvulválního váčku; d, ch – tvar ocasu; e, i – počet bočních linií (Decker, 1969; upraveno).
O biologii háďátka Ditylenchus destructor není mnoho informací a ty které existují, byly získány při kultivaci na houbových hostitelích. Biologie tohoto druhu je nicméně poměrně podobná biologii druhu Ditylenchus dipsaci. Významným rozdílem je však skutečnost, že i přes značnou morfologickou podobnost s háďátkem Ditylenchus dipsaci postrádá Ditylenchus
destructor
zřejmě schopnost
přežití
nepříznivých
podmínek
v anabiotickém stavu. Tento fakt značně usnadňuje ochranu proti tomuto druhu. Nepříznivá období přežívá nejspíš na půdních houbách (Hooper, 1973b). Z plevelů, na nichž může takto přežívat uvádí Brzeski (1998) mátu (Mentha sp.) a mléč (Sonchus sp.). Podle Thorna (1961) 15
přezimují u háďátka Ditylenchus destructor vajíčka. Dalším důležitým rozdílem biologie háďátka Ditylenchus destructor od háďátka zhoubného je neexistence ras lišících se v okruhu hostitelských rostlin, což může být dáno i celkově nižším počtem hostitelských rostlin. Podle Hoopera (1973b) vstupuje Ditylenchus destructor do hlíz brambor lenticelami a nejprve způsobuje malé bělavé prašné tečky těsně pod povrchem, které jsou patrné pouze po oloupání. Napadené oblasti se zvětšují a splývají do světle hnědých lézí, ty jsou tvořeny suchým zrnitým pletivem a jsou patrné pod slupkou. Jak napadení pokračuje, pletivo tmavne a zmenšuje se, slupka je popraskaná a papírovitá. Vnitřní pletivo postupně tmavne a často dochází k sekundárnímu napadení roztoči, bakteriemi nebo houbami. Při skladování ve vlhkém prostředí (např. v krechtech) může následovat celková hniloba šířící se na okolní hlízy. Napadené hlízy jiřin vykazují podobné příznaky. Na tulipánech a kosatcích infekce většinou začíná na bázi cibulí a postupně zasahuje horní část, přičemž se vytvářejí šedivé až černé leze; silně napadené rostliny mají často zčernalé kořeny a nažloutlé slabě vyvinuté listy.
Obr. 8: Schéma průběhu napadení bramboru háďátkem Ditylenchus destructor (Decker, 1969, upraveno).
2.2. Monitoring Před vlastním zahájením monitoringu je nutné vybrat lokality dávající předpoklad výskytu háďátek r. Ditylenchus. Při výběru lokalit se přihlíží především ke spektru na nich pěstovaných plodin. V případě monitoringu cílenému na Ditylenchus dipsaci jsou 16
upřednostňovány plochy s porosty cibulovin případně víceletých pícnin, u háďátka Ditylenchus destructor potom kultury brambor. Je možné odebírat jak vzorky půdy, tak rostlin. Při odběru půdních vzorků z celé plochy pozemku se odebírá větší počet dílčích vzorků (min. 4 vrypy na ar), dílčí vzorky o hmotnosti 50 – 200 g jsou umístěny do nádoby a smíchány, z nádoby je následně odebrán směsný vzorek o hmotnosti cca. 1000 g. Nevýhodou při extrakci háďátek ze substrátu je častá přítomnost mnoha necílových druhů háďátek v získané suspenzi což může diagnostiku poněkud komplikovat. Stejný problém ale nastává i při extrakci háďátek z rostlinného materiálu, který již podléhá zkáze. Při odběru vzorků rostlin se při procházení porostem vytipují ohniska vykazující příznaky, jenž by mohly být způsobeny napadením některým z obou sledovaných druhů. Z těchto míst se pak odebírají vzorky rostlinného materiálu, počet vzorků se v tomto případě řídí velikostí daného ohniska. Vhodný je ale i odběr rostlin nevykazujících na stejném pozemku příznaky, protože infekce se může manifestovat až při vysoké populační hustotě háďátek. V tomto případě se počet vzorků řídí velikostí daného pozemku, jeden vryp by měl připadat minimálně na cca. 10 m2 Před vlastní extrakcí je nutné vzorky uchovávat při teplotě 4ºC, doba uskladnění vzorků by neměla překročit dva týdny a vzorky by neměly proschnout. Extrakce háďátek ze získaných vzorků probíhá způsobem popsaným v následující části 2.5.
