STABILITA GENOMU II.
Metody detekce poškození DNA
Metody detekce poškození DNA Možnosti stanovení: 1. poškození DNA per se nebo 2. jeho následky – mutace genů a mutace chromosomů
1. Detekce poškození DNA A: PŘÍMÁ detekce poškození, např. přítomnost DNA aduktů nebo zlomů ‐ existuje řada metod pro měření aduktů, např.: ‐ kovalentní vazba radiosloučenin ‐ 32P‐postlabeling (včetně detekce pomocí hmotnostní spektrometrie (Accelerator Mass Spectrometry, AMS) ‐ imunologické metody stanovení specifických aduktů pomocí protilátek ‐ nástroje pro detekci zlomů vláken a chromosomálních aberací zahrnují např.: ‐ analýzu metafáze (karyotypizace) ‐ stanovení počtu mikrojader v buňce ‐ fluorescenční in situ hybridizace (FISH) ‐ elektroforetické metody jako je kometový test Comet assay B: NEPŘÍMÁ detekce poškození skrze měření opravných procesů DNA např. stanovení specifických markerů poškození DNA
Metody „přímé“ detekce poškození DNA 1. stanovení DNA aduktů ‘dodatečným’ značením ‐ 32P‐postlabeling 2. kometový test ‐ Comet assay
32P‐postlabeling ‐ metoda umožňuje simultánní stanovení řady různých typů DNA aduktů ‐ citlivost detekce až 1 modifikovaný nukleotid v 1010 v méně než 10 µg DNA (v kombinaci s imunoafinitními metodami) Princip: ‐ enzymatické štěpení DNA na nukleotidy ‐ (preselekce DNA aduktů pro zvýšení citlivosti) ‐ 5’‐značení nukleotidů izotopem fosforu γ 32P‐ATP (33P) ‐ chromatografická separace a detekce značených produktů (TLC/PE celulosa).
32P‐postlabeling
‐ pokrač.
Common methods of 32P‐postlabelling. X, adducted or modified nucleosides; N, normal nucleosides; p, a non‐radioactive phosphate group; p, a phosphate group containing 32P. D.H. Phillips/Mutation Research 378 1997 1–12
Comet assay ‐ vyvinuta 1984 Johansonem a Oeslingem ‐ denaturační modifikace (Singh et al.) ‐ umožňuje sledovat poškození DNA individuálních buněk ‐ principem je gelová elektroforéza buněk Postup: 1. buňky jsou zality do agarózy na mikroskopické podložní sklo 2. lýza pro uvolnění DNA 3. elektroforéza 4. vizualizace barvením DNA fluoroforem DNA fragmenty pocházející ze zlomů migrují rychleji a vytvářejí fluorescenční obraz připomínající kometu. http://www.cometassay.com/
Comet assay – pokrač. ‐ délka ‘chvostu’ spolu s dalšími znaky udávají
rozsah
poškození ‐ pro ‘kvantifikaci’ je dostupné komerční software ‐ varianty metody umožňují rozlišit jednovláknové a dvouvláknové zlomy ‐ většinou se používají lidské lymfocyty, ale je možné použít jakékoliv eukaryotní buňky
2. Detekce následků poškození DNA ‐ mutací ‐ chromosomů přímou vizualizací chromosomálních anomálií cytogenetické metody ‐ genů ‐ přímo (sekvenování) ‐ nepřímo pomocí indikátorů změny fenotypu ‐ analýza genových mutací (princip testů mutagenicity ‐ Amesův test)
Metody detekce následků poškození DNA 1. Cytogenetické metody 2. Analýza genových mutací
Cytogenetika ‐ analýza karyotypu (metafázová analýza) • celkový počet chromosomů • počet pohlavních chromosomů • přítomnost či absence jednotlivých chromosomů • povaha a rozsah chromosomálních aberací • klonální evoluce
Cytogenetické metody 1. Chromosome banding (1970) 2. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) (1990) 3. Spectral Karyotyping (SKY) 4. Comparative Genomic Hybridization (CGH)
1. Chromosome banding G banding Postup: metafázové (kondenzované) chromosomy izolované z proliferujících buněčných kultur jsou kontrolovaně natráveny trypsinem a obarveny chemickou barvou vázající DNA (Giemsa) ‐ tmavé pásy („G bands“) obsahují kondenzovanější chromatin
Detekční limit: ~ 5 ‐ 10 Mb
2. Fluorescence in Situ Hybridization (FISH) ‐ umožňuje přímou detekci poškozené DNA (dvouvláknových zlomů) nebo následků poškození DNA (chromosomální aberace) ‐ je možné vizualizovat jednotlivé geny či celé chromosomy ‐ rozlišení je závislé na velikosti použité sondy (BAC, cosmid; 3‐5 Mb) Princip: ‐ fluorescentní sonda je hybridizována ke komplementární (denaturované) sekvenci DNA metafázových nebo interfázových chromosomů ‐ poloha sondy na chromosomu je pozorována fluorescenčním mikroskopem
