Metody diagnostiky rostlinných virů EKOTECH – metody detekce rostlinných patogenů
Prof. Ing. Josef Špak, DrSc. Ústav molekulární biologie rostlin, Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Význam diagnostiky rostlinných virů Rychlá a spolehlivá detekce viru umožňuje při znalosti jeho biologie a epidemiologie přijetí účinných ochranných opatření. Citlivá detekce je předpokladem včasného odhalení viru při produkci viruprostých osiv a sadby, jejichž použití je nejúčinnější ochranou proti virózám.
Diagnostika rostlinných virů
Metody diagnostiky fytovirů - vizuální hodnocení příznaků - biologické testy - elektronová mikroskopie - sérologické metody - molekulární metody
Vizuální hodnocení příznaků SVBV (Strawberry vein banding virus)
Vizuální hodnocení příznaků
Vizuální hodnocení příznaků
TURNIP MOSAIC VIRUS - TuMV Virus mozaiky vodnice • charakteristika čs. a světových izolátů
CAULIFLOWER MOSAIC VIRUS - CaMV Virus žilkové mozaiky květáku • příprava antiséra • charakteristika čs. izolátů
ŠPAK, J.: Ochrana rostlin 25: 177 - 181, 1989. ŠPAK, J.: Ochrana rostlin 25: 241 - 247, 1989.
TURNIP YELLOW MOSAIC VIRUS - TYMV Virus žluté mozaiky vodnice • první nález v ČR • příprava antiséra • charakteristika čs. izolátů
ŠPAK, J., POLÁK, Z.:Ochrana rostlin 21: 13 - 20, 1985
ERYSIMUM LATENT VIRUS - ErLV Latentní virus hulevníku • první nález v ČR • příprava antiséra • charakteristika čs. izolátů
RADISH MOSAIC VIRUS - RaMV Virus mozaiky ředkvičky • první nález v ČR • příprava antiséra • charakteristika čs. izolátů
STRAWBERRY VEIN BANDING VIRUS - SVBV Virus lemování žilek jahodníku • první nález v ČR • charakteristika čs. Izolátů • částečná purifikace viru
RASPBERRY BUSHY DWARF VIRUS - RBDV Virus keříčkovité zakrslosti maliníku • první nález v ČR • důkaz S a RB (resistance breaking) kmene v ČR
Vizuální hodnocení příznaků
+ levné + rychlé
- vyžaduje „zkušené oko“ - málo citlivé (nezachytí latentní infekce)
Biologické testy (přenos virů na indikátorové rostliny) - mechanická inokulace - roubování - přenos vektory
Biologické testy - mechanická inokulace
Diferenční hostitelské rostliny • • • • •
Tabáky – N. tabacum cv. Samsun Rajče – L. esculentum Merlíky – Chenopodium quinoa Bobovité rostliny- hrách, fazol Jednoděložné - obiloviny
• Pro udržování a přenos izolátů virů volíme taxonomicky příbuzné druhy rostlin • Význam pufru pro stabilizaci viru při homogenizaci rostlinných pletiv
ARABIS MOSAIC VIRUS - ArMV Virus mozaiky huseníku • příprava antiséra • charakteristika čs. izolátů
STRAWBERRY LATENT RINGSPOT VIRUS - SLRSV Virus latentní kroužkovitosti jahodníku
• Primární příznaky na inokulovaných listech • Přiznaky systémové infekce na vrcholových listech
Biologické testy - roubování
Biologické testy - roubování
Converse, 1987
Biologické testy - přenos vektory
Brevicoryne brassicae
Myzus persicae
Biologické testy
+ univerzální (viry, viroidy, fytoplasmy) + citlivost
- pracné - nákladné - náročné na čas, prostor a zkušenost
Elektronová mikroskopie
Elektronová mikroskopie
Příprava preparátů - smáčecí metoda - ultratenké řezy
Elektronová mikroskopie
Ca
Caulimovirus
Carlavirus
Elektronová mikroskopie
Elektronová mikroskopie
Směsná infekce řepky z Uzbekistánu
ŠPAK, J., NOVIKOV, V.K.: Acta Virologica 38: 39 - 42, 1994.
Elektronová mikroskopie
Elektronová mikroskopie
+ rychlost + citlivost
- nákladné vybavení - náročná příprava a hodnocení preparátů - lze zpracovat jen omezené množství vzorků
Sérologické metody
reakce protilátek sCabílkovinným obalem viru
Sérologické metody
- Dvojitá difúze v agaru - ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) - ISEM (Immuno Sorbent Electron Microscopy)
Test difúze v agaru RADISH MOSAIC VIRUS - RaMV
ŠPAK, J., KUBELKOVÁ, D.: J. Phytopathology 148: 371 - 377, 2000.
ELISA
- Imunoglobuliny G - IgG - IgG konjugované s enzymem - Alkalická fosfatáza - Křenová peroxidáza
- Substrát – 4 – nitrofenyl fosfát
ELISA Imuno-enzymatické stanovení
ELISA Význam extrakčních pufrů
ELISA
Výrobci komerčních souprav pro diagnostiku rostlinných patogenů
ELISA
+ rychlost + citlivost + automatizace + komerční kity
- náklady - přístroje (pipety, diag. soupravy spektrofotometr)
ISEM (Immuno Sorbent Electron Microscopy)