2.3. Příprava nativních a trvalých preparátů Po extrakci háďátek z půdy či rostlinného materiálu pomocí Baermannovy nálevkové metody je možné přistoupit k diagnostice na základě měření jejich tělesných rozměrů. Základní měření je možné provádět na dočasných preparátech. Příprava dočasných preparátů probíhá následujícím způsobem: háďátka jsou nejprve vybrána pod stereomikroskopem a přenesena pomocí nematologické jehly do kapky destilované vody o objemu cca. 20 µl umístěné na podložním skle. Do jedné kapky je vhodné umístit maximálně 5 jedinců. K měření je nezbytné vybírat dospělé jedince. Do kapky jsou následně vloženy kulovité skleněné částice o průměru cca. 200 µm (částice zabrání praskání háďátek pod krycím sklem) a na preparát je umístěno kruhové krycí sklo o průměru 18 mm. Háďátka je možné usmrtit několikanásobným protáhnutím preparátu v plamenu lihového kahanu. Takto připravené nativní preparáty se dají pozorovat při maximálně 400 násobném zvětšení a je možné je použít k morfometrické identifikaci prováděné jak digitální analýzou obrazu, tak měřením pomocí stupnice na okuláru mikroskopu. 17
Pro detailní studium jemnějších morfologických struktur je nezbytné pozorování háďátek při 1000 násobném zvětšení a za použití olejové imerze. Vhodné je také použití Nomarskiho kontrastu. Pro pozorování při tomto zvětšení je nezbytné vytvořit trvalé mikroskopické preparáty, které slouží i jako dokladový materiál potvrzující výskyt daného druhu v testovaných vzorcích. Při přípravě trvalých preparátů byla háďátka opět vybrána ze suspenze pod stereomikroskopem a umístěna do malého objemu vody (max. 30 µl) na hodinové sklo o průměru 60 mm. Potom bylo hodinové sklo zalito fixačním roztokem TAF (7 ml 40% formaldehydu, 2 ml trietanolaminu a 91 ml destilované vody) ohřátým na 80ºC tak aby byla háďátka zároveň s přidáním fixačního roztoku i usmrcena. Háďátka byla ponechána ve fixačním roztoku po dobu 7 dnů, případně déle. Potom byla přenesena do 10% roztoku glycerolu na hodinovém skle a umístěna do exsikátoru se silikagelem. Roztok glycerolu s háďátky byl ponechán odpařovat se přibližně 14 dní. Potom bylo možné přistoupit k vlastní přípravě trvalých preparátů. Na čisté podložní sklo byla pomocí mikropipety umístěna kapka koncentrovaného glycerolu o objemu 5 µl. Do kapky byla nematologickou jehlou přenesena háďátka, kolem kapky byly umístěny tři kousky směsi parafínu a včelího vosku (5:1) na které bylo položeno krycí sklo. Takto připravené podložní sklo bylo umístěno na topnou plotnu předehřátou na 50ºC aby se parafín pomalu roztavil a uzavřel háďátka v glycerolu pod krycím sklem. Výše uvedený postup shrnuje Obr. 9.
18
Obr. 9: Schéma přípravy trvalých preparátů
2.4. Diagnostika háďátek pomocí světelné mikroskopie Diagnostiku háďátek rodu Ditylenchus je možné realizovat dvěma způsoby: klasicky nebo pomocí molekulárně biologických metod. Přehled molekulárně biologických metod uvádí Zouhar et al. (2002). Klasická diagnostika používaná v nematologii využívá optický mikroskop a měření různých rozměrů těla háďátka. K měření se používá okulár s vyznačeným měřítkem, tento postup je ovšem využitelný pouze pro měření krátkých a rovných úseků (např. délka styletu, nebo šířka těla). Při měření delších druhů háďátek, u kterých navíc dochází po usmrcení ke zkroucení těla, je nebytné před měřením háďátka nakreslit (Hooper, 1986). Tato metoda byla ovšem v současnosti vytlačena měřením využívajícím digitální analýzu obrazu.
19
Naměřené hodnoty mohou být dále dosazeny do vzorců pro výpočet nematologických indexů (někdy označovaných i jako de Manovy indexy). Měření je možné provádět na dočasných i trvalých preparátech, na fixovaných jedincích však může docházet ke ztrátě viditelnosti některých struktur. To může být způsobeno příliš vysokou teplotou použitou k usmrcení háďátek, nebo nevhodnou fixací. Metoda měření tělesných rozměrů má určité nevýhody – u příbuzných druhů se data často překrývají a měření je vždy do jisté míry subjektivní. U háďátka Ditylenchus dipsaci jsou tělesné rozměry často značně variabilní v závislosti na populaci a hostitelské rostlině (Brzeski, 1981). Podobnost jednotlivých druhů a značná vnitrodruhová biologická variabilita jsou hlavním problémem spojeným s diagnostikou založenou na studiu morfologických vlastností háďátek rodu Ditylenchus (Wendtová et al., 1993). I přes tyto nevýhody zůstává studium háďátek pomocí světelné mikroskopie základní diagnostickou metodou. Při porovnání různých populací druhu Ditylenchus dipsaci či různých druhů rodu Ditylenchus je nutné do hodnocení zahrnout hodnoty získané měřením více jedinců, přičemž se obecně považuje za minimální počet deset.