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/sky.html
Sonda proti genu na chromosomu 8
Sonda proti alterovaným telomerám
Sonda proti centromerám
Příklady FISH
Sonda proti celému chromosomu
3. Spectral Karyotyping ‐ SKY Chromosome painting; Multiplex FISH – M‐FISH ‐ směs DNA sond složených z velkého počtu fluorescenčně značených fragmentů jednotlivého chromosomu. Po hybridizaci fluoreskuje celý chromosom. ‐ kombinatoriální značení chromosom‐specifických sond více než jedním fluoroforem umožní definovat celý karyotyp (každému chromosomu je přiřazena pseudobarva) ‐ aberace jsou pak snadno detekovány podle počtu barevných oblastí v chromosomech
Normální buňka
Nádorová buňka
Příklady SKY Karyotypy nádorových buněk Normální karyotyp
http://www.accessexcellence.org/RC/ VL/GG/sky.html
Detekční limit: 1.5 Mb
4. Comparative Genomic Hybridization (CGH) ‐ relativně nová molekulárně‐cytogenetická technika ‐ odvozená od FISH ‐ celogenomové zobrazení chromosomálních imbalancí Princip: ‐ testovaná DNA a referenční DNA jsou označeny odlišnými fluorofory a kohybridizovány na representační genom (metafázový roztěr ‐ cytogenetická varianta CGH nebo genomový array ‐ microarray CGH) ‐ poměr fluorescenčních signálů detekuje variace v počtu kopií DNA
Cytogenetická varianta CGH ‐ cCGH Princip: ‐ označení testované a referenční DNA odlišným fluoroforem ‐ hybridizace obou vzorků společně na normální metafázový roztěr
Tumour DNA (Red)
Relativní množství testované či referenční DNA vázané na daný lokus závisí na relativním poměru množství obou sekvencí ⇒ lze identifikovat duplikace a delece.
Normal DNA (Green)
Normal control metaphases
FISH (48-72 hrs)
CGH image capture red, green dapi
myc amplification on 8q24 in COLO 320 HSR
karyotype
ratio
Detekční limit: 3‐8 Mb Kallioniemi et al. (1992) Science 258: 818‐821.
Interpretace cCGH
Limity rozlišení cCGH • zachytí pouze velké (3‐10 Mb) chromosomální imbalance • nedokáže rozlišit vyvážené změny uspořádání chromosomů (např. reciproční translokace či inverze, změny ploidity)
Array CGH ‐ aCGH Princip: ‐ příprava mikroarraye BACů pokrývajících celý lidský genom ‐ fl. značení testované (např. z tumoru) a referenční DNA Cy3 a Cy5 dCTP ‐ hybridizace arraye, detekce signálu (až 30.000 hodnot z jednoho vzorku) Normální buňky
Abnormalní buňky
Určení poměru signálů na každém fragmentu genomové DNA (BAC) DNA sonda 1
DNA sonda 2
Interpretace aCGH ‐ porovnává se log2 poměrů normálního a testovaného vzorku pro předem specifikovaný segment genomu – klon teoretické log2 poměry: • zisk 1 kopie (duplikace) = log(3/2) = 0.58 • neutrální = log (2/2) = 0 • ztráta 1 kopie (delece) = log(1/2) = ‐1
Detekční limit: >1Mb Ishkanian et al. (2004) Nat. Genet. 36: 299‐303.
Limity rozlišení aCGH • neposkytuje informace o lokalizaci sekvence, které ovlivnily počet kopií • chromosomální aberace, které nemají za následek změnu počtu kopií (vyvážené translokace) nejsou detekovány • heterogenní buněčné populace (např. směs nádorových a normálních stromálních buněk) může falešně udávat frakcionální rozdíl v počtu kopií
Srovnání metod pro stanovení chromosomálních aberací
Albertson DG et al.,2003 Nat Genentics, 34;369
Analýza genových mutací (mutagenicity) ‐ existuje velká řada variací ‐ obvykle se jedná o selekci reverze u kmene se specifickými nutričními nároky, odlišnými od divokého kmene (auxotrofní mutanty) ‐ pravděpodobně nejužívanějsí metodou pro detekci mutagenicity v mikroorganismech je Amesův test ‐ v lidských buňkách (lymfocytech) pak hypoxanthinfosforibosyltransferázový test (HPRT assay)
Amesův test Princip: ‐ sleduje reverzi v sadě histidinových auxotrofů Salmonella typhimurium ‐ bakterie jsou vystaveny testované chemikálii a vysazeny na kultivační médium neobsahujícím histidin ‐ pokud je látka mutagen, bakterie rostou a vytvoří kolonie ‐ může být použito několik geneticky odlišných kmenů, takže mohou být detekovány reverze vzniklé např. substitucí párů bází nebo mutacemi čtecího rámce
Pozitivní Amesův test – rostoucí kolonie S. typhimurium
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/AmesTest.html