Pro diagnostiku háďátek rodu Ditylenchus se používá měření následujících rozměrů: o L (celková délka těla) o největší šířka těla o délka styletu o délka jícnu o vzdálenost od přední části jícnu ke středu středního bulbu o délka ocasu o šířka těla u řitního otvoru o délka pářící jehlice o vzdálenost od vulvy po řitní otvor o vzdálenost od předního konce těla k vulvě
Naměřené rozměry jsou používány k výpočtu následujících nematologických indexů: o a (celková délka těla/největší šířka těla) o b (celková délka těla/délka jícnu) o c (celková délka těla/délka ocasu) o c‘ (délka ocasu/šířka těla u řitního otvoru) o MB (vzdálenost od přední části jícnu ke středu středního bulbu/délka jícnu)*100 20
o VA/T (poměr vzdálenosti od vulvy po řitní otvor a délky ocasu) o V (vzdálenost od předního konce těla k vulvě vyjádřená v % délky těla) o V‘ (vzdálenost od předního konce těla k vulvě vyjádřená v % vzdálenosti od předního konce těla k řitnímu otvoru)
Následující fotografie zobrazují měření nejdůležitějších tělesných rozměrů háďátka Ditylenchus dipsaci. Obdobně je možné provádět měření u druhu Ditylenchus destructor:
21
Obr. 10: měření celkové délky těla háďátka r. Ditylenchus
22
Obr. 11: měření největší šířky těla
23
Obr. 12: měření a) délky styletu; b) vzdálenost od přední části jícnu ke středu středního bulbu; c) celková délka jícnu
24
Obr. 13: sanec – měření a) délky ocasu; b) šířky těla u řitního otvoru; c) délky pářící jehlice
25
Obr. 14: samice – měření a) vzdálenosti od vulvy k řitnímu otvoru; b) šířky těla u řitního otvoru; c) délky ocasu
26
Následující část metodiky obsahuje tabulky uvádějící rozměry háďátek obou karanténních druhů rodu Ditylenchus. Uvedeny jsou jak literární údaje, tak původní data získaná v rámci výzkumu těchto háďátek ve VÚRV, v.v.i. Praha. Tato data mohou být použita pro porovnání údajů získaných při měření háďátek extrahovaných z půdních vzorků i ze vzorků rostlinného materiálu.
Tab. 1: rozměry háďátka Ditylenchus dipsaci uváděné v dostupné literatuře
Brzeski (1998) ♀
Thorne (1945) ♀ ♂
Blake (1962) ♀ ♂
L
1100 – 2000
délka ocasu
71 – 108
–
65 – 72
–
72
délka pářící jehlice
22 – 28
–
–
–
–
délka jícnu
105 – 228
–
–
–
–
délka styletu
10 – 13
–
–
–
–
a
36 – 64
36 – 40
37 – 41
56 – 68
52 – 74
b
6,5 – 12
6,5 – 7,1
6,5 – 7,3
14 – 16
13 – 16
c
11 – 20
14 – 18
12 – 15
12 – 16
12 – 16
c'
36 – 64
–
–
–
–
MB
35 – 43
–
–
–
–
V
76 – 86
–
–
–
–
V'
84 – 90
–
–
–
–
VA/T
1,3 – 2,1
–
–
–
–
1000 – 1300 1000 – 1300 1291 – 1309 1283 – 1317
27
Tab. 2: Měření a statistika dospělých jedinců dvou populací háďátka Ditylenchus ipsaci pocházejících z česneku a čekanky. Rozměry jsou uvedeny v µm; první hodnota je aritmetický průměr ± směrodatná odchylka.
♀ česnek
♂ česnek
♀ čekanka
♂ čekanka
25 1347 ± 71 (1249 - 1493) 40 ± 3,8 (35 - 48) 7,4 ± 0,5 (6,7 - 8,5) 15 ± 0,9 (14 - 17) 5 ± 0,4 (5 - 6) 30 ± 2,1 (26 - 36) 81 ± 0,9 (80 - 83) 87 ± 0,9 (86 - 89) 1,8 ± 0,2 (1,5 - 2,3) 11 ± 0,6 (10 -12) 34 ± 3,0 (27 - 40) 17 ± 1,0 (16 - 19) 182 ± 10,6 (164 - 199) 90 ± 5,2 (80 - 99)
25 1371 ± 98 (1182 - 1525) 45 ± 2,5 (39 - 49) 7,2 ± 0,3 (6,7 - 7,8) 15 ± 1,1 (14 - 18) 5 ± 0,6 (4 - 7) 32 ± 3,2 (28 - 42)
25 1292 ± 105 (963 - 1465) 47 ± 3,2 (37,0 - 53,3) 6,4 ± 0,5 (5,3 - 7,2) 15 ± 1,5 (12 - 18) 5 ± 0,5 (4 - 6) 35 ± 1,7 (30 - 38)
11 ± 0,9 (10 - 12) 31 ± 1,8 (28 - 35) 18 ± 1,7 (13 - 21) 190 ± 13,8 (164 - 218) 91 ± 5,8 (80 - 101)
25 1312 ± 158 (1095 - 1786) 41 ± 4,1 (34 - 48) 7 ± 0,9 (5,9 - 9,7) 15 ± 1,2 (13 - 18) 5 ± 0,6 (4 - 6) 36 ± 3,1 (32 - 45) 80 ± 1,3 (78 - 83) 86 ± 1,5 (83 - 90) 2 ± 0,3 (1,6 - 2,7) 11 ± 0,9 (9 - 12) 32 ± 4,0 (25 - 43) 17 ± 1,5 (15 - 19) 193 ± 17,8 (160 - 223) 89 ± 8,4 (73 - 111)
55 ± 2,7 (49 - 61)
60 ± 4,4 (55 - 73)
69 ± 7,8 (55 - 96)
71 ± 5,2 (59 - 79)
1257 ± 69,0 (1158 - 1399)
1280 ± 95,2 (1097 - 1431)
1223 ± 152,1 (878 - 1441)
1205 ± 102,4 (883 - 1369)
1095 ± 65,3 (995 - 1226)
-
1049 ± 131,6 (878 - 1441)
-
Délka pářící jehlice
-
25 ± 2,6 (20 - 29)
-
24 ± 1,8 (20 - 27)
Vzdálenost od vulvy k řitnímu otvoru
162 ± 11,5 (141 - 184)
-
180 ± 29,2 (138 - 242)
-
n L a b c c' MB V V' VA/T
Délka styletu Největší šířka těla Šířka těla u řitního otvoru Délka jícnu Délka ocasu Vzdálenost od přední části jícnu ke středu středního bulbu Vzdálenost od předního konce těla k řítnímu otvoru Vzdálenost od předního konce těla k vulvě
-
28
11 ± 0,8 (10 - 13) 27 ± 1,6 (25 - 30) 18 ± 1,3 (15 - 20) 203 ± 14,0 (176 - 229) 86 ± 7,2 (71 - 98)
Tab. 3: rozměry háďátka Ditylenchus destructor uváděné v dostupné literatuře
Brzeski (1998) ♀
Thorne (1945) ♀ ♂
L
690 – 1890
800 – 1400 800 – 1300
délka ocasu
62 – 89
–
délka pářící jehlice
24 – 28
délka jícnu
Goodey (1952) ♀ ♂ 690 – 1890
760 – 1350
–
–
–
–
–
–
–
134 – 164
–
–
–
–
délka styletu
10 – 14
–
–
–
–
a
18 – 49
30 – 35
34 – 40
18 – 49
24 – 50
b
4 – 12
8 – 10
7–8
4 – 12
4 – 11
c
9 – 30
15 – 20
12 – 16
9 – 30
11 – 21
c'
3–5
–
–
–
–
V
73 – 84
–
–
–
–
V'
83 – 89
–
–
–
–
VA/T
1,5 – 1,6
–
–
–
–
29
Tab. 4: Měření dospělých jedinců dvou populací háďátka Ditylenchus destructor, obě populace pocházely z brambor. Rozměry jsou uvedeny v µm; první hodnota je aritmetický průměr ± směrodatná odchylka.
n L a b c c' MB V V' VA/T Délka styletu Největší šířka těla Šířka těla u řitního otvoru Délka jícnu Délka ocasu
Brambory 1 ♀ 4 842±78,1 (767 – 935) 38,2±1,5 (37,6 – 39,9) 6,0±0,6 (5,2 – 6,6) 14,6±1,3 (12,9 – 15,8) 4,4±0,9 (3,6 – 5,5) 30,5±0,8 (29,9 – 31,6) 81,0±0,6 (80,1 – 81,5) 87,0±0,2 86,8 – 87,3 1,8±0,2 (1,6 – 1,9) 11±1,4 (9 – 12) 22±1,4 (21 – 24) 14±1,7 (11 – 15) 142±17,0 (117 – 154) 58±5,3 (50 – 61)
Brambory 1 ♂ 15 802±76,1 (656 – 920) 38,5±2,9 (33,5 – 43,8) 5,6±0,6 (4,4 – 6,7) 13,8±1,2 (12,3 – 17,4) 4,0±0,7 (2,9 – 5,2) 29,3±2,9 (27,2 – 38,3)
Brambory 2 ♂ 10 940±114,2 (698 – 1093) 35,9±4,1 (26,8 – 40,6) 6,7±0,7 (5,7 – 7,8) 14,9±1,3 (12,7 – 17,6) 4,3±0,6 (3,4 – 5,3) 36,8±5,1 (27,5 – 44,8)
11±0,5 (11 – 12) 21±1,6 (18 – 23) 15±2,7 (13 – 21) 144±12,5 (124 – 163) 58±6,9 (47 – 69)
Brambory 2 ♀ 10 957±111,8 (800 – 1120) 35,5±3,3 (30,7 – 41,4) 6,8±0,9 (5,8 – 8,3) 15,0±0,8 (13,2 – 16,1) 4,3±0,6 (3,6 – 5,4) 37,3±2,3 (31,5 – 39,7) 81,3±1,1 (79,2 – 83,4) 87,1 – 1,2 (84,7 – 89,1) 1,8±0,2 (1,5 – 2,2) 12±0,9 (10 – 13) 27±3,3 (21 – 30) 15±1,8 (13 – 18) 141±6,6 (131 – 150) 64±9,0 (55 – 84)
43±4,3 (37 – 46)
42±2,3 (33 – 59)
53±3,1 (47 – 58)
52±5,7 (41 – 58)
– – –
− − − 12±0,5 (11 – 12) 26±2,0 (23 – 29) 15±2,2 (12 – 17) 142±17,5 (96 – 158) 63±6,0 (55 – 73)
Vzdálenost od přední části jícnu ke středu středního bulbu Vzdálenost od předního konce těla k řitnímu otvoru Vzdálenost od předního konce těla k vulvě
784±75,5 (717 – 876)
743±7,1 (609 – 838)
893±103,8 (745 – 1047)
877±109,8 (643 – 1031)
682±66,5 (623 – 762)
–
778±91,8 (650 – 909)
−
Délka pářící jehlice
–
21±3,3 (16 – 25)
−
22±1,4 (20 – 24)
Vzdálenost od vulvy k řitnímu otvoru
102±9,09 (94 – 114)
–
115±17,4 (95 – 160)
−
30
2.5. Zakládání chovů háďátek druhů Ditylenchus dipsaci a Ditylenchus destructor, studium jejich škodlivosti a okruhů hostitelských rostlin Získané populace háďátek je vhodné převést do umělých chovů. Nejjednodušší metoda využívá reprodukci háďátek na původních hostitelských rostlinách. Z infikovaného rostlinného materiálu se háďátka extrahují pomocí modifikované Baermannovy nálevkové metody.
K extrakci háďátek pomocí Baermannovy nálevkové metody je zapotřebí: 1) laboratorní stojan 2) kruh na filtraci (nebo křížová svorka a kruh na vaření) 3) větší skleněná nebo plastová nálevka (horní průměr cca. 15 – 20 cm) 4) buničitá vata (2 – 3 listy na vzorek) 5) plastová okenní síťovina o rozměrech 15 x 15 cm 6) silikonová hadice hodící se svým průměrem na stopku nálevky, délka cca. 8 – 10 cm 7) kovová nebo plastová tlačka 8) krátká skleněná zkumavka Rostlinný materiál je vhodné před extrakcí homogenizovat rozkrájením na kousky o délce asi 5 mm. V případě extrakce ze suchého pletiva je možné listy rozdrolit a delší části stonků rovněž nakrájet nebo rozstříhat. Homogenizovaný materiál je zabalen do buničité vaty a umístěn na plastovou síťovinu. Síťovina se vzorkem je vložena do nálevky, na jejíž stopce je pomocí silikonové hadice připevněna skleněná zkumavka. Do takto připravené nálevky je přidána voda tak aby byl celý objem vzorku pod hladinou. Pletivo se extrahuje po dobu 48 h., přičemž první frakce háďátek se odebírá již po 24 hodinách, aby životaschopnost získaných jedinců nebyla negativně ovlivněna výluhem z pletiva. Extrakce háďátek z půdy se provádí obdobně, v úvodní fázi je vhodné z půdy odstranit kameny a hrubé nečistoty, extrakce se většinou provádí přibližně z 200 g půdy. Rozbor odebraných suspenzí se realizuje pomocí stereomikroskopu.
31
Obrázek 15: Baermannova nálevka
Získané suspenze háďátek je vhodné vyčistit od zbytků pletiva několikanásobným promytím destilovanou vodou a nakonec koncentrovat sedimentací a odpipetováním horní fáze. Následně je nutné stanovit objem takto získané suspenze a zjistit počet jedinců ve 20 µl a provést přepočet na celý objem suspenze. V případě, že suspenze háďátek, nemá koncentraci dávající předpoklad úspěšné inokulace je nutné realizovat další zahuštění, přičemž za minimální použitelnou je považována koncentrace 50 jedinců/20 µl. Nakonec je suspenze převedena do 1,5% roztoku karboxymetylcelulózy (CMC) a skladována ve skleněné zkumavce při 4ºC. Vlastní inokulace se provádí umístěním 20 µl kapky suspenze háďátek v 1,5% roztoku karboxymetylcelulózy mezi děložní lístky sazenic původních hostitelských rostlin, u jednoděložných
hostitelských
rostlin
do
úžlabí
prvních
pravých
listů.
Roztok
karboxymetylcelulózy se odpařuje pomaleji než voda, takže háďátka mají více času na průnik 32
do pletiva hostitelské rostliny. V průběhu inokulace je nutné suspenzi pravidelně promíchávat, aby se předešlo usazení háďátek u dna zkumavky. Rostliny je nutné bezprostředně po inokulaci přikrýt zvlhčenou polyetylénovou fólií. Fólie se odstraňuje po 48 hodinách. V případě dostatku biologického materiálu je vhodné po týdnu provést reinokulaci, aby se minimalizovala možnost úniku z inokulace. Vegetace hostitelských rostlin je ukončována průběžně při potřebě čerstvých háďátek, v případě háďátka Ditylenchus dipsaci a potřeby získání zásobního infikovaného rostlinného materiálu tohoto druhu je zastavena zálivka a rostliny ponechány pomalu uschnout. Suché rostliny byly sklizeny a uloženy v papírových sáčcích. K extrakci háďátek z takto získaného materiálu se dá použít opět Baermannova nálevková metoda. U háďátka Ditylenchus destructor je možné využít i jednodušší metodu inokulace. Infikovaná hlíza bramboru je umístěna do většího květináče naplněného pěstebním substrátem a do její těsné blízkosti byly zasazeny čerstvé zdravé hlízy. Po vzejití nových rostlin je další postup shodný jako v předchozím případě s tím rozdílem že se odebírají čerstvé infikované hlízy. Postup pro testování škodlivosti fytoparazitických háďátek r. Ditylenchus na různých druzích zeleniny k napadení háďátkem Ditylenchus dipsaci je obdobný. V průběhu vegetace je žádoucí sledovat příznaky odpovídající napadení háďátky a porovnávat je s negativní kontrolou. Škodlivost háďátek je v tomto případě definována jako schopnost populací testovaných populací háďátka přežívat a reprodukovat se na daných modelových hostitelských rostlinách. U poloviny rostlin je sklizena nadzemní část, omyta, nakrájena na kusy o délce 4 – 5 cm a vysoušena 24 hodin při teplotě 105ºC, následně jsou rostliny váženy pro stanovení hmotnosti sušiny jednotlivých pokusných variant. Zbylé rostliny jsou sklizeny odděleně, nakrájeny na kousky o délce 1 cm a vyplaveny Baermannovou nálevkovou metodou, získaná suspenze je pod binokulární lupou vyhodnocena na přítomnost háďátek. Tab. 5 udává přehled otestovaných hostitelských rostlin a jejich náchylnost vůči populaci háďátka Ditylenchus dipsaci izolované z čekanky.
33
Tab. 5: výsledky testování hostitelského okruhu populace háďátka Ditylenchus dipsaci z čekanky; 0 – rostlina není hostitelem háďátka, + - háďátka na rostlině přežívají, ale nemnoží se; ++ - hostitelská rostlina
Hostitelská rostlina
Výsledek
Česnek
+
Cibule
0
Pór
0
Špenát
+
Čekanka
++
Mrkev
0
Květák
0
Hlávkový salát
0
Hrách
0
Příklad výsledků hodnocení škodlivosti dvou populací háďátka Ditylenchus dipsaci na různých druzích zeleniny udává Tab. 6. Z tabulky je patrná značně nižší hmotnost experimentálních rostlin cibule inokulovaných háďátky, přičemž rozdíl byl statistiky významný. V ostatních variantách sice nebyl statisticky významný rozdíl zjištěn, nicméně příznaky přítomné na experimentálních rostlinách by v praxi stejně vyloučily jejich komerční využití. Tab. 7 uvádí výsledky testování výskytu háďátek v substrátu experimentálních rostlin. Bylo zjištěno že v substrátu se háďátka vyskytují pouze v případě vyšší populační hustoty. Tab. 6: průměrná hmotnost sušiny experimentálních rostlin při testování škodlivosti dvou populací háďátka Ditylenchus dipsaci. Uvedena je rovněž hmotnost rostlin kontrolní varianty a výsledky srovnání pomocí analýzy rozptylu.
Populace z česneku
Populace z čekanky Kontrola
P
Cibule
246,95
185,72
610,11
Česnek
1095,61
1467,08
1220,2 0,331148277
Pór
317,49
312,67
317,96 0,996149761
Špenát Čekanka
1172,28 1963,44
866,36 2075,71
799,05 0,199370147 1859,4 0,970353228
34
1,42697E-07
Tab. 7: výskyt háďátek v substrátu experimentálních rostlin
Populace z česneku + + -
Cibule Česnek Pór Špenát Čekanka
Populace z čekanky +
3. SROVNÁNÍ „NOVOSTI POSTUPŮ“ Předložená
metodika
shrnuje
optimalizaci
postupů
pro
účinný
monitoring
a
morfologickou diagnostiku karanténních fytoparazitických háďátek druhů Ditylenchus dipsaci a Ditylenchus destructor. V České republice nebyly dosud postupy uvedené v této metodice publikovány. Tato skutečnost dává předpoklady pro uplatnění metodiky v praxi.
4. POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY Metodika je určena pracovištím orgánů státní správy zainteresovaným v problematice ochrany rostlin (SRS; ÚKZÚZ). Uplatnění navržených postupů lze předpokládat při monitoringu a v oblastech diagnostiky a hodnocení škodlivosti karanténních háďátek rodu Ditylenchus.
Tato metodika vznikla v rámci řešení Výzkumného záměru Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. Praha, č. Mze 0002700603.
35
5. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY Anonym : http://nematode.unl.edu/didestr.htm (morfologie Ditylenchus destructor) Aftalionová B., Cohn E. (1990): Characterization of two races of the stem and bulb nematode (Ditylenchus dipsaci) in Israel. Phytoparasitica, 18 (3): 229–232. Blake C. D. (1962): Some observations on the orientation of Ditylenchus dipsaci and invasion of oat seedlings. Nematologica, 7: 177–192. Brzeski M.W. (1998): Nematodes of Tylenchina in Poland and temperature Europe. Muzeum i Instytut Zoologii, Polska Akademia Nauk, Warszawa. Decker H. (1969): Phytonematologie – Biologie und Bekämpfung Planzenparazität nematoden, VEB Detcher Landwirtschaftsverlag, Berlin, 171 – 176 p. EPPO (2006)a: http://www.eppo.org/QUARANTINE/nematodes/Ditylenchus_dipsaci/DITY DI_map.htm EPPO (2006)b: http://www.eppo.org/QUARANTINE/nematodes/Ditylenchus_destructor/DIT YDE_map.htm Esquibet M., Bekal S., Castagnone–Sereno P., Gauthier J.P., Rivoal R., Caubel G. (1998): Differentiation of normal and giant Vicia faba populations of the stem nematode Ditylenchus dipsaci: agreement between RAPD and phenotypic characteristics. Heredity, 81: 291–298. Esquibet M., Grenier E., Plantard O., Abbad Andaloussi F., Caubel G. (2003): DNA polymorphism in the stem nematode Ditylenchus dipsaci: development of diagnostic markers for normal and giant races. Genome, 46: 1077–1083. Evans A.A.F., Fisher J.M. (1970): The Excretory Systems of Three Ditylenchus spp. Journal of Nematology, 2(3): 260 – 264. Geraert E. (2006): Functional and detailed morphology of the Tylenchida (Nematoda). Koninklijke Brill NV, 215pp. Eds: D.J.Hunt, R.N. Perry. Goodey J.B. (1952): The influence of the host on the dimensions of the plant parasitic nematode, Ditylenchus destructor. Annals of Applied Biology, 39: 468–474. Greco N., Brandonisio A., Boncoraglio P. (2002): Investigations on Ditylenchus dipsaci damaging carrot in Italy. Nematologia Mediterranea, 30: 139–146. Hooper D.J. (1973a): Ditylenchus dipsaci. Description of Plant – parasitic Nematodes Set 1, No. 14. Commonwealth Institute of Helminthology, 103 St. Peter´s Street, St. Albans, Herts., England.
36
Hooper D.J. (1973b): Ditylenchus destructor. Description of Plant – parasitic Nematodes Set 1, No. 14. Commonwealth Institute of Helminthology, 103 St. Peter´s Street, St. Albans, Herts., England. Hooper D.J. (1986): Drawing and measuring nematodes. In: Laboratory Methods for Work with Plant and Soil Nematodes, pp. 87-94. Ed. J.F. Southey. Her Majesty’s Stationery Office, London. Janssen G.J.W. (1994): The relevance of races in Ditylenchus dipsaci (Kühn) Filipjev, the stem nematode. Fundamental and applied Nematology, 17(5): 469-473. Kornobis S. (1994): The development of populations of stem nematode (Ditylenchus dipsaci (Kühn) isolated from Vicia faba ssp. minor. Roczniki nauk rolnicznich, seria E, T. 24, Z. ½. Maggenti A.R. Sturhan D., Brzeski M.W. (1991): Stem and Bulb Nematodes, Ditylenchus spp. In: Manual of Agricultural Nematology. pp. 147–187. Ed. W.R. Nickle. New York, Marcel Dekker. Milano de Tomasel M.C., McIntyre G.A. (2001): Distribution and biology of Ditylenchus dipsaci and Aphelenchoides ritzemabosi in alfalfa grown in Colorado. Nematropica, Vol. 31, No. 1. Nagesh M., Parvatha Reddy P. (2000): Status of mushroom nematodes and their management in India. Integrated Pest Management Reviews, 5: 213–224. Palmerová H.M., Atkinson H.J., Perry R.N. (1991): The use of DNA probes to identify Ditylenchus dipsaci. Revue Nématol., 14(4): 625–628. Plowright R.A., Caubel G., Mizen K.A. (2002): Ditylenchus Species Plant Resistance to Parasitic Nematodes–CAB International. Polozhenets V.M. (1998): Mixed rots of potato tubers in Ukraine. EPPO Bulletin, 28: 481 – 482. Sabová M., Valocká B., Lišková M., Vargová V. (1993): Parazitické nematódy – škodcovia rastlín. Veda, vydavateľstvo SAV Bratislava. Thorne G. (1961): Principles of nematology, 533 pp. McGraw-Hill Book Co. Inc., New York, USA. Thorne G. (1945): Proceedings of the Helminthological Society Washington, 12: 27–34. Urek G., Munda A., Pajmon A., Šabec Paradžič M., Škervalaj V., Weilguny H., Zemljič Urbanič M., Žerjav M. (1998): Stebelná ogorčica, Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936. Technološki list 73/98. Kmetijski inštitut Slovenie, Ljubljana. Viglierchio D.R. (1971): Race genesis in Ditylenchus dipsaci. Nematologica, 17. 37
Vlk F. ( 1985): Ochrana rostlin – Nematologie obecná a speciální. VŠZ Praha. Wallace H.R. (1962): Observation on the behaviour of Ditylenchus dipsaci in soil. Nematologica, 7: 91–101. Webster J.M. (1967): The significance of biological races of Ditylenchus dipsaci and their hybrids. Annals of Applied Biology, 59: 77–83. Wendtová K.R., Vrain T.C., Webster J.M. (1993): Separation of Three Species of Ditylenchus and Some Host Races of D. dipsaci by Restriction Fragment Length Polymorphism. Journal of Nematology, 25(4): 555–563. Wharton D.A., Marshall A.T. (2002): Changes in surface features during desiccation of the anhydrobiotic plant parasitic nematode Ditylenchus dipsaci. Tissue & Cell, 34(2): 81–87. Whitehead A.G. (1984): Interaction of three lucerne cultivars and eleven English isolates of Stem Nematode (Ditylenchus dipsaci), 'lucerne race'. Plant pathology, 33: 33–37. Whitehead A.G., Fraserová J.E., Nichols A.J.F. (1987): Variation in the development of stem nematode, Ditylenchus dipsaci, in susceptible and resistant crop plants. Annals of Applied Biology, 111: 373–383. Yuksel H.S. (1960): Observations on the life cycle of Ditylenchus dipsaci on onion seedlings. Nematologica, 2: 289–296. Zouhar M., Ryšánek P., Tesařová B., Marek M. (2002): Metodická příručka pro diagnostiku karanténních háďátek rodů Globodera, Meloidogyne a Ditylenchus. ČZU Praha.
38
6. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE 1. Douda O. (2007): Háďátko zhoubné – nebezpečný škůdce. Úroda, LV: 66 – 69. 2. Douda O. (2006): Comparative study of morphological characteristics of two stem nematode (Ditylenchus dipsaci) populations, In: Sborník příspěvků "XVII. česká a slovenská konference o ochraně rostlin", 12.-14. září 2006, ČZU Praha, pp. 423-425, on CD. 3. Douda O. (2006): Srovnávací studie morfologických vlastností dvou populací háďátka zhoubného (Ditylenchus dipsaci), In: Sborník abstraktů "XVII. česká a slovenská konference o ochraně rostlin", 12.-14. září 2006, ČZU Praha, pp. 95-96. 4. Douda O. (2005) Host Range and Growth of Stem and Bulb Nematode (Ditylenchus dipsaci) Populations Isolated from Garlic and Chicory, Plant Protection Sci. 41(3): 104-108. 5. Douda O. (2003): Biologie a škodlivost háďátka zhoubného (Ditylenchus dipsaci) na zelenině, In: Sborník abstraktů "XVI. Slovenská a česká konferencia o ochrane rastlín", 16.-17. september 2003, Nitra, Slovenská republika, p. 172.
39
Název: Metody monitoringu, diagnostiky a hodnocení škodlivosti karanténních háďátek rodu Ditylenchus Autor: Ondřej Douda Vydavatel: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Tisk: Edward Fencl - Logus, Matjuchinova 1218, Praha Počet stran: 39 Vydání: první Rok vydání: 2008 ISBN : 978-80-7427-003-1
